TCNICAS ROTINEIRAS DE PREPARAO E ANLISE DE LMINAS HISTOLGICAS

Llian de L. Timm
Centro Universitrio La Salle Museu de Cincias Naturais La Salle ltimm@lasalle.tche.br lltimm@hotmail.com

RESUMO
Para a anlise das microestruturas anatmicas dos tecidos de animais sob microscopia ptica necessria a confeco de lminas histolgicas. Neste artigo so abordadas as tcnicas de coleta, fixao, incluso, microtomia, criomicrotomia e colorao em amostras de tecidos moles e as tcnicas de desgate e descalcificao para tecidos sseos. So abordadas ainda, tcnicas especiais de preparao de amostras para anlise sob microscopia eletrnica, criofratura e fracionamento celular. PALAVRAS-CHAVE: Tcnicas histolgicas, microtomia, colorao, desgaste, descalcificao, microscpios eletrnicos

formas e funes muito distintas. Contudo, todas trabalham em conjunto na sustentao e na manuteno do tecido. A matriz formada principalmente por fibras e gua que auxilia, principalmente no transporte de substncias. A exceo regra est no tecido epitelial. Embora formado por clulas epiteliais com diferentes formas, como cbicas, pavimentosas ou colunares, e arranjadas em diferentes camadas (simples, estratificadas ou pseudoestratificadas), este tecido freqentemente caracterizado pela ausncia de matriz extracelular. Sua nutrio acaba sendo efetuada pelo tecido conjuntivo vascularizado adjacente. Maior variao ainda se encontra em alguns tipos de tecido sseo, como o tecido acelular dos peixes telesteos, onde h a ausncia completa de clulas sseas. Neste caso especial, h uma perda progressiva dos ostecitos durante o crescimento do animal, que culmina na sua ausncia completa na matriz calcificada do indivduo adulto (Enlow e Brown, 1956).

INTRODUO
Histologia o ramo da anatomia que estuda os tecidos animais e vegetais. Tanto a zoologia quanto botnica apresentam nomenclaturas especiais. Neste artigo sero abordados, exclusivamente, conceitos e tcnicas de histologia animal. A maioria dos tecidos formada por clulas e matriz extracelular. Nesta categoria se enquadram os diferentes tipos de tecidos conjuntivos especializados cartilaginoso, adiposo, sangneo e sseo alm dos tecidos conjuntivo propriamente dito, muscular e nervoso. As clulas que os constituem, possuem

TCNICAS UTILIZADAS EM HISTOLOGIA

Muitas so as tcnicas utilizadas em histologia e no seria possvel, neste momento, aborda-las detalhadamente. Deste modo, foram selecionadas algumas tcnicas freqentemente utilizadas em rotinas de laboratrios que proporcionam a visualizao das microestruturas dos tecidos.

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232 Confeco de Lminas Histolgicas: Coleta, Fixao, Incluso e Microtomia

Para a anlise sob microscopia ptica necessria a confeco de lminas delgadas dos tecidos que formam os rgos. Estas lminas podem ser permanentes ou provisrias. A seguir, sero descritas as etapas de confeco de lminas histolgicas permanentes.

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riar entre 06 e 24h. recomendado que, sempre que possvel, no ultrapasse a 3mm de espessura e se utilize, no mnimo, um volume 20 vezes maior de fixador, em relao ao tecido a ser fixado, para que o material reaja satisfatoriamente. Uma vez fixado, a pea deve ser transferida para lcool 70%, onde poder permanecer indefinidamente. O fixador de Bouin tem a seguinte frmula (Junqueira e Junqueira, 1983): Soluo aquosa saturada de cido pcrico __________________________________ 75ml Formol ___________________________ 25ml cido Actico ______________________ 5ml Aps a fixao fundamental a remoo do cido pcrico dos tecidos para a posterior etapa de colorao. Alm disso, resduos deste cido podem favorecer a deteriorao da pea com o passar do tempo. Para a eliminao do excesso de fixador dos tecidos recomendado (Junqueira e Junqueira, 1983): 1) Lavagem em gua corrente por 18h; 2) Transferncia da pea para lcool 50%, durante 30min; 70%. 3) Armazenamento da pea em lcool

Coleta do material
Partes de rgos so retiradas com o auxlio de um bisturi, pina ou lmina de barbear. No indicada a extrao de pores grandes, uma vez que o objetivo final a obteno de uma camada fina que possa ser analisada em um microscpio ptico.

Fixao do material
Esta etapa consiste na utilizao de procedimentos fsicos ou qumicos para imobilizar as substncias constituintes das clulas e dos tecidos, fornecendo maior resistncia para suportar as demais etapas. Alm disso, os fixadores retardam os efeitos post mortem do tecido, mantendo sua arquitetura normal. Os agentes fixadores mais utilizados so o formol tamponado e o lquido de Bouin. Ambos fixam as protenas evitando sua degradao. O formol, por ser mais acessvel e de uso simples, o fixador mais utilizado nas tcnicas histolgicas. Contudo, seus resultados geralmente no so satisfatrios. Por essa razo recomendada a dissoluo de formol em tampo fosfatado preparado do seguinte modo (Junqueira e Junqueira, 1983): Formol (soluo a 37% de formaldedo) _______________________________ 100ml gua destilada ___________________ 900ml Fosfato de sdio monobsico _______ 4,0g Fosfato de sdio dibsico (anidro) ____ 6,5g O tempo de fixao depender do tamanho do fragmento do tecido, podendo va-

Importante: O contedo dos frascos de cido pcrico deve ser mantido mido, pois ele explosivo quando seco (Junqueira e Junqueira, 1983).

Incluso
Este procedimento consiste na impregnao do tecido com uma substncia de consistncia firme que permita, posteriormente, seccion-lo em camadas delgadas. Pelo fcil manuseio e bons resultados, a parafina a mais utilizada neste procedimento. Como ela no miscvel em gua, a primeira etapa da incluso compreende a desidratao, quando ocorre a retirada da gua dos tecidos e a sua substituio por lcool. A diafanizao

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a etapa seguinte, com a substituio do lcool, agora presente nos tecidos, por xilol. Finalmente, na impregnao, ltima etapa, o xilol substitudo por parafina fundida a 60 em pequenos blocos. Neste momento a catalogao do bloco importante para a posterior identificao da pea.

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Microtomia
Esta etapa (Fig. 1 A) consiste, basicamente, em utilizar um micrtomo para obter cortes sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos blocos de parafina com as peas includas. Este aparelho (Fig. 2) formado por uma lmina (fixa ou descartvel) de ao, afiada, e um brao ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.
Figura 2. Fotografia de um micrtomo para cortes em resina (Retirado de Junqueira e Carneiro, 1995)

difcil obter cortes abaixo de 3 a 4 micrmetros de espessura dos materiais includos em parafina. De um modo geral, so obtidos cortes entre 5 e 7 micrmetros.

Montagem da lmina histolgica

(A)

(B)

As fitas obtidas a partir do micrtomo so transferidas para um banho-maria, com o auxlio de uma pina, para serem distendidas (Fig. 1 B). A gua deve estar entre 3 e 8 abaixo do ponto de fuso da parafina utilizada. Nesta etapa, so retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Aps a distenso, os cortes so separados individualmente ou em grupos, conforme a convenincia, utilizandose lminas de vidro previamente limpas com detergente, estocadas em lcool 80% e previamente secas. Antes da utilizao das lminas, necessrio revestir suas superfcies com uma fina camada de albumina para facilitar a adeso da pea. Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (no mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado. Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60 para secagem entre uma e 24 horas.

Tcnica de Criomicrotomia (= Microtomia por Congelamento)

Figura 1. Esquema das etapas de microtomia (A) e distenso da fita em banho-maria (B) (Modificado de Junqueira e Junqueira, 1983).

A tcnica descrita acima, sem dvida, a mais utilizada. Contudo, em alguns casos, esta tcnica contra-indicada, como, por exemplo, no estudo da distribuio dos lipdios, em tcnicas histoqumicas avanadas ou quando so

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necessrios cortes urgentes, como em exames patolgicos. Nestes casos, os tecidos so endurecidos atravs do congelamento. Os aparelhos utilizados para os cortes podem ser de dois tipos: micrtomos de congelamento ou criostatos (Junqueira e Junqueira, 1983). Nos micrtomos de congelamento (Fig. 3) os tecidos so congelados tanto fixados quanto frescos. O congelamento ocorre por expanso de CO2 no suporte apropriado para o tecido. Assim como nos micrtomos de parafina, estes micrtomos possuem uma navalha. Contudo, no produzem cortes muito finos. Suas lminas cortam acima de 10 micrmetros. Outro inconveniente acertar a temperatura ideal para corte: se estes se fragmentam durante a passagem pela navalha, o tecido est frio demais; se ao contrrio, se deformam, o tecido precisa ser resfriado.

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modo, a remoo da parafina da pea que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lmina de vidro. Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral podem ser agrupados em trs classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999): Corantes que diferenciam os componentes cidos e bsicos das clulas; Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular; cidos. Sais metlicos que precipitam nos te-

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histolgicos so a Hematoxilina e a Eosina (HE). A Hematoxilina uma base que cora, preferencialmente, componentes cidos das clulas em um tom azulado escuro. Como os componentes cidos mais abundantes so o DNA e o RNA, tanto o ncleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes so chamados de basfilos. A Eosina, ao contrrio, um cido que cora as estruturas bsicas da clula de rosa. Estas estruturas so abundantes no citoplasma e so chamadas de acidfilas (Gartner e Hiatt, 1999). Outros corantes so tambm utilizados em procedimentos de rotina em laboratrios, tais como (Gartner e Hiatt, 1999): Tricrmico de Masson - cora o ncleo de azul escuro, o citoplasma, a queratina e o msculo de vermelho e o mucignio e o colgeno de azul claro; Orcena - cora as fibras elsticas de marrom; azul; preto; Weigert - cora as fibras elsticas de Prata - cora as fibras reticulares de

Figura 3. Fotografia de um micrtomo para cortes congelados.

O criostato um aparelho mais aperfeioado que o anterior. Permite a obteno de cortes muito mais finos de tecidos no fixados (at dois micrmetros), facilitando a visualizao das clulas (Junqueira e Junqueira, 1983).

Tcnicas de Colorao de Cortes Histolgicos

A colorao consiste numa etapa muito importante para a visualizao das estruturas do tecido. Normalmente so utilizados corantes hidrossolveis, sendo necessrio, deste

Hematoxilina frrica - cora as estriaes dos msculos, os ncleos e os eritrcitos de preto; cido peridico reativo de Schiff - cora as molculas ricas em glicognio e carboidrato de magenta; Wright e Giemsa - especializado em clulas sangneas, cora de rosa os eritrci-

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tos e os grnulos eosinfilos, de prpura o ncleo dos leuccitos e grnulos basfilos e de azul o citoplasma dos moncitos e dos linfcitos. Para corar peas includas em parafina necessria a retirada da parafina e a hidratao da pea. Este procedimento realizado a partir de uma seqncia de banhos em xilol, lcool e gua, inversamente ao procedimento executado na etapa de incluso. Segundo Junqueira e Junqueira (1983), o procedimento o seguinte: 1 Banho de xilol ___________________5min 2 Banho de xilol ___________________2min 3 Banho de xilol ___________________1min lcool 100% ______________________1min lcool 95% ______________________1min lcool 70% ______________________1min gua _____________________________2min Aps a hidratao, os cortes so corados de acordo com o procedimento mais apropriado para a anlise que ser realizada posteriormente. Aqui sero abordadas as etapas do mtodo da hematoxilina-eosina, por ser o mais utilizado e por ter um resultado final satisfatrio.

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as duas solues devem ser misturadas e aquecidas at a fervura. O xido de mercrio adicionado soluo que deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em gua fria. O cido actico ento colocado na soluo fria para finalmente ser filtrada. O prazo de envelhecimento desta soluo entre dois e trs meses. A partir desta data o corante perde suas propriedades e no reage adequadamente com o tecido. b) Material necessrio para a Eosina (Junqueira e Junqueira,1983): Eosina solvel em gua _______________ 1g gua destilada ___________________ 100ml c) Procedimentos para a colorao: Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das solues dos corantes. Deste modo, poder ser observada nas etapas abaixo uma variao muito grande em relao ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no laboratrio. De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas so: 1) desparafinar e hidratar os cortes; 2) corar em hematoxilina entre 5 e 15min; 3) lavar em gua corrente por 10min; 4) corar em eosina entre 1 e 10min; 5) lavar em gua e desidratar em lcool 70% rapidamente; 6) diafanizar e montar em resina.

Tcnica da hematoxilina-eosina (HE)

a) Material necessrio para a soluo de Hematoxilina de Harris (Junqueira e Junqueira,1983): Hematoxilina ______________________ 2,5g lcool 100% _____________________ 25ml Almen de amnio ou potssio ______ 50g gua destilada ___________________ 500ml xido vermelho de mercrio _______ 1,25g cido actico _____________________ 20ml Inicialmente, a hemotoxilina deve ser dissolvida no lcool e o almen na gua destilada (previamente aquecida). Posteriormente,

d) Montagem Final da Lmina: Este processo consiste em depositar uma gota de resina lquida sobre o corte que est aderido lmina de vidro e cobri-lo com uma lamnula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocao da lamnula. Finalmente a lmina catalogada. A resina depois de seca garantir uma lmina permanente que poder durar anos.

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236 Tcnicas Utilizadas para Confeco de Lminas sseas

Para a confeco de lminas sseas so utilizadas duas tcnicas: a primeira consiste no desgaste do osso atravs do polimento com lixa (Fig. 4). Inicialmente, retirado um fragmento do osso a ser analisado. Esse fragmento colado com blsamo do Canad sobre uma superfcie de madeira plana. Em um bloco de madeira colada uma lixa de granulometria grossa para o primeiro polimento. O polimento final feito com uma lixa mais fina, com movimentos firmes e no mesmo sentido, at que se tenha obtido uma camada de osso delgada. O osso retirado da madeira com xilol e aderido superfcie da lmina de vidro. Sobre ele colocada uma lamnula e fixada com resina (Amaral et al. 1994 ; Timm, 1996 a,b).

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Etileno Diamino Tetra Acetato (EDTA) __ 5,5g gua ____________________________ 90ml Formol ___________________________ 10ml Aps a fixao, o material lavado para retirar o excesso de fixador e transferido para um descalcificador. No recomendado utilizar fragmentos maiores do que 3mm de dimetro. Deve-se usar, no mnimo, 40 vezes o volume do tecido, agitando o frasco vrias vezes ao dia e trocando o descalcificador a cada 2 ou 3 dias. Os tecidos descalcificados no devem ser transferidos diretamente ao lcool 70%, e sim, lavados em gua corrente por algumas horas. Para a confeco das lminas histolgicas de ossos descalcificados seguem-se as etapas rotineiras citadas anteriormente.

Microscopia ptica de Alta Resoluo

A microscopia ptica utiliza cortes delgados e preparados com qualquer uma das tcnicas descritas anteriormente, com o objetivo de estudar a morfologia celular. A resoluo das estruturas pela microscopia ptica da ordem de 0,2 micrmetros. Na prtica histolgica em parafina, raramente inferior a 0,6 micrmetros, o que mesmo assim proporciona um bom resultado visual (Stevens e Lowe, 1995). O microscpio ptico possui um arranjo especfico de grupos de lentes para ampliar a imagem do tecido. Como tem mais que uma lente, freqentemente conhecido como microscpio composto. A fonte de luz provm de um bulbo eltrico com um filamento de tungstnio, cuja luz conflui para um feixe focal atravs das lentes do condensador. Microscpios mais antigos no possuem sua prpria fonte de luz, necessitando do auxlio de uma luminria que projeta a luz para um espelho situado na base do microscpio que a reflete para o condensador. Em ambos os casos, o feixe de luz atravessa o tecido delgado fixado na lmina histolgica e penetra em uma das lentes objetivas. Estas lentes esto situadas em um cilindro mvel conhecido como canho. Normalmen-

Figura 4. Confeco de lminas sseas por desgaste.

A segunda tcnica implica na descalcificao do osso. Este procedimento tem por objetivo retirar o fosfato de clcio do tecido sseo para que possa ser seccionado posteriormente. A descalcificao pode ser feita atravs da imerso em cidos ou compostos quelantes. Os quelantes capturam os ons metlicos (entre os quais o clcio), removendo-os dos tecidos com um mnimo de alterao. Embora de ao mais lenta, agridem menos o tecido, e so mais utilizados nos procedimentos histolgicos. Uma das frmulas mais usadas, segundo Junqueira e Junqueira (1983):

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te, existem quatro lentes objetivas que ampliam a imagem em 4, 10 e 40 vezes e uma lente de imerso que amplia a imagem em 100 vezes, onde deve ser utilizado um leo mineral. A imagem das objetivas conflui e posteriormente aumentada pela lente ocular que normalmente amplia a imagem em um mltiplo de 10. A imagem ampliada pela objetiva deve ser multiplicada pelo valor da ocular para a obteno do valor de aumento total. A focalizao da imagem obtida atravs do uso de parafusos que movem as lentes objetivas para cima e para baixo. O parafuso macromtrico move-se em intervalos maiores que o parafuso micromtrico. A imagem projetada na retina invertida da direita para a esquerda e de cima para baixo (Gartner e Hiatt, 1999).

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Microscopia Eletrnica
Nos microscpios pticos, as lentes focalizam a luz visvel (feixe de ftons). Nos microscpios eletrnicos, os eletromagnetos focalizam um feixe de eltrons. A resoluo cerca de mil vezes maior do que a de um microscpio ptico, podendo ampliar em 150.000 vezes a imagem de um objeto, o que permite, por exemplo, a visualizao de macromolculas como DNA (Gartner e Hiatt, 1999).
Figura 5. Fotografia de um Microscpio Eletrnico de Transmisso (MET).

Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET)

A preparao de amostras de tecido para o MET (Fig. 5) envolve as mesmas etapas bsicas da microscopia ptica. Contudo, fixadores especiais tm sido desenvolvidos, uma vez que as ligaes cruzadas entre protenas devem ser mais finas em funo da alta resoluo do aparelho. Estes fixadores incluem solues tamponadas de glutaraldedo, paraformaldedo, tetrxido de smio e permanganato de potssio que no s atuam na preservao das ultraestruturas, como tambm atuam como corantes eltrons-densos. Para a incluso tambm foi desenvolvida uma resina especial, como a resinas epxi e o bloco resultante no maior do que 1mm3 (Gartner e Hiatt, 1999). Os cortes devem ser ultrafinos, na ordem de 0,1 micrmetro de espessura (Stevens e Lowe, 1995).

Os feixes de eltrons so produzidos numa cmara a vcuo pelo aquecimento de um filamento de tungstnio, o catdio. Os eltrons so atrados para o andio, carregado positivamente, numa placa de metal em forma de amndoa com um orifcio central. O feixe de eltron focalizado no material atravs de eletromagnetos anlogos s lentes do condensador do microscpio ptico. Os tecidos so corados com metais pesados (urnio ou chumbo) que precipitam nas membranas lipdicas, fazendo com que os eltrons percam parte da sua energia cintica medida que interagem com o tecido. Os eltrons que deixam os tecidos esto sujeitos aos campos magnticos de muitos eletromagnetos adicionais, que focalizam o feixe numa placa fluorescente. medida que os eltrons alcanam a placa, sua energia cintica convertida em pontos luminosos. feito um registro permanente da imagem resultante, atravs da substituio de um filme sensvel ao eltron no local da placa fluorescente, com a produo de um negativo a partir do qual pode ser impressa uma fotomicrografia em preto e branco (Gartner e Hiatt, 1999; Stevens e Lowe, 1995).

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238 Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)

Diferentemente da MET, a Microscopia Eletrnica de Varredura utilizada para observar a superfcie de um espcime slido (ao invs de cortes), proporcionando uma imagem tridimensional (Fig. 6). O material preparado com uma camada de metal pesado como ouro ou paldio, depositado na sua superfcie. Conforme o feixe de eltrons varre a superfcie do material, alguns se refletem (eltrons de disperso) e outros so ejetados (eltrons secundrios) a partir da cobertura do metal pesado. Estes eltrons so capturados por detectores, interpretados, coletados e mostrados em um monitor com uma imagem tridimensional. A imagem pode ser fotografada ou digitalizada (Gartner e Hiatt, 1999).

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tirado e a rplica examinada ao microscpio eletrnico de transmisso, revelando, por exemplo, as protenas intercalares da membrana endoplasmtica (Gartner e Hiatt, 1999).

Fracionamento Celular
Esta tcnica permite que clulas inteiras sejam rompidas de maneira controlada. As diferentes partculas que resultam so separadas para anlise funcional ou estrutural, atravs da centrifugao das clulas rompidas em solues especializadas de densidade conhecida, alta velocidade. Os ncleos, as mitocndrias, os retculos endoplasmticos e os ribossomos podem ser isolados em forma relativamente pura (Stevens e Lowe, 1995).

INTERPRETAO DE CORTES HISTOLGICOS

Analisar uma lmina histolgica pode ser uma tarefa difcil. O primeiro passo entender o que se est observando. O rgo antes tridimensional, agora est seccionado, preparado, corado e fixado em uma lmina de vidro. As estruturas, quando cortadas transversalmente, se apresentam de modo distinto de quando cortadas longitudinalmente. Alguns planos de corte podem ser observados na Fig. 7.
Figura 6. Fotografia de um Microscpio Eletrnico de Varredura (MEV).

Criofratura
Tecidos congelados rapidamente, mas tratados com criopreservativos, no desenvolvem cristais de gelo durante o processo de congelamento e, por isso, no sofrem dano mecnico. Quando seccionado por uma navalha fria, o tecido sofre fratura de acordo com o plano de clivagem, nas regies com menos pontes moleculares. Nas clulas, a fratura tende a ocorrer entre as camadas interna e externa das membranas. A face fraturada coberta por platina ou carbono, formando acmulos em apenas um dos lados da projeo, o que gera uma rplica da superfcie. O tecido ento re-

Figura 7. Tipos de cortes que podem ser obtidos (Retirado de Gartner e Hiatt, 1999).

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Entendido isto, basta ter ateno aos detalhes, desenhar o que se est sendo observado e acompanhar esta tarefa com um atlas histolgico. O mundo das microestruturas anatmicas (Fig. 8) pode ser bem interessante. Visualizar a base de todo organismo vivo, sua relao com outras clulas, sua organizao em tecidos e entender que somos um conjunto de estruturas vivas formando um nico ser fazem parte da formao de todo bilogo.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AMARAL, Daoiz Mendoza; MENDONA, Olavo Valmor; LAURINO, Laviera B. Patologia ssea Fundamentos. So Paulo: BYK, 1994. ENLOW, Donald H.; BROWN, Sidney O. A comparative histological study of fossil and recent bone tissues. Part 1. The Texas Journal of Science, p. 405-443, 1956. GARTNER, Leslie P.; HIATT, James L. Tratado de histologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia bsica. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1995. JUNQUEIRA, Luis Carlos U.; JUNQUEIRA, Luiza Maria M. S. Tcnicas bsicas de citologia e histologia. So Paulo: Santos,1983.

Figura 8. Corte histolgico da costela de Caiman latirostris realizado pelo mtodo de desgaste. Seco transversal. Aumento: 96x. (Retirado de Timm, 1996b).

STEVENS, Alan; LOWE, James. Histologia. So Paulo: Manole, 1995. TIMM, Llian de L. Preliminary data on the pachyostosis in rib of the Trichechus inunguis Natterer, 1883 (Mammalia: Sirenia). In: Sesso da Academia Brasileira de Cincias, 1996a, Anais da Academia Brasileira de Cincias. Porto Alegre: UFRGS/ILEA, 1996a. p. 296. ______ . Estudo paleo-histolgico acerca da paquiostose em mesossauros.1996b. 181f. Dissertao (Mestrado em Geocincias) - Instituto de Geocincias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1996b.

AGRADECIMENTO
Ao tcnico administrativo Paulo Roberto Peres Carvalho do Centro de Microscopia Eletrnica da UFRGS (CME) pela permisso de fotografar os Microscpios Eletrnicos.

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