da inovao em frmacos: RNA interferncia saindo do laboratrio para a clnica

CARLOS FRedeRiCO MARtinS MenCk

de RNA foi recentemente identificada como um possvel frmaco capaz de revolucionar a forma com que realizamos terapias de um elevado nmero de doenas humanas. As atividades biolgicas dessas molculas, empregadas normalmente na forma de dupla fita, foram descobertas na dcada de 1990 graas identificao dos mecanismos de interferncia do RNA e baseiam-se na capacidade de essas molculas reduzirem (interferirem) a expresso de determinados genes-alvo. O potencial teraputico do RNA dupla fita enorme, sobretudo em processos genticos que requerem inibio de produtos de genes. Entre as doenas-alvo, destacam-se as terapias tumoral e de agentes infecciosos, especialmente vrus, mas vrias outras doenas humanas tambm podero ser controladas pela ao dessas molculas. O tamanho relativamente grande das molculas de RNA, sobretudo em comparao com algumas drogas qumicas, pode representar um dos problemas a serem enfrentados pelas pesquisas no tema, porm chama a ateno a facilidade com que essas molculas podem ser projetadas, dependendo apenas da sequncia das bases do gene-alvo. Vrios protocolos clnicos tm sido testados em humanos nos ltimos anos, e os resultados so promissores. possvel que em breve esse tipo de frmaco seja encontrado em farmcias: vale a pena saber o porqu!
molcula

A nova grande promessa

Introduo

O RNA no s um mero mensageiro do DNA

Na dcada de 1980, a comunidade cientfica se espantou com a revelao de que a molcula de RNA tem atividade cataltica, como as enzimas. Assim, essas molculas foram chamadas de ribozimas e demonstraram que o RNA pode desempenhar funes que superam em muito a de simples mensageiro para sntese de protenas. Mas isso foi s o comeo. Na dcada de 1990, resultados com plantas transgnicas comearam a gerar dados completamente inesperados: plantas que superexpressavam genes para produo de pigmentos (e que, portanto, deveriam gerar flores com mais pigmentos, ou seja, com colorao violeta-escuro) apresentaram flores brancas, em razo da ausncia de sntese do
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pigmento! No caso, houve o inesperado silenciamento do transgene e do gene endgeno das clulas dessas flores. O mecanismo molecular que levava ao silenciamento gnico permaneceu desconhecido por alguns anos, at que, trabalhando com o verme nematoide Caenorhabditis elegans, os grupos dos pesquisadores americanos Andrew Z. Fire e Craig C. Mello descobriram que molculas de RNA dupla fita (RNAdf) poderiam silenciar a expresso de genes (Fire et al., 1998). Os experimentos realizados para essa descoberta so extremamente simples: ao analisarem o efeito de silenciamento gnico de molculas de RNA simples fita antissenso e tambm senso (em relao ao sentido da molcula do RNA mensageiro do gene-alvo), os pesquisadores descobriram que o uso da molcula dupla fita tinha um efeito cem vezes maior. Pela capacidade do RNAdf de interferir na expresso gentica, o mecanismo comeou a ser chamado de RNA interferncia ou simplesmente RNAi.

O mecanismo de RNA interferncia funciona em clulas humanas

Esse mecanismo de silenciamento foi demonstrado inicialmente em vermes, plantas e insetos, mas demorou trs anos para ter sua existncia demonstrada em clulas humanas (Elbashir et al., 2001). Esses experimentos indicaram a importncia evolutiva dos mecanismos de RNAi em eucariontes em geral e acenderam ideias do uso potencial tecnolgico para molculas de RNAdf como base para silenciamento gnico com fins teraputicos em humanos. Alm disso, houve a identificao de pequenas molculas de RNAdf (na forma de grampos) sintetizadas pelas prprias clulas, a partir do seu genoma cuja funo controlar a expresso de genes celulares. Esses RNA endgenos ficaram conhecidos como microRNA (miRNA) e demonstram que as funes do RNA na clula vo muito alm da simples mensagem. Pela descoberta, os doutores Fire e Mello receberam o Prmio Nobel de Medicina em 2006.

Como funciona a RNA interferncia na clula

Os mecanismos de RNA interferncia j so bem conhecidos. Basicamente, genes endgenos so transcritos como um RNAm longo contendo vrios miRNA agrupados. Esses miRNA primrios so conhecidos como pri-miRNA e contm sequncias de bases palindrmicas, de modo que o emparelhamento entre elas gera estruturas de RNAdf na forma de grampo. Essas molculas so processadas ainda no ncleo da clula, sendo clivadas por RNAse (Drosha), formando estruturas com cerca de 70 bases, conhecidas como pr-microRNA (pr-miRNA). Essas molculas so exportadas ao citoplasma (pela enzima Exportina-5) e so novamente processadas por uma RNAse, Dicer, que produz os miRNA maduros que so duplexes de 19 a 23 pares de base. O complexo Risc (do ingls RnA induced silecing complex) a plataforma proteica que se associa aos miRNA e promove a interao de uma das fitas do RNAdf (RNA-guia) com molculas de RNA mensageiros. Essa interao ocorre por complementaridade na sequncia
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do RNA-guia e do RNAm, e normalmente ocorre na regio 3 no traduzida (3UTR), resultando no silenciamento do RNAm-alvo, seja por degradao desse, seja pelo bloqueio da traduo em protenas. No caso de bloqueio de traduo, a complementaridade no necessita ser completa, o que indica que um nico miRNA pode regular centenas de genes, e cada gene-alvo pode ser regulado por mltiplos miRNA, demonstrando a complexidade dessa rede de regulao gnica. A Figura 1 apresenta um esquema que descreve de forma simplificada como funciona o mecanismo de RNA interferncia (para uma reviso, ver Liu, 2008).

Figura 1 Ao de RNA interferncia em clulas animais. A) Esquema do mecanismo de RNA interferncia, indicando as principais protenas/complexos proteicos envolvidos; B) esquema mostrando como podemos empregar esses mecanismos para provocar silenciamento de genes de forma dirigida, com duplexes de RNA (siRNA), ou vetores virais ou no para expresso de shRNA.

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A descoberta do processo de regulao gnica atravs de RNA interferncia revolucionou tambm a forma como se estuda o papel de genes especficos na biologia. O uso de molculas de RNAdf exgenas como ferramenta pode reduzir a expresso de genes especficos (efeito conhecido como knock-down), de forma que as alteraes causadas por essa estratgia possibilitam avaliar quais funes esse gene desempenha na clula. Nesses experimentos, a sequncia da molcula de RNAdf definida pelo pesquisador para interferir no seu genealvo preferido. Essa estratgia tambm pode ser usada diretamente in vivo (em animais ou mesmo em humanos), e da a possibilidade de desenvolvimento de frmacos (Tiemann & Rossi, 2009). Basicamente, duas abordagens distintas podem ser usadas. Na primeira, vetores genticos, em geral derivados de vrus (como adenovrus, retrovrus ou vrus adenoassociados), so transduzidos nas clulas, de modo a expressar genes que so transcritos em molculas de RNAdf na forma de grampo (similares aos miRNA). Essas molculas so conhecidas como shRNA (do ingls short hairpin RnA) e tm como alvo o gene que se deseja silenciar. O shRNA clivado pela protena Drosha e assim processado pela maquinaria de RNA interferncia celular. Apesar de esse tipo de abordagem requerer a produo de vetores virais, o que no um processo simples do ponto de vista de produo de frmacos, ainda assim, como veremos adiante, h algumas estratgias teraputicas que esto sendo testadas, como protocolos clnicos em humanos, empregando vetores que expressam shRNA. Em uma segunda abordagem, pequenas molculas de RNAdf podem ser introduzidas diretamente nas clulas em cultura, visando degradao especfica do gene-alvo. Essas molculas so conhecidas como siRNA (small interfering RnA) e podem ser introduzidas na clula, por vrios tipos de metodologias, para o silenciamento de seu gene-alvo. Atualmente, vrias empresas de biotecnologia oferecem molculas de siRNA, para qualquer gene humano (ou camundongo) que o pesquisador pretenda silenciar. Uma caracterstica importante o tamanho da duplex que deve ter de 19 a 30 pares de base, uma vez que tamanhos maiores podem induzir respostas interferon inespecficas em clulas animais. Em cultura de clulas, a introduo de molculas de siRNA , em geral, feita atravs da formao de complexos dessas duplexes com polmeros qumicos ou lipdeos, normalmente catinicos. O complexo endocitado pelas clulas e as duplexes de RNA so liberadas no citoplasma, sendo processadas pela maquinaria de RNA interferncia, promovendo o silenciamento do gene-alvo. A utilizao de siRNA tem sido largamente empregada em estudos de genmica funcional e em distintos testes clnicos em razo do silenciamento gnico especfico e robusto induzido por essas molculas. A fcil manipulao e a existncia de sequncias de siRNA para qualquer gene do genoma humano tornaram acessvel o uso dessa ferramenta por diferentes grupos de pesquisa bsica e aplicada.

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Interferindo na expresso gnica in vivo

A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia em clulas humanas relativamente recente, mas, apesar disso, rapidamente verificou-se que o uso de RNAdf como ferramenta tambm pode ser feito in vivo, diretamente em animais. Obviamente, a maior parte desses testes pr-clnicos tem sido feita em camundongos, mas animais maiores, como macacos, tambm tm sido usados, e os resultados tm sido promissores. Isso estimulou o desenvolvimento de estudos diretamente em humanos, e vrios protocolos clnicos j esto sendo testados. O potencial teraputico de silenciamento atravs de RNA tem sido investigado tendo como alvo vrios tipos de doenas, como cncer, doenas respiratrias, inflamao, doenas neurolgicas, autoimunes e no combate a processos infecciosos (Figura 2). Alguns protocolos clnicos em fase I, que testam a segurana do uso de terapias em humanos, j foram concludos e se verificou que molculas de siRNA foram introduzidas em pessoas sem que se verificasse efeito txico. Mais do que isso, em vrios casos identificou-se o funcionamento dessas duplexes no silenciamento do gene-alvo, como desejado. O desenvolvimento de terapias baseadas em RNAi tornou-se um campo de pesquisa atrativo e promissor sobretudo nos casos em que a inibio de determinadas protenas no teve sucesso pelos mtodos farmacolgicos tradicionais. Alm disso, como o desenvolvimento de duplexes de RNA s depende do conhecimento da sequncia do gene-alvo, o desenvolvimento dessas drogas extremamente simples em relao ao tradicional drug design, no qual h necessidade de conhecimento da estrutura cristalogrfica da protena-alvo, o que no garantia de sucesso em determinar os ligantes ativos nessas estruturas. Apesar de existirem casos nos quais as duplexes podem atuar em alvos diferentes do previsto (efeito conhecido como off-target), vrios protocolos experimentais tm demonstrado a especificidade dada pela sequncia dessas molculas, o que estimula novas pesquisas na rea. Em geral, os trabalhos empregam as metodologias j bastante investigadas para introduo de DNA em organismos, em procedimentos de terapia gnica tradicional. Entretanto, algumas diferenas entre o uso dessas duas abordagens so claras e devem ser levadas em conta na escolha da metodologia. A molcula de siRNA muito menor (entre 19 e 30 pares de bases), o que facilita sua entrega em relao aos vetores genticos dependentes de DNA ou RNA (em geral alguns milhares de pares de base). Apesar disso, RNA uma molcula muito mais instvel, sendo degradada in vivo por RNAse. Essa caracterstica exigiu diversos estudos em modificaes qumicas que aumentam sua estabilidade no organismo, sem prejudicar a ao dessas molculas com frmacos. Os testes com animais empregam siRNA ou shRNA atravs de vrias vias de administrao, o que depende do gene e do tecido-alvo. Por exemplo, aplicaes intravenosas possibilitam que a duplex seja direcionada especialmente ao fgado, onde interiorizado nas clulas. Por sua vez, introduo de siRNA

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Figura 2 Principais vias utilizadas para silenciamento gnico atravs de ao direta em protocolos humanos com RNA interferncia.

por injeo intraocular garante um efeito direto nesse rgo, com a vantagem de o olho ser um compartimento de tamanho limitado, o que possibilita o uso de poucas molculas, que ainda so efetivas no silenciamento gnico. Tambm tem tido muito sucesso o emprego de aplicao de duplexes de RNA atravs de inalao quando o alvo so as vias areas. Alm disso, molculas de siRNA tm sido aplicadas diretamente na pele, o que possibilita um alcance em vrios pontos do organismo, ainda que preferencialmente em tecidos mais superficiais. Em geral, essas aplicaes in vivo utilizam, como em cultura de clulas, complexos com polmeros ou lipdeos (poliplexos ou lipossomos) que constituem as nanopartculas que so endocitadas para interiorizao das duplexes nas clulas. Curiosamente, no entanto, em vrias aplicaes, solues salinas de siRNA so diretamente usadas e essas ainda so eficientes, promovendo o silenciamento do gene-alvo no organismo. Entretanto, bastante provvel que, em muitos desses casos, o uso das nanopartculas melhore a eficincia do frmaco. Nos casos de shRNA, em geral so empregados vetores genticos derivados de vrus para sua expresso nas clulas. Como em outros procedimentos de terapia gnica, alguns dos casos so diretamente aplicados in vivo (por aplicao intravenosa, por exemplo), mas tambm h casos de aplicao ex vivo, que permite a modificao de clulas-tronco do prprio organismo com o vetor que expressa o shRNA (e promove o silenciamento do gene-alvo). Posteriormente, a clula modificada reintroduzida no organismo, de modo a obter o benefcio teraputico.
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Interferindo no genoma humano com fins teraputicos

Apesar de sabermos que o mecanismo de RNA interferncia existe em clulas humanas h relativamente pouco tempo (desde 2001), surpreendente como rapidamente foram iniciados protocolos clnicos em seres humanos empregando RNAi. Essa rapidez e relativo sucesso em alguns desses protocolos permitem prever que, em poucos anos, teremos essas molculas sendo comercializadas em nossas farmcias e/ou aplicadas em nossos hospitais (Tiemann & Rossi, 2009). Entre as principais indicaes de uso de RNA interferncia, destacamse aquelas envolvidas em terapias oftalmolgicas. Isso se deve basicamente compartimentalizao ocular, que permite a administrao direta com injees na cavidade vtrea. O compartimento ocular livre de nucleases e molculas de siRNA so internalizadas nas clulas-alvo. Essas vantagens tm sido exploradas por drogas teraputicas que usam oligonucleotdeos, j comercializadas (Vitravene, Novartis e Macugen, Pfizer). Com duplexes de RNA (siRNA), os testes clnicos tm se concentrado no tratamento de doena macular relacionada idade (AMD, do ingls age-related macular disease). O desenvolvimento de vascularizao no fundo do olho, sobretudo em pessoas acima de sessenta anos de idade, prejudica a viso nesses pacientes com AMD, e o tratamento com siRNA visa silenciar a expresso de genes relacionados ao desenvolvimento de vasos, como o receptor de VEGF-I (VEGF vascular endothelial growth factor). Testes clnicos de fase II/III, empregando 217 pacientes, indicaram uma melhora na acuidade visual em dois teros desses, demonstrando que essa tecnologia pode estar prxima de ser aprovada para comercializao. Entretanto, existem alguns problemas relacionados ao sistema de administrao (injeo intraocular), e, curiosamente apesar dos resultados positivos, h polmica quanto ao fato de parte dos efeitos se dever a respostas imunolgicas no especficas, e no ao silenciamento especfico pela siRNA (Hubschman et al., 2009). Estudos similares tm sido realizados empregando siRNA contra VEGF-A em pacientes diabticos com edema macular. Protocolos clnicos em fase II tambm esto sendo realizados para combater infeces respiratrias por vrus respiratrio sincicial (RSV). Nesse caso, molculas de siRNA contra genes virais so administradas atravs de inalao nos pacientes. Aparentemente os vrus RSV replicam clulas epiteliais superficiais do pulmo, que, por sua vez, so capazes de endocitar as duplexes de RNA, de modo que o silenciamento viral eficiente. Testes clnicos com 88 indivduos adultos sadios demonstraram que as molculas de siRNA foram seguras e houve nveis significativamente menores de infeco em relao a indivduos que receberam placebo (De Vincenzo et al., 2010). O uso de RNA interferncia como antiviral tambm est sendo testado clinicamente em terapia contra Aids. Nesses estudos, curiosamente, tm-se usado vetores virais derivados de HIV (agente etiolgico da Aids) para expresso de shRNA em clulas-tronco de pacientes. Esses vetores, conhecidos como
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lentivrus, so capazes de se integrar permanentemente no genoma das clulas, as quais so ento reimplantadas nos pacientes. Esse processo de transplante autlogo produz clulas (e principalmente linfcitos T4, alvo do vrus HIV) resistentes aos vrus, o que permite a recuperao do paciente. Dados tm sido promissores indicando que, mesmo dezoito meses aps incio da terapia, as clulas implantadas continuam a expressar o shRNA (Singh & Gaur, 2009). Alm dos protocolos clnicos citados aqui, a tecnologia de RNA interferncia ainda est sendo empregada em protocolos clnicos para outras doenas, como hepatite B, diferentes tipos de tumores (incluindo melanoma), hipercolesterolemia, injria renal aguda etc. Vrios so os genes-alvo testados para combate o cncer: oncogenes, mediadores de ciclo celular e apoptose, genes envolvidos em degradao e estabilidade proteica, angiognese, molculas relacionadas invaso metasttica e adeso celular. Alm disso, nossa proposta o uso de siRNA como coadjuvantes nos tratamentos teraputicos com radiao ionizante e agentes quimioterpicos. Para tanto, estamos testando o silenciamento de genes-alvo como aqueles que codificam protenas antiapoptticas, de multirresistncia a drogas e mesmo envolvidas no reparo de DNA. Certamente, pelo nmero de testes pr-clnicos que esto sendo realizados, a lista de doenas-alvo a serem testadas diretamente em humanos, empregando diferentes estratgias de uso de RNA interferncia, dever ser bastante ampliada.

A corrida do ouro no desenvolvimento de novas terapias com RNAi

A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia, apesar de recente, provocou uma verdadeira revoluo na forma como estudado o funcionamento dos genes nas clulas e tambm abriu perspectivas de interveno direta na ao gnica in vivo. Em vrios casos de doenas humanas, ocorre aumento de expresso de determinados genes, e o controle desses pelo silenciamento aparece como uma esperana na obteno de novas formas de terapia. A obteno de inibidores qumicos continua sendo uma alternativa extremamente interessante em vrias dessas doenas, porm o mecanismo de RNA interferncia fornece uma abordagem simples (busca de complementaridade de sequncia) para obter frmacos, ampliando seu potencial de uso e alcance. Esforos para uso dessa nova biotecnologia na clnica tm correspondido a um dos mais importantes exemplos recentes de medicina translacional, na qual o teste de laboratrio transferido rapidamente para o leito do paciente. Os desafios ainda so grandes, havendo necessidade de novas estratgias para maximizar a ao das molculas efetoras dentro das clulas, assim como dos mecanismos de administrao e entrega da molcula aos rgos-alvo. Vrias so as estratgias propostas, na teoria, para o direcionamento dessas molculas de modo a garantir uma melhor especificidade no tecido-alvo, mas h necessidade de testes que possibilitem a demonstrao de efetividade na prtica. Os desafios, porm, no parecem assustar as grandes empresas farmacolgicas
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do mundo inteiro. Pequenas empresas montadas por pesquisadores esto sendo adquiridas por empresas multinacionais, que esto investindo bilhes em pesquisas de desenvolvimento, acreditando que as drogas e estratgias desenvolvidas com a abordagem de RNA interferncia possam ter sucesso no s para doenas especficas, como tambm criem modelos para outras doenas. Esses investimentos tm sido to flagrantes que parecem uma nova corrida do ouro no uso do conhecimento adquirido com dcadas de estudo do genoma humano, na elaborao de novos frmacos. Entretanto, a aplicao de terapia baseada em RNA interferncia deve ser analisada com cautela, visto que ainda requer intenso trabalho de pesquisa em todo o processo de elaborao de protocolos teraputicos. O Brasil continua incipiente nesses estudos, de modo que apenas alguns grupos de pesquisa, nas universidades, tm o domnio da tecnologia para uso de RNA interferncia. Um nmero ainda menor est envolvido diretamente no desenvolvimento de tecnologias novas empregando essa abordagem. Se esse verdadeiro silenciamento intelectual continuar na rea, teremos que pagar caro pelas patentes e pelo uso dos novos medicamentos que muito provavelmente nos sero vendidos nas prximas dcadas.
Referncias
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resumo

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palavras-chave:

Rna interferncia, silenciamento gnico, Cncer, terapia gnica, In-

feco viral.
abstract

the discovery of gene silencing mechanisms in our own cells using Rna interference is very recent. However, in less than a decade, the scientific investigation have progressed enough to make us see that, very soon, we will use this knowledge for therapeutic purposes. Rna duplexes are potential pharmaceutical drugs and there are high investments in this new strategy. the promising gene therapy seems to finally reach maturity with these new tools.
Rna interference, Gene silencing, Cancer, Gene therapy, viral infection.

keywords:

Carlos Frederico Martins Menck professor do departamento de Microbiologia do Instituto de Cincias Biomdicas (ICB) da universidade de so Paulo. @ cfmmenck@usp.br Recebido em 21.9.2010 e aceito em 27.9.2010.

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