CATEDRTICO DE MICROBIOLOGA DE LA UNIVERSIDAD DE CRDOBA

JUAN CARLOS GARCA MAURICIO

PRINCIPIOS INSTRUMENTALES Y METODOLGICOS EN BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR, I

Bloque 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

TCNICAS BSICAS DE MICROBIOLOGA

MICROBIOLOGA
Microorganismos Organismo microscpico Una o varias clulas Virus

PREGUNTA
Diferencias entre eucariotas y procariotas. Resume en un esquema las principales diferencias morfolgicas y fisiolgicas entre los dos tipos de organizacin celular

LA UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS Lee y discute el artculo La microbiologa y la biodiversidad invisible (Guerrero, R. SEM Junio 2010) Lee y discute el artculo NO a los grmenes, s a los microbios IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS

Biotecnologa Ciclos biogeoqumicos Agricultura Energa Agentes etiolgicos de enfermedades

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA Microscopio simple realizado por Antoni van Leeuwenhoek, hacia 1668, en Leyden, HOLANDA (10 cm). Lo que permiti a Leeuwenhoek hacer los descubrimientos de infusorios, eritrocitos, levaduras, etc. pioneros en los hallazgos microscpicos Royal Society de Londres, 1684

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA

1684

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA SIGLO XIX Mejora y generalizacin del uso de los microscopios Tcnicas Bsicas de laboratorio para el estudio de los microorganismos BACTERIOLOGA Mtodos simples y efectivos para evitar la contaminacin de medios de cultivo estriles, como el uso del algodn para cerrar los tubos y los matraces

Ferdinand Cohn (1828-1898) Descubri el gnero Bacillus y el proceso de formacin de endosporas

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA Dos TEMAS o PREGUNTAS inquietantes La existencia de la generacin espontnea La naturaleza de las enfermedades infecciosas

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA La existencia de la generacin espontnea

Louis Pasteur (1822-1895)

Pasteur demostr la falsedad de la teora de la generacin espontnea con un sencillo experimento. Eliminar todas los microorganismos de un objeto es un proceso que ahora denominamos esterilizacin

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA La naturaleza de las enfermedades infecciosas

Robert Koch (1843-1910) Fue el primero que cultiv bacterias en medios de cultivo slidos y obtuvo cultivos axnicos o puros Walter Hesse, un ayudante de Koch, utiliz por primera vez el agar y otro ayudante Richard Petri desarroll las cajas de Petri

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA La naturaleza de las enfermedades infecciosas Para estudiar un microorganismo o relacionarlo con un proceso especfico, como el caso de una enfermedad, ste debe ser primero aislado. Koch desarroll varios mtodos ingeniosos para obtener bacterias en cultivo puro (rodajas de patata, caldos con gelatina y ms tarde con agar). Dedujo que cada colonia se originaba a partir de una sola clula que haba cado sobre la superficie, haba encontrado los nutrientes apropiados y se haba multiplicado, es decir, cada colonia representaba un cultivo axnico o puro

Lee y discute el artculo Robert Koch, el abuelo de la clonacin (El PAS, mircoles 01/02/2006)

LA MICROBIOLOGA COMO CIENCIA

Conclusin:
El desarrollo de la Microbiologa se debi a la mejora de la microscopa ptica y al descubrimiento de tcnicas bsicas para el estudio de los microorganismos, y estas se idearon en torno a dos preguntas 1) Existe la generacin espontnea? Desarrollo de las tcnicas de esterilizacin. 2) Cul es la causa de las enfermedades contagiosas? Desarrollo de los cultivos puros

OBJETIVO GENERAL APRENDER TCNICAS BSICAS DE MICROBIOLOGA OBJETIVOS ESPECFICOS

SABER HACER MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS CONOCER Y PRACTICAR LA TCNICA ASPTICA APRENDER MTODOS DE SIEMBRA AISLAR MICROORGANISMOS DE LA NATURALEZA CONOCER LOS MTODOS DE CONSERVACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO OBSERVAR MACROSCPICAMENTE Y MICROSCPICAMENTE MICROORGANISMOS. HACER TINCIN SIMPLE CONOCER EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Y LOS FACTORES QUE INFLUYEN EN EL MISMO. CONTAR MICROORGANISMOS

MEDIOS DE CULTIVO Objetivos Aprender la clasificacin, preparacin, esterilizacin y distribucin de los medios de cultivo Definicin Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones para el desarrollo de microorganismos. Estos pueden ser lquidos, slidos o semislidos. Existe una gran variedad de medios de cultivo Constituyentes habituales de los medios de cultivo Fuente de carbono (fuente de energa) Fuente de nitrgeno Agua Oxgeno Sales minerales Factores de crecimiento Otros (agar, tampones, indicadores de pH, agentes selectivos, agentes reductores)

MEDIOS DE CULTIVO Clasificacin de los medios de cultivo A) Segn su estado fsico o consistencia: Lquidos, Slidos, Semislidos. B) Segn su origen: a) Naturales (Estn constituidos por sustancias naturales, tales como patata, leche, huevos, sangre, mostos, .. ) b) Artificiales (Estn compuestos de sustancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio ) C) Segn su composicin: a) Sintticos o qumicamente definidos b) Complejos o qumicamente indefinidos D) Segn su utilizacin: a) Medios generales (permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos) b) Medios de enriquecimiento (favorecen el crecimiento de un grupo de microorganismos, sin inhibir el de otros) c) Medios selectivos (permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo, inhibiendo el desarrollo de los dems) d) Medios diferenciales (ponen de relieve propiedades que posee un tipo de microorganismo, discriminndolo del resto) e) Medios de identificacin (permiten comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad)

MEDIOS DE CULTIVO Preparacin de los medios de cultivo

Microondas o Autoclave

MANIPULACIN DE CULTIVOS Medidas de seguridad Hay que tomar mucha precaucin puesto que se va a usar mecheros Bunsen. Mantener una distancia de seguridad a la llama del mechero, es decir, mantener alejado los cuadernos, libros, pelos, ropa, etc. Los cabellos largos deben de estar recogidos. No atravesar el quemador para coger algo Los tubos con medio de cultivo deben mantenerse en una gradilla de pie para evitar que se derramen Antes de coger con el asa de siembra de un cultivo slido o lquido hay que enfriarla. El contacto con un asa caliente puede causar salpicaduras del material y el aerosol producido podr ser nocivo No tocar los medios de cultivo porque podras contaminarte Objetivos Aprender los mtodos de cultivo asptico Aprender tcnicas para transferir los microorganismos de una placa de agar a caldo o tubos inclinados o viceversa Aislar microorganismos a partir de un cultivo mixto por la tcnica de siembra de dilucin por estra en placa de agar y por la tcnica de dilucin en tubos y obtener un cultivo axnico o puro

TCNICA ASPTICA HERRAMIENTAS DEL MICROBILOGO

Mechero Bunsen

Asa y agujas de siembra

Asa de digralsky

TCNICA ASPTICA La tcnica asptica es todo procedimiento destinado a evitar la contaminacin

TCNICA ASPTICA

Transferencia de microorganismos

TCNICA ASPTICA

Transferencia de microorganismos

TIPOS DE SIEMBRAS Siembra por estras

Siembra por picadura

TIPOS DE SIEMBRAS Siembra en superficie o dispersin y en profundidad o en masa

Siembra por cobertera

TIPOS DE SIEMBRAS Siembra por dilucin en tubos

Siembra en profundidad en tubo Para anaerobios estrictos

AISLAMIENTO Y OBTENCIN DE CULTIVO AXNICO Siembra en placa para aislamiento por la tcnica de dilucin por estras

(a)

AISLAMIENTO Y OBTENCIN DE CULTIVO AXNICO Siembra en placa para aislamiento por la tcnica de dilucin por estras

Aislamiento por estras en tres fases

AISLAMIENTO Y OBTENCIN DE CULTIVO AXNICO Siembra en placa para aislamiento por la tcnica de dilucin por estras

Siembra en superficie por agotamiento

AISLAMIENTO Y OBTENCIN DE CULTIVO AXNICO Seleccin de colonia en cultivo puro

Obtencin de un cultivo puro

CONSERVACIN Y MANTENIMIENTO DE MICROORGANISMOS Existen diversos procedimientos para conservar y mantener los cultivos microbianos. El mtodo adecuado depende del tipo de microorganismo y del perodo de tiempo de conservacin que se requiera. Medios de conservacin Mantenimiento durante perodos cortos de tiempo (semanas)

Cultivos de almacn de trabajo

Lo ms habitual es emplear la refrigeracin a 4 C Estos cultivos se deben transferir con cierta periodicidad a medios frescos Actividad metablica es alta

CONTAMINACIONES

MUTACIONES

Controles frecuentes

Mantenimiento a largo plazo (meses, aos) Cultivos de almacn primarios

Los procedimientos ms habituales son la congelacin y la liofilizacin Actividad metablica muy baja

EJEMPLOS Y PROCEDIMIENTOS PARA CONSERVAR CULTIVOS PRIMARIOS

1) Basados en someter a los microorganismos o sus esporas a una

desecacin sobre suelo o sobre cualquier material slido inerte Gel de slice Papelillos de papel de filtro
Recuperacin 2) Almacenamiento en medios donde los microorganismos tengan

una baja actividad metablica Bajo una capa de aceite de parafina Congelacin (Crioprotectores)
3) Desecacin de las clulas vegetativas o esporas mediante la tcnica

de la LIOFILIZACIN o deshidratacin por congelacin Congelacin seguida de una sublimacin del agua congelada bajo vaco

Los microorganismos se liofilizan en presencia de un agente protector, un crioprotector (se recomienda el inositol) y se guardan en ampollas selladas al vaco para evitar la rehidratacin y la oxidacin de las membranas. Normalmente, las muestras liofilizadas se almacenan a temperatura constante, preferentemente a 18 y sin bajar de los 0 C, en la oscuridad. C

LIOFILIZADOR

OBSEVACIN MACROSCPICA DE MICROORGANISMOS Los microorganismos crecen en un medio slido formando colonias que son unidades identificables y representa una poblacin de microorganismos procedentes de una nica clula depositada en la placa
CARACTERSTICAS DE UNA COLONIA
FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. TAMAO: El dimetro en mm. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc. ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc. BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc. ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa. COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc. OPACIDAD: Transparente, opaca, etc. CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Se usa el asa bacteriolgica para determinar la consistencia.

Cada microorganismo dar un nico tipo de morfologa de colonia. El tipo de colonia da informacin que puede ser usado para ayudarnos a identificar el microorganismo en cuestin. La morfologa de las colonias vara segn las condiciones ambientales y el medio de cultivo

OBSEVACIN MACROSCPICA DE MICROORGANISMOS Crecimiento de microorganismos en medio lquido

Velo de flor

TINCIN SIMPLE

FROTIS

Extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos

Fijacin al vidrio del portaobjetos al calor

TINCIN SIMPLE

Adicin de colorante

Lavar con agua

Eliminar exceso de agua Secar con papel de filtro

Agregar 1 gota de aceite de inmersin y observar en el objetivo 100x

CRECIMIENTO MICROBIANO Incremento en el nmero de clulas microbianas, como consecuencia de la divisin celular

Curva de crecimiento

El crecimiento se afecta por la T, pH, composicin del medio.

TCNICAS DE RECUENTO MICROBIANO

En muchos estudios microbiolgicos es importante conocer con exactitud el nmero de microorganismos presentes en una muestra. As, en el campo de la alimentacin y la higiene es esencial conocer la carga microbiana de aguas, alimentos, superficies de trabajo, etc., para determinar la repercusin sanitaria o la calidad de los productos analizados. Tambin en muestras clnicas, como la orina, el recuento es de gran inters con vistas al diagnstico y tratamiento

Los mtodos de recuento microbiano ms utilizados son las medidas indirectas del crecimiento microbiano como las medidas de turbidez, o medidas directas como el recuento de colonias tras siembra de diluciones sucesivas de la muestra

TCNICAS DE RECUENTO MICROBIANO Los recuentos microbianos se efectan para hacer un recuento del nmero de microorganismos que hay presentes en una muestra lquida. Los recuentos cuantitativos no se pueden efectuar sobre muestras no fluidas. A. En medio lquido 1. Turbidimetra (absorbancia en un espectrofotmetro) 2. Cmaras de recuento 3. Bioluminiscencia (ATP) 4. Contadores electrnicos de partculas B. En medio slido 1. Mediante filtros de membrana calibrados 2. Mediante diluciones seriadas (1) en profundidad o en masa (2) en superficie (extensin con asa de Digralsky)

TCNICAS DE RECUENTO MICROBIANO TCNICAS TURBIDIMTRICAS

TCNICAS DE RECUENTO MICROBIANO Recuento de totales y viables

TCNICAS DE RECUENTO MICROBIANO

TCNICAS DE RECUENTO MICROBIANO

RECUENTO DE COLONIAS (VIABLES) DILUCIONES SERIADAS

La viabilidad en microbiologa se define como la capacidad del microorganismo para dividirse y dar lugar a una descendencia

Nmero de colonias x Factor de dilucin Nmero de UFC/ml = ---------------------------------------------------------------ml Sembrados en la placa

BIBLIOGRAFA

Manual prctico de MICROBIOLOGA. C. Gamazo, I. Lpez-Goi y R. Daz. ELSEVIER MASSON. (Barcelona), 2005.

BIBLIOGRAFA

Investigating Microbiology: A Laboratory Manual for General Microbiology. Philip E. Stukus, Ph.D. Saunders College Publishing. Harcourt Brace College Publishers, New York 1997.

CRITERIOS DE EVALUACIN DE LA PARTE DE MICROBIOLOGA

1. LA EVALUACIN ES CONTINUA 2. LA ASISTENCIA ES OBLIGATORIA Y CON APROVECHAMIENTO 3. REALIZACIN DE CUESTIONARIOS ONLINE 4. SE REALIZARN Y SE EVALUARN CASOS PRCTICOS DEL BLOQUE 1 Y DEL BLOQUE 2. AMBOS BLOQUES SON INDEPENDIENTES