Sistema ptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.

. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecnico SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto. 2 . El microscopio electrnico consta principalmente de una alta columna cilndrica hueca donde se confina el rayo de electrones, y de una consola con un panel de botones giratorios que controlan electrnicamente las operaciones efectuadas dentro de la columna. La parte superior de la columna contiene el ctodo, in filamento de tungsteno que cuando se calienta acta como fuente de electrones. Los electrones se desprenden del filamento caliente y se aceleran para formar un delgado haz mediante la aplicacin de un voltaje entre el ctodo y el nodo. Antes de la operacin se extrae el aire de la culunma para producir un vaco donde se desplazarn los electrones. Las lentes de un microscopio electrnico son electroimanes potentes localizados en la pared de la columna al vaco. La fuerza de los imanes esta controlada por la corriente suministrada, que es determinada por la posicin de los diferentes botones de la consola entre la fuente de electrones y la muestra se colocan lentes condensadores que se encargan de enfocar el rayo de electrones sobre la muestra. La propia muestra se sostiene sobre una pequea rejilla de metal delgado, el cual se introduce en la parte media de la columna del microscopio de modo que la rejilla se mantenga perpendicular al haz de electrones.

La distancia focal de las lentes se puede modificar cambiando la corriente suministrada, una lente objetivo puede recorrer toda la gama de amplificaciones sin necesidad de cambiar lentes. La imagen es resultado de los electrones que pasan a travs de la muestra enfocado sobre una pantalla localizada en la parte inferior de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan un recubrimiento de cristales fluorescentes que emiten su propia luz visible percibida por el ojo como una imagen de la muestra. Microscopio electrnico de barrido: se pueden obtener imgenes topogrficas tridimensionales de los materiales sujetos al estudio. Se emplea un haz de electrones que acta sobre la superficie del material: all los electrones excitan a las molculas de la muestra, las cuales emiten un delgado haz de electrones secundarios que adquieren un movimiento semejante al observado en los tubos de rayos catdicos, estos electrones son desviados hacia un tubo foto multiplicador, generando imgenes en una pantalla de televisin, esta se recubre con un metal pesado que se evapora en una cmara de vaco. Adems se hace rotar la muestra para que el metal se deposite uniformemente en toda la superficie. Microscopio electrnico de transmisin: es un instrumento que permite conocer la ultraestructura de las clulas y de la matriz extracelular, ya que posee un poder de resolucin mayor que el microscopio ptico. Utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electro esttico o electro magntico y de la misma forma que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente. Si se coloca un filamento en el interior de un tubo de vaco y luego se calienta, el filamento emite electrones que pueden ser acelerados por medio de un potencial elctrico. El haz de electrones tiende a seguir una trayectoria rectilnea y presenta propiedades similares a la de la luz. Manifiesta un carcter vibratorio y corpuscular, pero la longitud de onda es menor para los electrones. El filamento que emite la corriente de electrones acta como fuente termolnica. Por una bobina electromagntica que cumple las funciones del condensador del microscopio ptico, los electrones se concentran en el plano donde se coloca el material. Una segunda bovina funciona como una lente objetivo, lo que da una imagen agranda del objeto en observacin. Esta imagen es recibida por una tercera lente electromagntica, aumenta la imagen que proviene del objetivo. La imagen final se observa sobre una pantalla fluorescente o en ana placa fotogrfica. microscopio ptico microscopio electrnico Fuente de luz comn. Haz de electrones. Se pueden observar clulas y tejidos vivos y muertos. Solo se pueden observar clulas muertas. Con frecuencia las muestras se someten a Las muestras se tratan con sales metlicas. tcnicas de tincin con colorantes. El material biolgico tiene un grosor entre 1 Las muestras se cortan en secciones ultra finas de 50 a 100 y 10 um. se corta con micrtomo. um. de espesor utilizando ultramicrtomo. M electrnico de transmisin: ME de barrido: los electrones chocan con la muestra y Los rallos de luz atraviesan la muestra. los electrones atraviesan la muestra. rebotan. Poder de resolucin: 0,2um. PR: 0,2 0.5 um. PR: 10 um. Brinda informacin topogrfica y da una Proporciona informacin de la Da una imagen topogrfica y imagen muy reducida. ultraestructura celular. tridimensional del objeto. 3 . Microscopio de contraste de fase: sirve para ver clulas y tejidos vivos al estado transparente, es decir, que no tienen tcnicas de tincin. Su funcin se basa entre los diferentes ndices de refraccin que sufre la luz al atravesar un tejido biolgico, esos cambios en el ndice de refraccin se denominan cambios de fases. Las diferentes longitudes de onda son interpretadas en un microscopio por un censor de ndice de refraccin y produce las diferentes longitudes de onda en rayos, en diferentes longitudes grises. 2

Microscopio de interferencia: similar al de contraste de fase con la diferencia que tiene mayor sensibilidad para detectar los ndices de refraccin, por lo tanto se obtiene una imagen a color. Un tipo especial de microscopio de interferencia es el llamado microscopio de Nomarski, en el cual un rayo de luz nico atraviesa el material y el objetivo y luego se dividen en dos rayos que se interfieren entre s por medio de un prisma birrefringente. Tambin se utilizan filtros que actan como polarizadores y analizadores y un prisma compensador ubicado en el condensador. La imagen resultante presenta un relieve caracterstico. Este microscopio es particularmente til para el estudio de las clulas vivas durante la mitosis. 4 . Tcnica histolgica: Se denomina al conjugo de operaciones y procedimientos a los que se somete una muestra organizada, con el objetivo de facilitar la observacin de las piezas al microscopio permitiendo de esa manera observar estructuras no visibles al ojo humano. Pasos de la tcnica histolgica: Obtencin del material: se puede obtener a partir de: Biopsias: es un fragmento del tejido llamado bloque, se obtiene por biopsias quirrgicas. Necropsias: es la extraccin del material de cadveres. Obtencin a partir de animales de laboratorios. Estudio experimentales de animales y vegetales. Material obtenido a partir del cultivo celular. Frotis o extendidos. Para la obtencin de la muestra es necesario actuar con precaucin para no destruir o daar el tejido. Fijacin: una vez obtenido el material, se debe colocar en una sustancia llamada fijador, por medio de la fijacin se detiene el metabolismo celular y se conservan las estructuras. Para l su futuro tratamiento evitndose la degeneracin post mortem. Debemos diferenciar dos conceptos: Autlisis: proceso destruccin de los tejidos por sus propias enzimas lisosomales. Putrefaccin: proceso de destruccin de los tejidos asociados a la accin de microorganismos, como bacterias. La fijacin contribuye a endurecer las clulas para que resistan mejor los pasos de la tcnica y aumenta la afinidad de las estructuras celulares por los colorantes. Un fijador debe tener: Buen poder de penetracin. Actuar con rapidez. 3

Debe endurecer y conservar lo mas fielmente las estructuras celulares. Inclusin en parafina: la parafina es un producto residual del petrleo y constituye una base o sostn slido para el tejido. Una vez que se retira la muestra del fijador, se la lava y se la deshidrata, para ello se utiliza alcohol en forma creciente de 7090100 en cada bao la pieza estar de tres a doce horas. Una vez finalizada la deshidratacin se impregna la muestra con un solvente, ya que la muestra esta embebida en alcohol y la parafina es invisible en el mismo. Se trabaja con xilol, toluol y benceno que eliminan el alcohol y la muestra adquiere una transparencia caracterstica, este proceso se llama aclaracin y las sustancias empleadas se llaman aclarantes. Luego se produce una inclusin definitiva en una solucin que contiene partes iguales de parafina liquida y liquido intermediario (xilol, toluol y benceno) y se lo deja una hora en la estufa. Luego se introduce en otro recipiente que contiene parafina liquida solamente y se lo deja en la estufa cuatro horas. Confeccin de taco: se coloca el trozo de tejido con parafina en un molde especial de metal llamada barra de leuckart, orientndolo convenientemente para el posterior corte. Obtencin de cortes: los cortes deben ser delgados, se utilizan instrumentos llamados micrtomos. Hay varios tipos, el micrtomo tipo minot es el ms utilizado en la tcnica histolgica, pues da cortes sencillos en forma de cinta con espesores de dos a veinte micras. Una vez realizado el corte se recogen con ayuda de un pincel y se lo introduce en una caja de petri que contiene agua a 45. En un porta objetos se coloca albmina de mayer, se coloca el corte del tejido y se lleva a la estufa durante 15 o 20 minutos. Luego se realiza la desparafinizacin con xilol, toluol hasta que el material se vuelva transparente, como los cortes estn deshidratados se los vuelve a hidratar ya que se van a utilizar colorantes en una solucin acuosa. Se vuelven a emplear alcoholes en graduacin decreciente 969070 y agua durante un minuto cada una. Coloracin: proceso por el cual un cuerpo toma color por la accin de una sustancia colorante. Clasificacin de colorantes: Pueden ser: Naturales: animales: carmn. vegetales: hematoxilina, azafrn. Artificiales: cidos: eosina, son colorantes citoplasmticos bsicos: azul de metileno, son colorantes nucleares. neutros: eosinato de azul de metileno, tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. La coloracin puede ser: Ortocromtica: cuando los tejidos toman el mismo color al de la solucin empleada. Metacromtica: cuando los tejidos toman un color diferente el del color empleado. La tcnica de coloracin ms empleada es la de hematoxilinaeosina. Montaje: para proteger el preparado y evitar su deterioro se lo cubre con un cubre objetos de vidrio, colocando 4

previamente blsamo de canad. Basofilia: tejidos que reaccionan con colorantes bsicos, por ejemplo cromatina y los nucleolos. Asidofilia: tejidos que reaccionan con colorantes cidos, por ejemplo filamentos citoplasmticos. Clasificacin de fijadores: qumicos: simples: constituidos por una solo sustancia qumica. Formol al 40%, conocido tambin como formalina y se emplea al 10%, 25% diluido en agua. Para fijar extendidos desangre y de lquidos de puncin. compuestos: liquido de flemming que es un excelente fijador para la clula. Liquido de bouin que permite fijar piezas de hasta 1cm de grosor. fsicos: color seco: se unas en bacteorologa. color hmedo: se usa para fijar invertebrados. fri: es un buen fijador, pues cuando deja de actuar, se reinician los procesos pos mortem. desecacin: en extendidos de sangre. Lquidos de puncin. 5 . Tcnicas citoqumicas: Mtodo de feulgen: es especifica para detectar la presencia de ADN, algunos hidratos de carbono y lpidos. Se realiza una hidrlisis suave con cloruro de hidrgeno, lo que separa las purinas de la desoxirribosa. Luego se coloca el reactivo de schiff que reacciona con dos grupos aldehdos, revelndose la presencia de cromatina. El reactivo de schiff, se utiliza para detectar el cido desoxirribonucleico, algunos hidratos de carbono y lpidos. Para detectar ADN por medio de la reaccin de feulgen, los cortes de tejido fijado se someten a una hidrlisis cida dbil y luego se tratan con el reactivo de schiff. Esa hidrlisis es suficiente para extraer el ARN, pero no el ADN. La hidrlisis cida entre las purinas del ADN al nivel de la unin de la desoxirribosa purina por lo que se liberan los grupos aldehdos de la desoxirribosa. Los grupos aldehdos libres reaccionan con el reactivo de schiff. Reaccin de PAS: se basa en la oxidacin de los grupos gliclicos 12 de los polisacridos mediante el cido peridico, lo cual produce la liberacin de los grupos aldehdos que entonces dan positiva la reaccin de schiff. 6 . Cultivo celular: Para estudiar el comportamiento, crecimiento, reproduccin y metabolismo de las clulas se recurre al mtodo de cultivo en laboratorio. El cultivo de clulas consiste en la extraccin de clulas de su medio que luego se colocan en un recipiente de vidrio esterilizado, la caja de petri contiene un medio de cultivo, que son nutrientes, que van a facilitar el crecimiento o cultivo de clulas. El cultivo implica la extraccin de pequeos trozos de tejido vivo bajo rigurosas condiciones de esterilidad, 5

por lo que se les coloca en un medio apropiado de cultivo a 37C manteniendo a loas clulas en condiciones de humedad y oxigenacin. Para evitar la contaminacin de los cultivos, este procedimiento se realiza dentro de cmaras de flujo laminar con ultravioleta que solo se conectan en el momento de trabajar porque es nocivo para la salud. 7 . Tcnica inmunocitoquimica: Se basa en propiedades antignicas de los componentes celulares, por eso se utilizan anticuerpos para su deteccin. Los anticuerpos estn compuestos por cuarto pptidos que les dan a las molculas la forma de una Y, con dos sitios de fijacin para el antgeno. Una vez formado el complejo antgenoanticuerpo, puede ser revelada por medio de marcadores especiales con ayuda del microscopio ptico, electrnico o de fluorescencia. mtodos directos: consiste en tomar un animal e inyectarle un antgeno, el cuerpo genera anticuerpos y luego se extrae sangre del animal, en el suero se marcan los anticuerpos con marocromo (colorante fluorescente) y se une el antgeno para encastrarlo o seguirlo. Los anticuerpos pueden conjurase con colores fluorescentes, que permiten la deteccin del complejo mediante el microscopio de fluorescencia. mtodo indirecto: se realizan todos los pasos del mtodo directo, pero a los anticuerpo primarios no se los marca, e toma otro animal y e coloca el antgeno que genera anticuerpos y estos si son marcados. Se le extrae sangre asta llegar al suero y se marcan los anticuerpos del otro animal (secundarios). Se toma el tejido del primer animal y se le colocan los anticuerpos del segundo. Otra tcnica inmunocitoquimica indirecta que requiere la ayuda del microscopio electrnico se basa en la aplicacin de partculas de oro coloidal, las cuales son muy opacas a los electrones. 8 . Autorradiografa: Esta tcnica se utiliza para localizar radiactividad emitida por istopos que se hayan depositados en diferente tejidos, los cuales pueden demostrarse por su capacidad de interactuar con los cristales de bromuro de plata de las emulsiones fotogrficas. En una radioautografa la sustancia en estudio es incorporada a la clula y localizada mediante una emulsin fotogrfica. El corte tisular se pone en contact con la emulsin fotogrfica durante un breve tiempo, la radioautografa se revela como una fotografa comn. Superponiendo la imagen fotogrfica con las clulas procesadas para ser examinadas con el microscopio, puede obtenerse una idea precisa acerca de la localizacin del radioistopo. De las tcnicas radioautogrficas la ms utilizada es la que emplea emulsiones liquidas. El radioistopo ms usado es el tritio. Biologa Gua de Estudio y Trabajo Practico N 1 y 2 Microscopio ptico: esquema, partes y funciones. Microscopio electrnico de trasmisin y barrido: componentes, caractersticas. Diferencias con microscopio ptico. Microscopio de contraste de fase y de Nomarski. Fundamento de su funcionamiento. Tcnica histolgica: conceptos, etapas y caractersticas. Tcnicas citoqumicas: feulgen y PAS. Cultivo celular. Tcnicas inmunocitoqumicas. Autorradiografa.