Alvaro Gmez Losada. EGMASA 1.

Clasificacin biolgica de los cultivos

El cultivo de protozoos de vida libre proporciona un microhbitat en el cual los individuos alcanzan un nivel de poblacin adecuado y permanecen en l durante un tiempo razonable de tiempo. Para ello se requieren unas condiciones ptimas desde el punto de vista biolgico, qumico y de factores fsicos, semejantes a las que tiene una poblacin en un medio ambiente natural. Los cultivos son frecuentemente clasificados de acuerdo a la presencia o ausencia en el medio de cultivo de otros organismos junto a la especie que se pretende cultivar. As, estas otras especies pueden convertirse en predador o presa de la nuestra de inters, competir con ella por el alimento, oxgeno u otras necesidades o simplemente contaminar su ambiente con dixido de carbono u otros elementos. El cultivo ideal es el axnico, es decir, el que no tiene ms especies presentes que la que se pretende cultivar y adems se encuentra libre de bacterias. Los organismos generalmente absorben nutrientes en solucin, y algunas veces, ingieren partculas inanimadas. Un cultivo axnico puede haberse realizado sobre un medio definido, cuya composicin qumica es perfectamente conocida. Para el cultivo de protozoos son comnmente utilizados los medios no definidos, de los cuales se desconoce su composicin qumica exacta al contener multitud de compuestos orgnicos e inorgnicos a concentraciones desconocidas, son ms sencillos de preparar y ofrecen buenos resultados a la hora de cultivar protozoos. Un ejemplo de medios de composicin no definida son los preparados con extractos de suelo, infusiones, granos de cereal, etc. En general, la obtencin de un medio axnico requiere de experiencia y tiempo, por lo que resulta ms prctico recurrir a un cultivo monoxnico (monoespecfico), en el que adems del organismo de inters a cultivar se encuentra otro, generalmente el que le sirve de alimento. Un cultivo polixnico es aquel que cuenta con diversas especies presentes y si sus identidades son desconocidas, recibe el nombre de agnotoxnico o agnotobiotico. Los ciliados generalmente se cultivan en cultivos polixnicos, frecuentemente agnotoxnicos. Por tanto, para el cultivo de un ciliado genrico, no es recomendable eliminar los flagelados u otros pequeos ciliados que puedan acompaarle en el medio, al menos hasta que no estemos seguros de no constituyen su alimento o de que ayudan a eliminar el exceso de bacerias en el cultivo. Si se pretende, por el contrario, experimentar sobre las preferencias alimenticias de una especie predadora, debern permanecer el medio slo aquellos organismos sobre los que se quiera estudiar su interaccin (p. ej, ciliado-flagelado, ciliado-microalga, ciliadobacteria, flagelado-microalga, flagelado-bacteria), eliminado aquellos que puedan interferir en el estudio.

Los cultivos en donde convive una especie que sirve de alimento a otra predadora, resultan complicados de mantener, ya que requiere tener la precaucin de controlar el crecimiento de la primera. Los cultivos, basados en las caractersticas de su crecimiento, pueden clasificarse dependiendo de la disponibilidad de los nutrientes a lo largo del tiempo. En los cultivos discontinuos los nutrientes son consumidos por los microorganismos y agotados con el tiempo, a la vez que son excretados al medio los metabolitos residuales resultantes de tal asimilacin. Ambos factores conllevan la desaparicin de la poblacin. Por el contrario, en los cultivos continuos, el medio de cultivo nuevo siempre es aadido, a la vez que los metabolitos residuales generados como consecuencia del metabolismo abandonan el medio. La concentracin de microorganismos es siempre constante. Finalmente, para el estudio de los protistas de vida libre, se utilizan con frecuencia los cultivos enriquecidos. Se basan en mantener en condiciones de crecimiento la muestra original a la que se ha aadido algn suplemento (sustancia), preferentemente para facilitar el crecimiento de las especies presentes. De estos cultivos enriquecidos pueden aislarse con posterioridad individuos de los que se persiga algn inters.

2. Recipientes de cultivos y esterilizacin Segn el propsito del cultivo debe planificarse el volumen de medio a preparar y los volmenes de trabajo para realizar los cultivos, la clase y nmero de recipientes que contendrn el medio y, adems, decidir si se va a trabajar en condiciones de esterilidad, aunque estas ltimas siempre son aconsejables. La esterilidad, tanto de los recipientes como de los medios de cultivo, asegura que stos permanezcan monoespecficos y evita la contaminacin bacteriana. Los recipientes que van a contener los medios de cultivos deben estar limpios, tapados y reservados del ambiente exterior en armarios. Deben mantenerse en frascos de cristal cierto nmero de pipetas pasteur esterilizadas, con un trocito de algodn en su extremo de mayor dimetro, ya que constituyen un utensilio que nos ser de utilidad para muchas tareas rutinarias (aislamiento de individuos, transferir volmenes, subcultivar, etc.). 3. Tipos de medios Existe una gran nmero de medios diseados para el cultivo de los protozoos (ciliados, flagelados, amebas) , y su eleccin, depender del fn al que vayan destinados (p. ej., simple mantenimiento de un cultivo, determinacin de la mxima tasa de crecimiento de una especie o cualquier otro propsito). Las recetas siguientes, a menos que se indique lo contrario, pueden utilizarse para el cultivo de un amplio espectro de microorganismos, como es el caso de los medios basados en agua mineral o los extractos de suelo e infusiones de plantas, los cuales permiten el crecimiento tanto de flagelados como de ciliados bactervoros (p. ej. Colpidium y Paramecium).

La idoneidad de un medio para cada tipo de protozoo se conoce mediante mltiples pruebas de ensayo y error. 3.1. Agua El agua de grifo y de lluvia han sido usadas tradicionalmente para el cultivo de protozoos, pero debido a su composicin variable (dureza, sustancias orgnicas e inorgnicas) es preferible utilizar agua mineral embotellada. Supone el medio ms sencillo y el aconsejable si los ciliados que pretendemos cultivar no tienen unos requerimientos nutricionales especficos. La marca Lanjarn suele dar buenos resultados para el cultivo de protozoos, y en general, todas aquellas aguas minerales que no estn muy carbonatadas. Aunque la composicn inica de esta agua es adecuada y equilibrada para el desarrollo de protozoos, stos no crecern a menos que sea aadida al medio una fuente alimenticia (bacterias en el caso de protozoos bactervoros), ya que por s mismo, el medio no posee un valor nutricional. Esto puede conseguirse de forma sencilla aadiendo un grano de arroz sin cscara (el que ms comnmente se comercializa) por cada 10 ml de medio (agua mineral) al recipiente donde se vaya a desarrollar el cultivo, horas antes de realizar el inculo, para permitir el desarrollo bacteriano.

3.2. Soluciones de sales inorgnicas Como suceda con el agua, estos medios no aportan una fuente de nutrientes para los protozoos, por lo que debern ser suplementados con una fuente de bacterias (u otro protozoo, segn las caractersticas del cultivo, como Tetrahymena o Colpidium). La siguiente formulacin est indicada para el cultivo de amebas grandes (Amoeba proteus): Solucin de Prescott y Carrier Preparar las siguientes dos soluciones, cada una en 1 l de agua destilada. Solucin de reserva (stock) A 0,2 g MgSO4 7 H20 0,5 g KCl 1,0 g CaCl2 1,0 g Na Cl Solucin de reserva (stock) B 0,36 g CaHPO4 El medio de cultivo se prepara aadiendo 10 ml de cada solucin A y B a 980 ml de agua destilada.

3.3 Infusiones Pueden prepararse a diferentes concentraciones y existen numerosas variaciones sobre ellas, debido, entre otros factores, a las diferentes composiciones cualitativas de los ingredientes con las que se confeccionan. Las infusiones, una vez preparadas, pueden distribuirse en otros recipientes con volmenes ms pequeos y autoclavarse independientemente para su uso posterior. Previamente a la inoculacin del medio con protozoos, y para facilitar el crecimiento de bacterias con las que aqullos puedan alimentarse, para las siguientes recetas es recomendable aadir al recipiente que los contiene, horas antes, 1 grano de arroz sin cscara por cada 10 ml de medio, como suceda en el caso del medio de cultivo constituido por agua mineral. Heno (u otro cereal) Hervir 10 g de heno en 1 l de agua de grifo durante 5 minutos y permitir sedimentar. Diluir el sobrenadante igualmente con agua de grifo en la relacin 1 parte de infusin : 4 partes de agua. Lechuga Desecar varias hojas de lechuga en una estufa para despus triturar con un molinillo elctrico. Aadir 2,5 g de polvo de lechuga a 1 l de agua de grifo, hervir durante 5 minutos y filtrar. Para prevenir la acidez como consecuencia del posterior crecimiento bacteriano, pueden aadirse 0,2 g de Na2HPO4 (anhidro). Licor de mezcla Aunque no es propiamente una infusin, filtrar una alcuota del licor para eliminar las bacterias presentes. Puede enriquecerse el medio y/o esterilizarse si se considera conveniente antes de la inoculacin. En este segundo caso, aadir igualmente arroz al medio.

3.4 Extractos de suelo Obtener una cantidad suficiente de suelo, preferible de jardn (evitar suelo forestal y aquellos con un exceso de arena o arcilla) y pasar a travs de una serie de tamices hasta obtener una fraccin de granulometra fina. Aadir 32 g de suelo a 330 ml de agua de grifo (o cantidades equivalentes para preparar un mayor volumen) y autoclavar el conjunto (otros mtodos recomiendan hervir la solucin durante varios das), dejando sedimentar durante una semana para luego utilizar el sobrenadante como medio de cultivo (no es necesario diluir). Corregir el pH.

Es necesario comprobar la evolucin de los cultivos la primera vez que se realiza el extracto y en caso de modestos resultados, deben corregirse las proporciones suelo-agua o diluir antes de cultivar.

3.5 Medios orgnicos Son utilizados preferentemente para cultivos axnicos y para individuos que pueden vivir osmotrficamente. Una vez que se ha inoculado el medio con protozoos es necesario prevenir el crecimiento bacteriano, ya que el desarrollo de esta poblacin impedira la supervivencia de los protozoos. Medio de proteosa peptona / levadura Disolver 20 g de proteosa peptona y 2,5 g de extracto de levadura en 1 l de agua destilada. Distribuir en recipientes de tal forma que sea fcil la aireacin del medio por agitacin y esterilizar posteriormente.

4. Aislamiento y cultivo La muestra silvestre u original contendr un gran nmero de especies de protozoos (ciliados, falgelados y amebas), por lo que el objetivo ser obtener un cultivo monoespecfico, es decir, aqul que contenga el individuo de inters y a su vez una fuente de alimentos, en este caso bacterias. A la hora de establecer por primera vez un cultivo, existen varias formas de realizar el aislamiento de la primera clula, y todas ellas, requieren de cierta experiencia. En necesario modificar la pipeta pasteur suministrada comercialmente haciendo un capilar en uno de sus extremos, contando para ello con la ayuda de un soplete de gas. La aspiracin de las clulas con el capilar se consigue con la ayuda de una tetina colocada en el extremo ms grueso de la pipeta. Los principales mtodos de aislamiento son los siguientes: 4.1. Con la ayuda de un capilar (micropipeta con extremo modificado) y un microscopio estereoscpico, transferir un individuo de la muestra de agua original (p.ej. licor de mezcla) al medio de cultivo preparado, el cual ha debido ser dispensado en un placa de petri de pequeo dimetro (4-5 cm). Suele ser difcil la primera vez aislar uno y slo un individuo. 4.2. Verter en una caja de petri (4-5 cm de dimetro) una capa de varios milmetros de aceite de silicona. Colocar sobre ella una microgota conteniendo el individuo aislado de la muestra original y a continuacin, aadir sobre ella una gota del medio cultivo nuevo. Con este mtodo se obtiene una alta concentracin de individuos en un pequeo volumen de medio, aunque ha de aadirse medio nuevo con regularidad, para evitar la sobrepoblacin y posterior desaparicin del cultivo por alta densidad de individuos. 4.3. El mtodo de la mayonesa consiste en agitar con la ayuda de un vrtex (agitador) una alcuota de muestra original que contiene los protozoos con otra de aceite de

silicona. El resultado es un conjunto de burbujas que contienen pequeas poblaciones de protozoos y bacterias, sobre las cuales es ms sencillo efectuar un aislamiento con el capilar fabricado. Debe transferirse posteriormente la pesca realizada a un medio nuevo. 4. Puede recurrirse, cuando existe un gran nmero de protozoos presentes, al mtodo de la dilucin. ste consiste en realizar un ensayo de diluciones seriadas hasta llegar a la dilucin que contenga un nmero de individuos (o el protozoos de inters) que sea capaz de facilitar su aislamiento. Es recomendable transferir las clulas del tubo/pocillo de dilucin al medio de cultivo, aunque puede considerarse que el/los individuo/s permanezca/n en el tubo/pocillo de dilcin. Tanto los cultivos como los subcultivos que sern mencionados posteriormente, deben mantenerse alejados de una fuente de luz directa (a excepcin de ciertos cultivos de individuos completamente fotoautotrfos). La temperatura es uno de los factores limitantes que afectan al crecimiento y supervivencia de los cultivos; es fcilmente cuantificable pero no lo es tanto su control. Para el caso de los protozoos de aguas residuales, los cultivos deben mantenerse a una temperatura similar a la de los licores de mezcla. Teniendo en cuenta esto, debe experimentarse sobre cul es el rango de temperatura ptimo para que los microorganismos alcancen la mayor tasa de crecimiento en el medio de cultivo. En el caso de que se conozca de antemano que durante un intervalo de tiempo no se van a realizar subcultivos por no disponerse de tiempo, pueden mantener stos a una temperatura algo inferior a la de crecimiento para reducir el metabolismo de los individuos y as su desarrollo.

5. Subcultivos Subcultivar es transferir un pequeo volumen de un cultivo existente (inculo) a un medio nuevo, semejante al que sirvi para aislar originalmente al individuo. La frecuencia con la que realizarlo depende de la tasa de crecimiento de las especies cultivadas, tanto de la que sirve de presa como de la que acta de predadora, y por tanto, es necesario la observacin al respecto. Generalmente una vez cada 10 15 das es suficiente para mantener el cultivo en condiciones ptimas. La relacin inculo:medio nuevo suele ser de 1:10 a 1:20, y siempre debemos asegurarnos que transferimos suficiente cantidad de protozoos, aspecto que deberemos comprobar al microscopio estereoscpico. En general, las tcnicas bsicas para el estudio de los protozoos en estaciones depuradoras, con fines taxonmicos, se completan con aquellas dedicadas a la preservacin (uso de fijadores) de individuos, recuentos de poblaciones y tinciones o impregnaciones que faciliten su identificacin.

6. Resultado de los cultivos Todos los individuos fueron aislados del reactor biolgico de una EDAR al sur de Londres, y posteriormente cultivados con medios apropiados en el laboratorio de protozoologa del The Natural History Museum (Londres). Los protocolos de tincin fueron del tipo estndar para SEM. A causa del fijador, los individuos exhiben una deformacin de su biometra original. Todos los cultivos se encontraban en fase exponencial de crecimiento. 1 Carchesium polypinum y un microconjugante. (x2300).

2.

Campanula sp. Aumento (x1160). Se observan las teselas de la superficie del zooide. Uno de los pedunculos ha quedado libre de zooide.

3.

Campanella umbellaria

4.

Estriaciones y poros en la superficie de Campanella umbellaria

5.

Idem 4. Anormalidad en la estriacin. Posible estratega fisiolgica de ensanchamiento del zooide.

6.

Epistylis sp. (x 1620)

8.

Colonia formada por ciliados petricos y nadadores

Lecturas adicionales recomendadas

Prigsheim, E.G. 1946. Pure cultures of algae. Cambridge. Cambridge University Press. Dragesco, J. y Dragesco-Kernis, A. 1986. Cilis libres de lAfrique Intertropicale. Introduction la Connaissance et ltude des Cilis. Orstom, Paris. Collection Faune Tropicale n 26. Finlay, B.J., et al. 1988. A beginners guide to the collection, isolation, cultivation and identification of freshwater protozoa. Natural Environment Research Council. Culture Collection of Algae and Protozoa. Ambleside. Unite Kingdom. Kemp, P.F. et al. 1993. Handbook of methods in acuatic microbial ecology. Lewis Publishers, Boca Raton, Ann Arbor, London y Tokyo.