Sei sulla pagina 1di 33

SENESCENZA

APOPTOSI

MITOSI
TRASFORMAZIONE

DIFFERENZIAMENTO
STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA:

Permette di determinare le differenze qualitative e quantitative


dei geni espressi in un tipo cellulare in un dato momento

RNAm

E’ nota la natura dei geni NON è nota la natura dei geni


che si vogliono studiare che si vogliono studiare

.
PCR REAL-TIME . VISUALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DI RNAm

.
MICROCHIP A DNA . LA SAGE
La RT-PCR REAL TIME

Permette di analizzare l’espressione di pochi geni noti: necessita di primers specifici


per l’amplificazione del cDNA corrispondente

RT-PCR
+
RNA
FASE ESPONENZIALE: ciascun prodotto di amplificazione raddoppia esattamente ad ogni ciclo di amplificazione
FASE LINEARE (alta variabilità): i componenti della reazione sono stati consumati, la reazione sta rallentando
ed i prodotti si stanno degradando
FASE DI PLATEAU: la reazione si è fermata, non si creano più prodotti e se si attende troppo, essi si degradano
La reazione di amplificazione viene
monitorata attraverso l’emissione
di fluorescenza

Una fibra ottica rileva la


fluorescenza via via che la
reazione procede

In che modo si produce la fluorescenza durante la reazione?


1) La FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)

1) Si aggiunge alla miscela di reazione 2) La DNA-polimerasi rimuove le basi


un oligonucleotide che ha un emettitore (attività 5’-esonucleasica)
di fluorescenza a bassa energia in
vicinanza di un emettitore a forte
energia :trasferimento di energia
all’emettitore debole

3) La digestione separa i due emettitori:


cambio di fluorescenza
Il SYBR GREEN

Scarsa fluorescenza
I MICROCHIP A DNA

Permettono di monitorare l’espressione di decine di migliaia di geni, purchè noti

Microchip di cDNA
Microchip di oligo-dNTP
Marcatura dell’RNAm

Permette di fare trascrizione


in vitro
Si possono marcare gli RNAm da cellule diverse con diverse fluorescenze
QUANTIFICAZIONE DELL’ESPRESSIONE

Per valutare la specificità di segnale le sonde vengono sintetizzate come:

-PERFECT MATCH (sequenza completamente omologa) segnale SPECIFICO + RUMORE


-MISMATCH (sequenza con una mutazione) RUMORE
Segnale specifico= PERFECT MATCH - MISMATCH

-Come controllo QUANTITATIVO si ibridano delle sonde con RNAm aggiunti in quantità
nota:
STANDARD DI RIFERIMENTO
INTERPRETAZIONE DEI DATI
software

1 2

posizione della sonda correlazione tra posizione


e intensità della sonda sul microchip
ed identità dell’RNAm che
ad essa si lega
LA VISUALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DI RNAm

Permette di individuare geni espressi in maniera differenziale, di cui la


natura può anche NON essere nota

RNAm espressi durante


lo sviluppo embrionale
del cuore del ratto
(gg. 10, 11, 12, 16)
Restringe il numero
di RNAm retrotrascritti
(1/4)

(si ottengono TAG di


diversa lunghezza)

La TAG può essere


recuperata ed usata
come sonda per lo
screening di una
library o clonata
in un vettore e
Marcatura delle TAG
sequenziata

autoradiografia
La SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

Dr.Victor E. Velculescu

Permette una rapida, dettagliata analisi quantitativa, qualitativa e


simultanea di migliaia di trascritti, anche NON noti
Principi su cui si basa la SAGE:

1) Una TAG di circa 9-10 bp contenuta in una posizione definita di un


trascritto contiene sufficiente informazione per identificarlo in
maniera univoca.

49 = 262.144geni trascritti ≈ 20-25.000 (conto attuale: media/gene 2700bp; 411)

2) La concatenazione di tali TAGs permette l’efficiente analisi seriale


di trascritti, mediante il sequenziamento di TAGs multiple concatenate
all’interno di un singolo clone

Requisiti necessari:

Informazioni sull’ORIENTAMENTO e sui CONFINI tra TAGs adiacenti


Estrazione dell’RNA totale

Purificazione dell’RNAm

. Sintesi del cDNA con un oligo-dT biotinilato

BIOTINA
(vit. H)

.L’AE (enzima di ancoraggio) NlaIII


taglia nella sequenza 5'-GTAC, lasciando
4 basi sporgenti in 3’
Sferette coperte di
Taglia ogni 44 basi STREPTAVIDINA
(Streptomyces avidinii)

3’

. I frammenti biotinilati vengono isolati con


sferette coperte di streptavidina
Il campione viene diviso
in due provette e ciascuna
aliquota viene legata al linker
A o B grazie alla codina di
GTAC

I LINKERS sono costituiti da:


- sito unico di legame a un primer
per PCR (A e B)
-sito di riconoscimento 5’-GGGAC
per uno stesso enzina TE (Tagging
Enzyme) (BmsFI)
-estremità sticky complementari
a GTAC
. Taglio con BmsFI (TE)

BmsF1 appartiene agli enzimi di restrizione del tipo IIS: riconoscono


un sito di riconoscimento asimmetrico, ma tagliano fino a 20 bp di
distanza da esso: nel caso di BmsF1 vengono mantenute legate al
linker delle TAG di ciascun cDNA di 9 bp
.I campioni delle due provette
vengono riuniti e sottoposti a
ligazione

.Mediante amplificazione per PCR


utilizzando come primers A e
B si ottiene l’amplificazione solo
delle Ditags orientate testa/testa

Le Ditag vengono tagliate con l’EA e, grazie alle estremità stricky generate,
vengono concatenate. Centinaia di Ditag concatenate vengono clonate in un
vettore e sottoposte a sequenziamento in un unico round
Un software analizza la sequenza ottenuta: è
possibile attribuire la sequenza ad ogni Tag,
dato che si conosce la punteggiatura tra Ditag
(sito AE) e l’orientamento delle singole Tag nelle
Ditag (testa/testa). La sequenza della Tag può
essere utilizzata per determinare l’RNAm da cui
è stata estratta (banca dati o screening di
library) (informazione QUALITATIVA). La
frequenza con la quale una stessa Tag ricorre ci
dice QUANTO un gene è espresso.
Inizialmente nata per accelerare il
Sequenziamento delle EST nella prima
Fase del Progetto Genoma Umano,
Ora la SAGE viene utilizzata per
determinare le variazioni dell’espressione
genica indotte dall’innesco di programmi
biologici diversi

CAPITO ORA
PERCHE’?
La TRANSGENESI ANIMALE

-Bioreattori animali Studio della funzione biologica di un


gene: il modello del topo transgenico
-Animali con caratteristiche
più vantaggiose

Cervo catarifrangente
La ghiandola mammaria come bioreattore

-Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore


-può produrre fino a 10g/l di proteina transgenica
-è più economico dei comuni fermentatori
-produce corrette modificazioni post-traduzionali
-nel latte ci sono poche proteine (agevola la purificazione)
-si recuperano nel latte anche proteine di membrana
Per ottenere l’espressione
Del transgene solo nella
Ghiandola mammaria, Vi si
clona a monte il promotore
Di un gene che è espresso
Selettivamente in quel tessuto
(es: caseina, beta-lactoglobulina)

Se si induce l’espressione
dell’enzima lactasi, si ottiene
latte a basso tenore di lattosio
Un modello sperimentale importante:
IL TOPO TRANSGENICO

-Regolazione genica -Fattibilità della produzione industriale


-Sviluppo dei tumori di farmaci destinati all’uomo
-Sviluppo della specificità immunitaria -Modelli biomedici per lo studio di malattie
-Genetica molecolare dello sviluppo Genetiche dell’uomo
-Ecc…

.METODO DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA .METODO DELLE CELLULE STAMINALI


EMBRIONALI MANIPOLATE
.METODO DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA

Induzione di superovulazione:

Siero di cavalla gravida

48 ore

Gonadotropina corionica umana

Accoppiamento con un
Maschio vasectomizzato

Meno del 5% della


prole è transgenica
.METODO DELLE CELLULE STAMINALI
Topini neri EMBRIONALI (ES) MANIPOLATE
Si pilota l’integrazione di un transgene in
un sito cromosomico definito con la metodica
della
SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA:

1) Arricchimento in ES ricombinanti

2) Selezione di ES in cui è andato a buon fine


il gene targeting
Selezione di cellule
con giusto gene
targeting

Si usano due farmaci: G418 + ganciclovir

GANCICLOVIR (Gcv)= analogo nucleosidico antierpetico

HSV-tk Mamm-tk

Gcv Gcv-P Gcv-PPP

Incorporazione nel DNA

Terminazione della catena


e rotture nel DNA
tk1/tk2: HSV-tk

HB1/HB2: box di
omologia
con il sito di
integrazione
nel cromosoma A) Almeno un HSV-tk viene integrato nel genoma:
col ganciclovir le cellule muoiono
Neor: resistenza
al G418 B) Nessun HSV-tk viene integrato nel genoma:
le cellule sopravvivono
TG: transgene

Prima di procedere alla iniezione nella blastocisti si verifica la corretta


Integrazione nel cromosoma mediante PCR

P1: primer che ibrida in un Segmanto Esclusivo (US) del DNA del vettore
P2: primer che ibrida in una regione del cromosoma (CS) adiacente al sito
di ricombinazione omologa
Blastocisti accettrice
di topini bianchi

Determinazione del
Transgenico “fondatore”

Per ottenere un topo


transgenico omozigote è
sufficiente incrociare due
fondatori

transgene
ALCUNE APPLICAZIONI PARTICOLARI DEI TRANSGENI

. L’espressione di un transgene può essere indirizzata in tessuti specificicon i PROMOTORI


TESSUTO-SPECIFICI

T ag (antigene T): inattiva p53 e RB


Il transgene è soggetto alle stesse vie
L’espressione selettiva negli isolotti regolative del gene endogeno regolato
di Langerhans provoca l’insorgenza da quel promotore specifico
di tumori al pancreas

.I transgeni come KILLERS di tipi cellulari specifici: Promotore cellulo-specifico/gene


killer (es. HSV-tk)