UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

DISCIPLINA MICROBIOLOGIA GERAL

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

NORMAS PARA OS TRABALHOS NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

O avental ( ou jaleco ) de uso obrigatrio. No ser permitida a entrada do aluno no laboratrio em horrio de aula ou fora dela sem o mesmo. O laboratrio deve ser um recinto calmo, os alunos devem evitar conversar e sair de seus lugares desnecessariamente. Em caso de algum acidente, comunicar imediatamente ao professor. No caso de quebra, durante a manipulao com tubos ou placas contendo meios contaminados, no remover os fragmentos quebrados, deixando-os no local. Na ausncia do professor, verter sobre estes formol, avisando o professor ou monitor o horrio do acontecido para aps transcorrido o tempo necessrio para que o formol mate os microrganismos, o material seja removido e o local devidamente limpo. Sempre lavar as mos com gua e sabo antes e aps terminar o trabalho prtico. No fumar, no comer e nem levar boca qualquer objeto. No laboratrio de microbiologia trabalha-se com microrganismos potencialmente patognicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma possvel contaminao ( a boca porta de entrada para muitas infeces ). Na bancada de trabalho no deve haver acmulo de objetos, nela permanecendo apenas os indispensveis para o experimento em execuo, alm do roteiro e caneta ou lpis para as devidas anotaes. Todo material do aluno dever ficar nas estantes que se encontram nos laboratrios. Durante os trabalhos, manter o bico de gs aceso somente quando necessrio. As alas e agulhas de platina, pinas, estiletes, cotonetes, tubos contendo os meios de cultura, reagentes e corantes, etc., devem ser colocados nos suportes apropriados e no abandonados sobre a bancada de trabalho. As pipetas usadas, lminas e lamnulas (quando for o caso), etc., devem ser colocados em recipientes apropriados contendo soluo desinfetante ou detergente. Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo as placas de Petri e os tubos de ensaio contendo meios de cultura ou solues, devero ser devidamente identificados para observaes posteriores. (Estes devem conter: disciplina, data, curso, equipe, microrganismo ou material utilizado) Antes de qualquer observao microscpica, devem ser verificadas as condies em que se encontra o microscpio. Aps o uso do microscpio, desligar a lmpada, retirar a lmina usada e quando for o caso, dispens-la na cuba apropriada. Limpar as objetivas com algodo embebido em xilol ou benzina e depois com um algodo seco ou flanela. Terminado o trabalho prtico, deixar a bancada em ordem. O material contaminado nunca deve ser colocado na bancada, pia ou lixo. Deve voltar ao recipiente de onde foi tirado para ser esterilizado. OBS: Cada aula prtica dever iniciar-se com uma explicao e um perodo de demonstrao. O trabalho no deve ser iniciado pelo aluno, at que haja recebido todas as instrues necessrias. Os alunos devero adquirir para seu uso individual o seguinte material, que dever acompanh-lo impreterivelmente em todas as aulas prticas: Isqueiro ou caixa de fsforos. Caneta para retroprojetor azul ou preta ( para identificao do material ). Pina inoxidvel.

INTRODUO AO CURSO PRTICO DE MICROBIOLOGIA

Na natureza os microrganismos encontram-se formando populaes mistas (vrios tipos de microrganismos que pertencem a um mesmo habitat). Por outro lado, o desenvolvimento da microbiologia assim como todos os procedimentos laboratoriais para o diagnstico, dependem da obteno do crescimento dos microrganismos na forma de populaes puras , que quando crescidas em meios de cultura denominamse culturas puras ou axnicas ( populaes homogneas quanto ao tipo de microrganismo, cultivados em meios de cultura sem a presena de outras formas de vida contaminantes ). A obteno de uma cultura pura a partir de uma cultura mista denomina-se isolamento, conseguido atravs da semeadura dos microrganismos na superfcie de meios de cultura slidos em placas de Petri, o que permitir a formao de colnias ( que so populaes isoladas que crescem na superfcie destes meios). Como todos os seres vivos, os microrganismos necessitam de nutrientes apropriados ao seu desenvolvimento, assim como condies fsicas ou ambientais favorveis. Quando cultivados em laboratrio, estas necessidades devem ser respeitadas. O meio de cultura, portanto, deve conter: nutrientes em concentraes adequados ao crescimento do microrganismo que desejamos cultivar, alm das condies ambientais requeridas como: pH ideal, adequado ao seu crescimento, aerao, umidade, presso osmtica, temperatura, etc. Os meios de cultura so utilizados em trs diferentes tipos de consistncia: sob a forma lquida (denominados de meios lquidos ou caldos), slida (denominados de meios slidos ou solidificados, obtidos pela adio de agar-agar ao meio) e eventualmente semi-slida (denominados de meios semi-slidos, obtidos pela adio de pequena quantidade de agar-agar ao meio ). Conforme j dito, o estudo dos microrganismos (fungos e bactrias) , depende da obteno de uma grande quantidade de microrganismos idnticos ( cultura pura ), que so obtidos em laboratrio atravs do isolamento a partir de uma populao mista. Para isto devemos preparar meios de cultura estreis e conserv-los em condies estreis (desprovidos de qualquer forma de vida). Ao introduzimos no meio estril o inculo (quando estaremos semeando, inoculando), teremos o cuidado tcnico necessrio para que no haja contaminao externa (ambiental). Este procedimento denomina-se tcnica assptica. Depois de inoculado, o meio de cultura contendo os microrganismos incubado (colocado para crescer) em local apropriado e se for o caso, em local cuja temperatura seja controlada ( por exemplo : a estufa ). O crescimento significar o desenvolvimento de uma populao a partir de uma ou algumas clulas. Este poder ser evidenciado a olho n, sob a forma de turvao (em meio lquido ) ou formao de colnias quando em meio slido.

PRINCPIOS BSICOS DE MICROSCOPIA PTICA

Constituio Do M.O.C. Atualmente, o microscpio ptico composto (M.O.C.) constitudo por duas partes uma parte mecnica e uma parte ptica. Cada parte engloba uma srie de componentes constituintes do microscpio (fig. 1).

Ocular

Tubo Revlver Objetiva

Coluna Platina Diafragma Condensador Fonte de luz P

Parafuso Micromtrico

Parafuso Macromtrico

A parte mecnica serve para dar estabilidade e suportar a parte ptica. Esta parte constituda por: P ou Base suporta o microscpio, assegurando a sua estabilidade. Brao ou Coluna pea fixa base, na qual esto aplicadas todas as outras partes constituintes do microscpio. Tubo ou Canho cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revlver com objectivas. Platina pea circular, quadrada ou retangular, paralela base, onde se coloca a preparao a observar, possuindo no centro um orifcio circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador.

Parafuso Macromtrico engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocao a da platina. indispensvel para fazer a focagem. Parafuso Micromtrico imprime ao tubo ou platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscpio. Revlver disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliaes: por rotao possvel trocar rpida e comodamente de objectiva. A parte ptica constituda por: Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas o conjunto de lentes que permitem a ampliao do objeto. A ampliao dada ao microscpio igual ao produto da ampliao da objetiva pela ampliao da ocular. Fonte Luminosa existem vrios tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lmpada (iluminao artificial), ou um espelho que reflita a luz solar (iluminao natural). Condensador distribui regularmente, no campo visual do microscpio, a luz refletida pelo espelho. Diafragma regula a intensidade luminosa no campo visual do microscpio. Devido a estes componentes serem de alta preciso e porque o microscpio um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilizao e manuteno. Posio do Observador - O observador deve estar sentado. - Se o M.O.C. possuir uma ocular, deve olhar por ela com o olho esquerdo, mantendo os dois olhos abertos. Se o M.O.C. tiver duas oculares, deve olhar por ambas. - Os parafusos de comando devem ser manuseados com a mo esquerda, deixando a mo direita livre para desenhar as observaes. Focalizao - Colocar a ocular desejada; - Acender a fonte de luz acoplada;

- Posicionar o condensador o mais prximo possvel da platina; - Verificar se o diafragma est completamente aberto; - Colocar em foco a objetiva de menor aumento; - Fixar a lmina preparada para observao na platina, atravs das presilhas; - Observar o campo microscpico; - Ajustar o foco utilizando o parafuso macromtrico. - Para maior aumento trocar as objetivas e ajustando o foco com o parafuso macromtrico e se necessrio o micromtrico; - Para observar a lmina corada com a objetiva de imerso, colocar uma gota de leo de cedro sobre a rea corada da lmina; - Girar o revolver colocando a objetiva de imerso (maior aumento) em foco; - Olhando pelo lado, descer o canho (ou subir a mesa de platina) utilizando o parafuso macromtrico at que a lente da objetiva de imerso encoste no leo de cedro. NUNCA focalizar a imagem pela objetiva de imerso olhando pela ocular e sim sempre pelo lado; - Olhando pela ocular, girar o parafuso macromtrico LENTAMENTE, at conseguir focalizar de formar grosseira a preparao; - Mover o parafuso micromtrico at conseguir uma focalizao ideal; - Para mudar o campo microscpico a ser observado, mover o charriot ;

Cuidados a ter com o M.O.C. - Deve-se pegar no M.O.C. pelo brao, com a mo direita, enquanto se suporta a base com a mo esquerda; - No se deve tocar no sistema ptico com os dedos; - A lente das objetivas no deve tocar na lamela; - O M.O.C. deve estar completamente pousado numa mesa desocupado, e afastado da borda da mesa.

Material Necessrio Lminas coradas pelo mtodo de Gram com as seguintes bactrias: A) Staphylococcus sp B) Streptococcus sp C) Escherichia coli D) Bacillus sp Microscpio ptico leo de imerso (cedro) Papel absorvente, limpar lentes aps o uso Objetivos da aula A) Conhecer o microscpio ptico e suas partes B) Manusear o microscpio ptico com os devidos cuidados C) Observar morfologia bacteriana utilizando o microscpio optico A) B)

C)

D)

B) COLORAO DE BACTRIAS
As bactrias podem ser observadas de duas maneiras: com e sem colorao. 1- Sem colorao: os microrganismos so observados vivos, podendo ser evidenciada a motilidade. 2- Com colorao: os microrganismos so corados aps serem mortos. Apesar de quimicamente distintas do meio que as rodeiam, as bactrias so quase incolores no apresentando contraste suficiente com o meio em que se encontram, o que dificulta sua visualizao. A diferena qumica entre as bactrias e o meio que nos permite distingu-las por meio de colorao, pois o corante no reage com o meio externo, tornando-as quando coradas, mais visveis ao microscpio. Desta maneira poderemos observar suas formas fundamentais, dimenses e arranjos. A colorao apresenta ainda outras vantagens, pois com a utilizao da objetiva de imerso teremos uma maior amplificao da imagem, alm de nos permitir o estudo de estruturas da clula bacteriana como: parede celular, endosporos, flagelos e cpsula. As bactrias coram-se com os derivados de anilina (azul de metileno, fucsina,cristal, violeta, etc..) que so corantes bsicos ( on colorido = ction ) e que possuem afinidade pelo citoplasma destas clulas. Esta afinidade se deve ao fato do citoplasma bacteriano apresentar carga eltrica negativa, derivada, principalmente, dos radicais fosfatos dos cidos nuclicos que a se encontram. So dois os processos que nos permitem corar as bactrias: COLORAO SIMPLES: Nesta colorao utilizamos apenas um corante e ela baseia-se na diferena qumica existente entre as bactrias e o meio. Uma vez coradas, apresentam contraste, podendo ser melhor visualizadas. COLORAO DIFERENCIAL: Nesta colorao utilizamos geralmente 2 corantes, alm do mordente e do diferenciador. Baseia-se na diferena qumica existente entre as bactrias e consequentemente na reao diferente que as bactrias podem apresentar frente a um determinado corante. utilizada para distinguir diferentes tipos de bactrias. Os mtodos de Gram (1884) e de Ziehl-Neelsen (1882) so exemplos de colorao diferencial.

PREPARAO DO ESFREGAO E FIXAO DA AMOSTRA PARA COLORAO: Marcar com lpis dermogrfico o lado da lmina onde realizaremos o esfregao e colocar sobre ela o material contendo os microrganismos. Estes podero ser provenientes de: gua, solo, alimentos,

medicamentos, leso, sangue, urina, lquor, fezes, escarro, secreo uretral, etc. No caso do material ser obtido a partir de meio de cultura slido ou de outro que contenha microrganismos em excesso, deve-se dilu-

lo com uma gota de gua destilada ou salina estril (colocada anteriormente sobre a lmina com auxlio de uma ala de platina estril) at obter-se uma leve opalescncia. Espalhar com movimentos circulares at formar uma fina camada sobre a lmina. Deixar a lmina secar ao ar, em repouso. A secagem ao ar evita a formao de aerossis que acontecem quando fixamos a lmina antes que a mesma esteja seca. Os

aerossis se constituem de fonte de contaminao, pois nestes esto contidos os microrganismos presentes no material. Aps seca, a lmina dever ser fixada, antes de iniciarmos o processo de colorao. A fixao evita que as clulas dos microrganismos sejam lavadas e perdidas durante o processo de colorao. Alm disto, a fixao permite a aderncia das clulas lmina, matando os microrganismos atravs da coagulao seus protoplasmas, preservando suas estruturas na forma e posio originais. O calor o mtodo de fixao freqentemente utilizado. Para fixarmos, passamos a lmina com o esfregao voltado para cima, por trs vezes atravs da chama. Evitar o super aquecimento testando a cada passada a temperatura da lmina no dorso da mo.

COLORAO PELO MTODO DE GRAM

o mtodo de colorao mais empregado em bacteriologia. Importncia do mtodo: . separa as bactrias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS (G+/GP) e GRAM NEGATIVAS (G- /GN); . taxonomia ( identificao, classificao e nomenclatura, sendo o primeiro passo no processo de identificao); . possibilita o diagnstico presuntivo (preliminar), principalmente em casos de infeces graves e de evoluo fatal quando o mdico necessita introduzir uma teraputica, antes mesmo da identificao do microrganismo causador da infeco ; . permite evidenciarmos a contaminao a partir de diferentes materiais. SOLUES EMPREGADAS: 1- CRISTAL VIOLETA - funo: corante principal ( cora igualmente todas as bactrias ) 2- LUGOL ( soluo de iodo-iodeto de potssio) - funo: mordente. O mordente tem a finalidade de aumentar a afinidade do corante pela clula, permitindo que ela se core mais intensamente. 3- LCOOL ETLICO - funo: agente descorante e diferenciador. Sua utilizao permite que algumas clulas se descorem mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de descolorao que diferencia as bactrias. 4-- FUCSINA DILUDA - funo: corante de contraste, corante secundrio ou contracorante. o corante que d s clulas descoradas uma cor diferente daquelas que mantm a cor do corante principal.

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Os microrganismos que no se descoram facilmente retm a cor do corante principal ( cristal violeta ) enquanto que aqueles que se descoram facilmente podero ser visualizados, pois corar-se-o com o corante de contraste ( fucsina. ). TCNICA: 1- Cobrir o esfregao j fixado com soluo de Cristal Violeta por um (1) minuto. 2-Escorrer o cristal violeta, lavar em fio dgua e cobrir o esfregao com Lugol por um (1) minuto. 3-Escorrer o lugol, lavar em fio dgua . 4- Descorar rapidamente com lcool Etlico ( +/- 20 segundos) 5-Interromper o processo de descoramento lavando o esfregao com fio d gua. 6-Cobrir o esfregao com Fucsina diluda por 30 segundos. 7-Lavar e secar com papel filtro, pressionando o esfregao cuidadosamente. 8-Colocar uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e observar ao microscpio, utilizando a objetiva de imerso. RESULTADO: Bactrias coradas em roxo ( cor do cristal violeta ) - GRAM POSITIVAS Bactrias coradas em vermelho ( cor da fucsina ) - GRAM NEGATIVAS FUNDAMENTO DA TCNICA DE GRAM: Muitas explicaes j foram sugeridas na tentativa de elucidar o mecanismo da reao de Gram. As mais plausveis dizem respeito diferena na estrutura qumica da parede celular. Num primeiro momento, todas as bactrias ( G+ e G- ) absorvem igualmente o cristal violeta ( corante bsico que possui afinidade pelos seus citoplasmas, devido a carga eltrica negativa oriunda principalmente dos radicais fosfatos dos cidos nuclicos ). A seguir, o lugol reage com o cristal violeta formando o complexo iodo-pararosanilina, que se fixa e cora a clula mais intensamente. Posteriormente, quando tratamos o esfregao com lcool, as bactrias se comportam de maneira diferente: -1) as Gram-positivas no se descoram facilmente pelo tratamento com o lcool. Isto se explica pelo fato de comporem sua parede celular uma espessa camada de peptideoglicano, alm de outros possveis componentes, como: c. teicicos, protenas. polissacrides e etc., substncias estas, no solveis em lcool. O lcool atua desidratando as vrias camadas desta parede, o que traz como conseqncia uma diminuio na sua porosidade e esta diminuio reduziria a permeabilidade da parede, dificultando a extrao (sada) do complexo CV-I ( que se encontra no citoplasma ) de dentro da clula. Alm disto, parece haver uma reteno do CV-I na parede aps a ao do lcool, o que tambm contribuiria para a diminuio de sua porosidade. A bactria Gram-positiva permanece ento com a mesma colorao at o final. -2) as bactrias Gram-negativas so descoradas pelo tratamento com o lcool. Tal fato se explica por comporem a parede destas bactrias: delgada camada de peptideoglicano (menor entrecruzamento, o que no suficiente para impedir a passagem do solvente ) alm de substncias ricas em lpides (lipoproteina de apoio, fosfolpides da membrana externa e lipdio A que participa do LPS). O lcool solubiliza (dissolve) estes lpideos (muitas vezes extraindo a camada da membrana externa), aumentando a porosidade da parede, o que contribuiria para um aumento da permeabilidade. Assim sendo, o lcool penetra dentro da clula (atravessando a membrana citoplasmtica), removendo o complexo CV-I, descorando a clula. Finalmente as bactrias descoradas pelo lcool, por no apresentarem contraste que permita sua visualizao, seriam coradas pelo corante secundrio que a fucsina. As clulas que no foram descoradas pelo lcool (e tiveram sua permeabilidade diminuda) permaneceriam coradas com a cor do corante principal at o final da colorao, pois no absorveriam a fucsina.

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CONTROLE DAS POPULAES MICROBIANAS

IMPORTNCIA : a)Prevenir transmisso de doenas. b)Prevenir a contaminao ou crescimento de microrganismos nocivos. c)Prevenir a deteriorao e danos de materiais pelos microrganismos. OBJETIVOS: remoo, inibio ou morte dos microrganismos atravs da ao de agentes fsicos e qumicos. OS AGENTES FSICOS E QUMICOS PODEM PROMOVER: Esterilizao: destruio de todas as formas de vida (clulas vegetativas e esporos ). Desinfeco: destruio das formas vegetativas dos microrganismos (patognicos e incuos), mas no necessariamente das formas esporuladas. Geralmente refere-se a substncias qumicas ( desinfetantes ) aplicadas sobre objetos inanimados. Anti-sepsia: processo permite a remoo de parte dos microrganismos presentes em tecidos vivos. Associado a substncias qumicas ( anti-spticos ) aplicadas sobre estes tecidos. Esporocida: agente fsico ou qumico que mata as formas esporuladas dos microrganismos. Assepsia: conjunto de tcnicas utilizados para impedir a penetrao de germes em locais que no os contenha. CONDIES QUE AFETAM A AO ANTIMICROBIANA DOS AGENTES FSICOS E QUMICOS 1. Relacionadas ao microrganismo: - tipo: forma vegetativa (mais susceptvel), forma esporulada (mais resistente). - estado fisiolgico das clulas: clulas jovens (mais susceptveis), clulas velhas ( mais resistentes, que por poderem apresentar alteraes fisiolgicas e/ou estruturais, tornam-se mais resistentes ). - n de microrganismos: quanto maior o nmero de microrganismos presentes num material, maior a chance de haver sobreviventes e formas resistentes. 2. Relacionadas ao ambiente ou material onde se encontram os microrganismos: - pH: o calor mais eficiente em pH cido. - temperatura: quanto maior, maior a probabilidade de eliminao. - presena de compostos orgnicos: protegem os microrganismos, diminuindo a ao de alguns agentes qumicos. - consistncia do material: aquoso (maior penetrao), viscoso, denso (menor penetrao) 3. Tempo: os processos no so instantneos.

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AGENTES FSICOS UTILIZADOS NO CONTROLE DOS MICRORGANISMOS

CALOR:

a) Calor Seco:
1- Forno de Pasteur (forno de ar quente): ao esterilizante (causa a morte por promover: a oxidao das protenas que constituem o microrganismo). - Condies de esterilizao: de 150 a 170 C, de 1 a 2 horas - Utilizao: esterilizao de substncias imiscveis em gua (como ps, leos etc.), instrumentos cortantes (tesouras, bisturis, agulhas hipodrmicas e etc.) e vidrarias limpas e secas (placas de Petri, seringas de vidro, pipetas, bales, tubos de ensaio). 2- Incinerao: ao esterilizante. Leva carbonizao do material e dos microrganismos. - Para descartveis: animais usados em experimentos e produtos contaminados (cotonetes, curativos e ataduras contaminados, seringas plsticas contaminadas e etc.). 3- Flambagem: ao esterilizante: carbonizao do microrganismo. - O material submetido a ao direta da chama. - Condies de esterilizao: 200 a 300C, por poucos segundos. - Uso: apenas na rotina microbiolgica (alas e agulhas de platina, estiletes, bocas dos tubos).

b) Calor mido:
1- Autoclavao: realizada em autoclaves (aparelhos que utilizam vapor saturado sob presso). Ao esterilizante. Causa a morte por promover a desnaturao das protenas que constituem os microrganismos. - Condies para esterilizao: 121 C por 15 a 30 minutos a 1 atmosfera a mais de presso. - Substncias miscveis com gua (meios de cultura, soluo salina, gua, etc.), cotonetes, luvas de ltex (cirrgica), sondas, cateteres, gaze, rouparia, material contaminado, etc. OBS: utilizada apenas em materiais que no se alteram com a temperatura. 2- Ebulio: gua temperatura de 100C por um tempo de 30 minutos. Causa desnaturao protica, eliminando apenas formas vegetativas. 3- Pasteurizao: processo utilizado para alimentos. Elimina apenas microrganismos patognicos: Salmonella typhi, Brucella abortus e etc. - Condies: 63C por 30 minutos ou 72C por 15 segundos, seguido de resfriamento rpido (leite e vinho). UHT: leite aquecido a 74C, em seguida aquecido a 140C (5 segundos) e resfriamento imediato.

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4- Vapor Fluente Fracionado - Tyndalizao : submeter ao vapor fluente contnuo por 3 vezes, com intervalo de 12 a 18 horas aps cada execuo, tomando-se o cuidado de no abrir o recipiente onde est acondicionado o material. Elimina formas vegetativas e esporuladas. Causa a morte por promover a desnaturao de protenas dos microrganismos. - Uso: solues (vitaminas, carboidratos) e materiais que no suportam temperaturas acima de 100C.

c) Radiaes: o tempo e a intensidade das radiaes depende do material a ser esterilizado.

1- Radiaes No Ionizantes - raios Ultra-Violeta: baixo poder de penetrao: longo (carreia menos energia). Utilizado apenas em superfcies. Causam danos ao DNA levando a formao de dmeros de pirimidina (mutao). - Utilizado: eliminao de microrganismos em superfcies. 2- Radiaes Ionizantes - raios X e raios Gama : alta penetrabilidade. curto (muita energia). Promovem a excitao de eltrons, formando radicais altamente reativos (OH-, H+, H2O2 ). - Esterilizao de fios de sutura, material biolgico (soros, antibiticos e vacinas) que no podem ser submetidos ao do calor.

d) Microondas: muito empregado em laboratrios. As radiaes emitidas no afetam diretamente os

microrganismos, mas geram calor, que o responsvel pela morte dos microrganismos. Ainda no existem trabalhos mostrando tempo e potncia.

e) Filtrao: fazem desinfeco e no esterilizao. Apresentam poros de diferentes dimetros.

Ex.: Membranas Filtrantes - Millipore: ster de celulose (remove bactrias e alguns vrus)

AGENTES QUMICOS UTILIZADOS NO CONTROLE DOS MICRORGANISMOS.

a) lcoois: anti-spticos ou desinfetantes. Atua sobre formas vegetativas promovendo a desnaturao de

protenas. mais eficiente 70%, pois as protenas celulares so mais facilmente desnaturadas na presena da gua.

b) Aldedos e derivados: atua alquilando grupamentos funcionais das protenas como aminas,
carboxilas e hidroxilas, formando hidroximetilderivados inativos. Mais empregados: aldedo frmico (concentrao: 3 - 8%) e aldedo glutrico a 2%.

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c) Fenis e derivados: Atua sobre protenas a uma concentrao de 0.2 a 1%. Bastante txico.
Mais empregados: cresis (metacresol um dos ismeros mais ativos). A creolina (mistura de cresis) utilizada na desinfeco de pisos, vasos sanitrios, excrementos, etc.

d) Halognios e derivados: o iodo o mais empregado. Atua como bactericiada, fungicida e

esporocida, combinando-se irreversivelmente com protenas, atravs de interao com aminocidos aromticos (fenilalanina e tirosina). As solues alcolicas contendo 2% de iodo exercem ao imediata. Cloro: ataca grupamentos aminados das protenas, formando cloroaminocidos inativos. Utilizado sob a forma: hipoclorito de sdio ou clcio, cido hipocloroso.

e) Agentes de superfcie: detergentes catinicos: utilizados em desinfeco e anti-sepsias. Mais

empregados so: cloreto de benzalcnio, cloreto benzetnio e cloreto de cetilpiridnico. Clorexidina: empregada na anti-sepsia da pele, em anti-spticos bucais, etc.

f) Esterilizantes gasosos: xido de etileno: utilizado na esterilizao de instrumentos cirrgicos, fios de

sutura, etc. Atua promovendo a alquilao direta dos grupamentos carboxila, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas.

INDICADORES DE ESTERILIZAO:

- Substncias com ponto de fuso conhecidos :cido Benzico (121C) e Uria (125C). - Cultura de microrganismos esporulado: Bacillus stearothermophilus - Fitas indicadoras de esterilizao.

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ANTISSEPSIA DA PELE
Vrias substncias qumicas so utilizadas no processo de anti-sepsia da pele. Dentre estas, encontramos o iodo, lcool, triclosan e clorexidina como uma das mais utilizadas. O iodo um halognio que exibe sua ao sobre os microrganismos atravs de diferentes mecanismos de ao quais sejam: promovendo inativao enzimtica ou como oxidante, causando assim sua morte, Atua como bactericiada, fungicida e esporocida, combinando-se irreversivelmente com protenas, atravs de interao com aminocidos aromticos (fenilalanina e tirosina). As solues alcolicas contendo 2% de iodo exercem ao imediata. Os lcoois: anti-spticos ou desinfetantes. Atua sobre formas vegetativas promovendo a precipitao e desnaturao de protenas. mais eficiente 70%, pois as protenas celulares so mais facilmente desnaturadas na presena da gua. O gluconato de clorexidina um Anti-sptico qumico, Antifngico e um bactericida capaz de eliminar tanto bactrias gram-positivas quanto as gram-negativas, no entanto mostra-se menos eficiente com os microrganismos gram-negativos. Tambm um bacteriosttico, impedindo a proliferao de bactrias. Acredita-se que o mecanismo de ao ocorra atravs da ruptura da membrana celular, e no pela inativao por ATPase como pensava-se anteriormente.

Gluconato de clorexidina

Triclosan ou triclosano um agente anti-sptico efetivo contra bactrias gram negativas, bem como gram positivas. eficaz tambm contra fungos e bolores. encontrado em medicamentos, sabonetes, loes e cremes dentais. Apresenta boa tolerncia para uso na pele e cavidade bucal em baixas concentraes.

Triclosan

OBJETIVO: utilizar uma soluo de iodo, lcool, triclosan e clorexidina sobre uma poro da pele com a finalidade de reduzir a microbiota , eliminando quase todos os microrganismos presentes.

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TCNICA: Dividir o fundo da parte externa da placa como auxlio de uma caneta de retroprojetor, escrevendo de um lado salina e do outro iodo, lcool, triclosan ou clorexidina . Depois proceder como segue: 1: molhar o cotonete em soluo fisiolgica ( salina ) e esfreg-lo no dorso de uma das mos, em uma rea de + ou - 4 cm ( girando sempre o cotonete ). 2: Semear com este cotonete a metade da placa, no lado correspondente salina. 3: Com a outra extremidade da haste ( no utilizada ) deste mesmo cotonete, embeb-la na soluo de iodo e esfreg-la sobre o dorso da outra mo em rea de + ou _4 cm. AGUARDAR 5 ( CINCO ) MINUTOS PARA QUE O IODO POSSA ATUAR SOBRE OS MICRORGANISMOS DA PELE, ELIMINANDO-OS. 4: Pegar o outro cotonete e molh-lo em soluo fisiolgica, esfregando-o sobre a rea onde foi passada a soluo de iodo, lcool, triclosan ou clorexidina. 5: Semear com este cotonete a outra metade da placa, no lado correspondente ao iodo, iodo lcool, triclosan ou clorexidina. 6: Levar a placa identificada para ser incubada na estufa a 37C por 24 horas. Aps esse prazo retornar ao laboratrio para complementar seu experimento, conforme instrues abaixo.

Fazer leitura da placa aps 24 horas de incubao, concluir o resultado e realizar um Gram das diferentes colnias crescidas dos dois lados da placa, descrevendo o observado.

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MEIOS DE CULTURA
OBJETIVO: Tcnica para a execuo dos meios de cultura; tipos de meios empregados para o isolamento e identificao de microrganismos ( bactrias e fungos ). MEIO DE CULTURA: Os microrganismos possuem um ciclo natural na gua, solo, ar, na nossa superfcie corporal e de outros animais etc. Estes microrganismos conseguem sobreviver custa de materiais orgnicos e inorgnicos existentes nestes ambientes. O ciclo artificial (meio de cultura) o modo que empregamos em laboratrio para cultivarmos os microrganismos. Chamamos de meio de cultura ao conjunto de substncias necessrias ao crescimento e multiplicao dos microrganismos No ciclo artificial tentamos reproduzir as condies naturais fornecendo: A - Substncias nutritivas em concentraes adequadas, que devem servir como: - fonte de energia - fonte de carbono - fonte de enxofre e fsforo - doador de eltrons - fonte de nitrognio - fonte de sais e ons - fatores de crescimento - receptor de eltrons

B - Condies ambientais favorveis: - temperatura (termfilos, mesfilos e psicrfilos) - umidade - pH ( de 2 a 9 )

- atmosfera de incubao (aerobiose, microaerofilia, anaerobiose)

Tcnicas para a execuo dos meios de cultura:

1- Usar somente substncias qumicas ou ingredientes de boa qualidade 2- Fazer a pesagem corretamente 3- Usar vidraria seca e limpa 4- Usar apenas os ingredientes da frmula 5- Se necessrio, filtrar 6- Ajustar o pH do meio aps a filtrao, antes de juntar o agar 7-Para manter a eficincia dos meios depois de prontos, conserv-los em lugar frio, escuro e em recipientes hermticamente fechados.

Estado fsico (consistncia):

Os meios podem ser classificados em: 1- Lquidos: utilizados para crescimento em massa ( no promovem a formao de colnias, mas sim, crescimento por disperso ). 2- Semi-slidos: para verificao de motilidade (0,5% de agar-agar) 3- Slidos: para fazer isolamento, devido a formao de colnias (1,5 % a 2% de agar-agar)

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Finalidade:
- Meios de enriquecimento: aumentam a possibilidade de crescimento da espcie desejada, quando a mesma se encontra em pequeno nmero. - Meios indicadores (ou diferenciais): revelam uma propriedade bioqumica, permitindo uma identificao presuntiva. - Meios seletivos: impedem o crescimento de determinados grupos num inculo misto, mas permite o desenvolvimento de outros. - Meios seletivos-indicadores: revelam uma propriedade bioqumica e selecionam grupos de bactrias. - Meios de triagem: empregados para separar bactrias da mesma famlia. - Meios de transporte: garantem por mais tempo a viabilidade dos microrganismos que no podem ser semeados logo aps a coleta e que poderiam morrer.

Componentes bsicos dos meios de cultura:

- Extratos: de carne e de levedura. Concentrados aquosos desidratados que servem como fonte de: carboidratos, vitaminas, compostos orgnicos nitrogenados e sais. - Peptonas: derivados da hidrlise cida ou enzimtica de protenas de origem animal ou vegetal (peptona de casena, peptona de soja) que servem como fonte de N orgnico, vitaminas, carboidratos, enxofre, fsforo, clcio e magnsio. - Agar-agar: polissacardeo obtido a partir de algas rodofceas. Funo: agente solidificante, cujo P.F.= 95 C e o P.S.= 45 C. No tem funo nutritiva. - NaCl: mantm o equilbrio osmtico do meio e serve como fonte dos ons Na e Cl. - gua: umidade e fontes de ons. Frmulas de alguns meios bsicos, de uso rotineiro em bacteriologia: CALDO SIMPLES: - Extrato de carne - 5 g - Peptona - 10 g - NaCl - 5 g - H2O - 1000 ml - pH: 7,4 +/- 0,2 obs.: Aferir o pH aps a dissoluo dos componentes, distribuir nos tubos, acondicionar e esterilizar. Modo de preparo: Fundir a mistura acima em banho-maria, at a completa dissoluo do gar. -a- Meios em tubos: distribuir o meio ainda quente nos tubos e depois autoclavar (no caso de necessitarmos utilizar agar inclinado, inclinar os tubos aps autoclavao, com o meio ainda quente para solidificao ). -b- Meios em placas: autoclavar o balo onde foi preparado o meio e a seguir distribu-lo ainda quente, em placas previamente esterilizadas em forno de ar quente. AGAR SIMPLES: - Caldo simples ( com pH aferido ) - 1000 ml - gar-agar - 20 g

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TCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Isolamento de um microrganismo:

O isolamento consiste na obteno de uma cultura pura (colnias isoladas de um nico microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material ). Finalidades do isolamento: . Identificao de um microrganismo. A simples observao de caracteres morfolgicos no suficiente para a identificao e classificao dos microrganismos. Para isto lanamos mo da anlise de uma srie de caractersticas destes como: caractersticas bioqumicas, sorolgicas, de patogenicidade, e etc. O estudo destas caractersticas est na dependncia do microrganismo que se pretende identificar.

. Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material

contaminado qualquer. . Repique: Consiste na transferncia de um microrganismo de um meio de cultura para outro.

. Tcnica de semeadura ou repique de bactrias em meio lquido: 1- Segurar a ala com a mo direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a ala flambada na posio vertical e dever ficar atrs da chama para proteo do operador). 2- Retirar a rolha de algodo do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado ( que dever estar na mo esquerda ) utilizando-se o dedo mnimo da mo direita. A ROLHA DEVER PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MNIMO, AT O FINAL DA OPERAO. 3- Flambar a boca do tubo, e retirar o inculo com a ala fria. 4- Flambar novamente a boca do tubo e fechar. 5- Pegar o tubo onde se ir realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. 6- Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. 7- Esterilizar a ala, identificar o tubo semeado e levar para incubao em estufa.

Semeadura ou repique de bactrias em meio slido inclinado: Os cuidados so os mesmos que para o meio lquido. Empregamos geralmente a ala. Quando necessitamos realizar semeadura de profundidade, utilizamos a agulha. O plantio feito em zig-zag, iniciando-se pelo fundo do tubo.

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Semeadura ou repique de bactrias em placas de Petri: O material a ser semeado dever conter poucos microrganismos porque o inculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colnia formada na superfcie de um meio slido originada de um ou alguns microrganismos. Quando maior o nmero, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inculo for obtido a partir de meio slido ( inculo pesado ), este poder ser diludo em salina estril ou ser utilizada a tcnica de esgotamento adequada. O inculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluio da cultura em meio slido feito da seguinte maneira: 1. Retiramos o inculo do tubo com a ala j flambada e fria. 2. Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapu com a placa . 3. Colocamos o inculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir atravs de estriamento ( que poder ser contnuo ou descontnuo ). O estriamento poder se feito de maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a ala duas vezes no mesmo local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na ala. Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bactrias, o que dificultar o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento, aps termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a ala, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a ala na ltima estria que realizamos. Aps terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levando-a a seguir para incubao na estufa, com a tampa voltada para baixo. 4. Flambar a ala utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.

OBS: Para a realizao da semeadura utilizando-se inculos pesados no diludos, a tcnica a mesma que a descrita anteriormente, s que ao invs de interrompermos o processo uma vez para flambarmos a ala, o faremos duas vezes.

Tcnica de repique em meio semi-slido: 1. Retirar o microrganismo do meio slido ou lquido com o auxlio de uma agulha j flambada e fria. 2. Abrir o tubo que contm o meio semi-slido e semear o microrganismo atravs de picada at mais ou menos 1/3 ou do tubo. 3. Fechar o tubo, identificar e levar para incubao. 4. Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.

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EMPREGO DE MEIOS DE CULTURA SELETIVO-INDICADORES

Os meios seletivo-indicadores so utilizados para selecionar grupos bacterianos ( atravs da utilizao de substncias inibidoras que impeam o crescimento de bactrias indesejveis ) e indicar uma propriedade bioqumica destas bactrias, que contribuam para o processo de identificao.

AGAR MAC-CONKEY: Finalidade: meio de cultura seletivo-indicador, utilizado para isolamento de enterobactrias ( bacilos Gram negativos ) a partir de fezes, urina, lquor, alimentos, gua residual, etc. FRMULA: Peptona de casena Peptona de carne Lactose Mistura de sais biliares Cloreto de sdio Vermelho neutro pH: + ou - 7.1 cristal violeta agar-agar gua destilada

FUNDAMENTOS: 1) Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da microbiota Gram-positiva por ventura existente no material (seletividade para Gram-negativo).

2) A lactose junto com o indicador de pH (vermelho neutro) serve para comprovar a degradao ( fermentao ) deste carboidrato ( o que feito por apenas parte dos membros desta famlia). Quando ocorre a fermentao, a bactria classificada como Lac +.

LEITURA: Colnias lactose-positiva (Lac. +) : degradao ( fermentao ) da lactose com acidificao do meio que produzir colnias de cor rosa com halo central mais claro. Ex.: E. coli, Klebsiella, Enterobacter. Colnias lactose-negativa (Lac. -): no utilizao da lactose, formao de colnias incolores e transparentes. As colnias assumem a colorao do meio, que se apresentar um pouco alterado, devido a utilizao dos outros componentes ( s no utilizar a lactose) . Ex.: Proteus, Salmonella, Shigella.

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PROVAS BIOQUMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICAO DE BACTRIAS

METABOLISMO DE CARBOIDRATOS

1- Fermentao de carboidratos:
Algumas bactrias so capazes de hidrolizar os carboidratos (dissacardeos at glicose), e metabolizar a glicose at cidos (com ou sem liberao de gs) e/ou lcoois. Carboidrato ( manitol, sacarose, lactose, etc. ) glicose c. pirvico cidos, lcoois e gases.

Meio utilizado: meio de cultura indicador que contm: caldo simples + carboidrato + indicador de pH (indicador de Andrade ) + tubo de Durhan. TCNICA: a) repicar o microrganismo j isolado para o meio contendo o carboidrato e incubar em estufa a 37 C por 24 horas. b) Leitura: observar se houve produo de cidos (viragem da cor do meio) com ou sem produo de gs (formao de bolha no interior do tubo de Durhan).

2- Prova do citrato:
Muitas bactrias so capazes de utilizar o citrato (c. orgnico do ciclo de Krebs) como fonte de carbono .A enzima que cataliza a clivagem do citrato recebe vrias denominaes, dentre elas, citratoliase e citrilase. Os produtos de clivagem so acetato e oxaloacetato, este ltimo sendo subseqentemente convertido em Piruvato e CO2 , por uma oxalacetato descarboxilase.

citrato

citrilase

oxalacetato + acetato

oxalacetato descarboxilase

c. Pirvico + CO2

O piruvato utilizado pela clula ( para seu metabolismo ) e o CO2 liberado no meio de cultura. O CO2 liberado reage ento com o sdio ( proveniente do sal citrato de sdio incorporado na composio do meio de cultura ), formando carbonato de sdio ( composto alcalino ), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinizao. Meio utilizado: Citrato de Sdio + H2O + Indicador de pH ( azul de bromotimol ). O pH final do meio aps preparo: 6.8 . Indicador de pH: azul de bromotimol: verde em meio ligeiramente cido ( 6.8 ) e azul em pH acima de 7,6.

Tcnica: repicar o microrganismo j isolado no meio do citrato e incubar na estufa a 37 C por 24 horas. Leitura: - teste positivo: meio de cultura azul (a bactria utilizou o citrato, liberando CO2,) - teste negativo: meio inalterado ( verde ): bactria no utilizou o citrato.

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METABOLISMO DE PROTENAS A decomposio de protenas ( liberao de aminocidos ) conduz produo de substncias ptridas (de mal cheiro) como: H2S, Indol e escatol e etc. Neste experimento, observaremos a utilizao ou no de certos aminocidos pelas bactrias ( necessrios ao seu metabolismo ), atravs da deteco da presena de substncias ptridas. Meio de cultura utilizado: Meio SIM. ( S=sulfeto; I=indol; M=motilidade ) Composio: peptona (protena que serve como fonte de tryptofano e cistina), sal de metal pesado (sal de ferro ou chumbo), gua e gar. TCNICA: Semear com agulha ( picada at + ou - 1/3 do tubo ) a bactria j isolada para o meio SIM. Incubar em estufa a 37C por 24 horas. Aps incubao, adicionar de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs e proceder a leitura. FUNDAMENTO:

1- Produo de Indol: degradao do tryptofano

Tryptofano triptofanase produzida pela bactria c. pirvico e indol

c. pirvico: utilizado pelo metabolismo da bactria. Indol: liberado no meio de cultura. Adicionar aps incubao, de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs ( soluo de paradimetilaminobenzaldeido ). Se houver liberao de indol, formar-se- um anel vermelho ( composto denominado rosindol) Resultado: - Indol positivo: anel vermelho - Indol negativo: no utilizao do tryptofano. Presena de anel amarelo (cor do reativo de Kovacs)

2- Produo de H2S:
Cistina: aminocido que contm enxofre (S). Degradao da cistina com liberao de H2S.

Cistina

2 cistena

cistena dessulfidrilase
produzida pela bactria

H2S + c. pirvico

c. pirvico; utilizado no metabolismo da bactria. H2S: liberado no meio de cultura. O H2S liberado combina-se com o sal de ferro ou chumbo, dando como resultado um precipitado de cor negra. Resultado: - H2S positivo: precipitado preto - H2S negativo: sem precipitado

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TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( TSA ) / ( ANTIBIOGRAMA )

1. CONCEITO e INTRODUO: Teste para verificar o comportamento dos microrganismos (sensibilidade ou resistncia) "in vitro", frente a diversos antibiticos e quimioterpicos, para a escolha do antimicrobiano ideal. A orientao fornecida pelo TSA sobre a eficcia de determinada droga contra um agente infeccioso pode vir a ser de grande importncia, visto que diferentes espcies bacterianas, ou diferentes cepas de uma mesma espcie, podem demonstrar diferentes nveis de sensibilidade a uma droga. Neste particular, destaca-se a resistncia infecciosa protagonizada por diversos gneros bacterianos. Multiresistncia de origem plasmidial talvez seja a principal causa do surgimento de cepas resistentes, aliada seleo natural que ocorre entre populaes bacterianas. Suassuna: Para o sucesso da antibioticoterapia, a partir do conhecimento de um agente etiolgico cuja sensibilidade foi indicada pelo laboratrio, h de se considerar, entre tantos condicionantes para o xito do tratamento, se as leses so abertas ou fechadas; contaminadas ou no; purulentas ou granulomatosas; superficiais, justamucosas, profundas ou sob barreiras anatmicas. Critrio absoluto da eficcia de um antibitico a dose adequada da droga correta. 2. INDICAES: Para microrganimos isolados e identificados como os agentes causadores da infeco; quando o microrganismo causador da infeco apresenta, estatisticamente, grande variabilidade no espectro de resistncia ou tendncia mesma. Ex.: Enterobactrias, Staphylococcus aureus, Pseudomonas. 3. DISPENSADO: Para microrganismos, cuja sensibilidade no apresenta variao ao longo do tempo. Ex.: Neisseria meningitidis e Streptococcus do grupo A (sensveis penicilina G), Salmonella typhi (sensvel ao cloranfenicol) Resposta clnica do paciente quando a ele se administra

4. TIPOS DE TESTE:

4.1. QUANTITATIVO: determinao da Concentrao inibitria mnima (CIM). - Diluio : em tubo e em placa - Teste E (Teste epsilomtrico): consiste em uma fita plstica, impregnada com um gradiente de concentrao do antimicrobiano.

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4.2. QUALITATIVO: Mtodo de difuso de discos em gar. PRINCPIO DO MTODO QUALITATIVO: medida do halo de inibio em mm. LEITURA: - ausncia de halo: resistncia - presena de halo: sensibilidade ou resistncia

5. FATORES QUE INFLUENCIAM O RESULTADO DO TSA:

5.1. COMPOSIO QUMICA DO MEIO DE CULTURA: Meio de cultura padro para a realizao do TSA: Agar Meller-Hinton (pH: 7.2 a 7.4), em placas com 4 a 6 mm de espessura. Permite bom crescimento do microrganismo e boa difusibilidade do antibitico, podendo ainda se necessrio, ser acrescido de sangue. 5.2. DENSIDADE DO INCULO: concentrao do inculo: 108 clulas/mL. 5.3. TEMPERATURA: A temperatura de incubao ideal se situa entre: 35 a 37C. Temperaturas alteradas podem conduzir a uma deteriorao do frmaco ou no caso dos microrganismos produtores de enzimas, a produo de enzimas poder ser baixa e quantidade to pequena que haver a formao de halo maior ( falso-positivo ).

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5.4. CONCENTRAO DOS ANTIMICROBIANOS NOS DISCOS: padronizada pelo fabricante.

5.5. VALIDADE E CONSERVAO DOS DISCOS: observar sempre: a data de validade, a umidade e a temperatura ideal de armazenamento

5.6. AO E ESTABILIDADE DA DROGA: . algumas drogas podem sofrer hidrlise nas primeiras horas de incubao (o que possibilita o desenvolvimento dos microrganismos, mesmo que sensveis a elas ) . alguns microrganismos se reproduzem antes de serem inibidos pela droga (velocidade de crescimento maior que a velocidade de difuso da droga. Tais fatos permitem o surgimento de colnias satlite (colnias que podem surgir dentro do halo de inibio). Alm destas, outras explicaes so atribudas ao surgimento de colnias satlite: inoculo misto e mutantes resistentes ao antimicrobiano dentro da populao.

5.7. TEMPO DE INCUBAO: de 12 a 18 horas 5.8. INTERPRETAO: medida do dimetro do halo de inibio (mm).

6. RESULTADO:

- Sensvel (S), - Moderadamente resistente ou intermedirio (I), - Resistente (R).

TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( TSA ) / (ANTIBIOGRAMA)

MTODO DE KIRBY-BAUER
Mtodo de difuso em meio de cultura slido pelo sistema de discos nicos. Padronizado pela OMS em 1977. Caractersticas necessrias ao meio de cultivo para TSA: O meio de cultivo, sem enriquecimento, deve sustentar o bom crescimento dos organismos em teste. No deve possuir substncias que antagonizem os antibiticos testados. Deve ser resistente a mudanas de pH durante o perodo de incubao. Deve permitir o acrscimo de sangue quando o organismo em teste exigir.

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Meio no deve conter carboidratos fermentveis porque o pH cido estimula as ciclinas (enquanto que o pH alcalino estimula aminoglicosdeos e macroldeos). O pH do meio deve manter-se entre 7,2 e 7,4. O meio Miller Hinton satisfaz parcialmente estas exigncias, sendo recomendado por diversos autores. Quando usado para o teste de difuso, deve ser adicionado s placas em quantidade suficiente para que solidifique com uma espessura de 4 mm.

MATERIAL: . suspenso bacteriana em caldo ( concentrao: 108 clulas/mL). - recomendado um inculo correspondente ao padro 0,5 da escala de MacFarland. . placa contendo meio de cultura padro: Agar Meller-Hinton . cotonete estril ( para a semeadura) . discos de papel contendo os antimicrobianos ( em concentraes padronizadas )

Escala de MacFarland: Preparar soluo de cido sulfrico a 1%. Preparar soluo aquosa de cloreto de brio a 1,175%. Lentamente, e sob constante agitao, adicionar as quantidades indicadas a 10 tubos previamente preparados. Fechar os tubos hermeticamente, conservando-os temperatura ambiente e ao abrigo da luz. O precipitado de sulfato de brio, quando ressuspendido, corresponde densidade conferida por cultivo de E. coli em meio lquido, nas concentraes relacionadas na tabela:

0,5 BaCl2(ml) H2SO4(ml) 0,05 9,95

1 0,1 9,9 3

2 0,2 9,8 6

3 0,3 9,7 9

4 0,4 9,6 12

5 0,5 9,5 15

6 0,6 9,4 18

7 0,7 9,3 21

8 0,8 9,2 24

9 0,9 9,1 27

10 1,0 9,0 30

Concentrao 1,5 (x108/ml)

O inculo pode ser obtido de formas variadas: Selecionar 4 5 colnias desenvolvidos em meio slido e que apresentem o mesmo tipo morfolgico. Transferir estas colnias para o meio lquido.

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Incubar a 35 370C at turvao visvel (normalmente entre 2 a 8 horas). Ajustar a turvao com salina estril ou meio lquido at a concentrao desejada. Obter suspenso bacteriana em salina estril ou em meio lquido a partir de colnias que se tenham desenvolvido em meio slido. Utilizar tantas colnias quantas forem necessrias para a obteno da turvao visvel. Ajustar a turvao com salina estril ou meio lquido at obter a concentrao desejada. Obs: Esse mtodo recomendado especialmente para bactrias que se desenvolvem com dificuldade em meio lquido.

TCNICA: . retirar a suspenso bacteriana contida no tubo com o cotonete , tomando o cuidado de retirar o excesso de caldo , comprimindo a haste contra a parede do tubo; . semear a suspenso na placa contendo o Agar Meller-Hinton, em trs planos, para que haja crescimento confluente; . deixar a placa secar entreaberta durante no mximo, por 15 minutos, em frente chama; . colocar os discos de papel com o auxlio de uma pina flambada, resguardando um espao de 2 cm do disco para a borda da placa e de 3 cm entre um disco e outro; . esperar de 20 a 30 minutos para que ocorra a difuso do antimicrobiano, antes que o microrganismo comece a se desenvolver; . levar estufa a 35 ou 37 durante 12 a 18 horas; . aps a incubao, promover a leitura e interpretao.

OBSERVAES: OBS: Staphylococcus sp., o perodo de incubao deve ser prolongado at 24 horas, visando deteco de cepas meticilina resistentes (O.R.S.A.). Incubao em atmosfera de microaerofilia no recomendada, uma vez que o CO2 proporciona acidificao da superfcie do meio de cultivo. Organismos que requerem CO2 para seu desenvolvimento devem ser testados (N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae) no ambiente solicitado, ainda que, idealmente, o procedimento deva ser acompanhado por teste paralelo com cepa padro.

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Leituras: Resultados quantitativos Resultados qualitativos expressos em concentrao inibitria mnima. como sensvel, intermedirio, resistente.

Interpretao de antibiogramas recomendada pelo NCCLS:

Sensvel (S): Uma infeco por determinada cepa pode ser tratada apropriadamente com dosagem de agente antimicrobiano recomendada para aquela infeco, salvo qualquer outra contra indicao. Intermediria (I): A CIM dos agentes antimicrobianos aproximam-se dos nveis plasmticos e tissulares habituais. Pode apresentar uma resposta menor que a das cepas sensveis. Resistentes (R): Cepas no so usualmente inibidas por concentraes sistmicas avaliadas do agente.

Staphylococcus sp meticilina resistente (heterorresistente) O mecanismo de resistncia est relacionado alterao de PBP codificada pelo gene mec A. Cepas com o gene mec A habitualmente so multirresistentes, e o resultado da resistncia oxacilina deve ser confirmado. Pesquisa tradicional discos de oxacilina 1 g. Disco de cefoxitina 30 g detecta de forma segura todas as classes de MRSA, mesmo cepas que apresentam resistncia oxacilina em baixos nveis. Reportar como resistente a oxacilina, penicilina, Beta lactmicos, Beta lactmicos mais inibidores, cefens, monabactans, carbapenens.

Seleo de antimicrobianos: Antimicrobianos devem ser os mais adequados para o microrganismo isolado e o stio da infeco. Devem ser adequados ao hospital ou instituio. Orientaes publicadas anualmente pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).

Controle de qualidade: Utilizao de cepas padro para verificao dos testes. Cepas padro ATCC (American Type Culture Collection). Exemplos: E. coli ATCC 25922 - Lactamase negativa para controle de discos para enterobactrias.

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Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Controle de discos para deteco de cepas

K.

pneumoniae, E. coli, K. oxytoca ESBL (extended spectrum beta lactamase). S. aureus ATCC 25923 Cepa - Lactamase negativa para controle de discos de Gram positivos.

Freqncia do teste de controle de qualidade: Cada novo lote do meio preparado, cada novo lote de antibitico recebido no laboratrio. Atentar para microrganismos com resistncia intrnseca (microrganismos que, se reportados como resistentes, a identificao deve ser revista).

Guia para realizao do teste de avaliao da resistncia pelo mtodo de difuso em disco:

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PRINCIPAIS CLASSES DE ANTIBITICOS

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ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE FUNGOS

1 - INTRODUO: 1.1 - IMPORTNCIA DO ESTUDO DOS FUNGOS Os fungos so seres vivos e apresentam uma caracterstica marcante que a ubiqidade, ou seja, se encontram amplamente disseminados na natureza, onde desempenham efeitos benficos (manuteno do equilbrio dos diversos ecossistemas, participao no ciclo de vida na terra, fertilizao do solo, etc.) e malficos (causando doenas e deteriorando alimentos e materiais) para a humanidade. Ressalta-se tambm a utilizao desses microrganismos em indstrias de alimento e bebidas (queijo, po, vinho, cerveja, etc.), farmacutica (antibiticos, hormnios, alucingenos) e qumica (enzimas, cidos orgnicos, vitaminas, pigmentos, etc.). Os fungos so tambm largamente usados como ferramentas em pesquisa bsica de gentica, fisiologia, bioqumica, entre outras. O habitat natural desses microrganismos bastante variado, permitindo classific-los como anemfilos (fungos do ar), geoflicos ou telricos (do solo), aquticos (da gua), zooflicos (de animais), antropoflicos (do homem) e fitoflicos (de vegetais). Portanto, possvel promover o isolamento desses microrganismos de qualquer um destes locais, ou de materiais como madeira, couro, alimentos e detritos de um modo geral. Para isto, necessrio que sejam fornecidas condies ambientais e nutrientes adequados para promover o desenvolvimento destes microrganismos nos meios de cultura.

1.2 - FINALIDADES DO ISOLAMENTO So vrias as situaes onde se faz necessrio o isolamento dos fungos: - Estudo da microbiota fngica de determinada regio. - Avaliao de poluio ambiental. - Determinao do grau de contaminao de determinados ambientes. - Verificao de contaminao de alimentos e medicamentos. - Obteno de amostras de interesse industrial. - Diagnstico etiolgico de micoses. - Obteno de amostras para o preparo de antgenos. - Estudo da correlao de alergia com a presena de fungo no ambiente.

1.3 - OBJETIVO DAS AULAS Apresentar as tcnicas mais utilizadas em micologia, discutindo a metodologia de isolamento e identificao de fungos. Para tal, usaremos um modelo de estudo dos fungos anemfilos, que pode ser adaptado para outras investigaes.

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2 - ISOLAMENTO DOS FUNGOS 2.1 - SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA a) Meio de cultura mais utilizado: Agar Sabouraud Composio qumica: gua, agar-agar, peptona, dextrose ou maltose, pH: cido (em torno de 5.6) b) Outros meios de cultura utilizados em micologia: - Agar Mycosel - este meio apresenta composio qumica semelhante ao Agar Sabouraud, porm acrescido de antimicrobianos (Cloranfenicol - antibacteriano e Cicloheximida ou Actidione - inibidor do crescimento de fungos saprfitas), sendo muito utilizado no isolamento de fungos patognicos. O Agar Mycosel um meio seletivo para isolamento de fungos patognicos. - DTM - meio seletivo e indicador utilizado no isolamento de dermatfitos. - Czapeck-Dox - utilizado no isolamento de fungos presentes em escarro e outras secrees ( tem substncias que fluidificam o muco). - Chlamydospore agar - utilizado para induzir a formao de clamidosporos. - Agar fub, agar arroz, agar batata - meios pobres, mas ricos em carboidratos que estimulam a esporulao, sendo usados no microcultivo

8.2 - CONDIES DE INCUBAO: Temperatura: - ambiente - para os fungos dimrficos: 1 tubo a 37C e outro temperatura ambiente. - Atmosfera: aerobiose - Tempo: fungos saprfitas - em torno de 3 dias ( 3 a 7 dias) fungos patognicos - de 5 a 30 dias

2.3 - ACOMPANHAMENTO DO DESENVOLVIMENTO E ANLISE DA COLNIA

3 - IDENTIFICAO DE FUNGOS A identificao dos fungos se baseia principalmente em caractersticas morfolgicas (macro e microscpicas), reprodutivas e metablicas.

3.1 - CARACTERSTICAS MACROSCPICAS Na anlise da morfologia colonial vrias caractersticas devem ser observadas como: aspecto da colnia, cor, bordos, superfcie, consistncia, presena de protuberncia e sulcos.

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3.2 - CARACTERSTICAS MICROSCPICAS Nesta observao devemos analisar no apenas a micromorfologia como tambm aspectos relacionados reproduo dos fungos. Verifica-se, portanto, se o microrganismo uni ou multicelular, a forma e tamanho das clulas, a presena de hifas, de clulas leveduriformes e de pseudo-hifa, se a hifa septada ou cenoctica, a presena de estruturas facultativas (cpsula, rizides e haustrios), o tipo de reproduo e o aspecto dos esporos e do corpo de frutificao.

3.3 - CARACTERSTICAS METABLICAS (OU BIOQUMICAS) So vrias as provas de identificao de fungos que se baseiam em aspectos metablicos. Dentre elas podemos citar o zimograma (prova de fermentao de carboidratos), o auxanograma (prova de assimilao de carboidratos e de compostos nitrogenados) e pesquisa de enzimas (urease, por exemplo). Estas provas bioqumicas (principalmente zimograma e auxanograma) so indispensveis na identificao de leveduras.

3.4 - OUTRAS PROVAS DE IDENTIFICAO . Tubo germinativo . Termotolerncia . Dimorfismo . Perfurao do plo . Sensibilidade cicloheximida

4 - TIPOS DE EXAMES MICROSCPICOS: 4.1 - COLORAO DE GRAM Esta colorao, muito utilizada na bacteriologia, permite tambm a observao microscpica dos fungos, desde que a colnia ou o material a ser analisado permita a confeco e fixao de esfregao, conforme recomendado para tal mtodo. Os fungos so Gram positivos, ou seja, se coram de roxo.

4.2 - TRATAMENTO PELA POTASSA ( KOH ) Este o procedimento mais utilizado para exame direto de espcimes clnicos (escamas de pele, plos, fragmentos de unha, escarro, secrees, etc.). O hidrxido de potssio (usado em concentraes de 20 a 40%) uma substncia clareadora que digere os elementos tissulares, permitindo uma melhor visualizao das estruturas fngicas (hifas, clulas leveduriformes, esporos).

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4.3 - COLORAO COM TINTA NANQUIM A tinta nanquim ou tinta da China um corante utilizado para verificao da presena de cpsula (que no se cora). Ex: Cryptococcus neoformans, Rhodotorula. 4.4 - COLORAO COM LACTOFENOL DE AMANN OU AZUL DE ALGODO O lactofenol o corante mais utilizado para observao microscpica de fungos, aps o seu desenvolvimento em meios de cultura. Na sua composio qumica encontramos: gua, fenol, cido ltico, glicerina e azul de algodo (ou de metila). O estudo da micromorfologia dos fungos, corado pelo lactofenol, pode ser realizado basicamente atravs de 2 tcnicas: retirada de fragmentos de colnia e o microcultivo. A tcnica do microcultivo (ou cultura em lmina) pode ser realizada em uma placa de Petri contendo uma lmina sobre um suporte de vidro. Esta vidraria previamente esterilizada e sobre a lmina coloca-se um bloco (um cubo) do meio de cultura. Geralmente se usa o agar batata para o estudo dos bolores e agar fub para leveduras. O fungo a ser analisado ento repicado para o pedao de meio de cultura e coberto com lamnula. Para se criar um ambiente mido, coloca-se um pouco de gua destilada estril dentro da placa, que incubada temperatura ambiente. Aps 15 dias, ou quando houver um bom desenvolvimento do fungo no meio de cultura (inclusive na lamnula), retira-se a lamnula que dever ser colocada sobre uma outra lmina com 1 gota de lactofenol e observada ao microscpio, no menor, mdio e maior aumento. 4.5 - EXAME COM FITA DUREX Esta tcnica permite a colheita de material e observao microscpica de casos de pitirase versicolor (micose de pele causada pela levedura Malassezia furfur). 4.6 - EXAME HISTOPATOLGICO Os exames histopatolgicos so de grande relevncia no diagnstico de doenas infecciosas e permitem a deteco de fungos nos tecidos. 5- ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NAS AULAS PRTICAS SOBRE IDENTIFICAO DE FUNGOS ANEMFILOS ISOLAMENTO E

. Observao de exposio sobre fungos . Descrio da morfologia colonial: Os alunos devero observar todas as colnias expostas, procurando analisar as semelhanas e diferenas entre os mesmos tipos morfolgicos. A seguir, escolher uma colnia de bolor e uma de levedura (da nossa micoteca) e anotar as principais caractersticas de cada uma, fazendo a diferenciao entre elas.

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A tabela de identificao macromorfolgica dos fungos (em anexo) poder servir de base para tal descrio.

. Observao da micromorfologia Os alunos devero fazer observao microscpica dos fungos focalizados, analisando as caractersticas e diferenas de miclio, rgos de reproduo (corpo de frutificao) e esporos. Anotar (ou desenhar) as caractersticas observadas. Correlacionar os dados da micromorfologia dos fungos focalizados com os tipos expostos em culturas. Muitos fungos expostos nas culturas esto igualmente focalizados nos microscpios.

Coleta de material Os alunos devero escolher um ambiente para investigar a presena de fungos anemfilos. Neste local, as placas de Petri contendo agar Sabouraud devero ser abertas e expostas ao ar, aproximadamente 15 minutos. Em seguida, as placas sero fechadas, temperatura ambiente. por

identificadas e incubadas

. Acompanhamento do desenvolvimento de colnias Os alunos devero retornar ao laboratrio todos os dias para acompanhar o experimento e verificar se est havendo crescimento de colnias de fungos na superfcie dos meios de cultura. Anotar o tempo de crescimento, o nmero e variedade de colnias. Comparar com a de outros colegas e tentar determinar possveis diferenas ou semelhanas. . Descrio da morfologia colonial: ( dos isolados em sua placa): Aps o desenvolvimento dos fungos no meio de cultura, escolher uma colnia e descrever a sua macromorfologia.

. Descrio da micromorfologia: A colnia de fungo anemfilo escolhida ser agora analisada sob o aspecto microscpico, utilizando a tcnica de fragmento de colnia. Com a agulha de platina flambada e fria, raspar a superfcie da colnia escolhida para obter pequenos fragmentos. Estes sero colocados sobre uma lmina, juntamente com 1 gota de lactofenol e cobertos por lamnula. Em seguida, observar ao microscpio no menor, mdio e maior aumento. Anotar (ou desenhar) as caractersticas observadas. Estes dados podero permitir a identificao do fungo escolhido.

. DESCRIO FINAL DO FUNGO ESCOLHIDO: Baseando-se na anlise da macro e micromorfologia do fungo por sua equipe escolhido, d sua descrio final, e se possvel, o gnero a que este fungo pertence.

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TABELA DE IDENTIFICAO MACROMORFOLGICA DOS FUNGOS

1- Miclio ( aspecto macroscpico ): ( ) leveduriforme (levedura) ( ) areo ( o que se projeta acima do meio de cultura) meio de cultura) 2- Cor da colnia: ......................................................................... 3- Presena de pigmento: ( reverso da colnia - verso da placa) .............................................................. 4- Bordos: ( ) inteiro ( ) ondulado ( ) franjado ( ) encrespado ( ) liso ( ) arredondado ( ) filamentoso (bolor) ( ) rasteiro (o que cresce sobre ou abaixo do

5- Superfcie: ( ) lisa

( ) rugosa

( ) cerebriforme ( ) concntrica

( ) coricea ( ) opaca

( ) algodonosa ( ) aveludada

( ) mucide ( ) cremosa

( ) brilhante ( ) pulverulenta ( ) pastosa

6- Sulcos: ( ) presentes 7- Tipo: ( ) seca ( ) mida

( ) ausentes

8- Protuberncia central: ( ) presente 9- Elevao: ( ) achatada

( ) ausente ( ) amontoada

( ) levantada

10- Reverso da colnia: ............................................................................................................................. 11- Morfologia colonial final aps a identificao: ......................................................................................... ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................

OBS: Esta tabela tem por finalidade orient-lo na verificao das principais caractersticas macromorfolgicas que devero ser observadas. Entretanto, no significa que a colnia que voc deseja identificar tenha todos os itens descritos acima, e alm disto, para cada item poder ser observada mais de uma caracterstica. (por exemplo: a superfcie de uma colnia poder ser ao mesmo tempo: lisa, pastosa e brilhante).