Técnica de Gram

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Staphylococcus aureus: Cocos gram-positivos

A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações histológicas
para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com
base na composição química e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, são
classificados em gram positivos (roxo) ou gram negativos (vermelho). Tal método se deve ao
médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938).
Procedimento:
1. Confeccionar o esfregaço;
2. Secar ao ar e fixar em chama;
3. Cobrir a lâmina com cristal violeta por 30 segundos a 1 minuto;
4. Lavar em água corrente;
5. Cobrir a lâmina com lugol por 2 minutos;
6. Lavar a lâmina;
7. Descorar rapidamente com álcool-acetona;
8. Lavar a lâmina;
9. Cobrir com safranina ou fucsina diluída de gram por 30 segundos;
10.Lavar a lâmina com água, secar e ler.

Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos

As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da
seguinte forma.
O primeiro corante (violeta de genciana ou cristal violeta) penetra na bactéria assim como o
mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em
água, que vai corar o protoplasma e a parede celular.
A lavagem com álcool-acetona dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for
permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa
do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a
diferenciação com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por
Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas.
Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho.
Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou
menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa
corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar
negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento
celular ou acção de lisozimas).
Preparação para a coloração
Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o
que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e
algumas refringência e mobilidade.
A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à
lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.
A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura
bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzênicos que se encontram
ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo
que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os
tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes
ácidos (são negativos, formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos, formando
sais com ânions). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa, existe afinidade entre os
corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria, permitindo que esta fique corada. Para reforçar
a ação do corante, aumentando a força de ligação deste, as estruturas celulares utilizam-se de
mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e
os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias, sendo geralmente hidro-
alcoólicos-fenicados porque, além da substância corante, possuem água para permitir a dissociação
iônica do corante; álcool para conservar e ácido fênico, que atua como mordente e como
bacteriostático, evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante, aplica-
se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool
95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são
usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações policromáticas segue um
protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:
1. O primeiro corante
2. O mordente
3. O diferenciador
4. Água (vai parar a diferenciação)
5. Segundo corante (vai ser contrastante)

Alguns microorganismos gram-positivos

• Staphylococcus
• Streptococcus

Alguns microorganismos gram-negativos

• Pseudomonas aeruginosa
• Haemophilus influenzae