PROTEINE ENZIMATICHE: Laurea Specialistica in Conservazione e Restauro dei BBCC Prof. F.

Palla

FATTORI CHE NE INFLUENZANO LATTIVITA Temperatura

Gli enzimi, in quanto catalizzatori biologici agenti allinterno dei sistemi viventi, hanno una temperatura ottimale compresa tra i 30- 40 C. Vi sono tuttavia casi, come quelli relativi ad enzimi prodotti da microrganismi che vengono secreti allesterno dellorganismo stesso, in cui la temperatura ottimale coincide con quella dellambiente (20-25 C). Proprio dalla temperatura pu dipendere anche la scelta dellenzima e le modalit di applicazione dello stesso, evidente che se si utilizzano enzimi con temperatura ottimale elevata, bisogner considerare lipotesi di un riscaldamento della miscela enzimatica e della superficie stessa da trattare. pH Il valore ottimale del pH della miscela deve essere mantenuto durante la reazione enzimatica, infatti, se il mezzo acquoso in cui lenzima si trova disperso ha un pH che si discosta dal valore ottimale, lattivit enzimatica potr esserne compromessa. Il 100% di attivit si ha infatti solo entro un preciso intervallo, discostandosi dal quale si pu avere una notevole perdita di attivit. Se, ad esempio, la soluzione in cui lenzima sciolto non stata tamponata , il contatto con sostanze a carattere acido o basico (per esempio sostanze che a seguito di invecchiamento sono divenute acide, come Oli e Resine naturali) pu causare una variazione del pH tale da rallentare o addirittura arrestare lattivit enzimatica. Inibitori dellattivita enzimatica Alcuni ioni di metalli pesanti come Rame (Cu+ ), Mercurio (Hg 2+), Piombo (Pb2+), Cadmio (Cd2+), Argento (Ag2+) possono svolgere un ruolo di inibitori dellattivit enzimatica, perch sono in grado di legare reversibilmente lenzima. causando alterazioni strutturali nella configurazione stessa dellenzima. Questi metalli sono compresi in una grande variet di pigmenti sia antichi che recenti: rame: Azzurrite e Malachite; cadmio: la serie dei gialli e rossi di cadmio; mercurio: cinabro; piombo: biacca e minio; antimonio: giallo di Napoli; cromo: tutta la serie dei verdi di cromo. In realt, a seconda dei casi, la presenza di uno o pi di questi pigmenti in uno strato pittorico, pu essere considerata una limitazione o, al contrario, uneventuale garanzia di selettivit.

Se, ad esempio, si volesse rimuovere una ridipintura con metodo enzimatico, la presenza di questi agenti inibitori rappresenterebbe una limitazione. Se, invece, volessimo togliere una patina sopra lo strato pittorico, la certezza che il pigmento blocca lenzima sarebbe una garanzia di selettivit dellintervento, in quanto eviterebbe linterferenza con lo strato pittorico. Diverso il caso in cui un enzima viene a trovarsi a contatto con uno strato pittorico, in cui le particelle di pigmento sono disperse nella matrice filmogena, costituita dal legante pittorico solidificato. In questo caso, infatti,, non detto che lo ione metallico possa interagire con lenzima. In particolare, in una pittura grassa, tipicamente a legante oleoso le particelle di pigmento sono completamente rivestite da una pellicola di legante idrofobo, idrorepellente. In queste condizioni difficile pensare che lo ione metallico possa interagire con lenzima causandone linibizione. Diverso il caso di una pittura magra, come una tempera a colla (animale) o a gomma (vegetale), che ha un tipico aspetto satinato, proprio perch le particelle di pigmento sono completamente ricoperte da legante; in queste condizioni, dato il carattere idrofilo del legante, le particelle metalliche possono effettivamente arrivare a contatto con lenzima. LE IDROLASI Gli enzimi che interessano il restauro sono gli enzimi Idrolitici o Idrolasi, enzimi in grado di catalizzare lidrolisi dei legami C-O o C-N e che, quindi, hanno la capacit di degradare macromolecole a carattere polisaccaridico (cellulosa, amido, sostanze amilacee), proteico (collagene e colle animali, albumine, caseine, uovo), lipidico (oli, grassi, cere). Le Amilasi possono essere: di origine animale, ricavate dalla saliva o dai tessuti di alcuni organi come le Amilasi pancreatiche; di origine microbica: isolati da varie specie di batteri soprattutto Bacillus e microfunghi come Aspergillus; di origine vegetale, ricavate da tuberi.

Gli enzimi Proteolitici possono avere: origine animale, derivati dai tessuti di alcuni organi, principalmente stomaco o pancreas, come Pepsina, Tripsina, Pancreatina e Proteasi gastriche; di origine vegetale, ricavate dai frutti di ananas, papaia e fico;

di origine microbica, isolati da varie specie di batteri, soprattutto Bacillus e microfunghi come Aspergillus; di origine animale: estratti dai tessuti del pancreas, come le Lipasi pancreatiche; di origine microbica: isolati da varie specie di batteri, soprattutto Bacillus e funghi, in particolare Asperigillus e Penicillum. Analogamente gli enzimi Lipolitici possono essere: di origine animale: estratti dai tessuti del pancreas, come le Lipasi pancreatiche; di origine microbica: isolati da varie specie di batteri, soprattutto Bacillus e funghi, in particolare Asperigillus e Penicillum. A determinare il tipo di Idrolasi da utilizzare la natura dello sporco che deve essere rimosso. La scelta deve, per, tenere conto anche della composizione degli altri materiali, quelli originari che devono essere preservati e non alterati dalloperazione di pulitura. Quindi necessario ricorrere ad analisi preliminari ed effettuare unaccurata diagnosi al fine di ottenere informazioni pi precise sulla natura di questi materiali e dello sporco da rimuovere. Le amilasi richiedono solitamente un pH neutro, grazie alla loro capacit di degradare la molecola dellamido possono essere impiegate per la rimozione di diversi materiali adoperati nel restauro; amido presente nelle colle damido; sostanze amilacee come le farine, presenti in miscela con altri componenti nelle colle di pasta e nelle colle di farina. Dal momento che abbastanza infrequente la presenza di amido sulla superficie dipinta, spesso si ricorre alluso delle amilasi per interventi finalizzati alla rimozione di residui di colle, damido o di pasta, utilizzate in interventi di foderatura; risulta frequente il loro utilizzo su materiale cartaceo o librario. Le amilasi non hanno invece alcun effetto idrolitico sulla cellulosa e quindi non possono degradare carta, tela e legno, rendendo sicura la loro applicazione sul retro di un dipinto o sulla carta. Analogamente le amilasi non interagiscono neppure con altri polisaccaridi, come quelli costituenti le gomme vegetali (gomma arabica). Le proteasi possono richiedere un mezzo alcalino (come alcune proteasi microbiche, la Tripsina); neutro (la Papaina); acido (la Pepsina). Per la loro capacit di degradare peptidi, le proteasi sono adatte per la rimozione di materiali quali: colle e gelatine animali, albumine, caseina e uovo. Le proteasi sono utilizzate per interventi di pulitura dellimmagine pittorica, oppure per interventi pi strutturali quali, la rimozione di colle

utilizzate per la foderatura. Per quanto concerne la Caseina, se non viene applicata come tale ma come anione, cio come caseinato di calcio, che ha una differente suscettibilit allazione enzimatica, molto spesso accade su supporti murali, che le Proteasi si rivelano inefficienti Una valida alternativa pu essere rappresentata dalluso combinato dellenzima ad un chelante, tipicamente un sale dellacido etilendiamminotetracetico (EDTA), che ha la capacit di chelare, cio legare ioni metallici bi - trivalenti. Nel caso della Caseina, quando utilizzata come legante in combinazione con latte di calce e dunque nella forma di calcio caseinato, lEDTA e i suoi sali complessano lo ione calcio e quindi di fatto aiutano il processo di idrolisi dello strato. Laggiunta di EDTA ad una Proteasi non per sempre ammissibile, perch la solubilit dellEDTA in un mezzo acquoso apprezzabile solo in ambiente basico (quando lacido inizia a salificarsi); lambiente basico, per, non presenta un pH compatibile con tutte le Proteasi (quelle gastriche, tipo Pepsina, hanno infatti un pH ottimale in ambiente acido). Un grande numero di proteine microbiche di solito operanti ad un pH intorno alla neutralit, sono classificate come Proteasi neutre sensibili ai chelanti: la loro attivit catalitica strettamente dipendente dalla presenza, allinterno dellenzima, di ioni zinco, e se questi vengono chelati dallEDTA, lattivit catalitica notevolmente ridotta o nulla. Appartengono a questa categoria molte Proteasi derivate da specie di Bacillus, Aspergillus, Streptomyces e Pseudomonas. Il legante proteico delle tempere e della doratura aggredibile dalle Proteasi per cui luso di questo tipo di enzima a contatto con questi substrati richiede molta attenzione. Le lipasi, e in generale le Esterasi, richiedono solitamente un mezzo a pH neutro-alcalino (pH 7-9) e grazie alla loro azione idrolitica nei confronti dei Trigliceridi, le lipasi possono essere utilizzate per interventi di pulitura dellimmagine pittorica che richiedano la rimozione di oli siccativi (vernici oleo-resinose, beveroni, ridipinture). Alcune lipasi, invece, agiscono come Esterasi, capaci cio di idrolizzare esteri semplici; possono essere pertanto utilizzate per la rimozione di cere e resine sintetiche come esteri acrilici o vinilici. Questi tipologia di enzimi quella che pi di tutti richiede condizioni di temperatura vicine alla temperatura fisiologica di 37 C, perch in caso contrario la loro azione potrebbe risultare troppo lenta. La ragione sta nel fatto che le due subunit, lenzima e il substrato, hanno un carattere completamente opposto, idrosolubile il primo molto lipofilo il secondo. Per quanto riguarda le ridipinture ad olio bisogna tenere presente la possibile inibizione da parte di certi pigmenti che possono rivelarsi resistenti allazione delle lipasi; altri elementi come il Ferro (strati pigmentati con ocre e terre), invece, non sembrano comportarsi da inibitori risultando degradabili da attivit enzimatica.

Il dubbio continua a permanere, invece, per quanto riguarda il Rame (i pigmenti dellAzzurrite, Malachite e Verde di Rame), il Cromo (i pigmenti Gialli e Verdi di Cromo), il Cadmio (i Gialli e Rossi di Cadmio), il Piombo (i pigmenti della Biacca, Minio, Litargirio e Giallorino). Luso delle lipasi direttamente sullo strato del colore di un dipinto ad olio deve pertanto essere attentamente vagliato, invece raccomandato nel caso in cui lenzima agisca sopra uno strato di colore ad olio verniciato. Si possono distinguere due casi: i) il primo in cui ci si trova di fronte ad una ridipintura ad olio eseguita direttamente sopra lo strato di colore ad olio. In mancanza di un mezzo che permetta di agire sulla ridipintura, lasciando inalterato lo strato sottostante, risulta sicuramente pi selettiva la rimozione meccanica (a bisturi). Un certo margine di sicurezza potrebbe aversi soltanto nel caso in cui il colore originario sia molto pi vecchio della ridipintura; ii) nel secondo caso, in cui ci si trovasse davanti ad una ridipintura eseguita con lo stesso legante dello strato pittorico, ma da questo isolato da uno strato intermedio di materiale resinoso come da una vernice, luso degli enzimi rappresenterebbe un intervento sicuramente pi selettivo rispetto ai metodi tradizionali (solventi organici ad alta polarit oppure sostanze a carattere basico).

Solventi e sostanze basiche possono, inoltre, rappresentare un rischio anche per lintegrit dello strato sottostante, i solventi ad alta polarit (chetoni, alcoli o solventi dipolari aprotici) hanno, infatti, il pi delle volte effetto anche sulla resina invecchiata. Lenzima lipolitico agisce, invece, solo sul materiale oleoso superficiale e il mezzo acquoso in cui lenzima si trova disciolto non in grado di alterare lo strato sottostante di vernice. La maggior parte delle lipasi richiedono un mezzo tamponato a pH 8,0-9,0 e in queste condizioni di alcalinit il mezzo acquoso non in grado di salificare il materiale resinoso ( per questo fenomeno occorrerebbe un valore di pH superiore al 9,0). Diverse prove, condotte da Paolo Cremonesi, su stesure di vernici oleo- resinose applicate a dipinti, hanno dimostrato la possibilit di utilizzare la lipasi in combinazione con il Resin Soap, per formare

un Enzyme Soap cio un solvente enzimatico attivo su questo tipo di vernici. Anche in questo caso non si pu tuttavia parlare di unalternativa sempre valida, in quanto non si ha ancora modo di sapere, a priori, se la componente resinosa della vernice (componente idrocarburica) possa esercitare, oppure no, unazione inibitoria nei confronti dellenzima. UTILIZZO DELLE IDROLASI IN INTERVENTI DIVERSI DALLA PULITURA: La capacit degli enzimi di disgregare macromolecole organiche fa s che essi possano essere utilizzati non soltanto per operazioni di pulitura dellimmagine di un dipinto o in generale di superfici policrome, ma anche per operazioni finalizzate al consolidamento, intendendo con questo termine la rimozione di materiale da un supporto (residui di colla di pasta usata per foderature, rimozione di colla animale o vegetale da fogli di carta). La presenza di residui di colle molto vecchie pu talvolta configurarsi come unoperazione minuziosa e delicata. Luso degli enzimi, in sostituzione della tradizionale asportazione meccanica a bisturi, pu prevedere luso di unamilasi che agisca sulla componente propriamente amilacea della colla (la farina) e ricorrere ad una proteasi per la componente proteica, cio la colla animale. Prima di qualunque intervento occorre, per, considerare sempre la natura dei materiali costituenti la preparazione di un dipinto, necessario stabilire se si tratta di una preparazione magra a legante proteico (la tradizionale preparazione a gesso e colla); oppure di una mestica, cio una preparazione grassa a base di olio siccativo e una carica inerte (solitamente biacca o una terra). Dal momento che lazione avverr dal retro del dipinto, occorre considerare la possibilit che il mezzo acquoso contenente lenzima possa, almeno localmente, essere assorbito dalla tela ed arrivare in contatto con la preparazione dal lato opposto.In effetti, utilizzando una proteasi, anche il legante proteico potrebbe essere soggetto allazione enzimatica, con conseguente perdita di coesione dello strato e ripercussione sugli strati sovrastanti. Luso di unamilasi, invece, non comporterebbe problemi in quanto infrequente trovare sostanze amilacee allinterno di una preparazione a gesso e colla.Se lo strato preparatorio dellopera fosse invece costituito da una mestica (cio una preparazione grassa a base di olio siccativo e una carica inerte come una biacca o una terra), luso di una proteasi sarebbe privo di rischio per lassenza di sostanze a carattere proteico, mentre luso di unamilasi risulterebbe dannoso.