Actinomicetos Los actinomicetos representan un grupo ubicuo de microorganismos ampliamente distribuido en ecosistemas naturales y tienen gran importancia en la participacin

de la degradacin de materia orgnica, adems de ciertas propiedades fisiolgicas que los hacen particulares (Ghanem et al., 2000). En un principio los actinomicetos se incluyeron entre los hongos porque su morfologa y desarrollo presentaban gran similitud, dotados de un micelio verdadero; debido a esto se les denomin hongos radiados. Sin embargo, hoy en da, y dado su carcter procaritico, se sustenta muy bien su clasificacin como bacterias (Koneman, 2001; Prescott, 2002). Estos microorganismos resultan ser abundantes en suelos, tanto o ms que las mixobacterias (Ben-Omar et al., 1997), sin embargo, tambin se encuentran en ambientes acuticos, dulces y marinos (Leiva et al., 2004). Dentro de sus caractersticas particulares presentan un olor tpico a suelo hmedo por la produccin de un metabolito llamado geosmina, adicionalmente presentan una actividad metablica alta, producen terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares con las que son capaces de degradar la materia orgnica de origen vegetal y animal (Ezziyyani et al., 2004). Como la gran mayora de bacterias que son abundantes en suelo, presentan un importante papel ecolgico en el mismo (Ben-Omar et al., 1997). 3.3.1. Caractersticas Generales Los actinomicetos constituyen un grupo heterogneo de microorganismos; son bacterias Gram positivas que se caracterizan por su capacidad de formar filamentos ramificados. El orden de los Actinomycetales comprende 63 gneros constituyendo, aproximadamente del 20-60% de la poblacin microbiana del suelo (Ezziyyani et al., 2004). En la actualidad, los actinomicetos se encuentran incluidos en el domino bacteria (Figura 1) debido a varias razones: la pared celular est compuesta por peptidoglicano, el dimetro de sus hifas es inferior al de los hongos (0.5 a 2.0 m), son sensibles a los antimicrobianos pero presentan resistencia a los antifngicos y la disposicin de su material gentico es tpicamente procaritica (Sylvia, 2005), aunque se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN, encontrndose entre el rango de 51 a 78% G+C. Estas bacterias son aerobias y algunas anaerobias, pudindose encontrar en animales o en el hombre; son hetertrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes de carbono simples, complejas y compuestos moleculares orgnicos tales como cidos, azcares, polisacridos, lpidos, protenas e hidrocarburos alifticos. Utilizan como fuentes de nitrgeno amonio, nitratos, aminocidos, peptonas y un gran nmero de protenas (Leveau & Bouix, 2000). Frecuentemente, alcanzan grandes densidades poblacionales en suelos con alto contenido de materia orgnica y amplias reservas de carbono asimilable y humus (Fernndez, 1988). Existen tres factores que influyen en la distribucin y en la actividad de muchos actinomicetos en el suelo: el pH, la temperatura y el tipo de suelo, particularmente su composicin. La taxonoma de los actinomicetos ha avanzado mucho durante los ltimos treinta aos, al mismo tiempo que el nmero de gneros de este grupo, cuyo aumento debe atribuirse en gran parte al inters industrial que poseen. En la Figura 1 se presenta un rbol filogentico con la descripcin del nmero de gneros, rdenes y subrdenes (Prescott, 2002). La mayora de los actinomicetos son mesfilos y su crecimiento se registra entre 25C a 30C, en temperaturas inferiores a 5C el crecimiento es nulo prcticamente y temperaturas superiores a

55C solo algunas especies termoflicas de Streptomyces sp.,Thermomonospora sp. y Thermoactinomyces sp. son capaces de crecer aunque el efecto de la alta temperatura posiblemente sea letal para el microorganismo si est acompaado de humedad (Stanley, 1994). En relacin con los requerimientos de oxgeno, estos microorganismos generalmente son aerobios creciendo en buena proporcin en suelos drenados de granulacin ptima que permiten un adecuado intercambio gaseoso. De acuerdo a la especie son afectados por la disminucin en la concentracin de oxgeno, debido a que algunos de ellos son microaeroflicos y toleran bajas presiones parciales de dicho gas en el suelo (Koneman, 2001). Figura 1. Relaciones taxonmicas y filogenticos de la clase Actinobacteria (Prescott, 2002). La composicin de la pared celular de los actinomicetos vara mucho segn los grupos y tiene una importancia taxonmica considerable. Cabe distinguir cuatro tipos principales de pared celular . Las caractersticas, segn la composicin y estructura del peptidoglucano son (Prescott, 2002) La ubicacin del aminocido en la posicin 3 de la cadena lateral del tetrapptido. La presencia de glicina en los puentes interpeptdicos El tipo de azcares que contiene el peptidoglucano. Los actinomicetos predominan en forma libre en suelos secos y clidos en cantidades de millones por cada gramo de suelo, se caracterizan por tener la capacidad de sintetizar antibiticos y se han descrito como posibles promotores de crecimiento vegetal. Caractersticas de Actinobacterias (dimensiones, morfologa, contenido G+C, requerimientos de oxgeno y otras caractersticas) (Prescott, 2002). 3.3.2. Condiciones de crecimiento La adicin de materia orgnica a los suelos estimula la multiplicacin y actividad de los actinomicetos. Los suelos alcalinos y neutros resultan ser ms favorables para el desarrollo de estas bacterias; el rango de pH ptimo para las actividades de estos microorganismos se encuentra entre 6.5 y 8.0; en suelos con pH por debajo de 5.0 es frecuente observar su ausencia. Los actinomicetos al ser principalmente aerobios se desarrollan favorablemente en suelos bien aireados; suelos con humedades entre el 80 y el 90% son perjudiciales para el crecimiento de los actinomicetos. El porcentaje de actinomicetos en la poblacin total microbiana incrementa con la profundidad del suelo, sin embargo pueden ser encontrados en la superficie de ste. Los gneros Streptomyces, Nocardia y Micromonospora se encuentran frecuentemente como habitantes del suelo (Titus & Pereira 1999). La mayora de los actinomicetos crecen en medios como agar nutritivo, agar tripticasa soja, agar sangre o agar infusin cerebro corazn. Sin embargo, para la diferenciacin y el desarrollo de esporas y/o pigmentos se necesita de medios suplementados con quitina coloidal, extracto de suelo, avena, almidn con sales inorgnicas, agar agua con determinados polisacridos como fuente de carbono, extracto de levadura o peptona. Por ejemplo las colonias de algunas especies de Streptomyces que crecen como colonias duras, brillantes y plidas en agar nutritivo; en medio avena o de sales inorgnicas con almidn pueden crecer como colonias amarillas brillantes con micelio areo pulverulento blanco (Bergey et al., 2000). El crecimiento de las colonias de actinomicetos en medio slido se puede ver a los 3 4 das de incubacin pero el desarrollo de micelio areo maduro con esporas puede tardar entre 7 y 14 das en desarrollarse, y en algunas cepas de crecimiento lento hasta ms de un mes de incubacin. El

crecimiento en medios lquidos estacionarios se restringe a la formacin de una pelcula en la superficie o quizs un sedimento algodonoso dejando el medio lquido transparente. Por lo cual para el crecimiento en medios lquidos se recomienda una agitacin a velocidades como 200 250 rpm para suministrar la mejor aireacin posible. A diferencia de las bacterias no filamentosas, los actinomicetos pueden crecer formando pellets o agrupaciones de filamentos en medios lquidos (Prescott, 2002). Se caracterizan por no producir mucopolisacridos como otras bacterias como las mixobacterias (Ben-Omar et al., 1997), de ah que se observen en placas de agar como colonias secas y no cremosas. 3.3.3. Ecologa y distribucin Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos que se encuentran en la gran mayora de sustratos naturales, ampliamente distribuidos en una gran variedad de hbitats diferentes: suelo, agua marina, agua dulce, aire, estircol, fango de los ros y fondo de los lagos. Son saprfitos y algunas especies pueden provocar enfermedades a las plantas, animales domsticos e incluso al hombre (Martin 1981). En el suelo se encuentran en casi todos los tipos y bajo condiciones extremas disminuyen levemente la concentracin de la poblacin. Su nmero vara en gran proporcin segn el caso, pero es comn encontrarlos en suelos frtiles con concentraciones de 106 UFCg-1 de suelo seco. Por lo general se aslan cepas de actinomicetos en la superficie del suelo y en profundidades entre 2 y 15 cm, ms all de esta profundidad disminuye la cantidad de stos. El tamao de la comunidad depende del tipo del suelo, particularmente de algunas de las caractersticas fsicas, del contenido de materia orgnica y del pH del medio ambiente (Tate, 2000). Los principales gneros que se aslan a partir de suelos son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas (Martin, 1981). Sin embargo, los mtodos de aislamiento convencionales muestran que el 95% de los actinomicetos aislados a partir de suelo pertenecen al gnero Streptomyces(Lacey, 1973). El uso de tcnicas moleculares para la deteccin de estas bacterias en diferentes ambientes ha mostrado la presencia de organismos de la clase Actinobacteria que no han podido ser aislados por tcnicas tradicionales de cultivo. Ciertos de estos organismos no han sido identificados especficamente, y la posicin filogentica de algunos subgrupos muestra que su divergencia corresponde con la de los gneros tradicionales de actinomicetos, indicando una estructura rica en organismos de esta clase y no cultivable en suelos (Rheims et al., 1999). Los actinomicetos son frecuentemente descritos como organismos de crecimiento lento que no compiten eficientemente con bacterias u hongos de rpido crecimiento por el carbono disponible en el suelo. Sin embargo, son microorganismos importantes en la mineralizacin del carbono y el nitrgeno, y en la descomposicin de la materia orgnica presente en el suelo. La descomposicin de la materia orgnica en el suelo es llevada a cabo por los actinomicetos gracias a la diversidad de enzimas hidrolticas, ligninolticas y por la capacidad de degradar compuestos recalcitrantes presentes en la materia orgnica que es mineralizada en el suelo (Sylvia, 1998). Algunos gneros han sido reportados como fijadores de nitrgeno atmosfrico, como Frankia y algunas cepas pertenecientes a las familias Thermomonosporaceae y Micromonosporaceae (Valds et al., 2005). Los actinomicetos tambin han sido descritos como agentes de biocontrol por la capacidad de producir enzimas biodegradativas como quitinasas, glucanasas, peroxidasas y otras, involucradas

en el papel del micoparasitismo que llevan a cabo estos microorganismos (Tokala et al., 2002). El gnero Streptomyces ha sido descrito como colonizador de la rizosfera, capaz de ejercer biocontrol sobre hongos fitopatgenos, producir siderforos, sustancias promotoras del crecimiento vegetal in vitro, promover la nodulacin y ayudar a los bacteriodes de Rhizobium a la asimilacin del hierro en la fijacin de nitrgeno en leguminosas, lo cual contribuye indirectamente a la promocin de crecimiento vegetal (Tokala et al., 2002). 3.3.4. Clasificacin de los Actinomicetos La clasificacin de los actinomicetos ha ido evolucionando a medida que se han generado nuevas tcnicas de clasificacin. El gran inters que generaron los actinomicetos por la gran diversidad de metabolitos secundarios y teraputicos, especialmente el gnero Streptomyces, hizo que se desarrollaran rpidamente estudios de carcter citolgico y fisiolgico pero no ampliamente los de clasificacin (Hopwood, 2003). Los criterios de clasificacin utilizados se han basado en la quimiotaxonoma, donde se estudian los componentes de la pared bacteriana (Tabla 1), el tipo de peptidoglicano incluyendo azcares e ismeros de cido diaminopimlico (DAP), el patrn de los cidos grasos y de fosfolpidos de membrana, las menaquinonas y su grado de hidrogenacin, contenido y tipo de cidos miclicos, y el porcentaje molar de relacin Guanina - Citosina (mol% G+C) del ADN (Goodfellow & Cross, 1984; McNeil & Brown, 1994). Otro criterio que se ha usado para la clasificacin es la fagotipificacin, aprovechando la especificidad por el hospedador de los actinofagos, con lo cual se ha conseguido identificar hasta nivel de gnero y especie, especialmente para el gnero Streptomyces (Wellington & Williams, 1981). La serologa ha sido tambin utilizada para la clasificacin de los actinomicetos, as como el desarrollo de pruebas bioqumicas rpidas para la identificacin de los miembros de la familia Actinomycetaceae y otras bacterias relacionadas como es el caso del sistema API ZYM, y el desarrollo de sustratos cromognicos y fluorognicos para la deteccin de enzimas bacterianas que permitan una rpida y acertada clasificacin (McNeil & Brown, 1994). La clasificacin del gnero Streptomyces se inicia en 1964 con el proyecto internacional de Streptomyces (ISP del ingls Internacional Streptomyces Project) para introducir un criterio estndar en la determinacin de especies de este gnero. Mediante la utilizacin de varias caractersticas fenotpicas se consigui reducir la cantidad de especies de Streptomyces de 463 a 142 de la versin del Manual de Sistemtica Bacteriolgica de Bergey del ao 1972 al ao 1989. Adicionalmente, existan aislamientos que no concordaban con las matrices de identificacin. Hoy en da, para la clasificacin de especies de Streptomyces, se deben utilizar mtodos quimiotaxonmicos y moleculares, junto con los mtodos de taxonoma numrica basados en criterios fenotpicos (Wellington & Anderson, 2001). La aplicacin de tcnicas moleculares al anlisis de genomas bacterianos ha contribuido considerablemente a la taxonoma bacteriana (Wellington & Anderson, 2001). Filogenticamente los actinomicetos forman una subdivisin de los organismos del dominio Bacteria, diferente de los formadores de endosporas y de los cocos Gram positivos (Figura 2). Figura 2. rbol filogentico de los organismos tomado de: Kitasato University, (2007) Las subunidades 16S y 23S del ADNr son molculas razonablemente grandes y por consiguiente contienen informacin suficiente para llevar a cabo comparaciones significativas. Dado que el ADNr 16S es ms manejable que el 23S para la experimentacin, se est utilizando extensamente para estudios filogenticos (Madigan et

al., 1998). La secuencia de nucletidos del ADNr 16S est altamente conservada en algunas regiones y contiene regiones variables y las tasas de mutacin son relativamente bajas. Un gran nmero de secuencias estn disponibles en las bases de datos, lo que facilita la identificacin de regiones con secuencias nicas por medio de alineamientos (Rosado et al., 1997). Particularmente, los genes codificantes para la subunidad 16S del ADNr contienen regiones con secuencias altamente conservadas y regiones muy variables, las cuales permiten la medida de relaciones filogenticas entre taxa cercanos o distantes y la capacidad de resolver el dominio, divisin, familia, clase, orden, gnero y especie de los microorganismos analizados (Penny & Haldeman, 1997). Aislamiento de actinomicetos De cada una de las muestras de suelo se tomaron 10 g (previa homogenizacin de las muestras) y se adicionaron a 90 ml de agua peptonada al 0.1% p/v para realizar las diluciones seriadas, utilizando la misma solucin diluyente, hasta llegar a una dilucin de 10-8. De las diluciones 10-4 a 10-8 se sembraron por triplicado en superficie 0.1 ml de la dilucin sobre medio agar avena suplementado con nistatina al 0.1% como agente inhibidor de hongos . La suspensin se distribuy sobre la superficie del agar de forma homognea y luego se incub a 22C durante 10 das (Sylvia, 1998; FrancoCorrea, 1999). Pasado el tiempo de incubacin se seleccionaron las colonias segn las caractersticas morfolgicas que permitieron determinar los aislamientos de actinomicetos (textura, coloracin del micelio areo y de sustrato, forma y tamao de la colonia, y la produccin de pigmentos (Bergey & Hendricks, 1984). Posteriormente se realiz el recuento de la poblacin y se purificaron los aislamientos en agar avena suplementado con nistatina al 0.1% Conservacin de las cepas de actinomicetos Para la conservacin de los actinomicetos se utiliz 1 ml de glicerol a una concentracin de 12% que se adicion a tubos eppendorf de 1.5 ml, secos y estriles (Bayona, 2003). De cada una de las cepas de actinomicetos se realiz un raspado de la superficie con cuchillas quirrgicas estriles, el cual fue colocado dentro de los tubos eppendorf homogenizndolo con el glicerol para su posterior almacenamiento a -20C. Para la conservacin a corto plazo (subcultivo) se realizaron siembras masivas de cada una de las cepas aisladas en agar avena (tubos), se mantuvieron a temperatura de refrigeracin (4C) y se hicieron sub-cultivos cada 30 das.