Biotecnologia Vegetal

BIOTECNOLOGIA VEGETAL I

Universidade de vora

Prof. Amely Zavattieri

2002

Micropropagao
!Introduo !Multiplicao conforme !Etapas !Automatizao !Dupla fase !Robotizao !Bioreactores

A Micropropagation a propagao fiel de um gentipo seleccionado por meio das tcnicas da cultura in vitro. Geralmente a micropropagao tambm associada com a produo em grande escala a preos competitivos. O Prof. Murashige (Univ. de California, Riverside) definiu 3 fases principais na multiplicao in vitro de plantas, tanto para os laboratrios comerciais como para os de investigao. Estas fases descrevem passos a seguir no processo, como assim tambm momentos na cultura nos quais as necessidades do ambiente da cultura devem ser modificados. A figura seguinte representa um esquema das diferentes fases do processo de micropropagao como proposto por Deberg e Maene (1981).
in vivo in vitro Fase 0: preparao da planta me

Fase 1: Iniciao assptica Fase 2: multiplicao Fase 3a: Alongamento Fase 3b: Induo radicular e preaclimatao

in vivo

Fase 4: aclimatao

Teoricamente as plantas que no so quimereas podem ser propagadas usando diferentes tcnicas: rebentos axilares; rebentos adventcios; embriognese,... Para efeitos da micropropagao a tcnica de multiplicao via rebentos axilares a preferida para a maioria das plantas. Isto em princpio produz plantas conformes. a nica tcnica que pode ser aplicada propagao de quimeras. Com o aumento do nmero de subculturas o meio que originalmente tinha sido preparado para dar rebentos axilares pode ser mudado para a produo de rebentos adventcios. Como consequncia o nmero de variao somaclonal se incrementa.

Rebentos axilares obtidos de uma Dracaena (quimera).

Desenvolvimento de gomos adventcios em Dracaena (quimera).

Fases da Micropropagao "Fase 0 "Fase 1 "Fase 2 "Fase 3 "Fase 4

Fase 0. Preparao das plantas me

1. Plantas saudveis 2. Evitar rega excessiva das plantas mes 3. Induzir crescimento vigoroso nas plantas mes

Fase 0. Foi originalmente concebido

para melhorar as condies higinicas das plantas me.. Prvio ao inicio da cultura dever prestar-se uma ateno especial da planta da qual sero retirado/s o/s explants. As plantas mes podero ser previamente tratadas com hormonas, desinfectantes, fazer testes de viroses, etc. todo em vista ao xito da cultura in vitro. A desinfeco do material vegetal essencial nesta fase. O crescimento, a morfognese e as taxas de crescimento e propagao da cultura dependero do tratamento prvio da planta me.

Fase O Possveis pre-tatamentos

Poda; perda da dominncia apical Rega gota -a gota das plantas mes.

Solues foradas contendo GA3; citocininas; hidroxiquinoleina

Etiolamento

Injeco de citocininas

Enxertia em cascada

Fase1: Estabelecimento da cultura

1. Seleco do explant 2. Desinfeco superficial 3. Meio de cultura 4. Acastanhamento do meio 5. Consistncia do meio 6. Condies ambientais

Condies ambientais a considerar Temperatura 1. Afecta o crescimento das culturas 2. Efeito sobre a morfognese
Humidade relativa Luz

1. Qualidade 2. Quantidade 3. Efeito sobre a morfognese

Fase 1 Estabelecimento da cultura

Objectivos

#Dar incio cultura #Em princpio o mtodo usado deve ser

reproduzvel Deve existir um compromisso entre uma adequada desinfeco do material vegetal e uma boa taxa de sobrevivncia dos explants no contaminados.

Procedimento
Frequentemente para o incio da cultura so usados gomos axilares ou meristemas. Em certos casos so usados outras partes da planta. Ex. Sendo difcil obter gomos axilares no contaminados em Ficus lyrata e Anthurium spp. Gomos adventcios so primeiramente obtidos sobre folhas, os rebentos assim obtidos so ento seccionados para ser os explants iniciais da fase 2. recomendvel no iniciar a propagao durante a fase de iniciao.

Exemplo: incio da cultura em Roseira

Exemplo: Fase de iniciao em roseiras

Plantas me com rega gota -a gota

So retirados ramos jovens. Cortar os pices e as bases dos ramos

So retiradas as folhas ficando os pecolos nas seces cortadas.

Lavar com 80% etanol, desinfectar em lexivia comercial 10% (NaOCl) por 15 minutos

Lavar 3x com gua estril

Cortar os extremos o mais prximo possvel do n.

Entre ns cortados. Cada n contm um meristema axilar.

Colocao de um n em um tubo de ensaio.

Transladar os tubos para a sala de cultura

Fase 2. Multiplicao
O objectivo desta fase a multiplicao propriamente dita dos rgos e estruturas que so capazes de dar origem a plantas completas. De acordo com os mtodos de propagao que sejam empregues estas estruturas podero ser: rebentos axilares ou adventcios, embries o rgos em miniatura como microtubrculos, cormos, etc. Em alguns programas de micropropagao este estado inclui uma induo prvia de centros ou zonas meristemticas a partir da qual se desenvolvero os rgos adventcios. Os rebentos produzidos na fase 2 so considerados como propgulos pois podem ser propagados ou multiplicados para aumentar o seu nmero em sucessivas subculturas.

1. Produo de rebentos adventcios 2. Produo de rebentos axilares 3. Embriognese somtica

Multiplicao Vegetativa por Gomos (rebentos) Adventcios. Adventcios

A- O explant constitudo de um fragmento de rgo, de uma poro de tecido ou mesmo de clulas isoladas (gros de plen, protoplastos, etc. B- Os rebentos so neoformados (formados de novo) a partir de clulas do explant inicial. C- Estes rebentos desenvolvem-se em caules, geralmente sobre um meio de alongamento D- As clulas do explant inicial dividem-se rapidamente e formam, de maneira desorganizada, um calo primrio ligado ao explant de partida

E- O calo primrio pode ser subcultivado em meio slido para crescimento do calo

F- O calo forma rebentos sob um meio de induo apropriado G- Todos os ramos obtidos so transferidos para um meio neutro ou enriquecido em auxinas que provocam o posterior enraizamento. A conformidade do material das plantas obtidas por este mtodo, no pode ser garantida.

Multiplicao Vegetativa por gomos (rebentos) Axilares.

A- O explant pode conter um meristema isolado, um gomo terminal ou axilar, uma extremidade de um ramo, um fragmento de ramo que possua pelo menos 1 gomo axilar B- Num meio com citocininas o meristema cresce, o gomo desenvolve-se em um ramo folhoso C- Este ramo pode ser cortado em fragmentos (ns que permanecem sobre o mesmo meio dando novos ramos folhosos D- Se o explant inicial depositado num meio rico em citocininas, os gomos desenvolvem-se dando um ramo folhoso que se ramifica ele prprio dando ramos secundrios e posteriormente tercirios, e assim sucessivamente E- Os tufos de rebentos so fragmentados e a multiplicao realiza-se nesta fase F- Os rebentos so transferidos para meio de alongamento para preparar os mesmos para a fase de enraizamento G- Os ramos podem ser agora transferidos par um meio neutro (S/hormonas) ou com auxinas para enraizarem. A taxa de multiplicao pode variar entre 2 a mais de 20 por ms.

Fase 2 Multiplicao

Taxa de Multiplicao

Fig. 1. Teoricamente o numero de plantas que podem ser produzidas em 1 ano quando a taxa de multiplicao de 2 (A) ou 4 (B) por mes.

Para a maioria dos sistemas de micropropagao os sistemas de ramificao axilar so os mais favorveis. Em outros sistemas mais avanados podem ser usados embries, gomos adventcios, ns, conjuntos meristemticos.

Multiplicao porEmbrignese Somtica.

A embriognese somtica aparece a maior parte das vezes em suspenses celulares, ocasionalmente sobre calos, e mais raramente directamente sobre rgos A- O explant de partida pode ser um fragmento de rgo, de tecido, ou clulas isoladas. B- Forma-se um calo primrio (em rgos) ou um micro calo (em clulas isoladas). C- Subcultura de calo primrio ou de microcalos D- O calo pode dissociar-se e multiplicar-se sob a forma de suspenso celular E- Em certas condies, as culturas celulares em meio lquido ou slido organizam-se em pequenos macios de estruturas bipolares chamados embriides, ou embries somticos F- Os embries somticos se desenvolvem directamente em plntulas com raiz como as derivadas de uma semente.

Exemplo: multiplicao de roseiras.

Fase 3 Enraizamento

Fase 3: Enraizamento
Os rebentos ou plntulas derivadas da fase 2, so muito pequenas e incompletas, no sendo possvel a sua transferncia directa para o solo ou outro substrato, pelo que nesta fase, so seguidos certos procedimentos para que estas pequenas plantas desenvolvam a sua capacidade fotossinttica e sejam capazes de sobreviver em condies naturais sem a adio artificial de carbohidratos.

recomendvel dividir esta fase em fase de alongamento (3a) e fase de induo radicular e pre-aclimatao (3b).

Enraizamento (cont.) Fase 3a: alongamento

Em certos casos o alongamento dos caules um pre-requisimo para a fase de enraizamento $Os meios de cultura desta fase geralmente no contm citicininas como as usadas na fase 2 $Nesta fase pode ser necessrio adicionar carvo activado para neutralizar os efeitos das citicininas da fase 2 $Dependendo do tipo de planta, o alongamento pode pode ser feito em caules singulares ou em caules agrupados (roseta).

Fase 3b: induo radicular e pre-aclimatao

Frequentemente so as auxinas os reguladores de crescimentos usados para induzir enraizamento. No entanto, h que ter em conta que as auxinas inibem o posterior crescimento das razes. Melhor enraizamento geralmente obtido em meios com baixa concentrao de sais (ex. Knop 1/2). $As razes que se desenvolvem em condies in vitro, no so frequentemente aptas para as condies de estufa e podem ocasionar problemas no momento do transplante (stress hdrico). $A induo pode ser feita em caules simples ou em caules em rosetas $Para alm do enraizamento esta fase deve favorecer a aclimatao posterior das plantas. Para isto pode-se: favorecer as condies autotrficas; suplementar as plantas com carbohidratos, diminuir a humidade relativa dos recipientes da cultura, micorrizao, utilizao de substratos inertes (e.g. rockwool, tacos de celulose, espuma de poliuretano.

Fase 4 Aclimatao

Fase 4: Aclimatao
Factores ambientais Humidade relativa Luz Enfermidades patognicas Factores da Planta Morfologia estomtica Funcionamento estomtico Dormncia Formao da cera epi-cuticular Capacidade fotossinttica

Fase 4: aclimatao (cont.)

O objectivo desta fase a de optimizar a transferncia das plantas da condio in vitro as condies de campo ou de estufa. A maior preocupao dever ser a de minimizar as perdas e acelerar os procedimentos.

Exemplo: aclimatao em roseiras Ver tambm: aclimatao

Fases da micropropagao (esquema geral)

Tcnica da dupla-fase Sistema de dupla fase aplicado multiplicao in vitro de Cordyline terminalis.
Adicionar 20 ml de meio lquido sobre o meio da fase final (slido) (inicialmente 100 ml), de maneira a evitar as subculturas. Isto reduz os custos do processo. O sistema usado : Durante a fase 2 para plantas que requerem um longo perodo de subculturas (e.g. orqudeas, uma subcultura leva aproximadamente 6 meses, meio fresco adicionado aos 3 meses em cultura); Na fase final para induzir alongamento e/ou enraizamento.

Os ingredientes clssicos usados na tcnica de dupla fase so: macro nutrientes de Knop concentrao; "carvo activado; "acares; "auxinas

Desenvolviment o posterior

Rosas em contendor de plstico

Enchimento com meio para dupla-fase

Efeito do sistema de dupla fase no crescimento in vitro de Cordyline terminalis.

Peso Peso mdio Peso meio N mdio mdio dos dos rebentos rebentos (g) 4 por de contenedo rebentos no semanas depois do r com > transplant (g) 2.5 cm e transplante (g) (g)

Tratamento

Fase 2 cultura transferidas para meio fresco no incio da Fase 3 Fase 2 cultura na qual foi adicionado meio fresco na Fase 3

23.3 5.5

22.4 5.5

0.139 0.013

0.174

28.0 1.6

51.4 6.9

0.191 0.022

0.269

Vantagens da Micropropagao
! As plantas so frequentemente mais uniformes

! Pode ser a nica forma de as propagar vegetativamente ! As plantas tem geralmente um crescimento mas rpido ! Maduram mais rpido que as propagadas por sementes ! Pode ser usada para produzir linhas parentais para produzir sementes. Para manter as linhas parentais. Para prevenir depresso por consanguinidade

Desvantagens da Micropropagao
!

A propagao massiva no pode ser aplicada actualmente em todas as espcies vegetais

! A regenerao pode no ser possvel. Especialmente para rvores lenhosos adultos. Existem mais problemas para obter razes que rebentos ! Podem no ter um crescimento uniforme e em lugar disso ter diferentes taxas de crescimento e madurao in vitro

Aplicaes da Micropropagao
%1. Propagao clonal %2. Propagao de plantas difceis de propagar por outra via ou plantas muito valiosas %3. Introduo de novos cultivares %4. Propagao vegetativa de plantas mes ou parentais %5. Eliminao de patogenias %6. Armazenamento de germoplasmas

Alguns exemplos

Robotizao

A mo de obra representa aproximadamente 70% do custo de uma planta micropropagada. Por este motivo muitos laboratrios de micropropagao esto instalando-se em pases onde a mo de obra mais barata. Uma alternativa a utilizao de robots. Existem no entanto, alguns problemas especficos com a robotizao da cultura de tecidos, alguns destes so: !Os tecidos vegetais so frgeis !No esto presentes tecidos vegetais idnticos ! necessria uma manipulao assptica A figura seguinte representa a configurao de um sistema robtico totalmente automatizado para a multiplicao de Chrysanthemum. Neste sistema o brao do robot efectua as operaes de corte e transplante.

Bio reactores a pequena escala

Bio reactores em grande escala no so favorveis micropropagao pois so demasiado caros e representam um sistema com alto risco em perdas de grande nmero de plantas simultaneamente. Pequenos bio reactores do maior flexibilidade e permitem um controlo individual dos componentes. So exemplos: Nalgene TM unidades de filtrao, o RITA TM (Cirad, Montpellier) e LifeReactor TM da Osmotek.

Nalgene TM filter units

Lifereactor TM

RITA TM