MINISTRIO DA SADE

Jos Serra
Ministro de Estado da Sade

Joo Yunes
Secretrio de Polticas de Sade

Pedro Chequer
Coordenador Nacional de DST e Aids

Hlio Moraes de Souza

Coordenador Nacional de Sangue e Hemoderivados

Miriam Franchini e Hlio Moraes de Souza

Coordenadores do projeto TELELAB -Srie Sangue

Autores:
Ana Maria Coimbra Gaspar Clara T. Tachibana Yoshida Dagmar Kiesslich Edwin Antnio S. Castillo Geni N. Noceti de Lima Cmara Neiva Sellan Lopes Gonales Luiz Alberto Peregrino Ferreira Maristela Arantes Marteleto (pedagogia)

Hepatites Virais Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Ministrio da Sade, Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. 1998. 68 p.: il. (Srie TELELAB ) 1. Hepatites Virais Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica I. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids (Brasil) II. Srie TELELAB

Apresentao
Coordenao Nacional de DST e Aids e a Coordenao de Sangue e Hemoderivados do Ministrio da Sade, em nome do compromisso com a melhoria do atendimento populao, unem seus esforos a fim de promover o aperfeioamento dos profissionais dos laboratrios de sade pblica e das unidades hemoterpicas. Nessa perspectiva, os cursos do Sistema de Educao a Distncia TELELAB, organizados numa abordagem favorvel ao repensar da prtica profissional, oferecem aos profissionais da sade uma oportunidade de adquirir conhecimentos embasados em critrios tcnico-cientficos de qualidade para assegurar o padro de excelncia desejvel no atendimento aos usurios dos servios de sade. Queremos deixar registrado nosso agradecimento a todos os que contriburam na produo dos vdeos e dos manuais que compem os cursos. Esses especialistas de reas to diversas aproveitaram as diferenas para realizar um trabalho harmnico e integrado, o que refora a nossa idia de que em equipe e em parceria que se constri um sistema nico de sade com qualidade. Aos alunos do TELELAB nossas boas vindas e votos de sucesso! Pedro Chequer
Coordenador Nacional de DST e Aids

Hlio Moraes de Souza

Coordenador Nacional de Sangue e Hemoderivados

HEPATITES VIRAIS

Seja bem-vindo (a)!

Voc agora faz parte do TELELAB, um Sistema de Educao a Distncia do Ministrio da Sade. Esto sua disposio os seguintes cursos:
Cursos TELELAB 01 - Tcnicas para Coleta de Secrees 02 - Tcnicas para Coleta de Sangue 03 - Tcnica de Colorao de Gram 04 - Cultura, Isolamento e Identificao de "Neisseria gonorrhoeae" 05 - Diagnstico Laboratorial da Chlamydia 06 - Diagnstico Sorolgico da Sfilis 07 - Diagnstico Sorolgico do HIV: Testes de Triagem 08 - Diagnstico Sorolgico do HIV: Testes Confirmatrios 09 - Coleta de Sangue de Doadores 10 - Preparao de Hemocomponentes 11 - Doena de Chagas Triagem e Diagnstico Sorolgico em unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica 12 - HTLV-I/II Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica 13 - Hepatites Virais Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica 14 - Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica 15 - Equipamentos Utilizao e Monitoramento em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica 16 - Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica Pr-requisitos Curso 01 Curso 01 e Curso 03 Curso 01 Curso 02 Curso 02 Curso 02 e Curso 07 Curso 09 Curso 02 Curso 02 Curso 02 Curso 06 ou 07 ou 11 ou 12 ou 13 Um dos cursos anteriores Um dos cursos anteriores

Observaes: 1. Voc se inscreve em um curso por vez, escolhido de acordo com seu interesse e/ou necessidade do servio, respeitando os pr-requisitos identificados. 2. O curso Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos complemento essencial para todos os cursos de diagnstico sorolgico. Ele deve ser feito imediatamente aps a concluso do primeiro desses cursos (06 ou 07 ou 11 ou 12 ou 13). 3. Os cursos de Equipamentos (15) e de Biossegurana (16) so complementos essenciais para todos os outros cursos e devem ser feitos aps o primeiro curso concludo por voc.

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Como funciona
Os cursos do TELELAB esto programados de modo a no interferir na sua rotina de trabalho e voc tem 1 ms para concluir cada curso que fizer. Em cada um deles, voc: Pr-teste faz um pr-teste e, depois, assiste a um vdeo Vdeo quantas vezes quiser, no lugar combinado com a coordenao local do TELELAB; Manual Ps-teste Certificado estuda o manual correspondente, no tempo, horrio e lugar de sua preferncia; faz um ps-teste para avaliao de sua aprendizagem; depois de acertar no mnimo 80% do psteste, recebe, um certificado.

Para esclarecimentos de dvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com: TELELAB - CN-DST/AIDS MS Fax gratuito: 0800-612436
Ao final do curso "Hepatites Virais - Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica", voc ser capaz de: identificar os procedimentos e as tcnicas recomendados pelo Ministrio da Sade para a triagem sorolgica de doadores de sangue e para o diagnstico sorolgico das hepatites virais; executar os testes para deteco dos marcadores sorolgicos das hepatites virais A, B e C, obedecendo a critrios tcnicos e de controle de qualidade.

GUARDE ESTE MANUAL. ELE SEU. USE-O!

Sumrio
INTRODUO HEPATITES VIRAIS introduo principais vrus formas de transmisso e distribuio geogrfica manifestaes clnicas vacinas 7 7 9 10 12 13 14

TRIAGEM SOROLGICA DE DOADORES DE SANGUE E DIAGNSTICO SOROLGICO DAS HEPATITES VIRAIS 15 vrus investigados na triagem de doadores de sangue e vrus investigados para o diagnstico etiolgico 17 pesquisa do HDV e do HEV 17 principais marcadores sorolgicos do HAV, do HBV e do HCV deteco dos marcadores do HAV no curso sorolgico tpico da hepatite A deteco dos marcadores do HBV no curso sorolgico tpico da hepatite B caracterizao sorolgica da evoluo para a forma crnica da infeco pelo vrus da hepatite B identificao do marcador do HCV no curso sorolgico tpico da hepatite C marcadores sorolgicos pesquisados na triagem de doadores de sangue fluxograma de testagem na triagem de doadores de sangue procedimentos com doadores com resultados reagentes ou indeterminados marcadores sorolgicos pesquisados para o diagnstico etiolgico fluxograma para diagnstico das hepatites virais agudas fluxograma para diagnstico da hepatite C METODOLOGIAS PARA DIAGNSTICO SOROLGICO DAS HEPATITES VIRAIS dosagem bioqumica mtodos de biologia molecular testes sorolgicos hemaglutinao radioimunoensaio quimioluminescncia imunoenzimtico testes imunoenzimticos ELISA e Imunoblot ELISA fase slida, antgeno, anticorpo, enzima, substrato e cromgeno tipos e seqncias das reaes dos ELISA utilizadas na deteco dos marcadores sorolgicos das hepatites A, B e C sanduche para pesquisa de antgeno 18 19 20 22 23 23 24 26 26 26 28 31 33 33 34 34 35 35 35 35 36 37 38

ELISA indireto ELISA de captura para lgM ELISA competitivo definio de resultado no ELISA clculo da zona cinza componentes do Imunoblot seqncia de Imunoblot definio do resultado no Imunoblot critrio para utilizao do Imunoblot na testagem das amostras PROCEDIMENTOS PARA REALIZAO DOS TESTES SOROLGICOS PARA DIAGNSTICO DAS HEPATITES VIRAIS tipos de amostras registro de amostras, distribuio em alquotas, acondicionamento e conservao de amostras em laboratrios de unidades hemoterpicas registro de amostras, distribuio em alquotas, acondicionamento e conservao de amostras em laboratrios de sade pblica equipamentos e materiais para execuo do ELISA e do Imunoblot procedimentos gerais para execuo do ELISA procedimentos gerais para execuo do Imunoblot garantia de qualidade dos testes imunoenzimticos ANEXOS anexo 1: relao entre os resultados dos marcadores sorolgicos da hepatite B, o estgio e a evoluo da infeco anexo 2: exemplo de planilha de resultados em servio de hemoterapia anexo 3: exemplo de planilha de resultados de sorologia de hepatites utilizada em laboratrios de sade pblica anexo 4: exemplo de protocolo de ELISA em microplaca anexo 5: exemplo de protocolo de Imunoblot anexo 6: exemplo de planilha de resultados para teste complementar Imunoblot BIBLIOGRAFIA

39 40 43 43 44 44 44 46 46

47 49 49 50 51 53 54 56 57 59 60 61 62 63 64 65

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Introduo
A hepatite uma inflamao do fgado que pode estar relacionada a causas diversas, tais como: uso de alguns medicamentos, intoxicao por defensivos agrcolas, uso excessivo de bebidas alcolicas e agentes infecciosos. Os vrus so os principais agentes infecciosos causadores das hepatites. As hepatites virais apresentam distribuio mundial e ampla e esto entre as doenas infecciosas de maior importncia em sade pblica. Antes da descoberta dos vrus, a diferenciao dos tipos de hepatite s era possvel pela observao do tempo de incubao da doena e forma provvel de contgio. Assim, eram identificados apenas dois tipos de hepatite: de transmisso fecal-oral, por exemplo pela gua ou alimentos contaminados, e a de transmisso sangnea. Na dcada de 60, Blumberg, pesquisando as protenas do sangue, observou no soro de um australiano a presena de um antgeno que denominou de "antgeno Austrlia", hoje reconhecido como o antgeno de superfcie do vrus da hepatite B. Desde ento, a rpida evoluo dos conhecimentos possibilitou a deteco de diferentes vrus capazes de causar hepatites na espcie humana. Nos anos 70, foram descritas as partculas do vrus da hepatite B, por Dane, do vrus da hepatite A, por Feinstone e da hepatite D, por Rizzetto. Na dcada de 80, Choo descobriu o vrus da hepatite C e Balayan o vrus da hepatite E. A medida em que os vrus foram sendo descobertos, os testes para sua identificao puderam ser desenvolvidos, possibilitando o diagnstico. A utilizao rotineira dos testes sorolgicos em unidades hemoterpicas tem contribudo, de forma decisiva, para a reduo do nmero de casos de hepatites B e C ps-transfusionais.

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HEPATITES VIRAIS

Quais os principais vrus que causam hepatites na espcie humana?

So os vrus das hepatites A, B, C, D e E. Esses vrus tm estrutura, forma e classificao diferentes, como voc pode ver na Figura 1.

Figura 1 - Vrus das Hepatites A, B, C, D e E

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Observe que as partculas virais so constitudas por uma molcula de cido nucleico, envolvida por uma estrutura proteica chamada capsdeo.
cido nucleico viral o material gentico constitudo pelo RNA (cido ribonucleico) ou DNA (cido desoxiribonucleico) onde esto contidas as informaes para a produo de novos vrus.

O HAV - Vrus da Hepatite A - e o HEV - Vrus da Hepatite E - so vrus de RNA com capsdeos formados pelos antgenos HAVAg e HEVAg, respectivamente.
Antgeno - Ag - qualquer substncia que o organismo identifica como estranha e que induz a produo de protenas especficas (anticorpos) pelo sistema imune.

Observe, tambm, que o HBV - Vrus da Hepatite B - o nico com DNA e, alm disso, ele revestido por duas camadas: uma externa constituda por HBsAg - antgeno de superfcie do vrus da hepatite B; uma interna, ou core, constituda por HBcAg - antgeno c do vrus da hepatite B. O HBV possui, ainda, uma outra protena, HBeAg - antgeno e do vrus da hepatite B. Veja que o cido nucleico do HDV Vrus da Hepatite D - tambm chamado vrus Delta, constitudo de RNA com um antgeno associado o HDVAg. O envoltrio do HDV constitudo pelo HBsAg que o antgeno de superfcie do vrus da hepatite B, do qual o Delta depende para penetrar na clula e se multiplicar. Por isso, a infeco pelo HDV est sempre associada infeco pelo HBV. Finalmente, voc pode ver que o HCV Vrus da Hepatite C - um vrus RNA que possui capsdeo e um envoltrio mais externo, o envelope, de constituio lipoproteica. Alm das diferenas de estrutura e classificao, os vrus apresentam formas de transmisso e distribuio geogrfica distintas. Confira no prximo item.

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HEPATITES VIRAIS

Quais as formas de transmisso e como se distribuem geograficamente os vrus das hepatites?

De acordo com sua forma de transmisso os vrus podem ser divididos em dois grupos: vrus transmitidos por via fecal-oral HAV e HEV; vrus transmitidos pelo sangue, contato sexual e fluidos corporais HBV, HCV e HDV. Os vrus das hepatites A, B e C so encontrados no mundo inteiro, com predominncia maior ou menor, dependendo da regio geogrfica. Para melhor compreenso, veja, a seguir, as fontes mais importantes de contaminao de cada grupo de vrus nas diversas regies. vrus transmitidos por via fecal-oral O HAV atinge principalmente crianas e adultos jovens. Alm da transmisso por meio da gua e dos alimentos, o uso de utenslios contaminados e o contato direto com fezes de indivduos infectados so fontes de contaminao importantes. No Brasil, devido precariedade das condies sanitrias, a hepatite A responsvel por mais de 50% dos casos de hepatite viral em crianas e adultos jovens. A transmisso do HEV tem sido relacionada, desde sua descoberta, veiculao por gua. No entanto, a maior ocorrncia da infeco pelo HEV em adultos jovens tem sugerido a possibilidade de sua transmisso por via sexual. O risco da infeco pelo vrus da hepatite E est limitado a certas regies geogrficas como: ndia, frica, Sudoeste Asitico e Mxico. vrus transmitidos pelo sangue, contato sexual e fluidos corporais A forma de transmisso do HBV varia em funo da maior ou menor predominncia em cada regio. Assim, nas regies onde sua ocorrncia muito elevada, como na regio Amaznica, a transmisso ocorre principalmente por fluidos orgnicos no contato interpessoal, quando h leses de pele e mucosas. Nas regies do Brasil onde o HBV menos freqente, a transmisso sexual e a sangnea, por compartilhamento de seringas no uso indevido de drogas, so, atualmente, as principais formas de contaminao. O HDV, como voc j sabe, se transmite pelas mesmas vias do HBV, do qual depende para se multiplicar. O vrus da hepatite D pode ser transmitido junto com o HBV (coinfeco), ou infectar portadores crnicos do HBV (superinfeco): No Brasil, a ocorrncia da infeco pelo HDV est restrita Regio Amaznica.

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A infeco pelo HCV ocorre principalmente por via sangnea atingindo, com maior freqncia, indivduos que fazem uso compartilhado de seringas e os doentes crnicos, como por exemplo os doentes renais e os hemoflicos, que so expostos, constantemente, ao risco de contaminao em transfuses e em equipamentos de uso comum durante a dilise. O estabelecimento de critrios cada vez mais rigorosos para a triagem sorolgica dos doadores de sangue vem permitindo reduzir quase totalmente o risco de transmisso transfusional das hepatites B e C.

Quais so as manifestaes clnicas mais freqentes nas hepatites virais?

Clinicamente, as hepatites provocadas por vrus podem se apresentar de modo sintomtico ou assintomtico. Em geral, elas se apresentam de modo assintomtico. Nas hepatites virais sintomticas, as manifestaes variam desde um mal-estar generalizado at o comprometimento heptico fulminante. So sintomas freqentes: a falta de apetite, dor abdominal, nuseas, vmitos, ictercia, urina escura, fezes esbranquiadas e febre. Com ou sem sintomas, as hepatites podem evoluir de forma aguda ou crnica em funo, entre outros fatores, do tipo de vrus. Confira, no Quadro 1, a evoluo clnica das hepatites relacionadas a cada vrus.
Quadro 1 - Evoluo das hepatites virais TIPO DE VRUS HAV Hepatite A HBV Hepatite B HCV Hepatite C HDV Hepatite D HEV Hepatite E 15 - 150 30 - 50 INCUBAO (DIAS) 15 - 45 30 - 180 FORMA DE EVOLUO aguda no h forma crnica aguda crnica: 5% a 10% dos casos em adultos e 90% em neonatos aguda crnica: 85% dos casos aguda crnica: 5% a 10% nos casos de coinfeco e 70% a 80% na superinfeco aguda no h forma crnica

28 - 48

Como voc pode ver, no h formas crnicas nas hepatites A e E. Observe que na hepatite B a evoluo para a forma crnica est relacionada idade em que o indivduo adquiriu a infeco.

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Existem vacinas para prevenir as hepatites virais?

As hepatites A e B so doenas imunoprevinveis, ou seja, elas podem ser evitadas por meio de vacinas comerciais disponveis no mercado. Ainda no foi possvel a seleo de um agente imunizante para a produo de uma vacina eficaz contra o HCV, vrus responsvel pela hepatite C. A infeco causada pelo vrus Delta evitada pela mesma vacina da hepatite B. Os estudos sobre o desenvolvimento de uma vacina contra a hepatite E so mais recentes e ainda inconclusivos. Vacine-se contra a hepatite B! Os profissionais de sade, pela exposio freqente a esse vrus, apresentam um risco duas a dez vezes maior de adquirir a doena, do que a populao em geral.

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Quais os vrus investigados na triagem sorolgica de doadores de sangue?

Para a triagem de doadores, devido ao alto risco de transmisso transfusional, so investigados os vrus das hepatites B e C. Como a infeco pelo vrus Delta est sempre associada ao vrus da hepatite B, desnecessria a sua investigao.

Quais os principais vrus investigados para o diagnstico etiolgico das hepatites?

O HAV, o HBV e o HCV so os principais vrus a serem investigados para o diagnstico etiolgico das hepatites. As pesquisas do HDV e do HEV esto restritas a laboratrios de referncia.

Como proceder se for solicitada a pesquisa do HDV e do HEV?

Se for solicitada a pesquisa para deteco de marcadores do HDV e HEV, faa contato com os seguintes laboratrios:
Para HDV: Laboratrio de Referncia para Hepatites Virais Instituto Evandro Chagas (IEC) Av. Almirante Barroso 492 - CEP 66090-000 - Belm PA Fax: (091) 226-1284 Para HEV: Laboratrio de Referncia para Hepatites Virais Fiocruz - Instituto Oswaldo Cruz - Departamento de Virologia Pavilho Rocha Lima - 5 andar Av. Brasil, 4365 Manguinhos CEP 21045-900 - Rio de Janeiro - RJ Fax: (021) 270-6397

Ateno: no manual "Coleta de Sangue" do TELELAB voc encontra orientaes sobre o acondicionamento das amostras para transporte.

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HEPATITES VIRAIS

Como so detectados os vrus das hepatites A, B e C no soro dos indivduos?

A presena dos vrus das hepatites no soro dos indivduos detectada atravs dos marcadores sorolgicos. Os marcadores sorolgicos so os antgenos e os anticorpos especficos de cada vrus detectveis no soro ou plasma de pessoas infectadas. Anticorpo - Ac - tambm chamado imunoglobulina - Ig, uma protena produzida pelo sistema imune em resposta a um determinado antgeno. O anticorpo se liga de maneira especfica ao antgeno.

Quais os principais marcadores sorolgicos da infeco pelo vrus das hepatites A, B e C?

Veja, no Quadro 2, os principais marcadores sorolgicos da infeco pelos vrus das hepatites A, B e C.
Quadro 2 VRUS HAV Principais marcadores sorolgicos da infeco pelos vrus das hepatites A, B e C MARCADORES anti-HAV Igm anti-HAV HBsAg anti-HBs anti - HBc lgM HBV anti - HBc HBe Ag anti - HBe anti - HCV SIGNIFICADO anticorpo IgM contra o vrus da hepatite A anticorpo total (lgM + lgG) contra o vrus da hapatite A antgeno de superfcie do vrus da hepatite B anticorpo contra o antgeno de superfcie do vrus da hepatite B anticorpo lgM contra o antgeno core do vrus da hepatite B anticorpo total (lgM + lgG) contra o antgeno core do vrus da hepatite B antgeno "e" do vrus da hepatite B anticorpo contra o antgeno "e" do vrus da hepatite B anticorpo contra o vrus da hepatite C

HCV

Como voc j sabe, o vrus da hepatite B possui tambm uma protena interna chamada HBcAg. Este antgeno est no tecido heptico, mas no circula no sangue e, portanto, no um marcador sorolgico.

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Quando so identificados os marcadores do HAV no curso sorolgico tpico da hepatite A?

Veja, na Figura 2, a representao grfica do curso sorolgico da infeco pelo vrus da hepatite A.

Figura 2 - Curso sorolgico tpico da hepatite A

Observe que: os anticorpos anti-HAV IgM aparecem em torno de quatro semanas aps a exposio, caracterizando a infeco aguda que coincide com o aparecimento dos sintomas e com os nveis mximos de ALT.
ALT - alanina aminotransferase. Veja no bloco "Metodologias para diagnstico das Hepatites Virais" mais informaes sobre essa enzima.

o anti-HAV IgM desaparece, em geral, em torno de 16 a 20 semanas aps a infeco, o que o classifica como um marcador de infeco recente; anticorpos anti-HAV IgG substituem gradativamente os anticorpos anti-HAV IgM e persistem por toda a vida, sendo indicativos de imunidade contra o vrus da hepatite A. O anti-HAV IgG pode tambm ser detectado para avaliar a resposta vacinal.

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Quando so identificados os marcadores do HBV no curso sorolgico tpico da hepatite B?

Os marcadores sorolgicos da hepatite B aparecem em vrios momentos da infeco, sendo que: o HBsAg e o anti-HBc IgM caracterizam a infeco aguda; o HBeAg, o anti-HBc IgG, o anti-HBe e o anti-HBs permitem avaliar a evoluo clnica da infeco. Para compreender melhor, veja a Figura 3.

Figura 3 - Curso sorolgico tpico da hepatite B

Observe que: o HBsAg est presente no soro antes mesmo do incio das alteraes da ALT e do aparecimento dos sintomas. Este , portanto, o primeiro marcador a aparecer e sua concentrao mxima coincide com os sintomas. Por isso, um dos marcadores pesquisados tanto na triagem de doadores de sangue em unidades hemoterpicas quanto no diagnstico em laboratrios de sade pblica; o HBeAg surge no incio da infeco e pode ser detectado durante vrias semanas. Este marcador indica intensa multiplicao viral e, portanto, um maior potencial de transmisso;

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o anti-HBc IgM surge na fase aguda, podendo permanecer detectvel at oito meses aps o incio da infeco; o anti-HBc IgG substitui gradativamente o anti-HBc IgM e, em geral, persiste por toda vida, sendo til para indicar que houve em algum momento infeco pelo vrus da hepatite B; o anti-HBc (IgM+IgG) o nico marcador que define a etiologia da doena, detectvel entre o desaparecimento dos antgenos e o aparecimento dos anticorpos. Por isso, o anti-HBc pesquisado tanto na triagem de doadores de sangue, em unidades hemoterpicas, quanto no diagnstico em laboratrios de sade pblica; o anti-HBe pode ser detectado aps o desaparecimento do HbeAg indicando diminuio da multiplicao viral e a provvel evoluo para a cura da infeco; o anti-HBs pode ser detectado aps o desaparecimento do HBsAg. A presena de anti-HBs indica imunidade em relao infeco ou resposta vacinal. Em cerca de 5% a 10% dos casos de infeco pelo vrus da hepatite B no h desenvolvimento de imunidade, configurando a evoluo para a forma crnica.

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HEPATITES VIRAIS

Como caracterizada sorologicamente a evoluo para a forma crnica da infeco pelo vrus da hepatite B?
Confira, na Figura 4, como se caracteriza sorologicamente a evoluo para a forma crnica da infeco pelo vrus da hepatite B:

Figura 4 - Curso sorolgico da infeco crnica pelo vrus da hepatite B

Observe que a permanncia do HBsAg por mais de seis meses caracteriza a forma crnica da infeco. Este marcador est sempre presente ao longo do curso sorolgico da forma crnica. No curso sorolgico da infeco crnica pode ainda ser detectado o HBeAg ou o anti-HBe: a presena do HBeAg sinaliza uma forma mais grave da infeco; o anti-HBe indicador de um estgio com diminuio da multiplicao viral.
No Anexo 1, voc encontra um quadro que relaciona os marcadores sorolgicos da hepatite B com o estgio e a evoluo da infeco.

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Quando identificado o marcador do HCV no curso sorolgico tpico da hepatite C?

Veja, na Figura 5, a representao grfica do curso sorolgico da infeco pelo vrus da hepatite C.

Figura 5 - Curso sorolgico da hepatite C

Como voc pode ver, o anti-HCV detectado tardiamente, ou seja, cerca de trs meses aps a infeco. Assim, na faixa identificada como limiar de deteco, s possvel caracterizar a infeco pela identificao do RNA, por mtodos de biologia molecular. Veja o bloco de "Metodologias para Diagnstico Sorolgico das Hepatites Virais". Observe, tambm, que a dosagem de ALT no soro apresenta nveis variveis ao longo da infeco pelo HCV.

Quais os marcadores pesquisados na triagem sorolgica de doadores de sangue?

Na triagem de doadores so pesquisados obrigatoriamente, conforme a portaria 1.376 de 19/11/93 do Ministrio da Sade, os marcadores HBsAg, anti-HBc e o anti-HCV. Alm disso, obrigatria tambm, a dosagem da enzima alanina aminotransferase (ALT). A obrigatoriedade da realizao destes testes visa a proteo do receptor e no o diagnstico das hepatopatias entre os candidatos voluntrios doao de sangue.

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Qual o fluxograma recomendado para a pesquisa dos marcadores HBsAg, anti-HBc e anti-HCV na triagem sorolgica de doadores de sangue?
Veja, a seguir, o fluxograma recomendado para a testagem dos marcadores HBsAg, anti-HBc e anti-HCV em unidades hemoterpicas:

Figura 6 -

Fluxograma de triagem sorolgica de doadores de sangue para os marcadores das hepatites B e C

Para a compreenso deste fluxograma, importante observar que: a amostra (soro ou plasma) testada para deteco dos marcadores sorolgicos HBsAg, anti-HBc e anti-HCV: a amostra no reagente para o marcador testado ser considerada amostra negativa para o mesmo;

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a amostra reagente ou indeterminada para qualquer um dos marcadores deve ser retestada em duplicata com o mesmo conjunto diagnstico; na retestagem em duplicata: a amostra no reagente para o marcador testado ser considerada amostra negativa para o mesmo.
Importante: Em caso de amostras reagentes na testagem inicial e no reagentes na retestagem, no libere nenhum dos resultados obtidos com as outras amostras testadas no mesmo protocolo. Isto porque possvel que tenha havido erro de transcrio no protocolo ou troca de amostras. Se o protocolo estiver correto, faa novamente o teste de todas as amostras.

sero descartados os hemocomponentes correspondentes amostra reagente, indeterminada ou com resultados discordantes para qualquer um dos marcadores sorolgicos testados; a definio do resultado de cada amostra deve obedecer aos critrios apresentados no Quadro 3:
Quadro 3 - Critrios para definio do resultado final da triagem sorolgica de doadores de sangue para os marcadores das hepatites B e C
Resultados da Triagem (-) ( + ) OU ( I ) ( + ) OU ( I ) (+) ( + ) OU ( I ) Resultados da retestagem em duplicata (-/-) (+/+) ( + / - ) ou ( - / + ) ou ( +/ I ) ou ( I / + ) ( - / I ) ou ( I / - ) ou ( I / I ) Resultados final Negativo Negativo Reagente Reagente Indeterminado

(-) no reagente, ( + ) reagente ou ( I ) indeterminado

Ateno: a liberao dos hemocomponentes s pode ser feita quando todos os testes sorolgicos obrigatrios, conforme as normas vigentes do Ministrio da Sade, apresentarem resultados negativos.

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Quais os procedimentos com os doadores que apresentarem resultados reagentes ou indeterminados?

Os doadores com resultados reagentes ou indeterminados para qualquer um dos marcadores das hepatites devem ser encaminhados aos servios de sade para diagnstico. As unidades hemoterpicas devem, obrigatoriamente, notificar casos positivos para HBsAg e/ou anti-HCV, vigilncia epidemiolgica local.

Quais os marcadores sorolgicos pesquisados para o diagnstico etiolgico das hepatites virais em laboratrios de sade pblica?
Para definio do diagnstico etiolgico das hepatites em laboratrios de sade pblica so pesquisados os marcadores anti-HAV IgM, HBsAg, anti-HBc IgM e o anti-HCV. Para testagem desses marcadores, so recomendados dois tipos de fluxogramas: um para a testagem dos marcadores HBsAg, anti-HBc IgM e anti-HAV IgM no diagnstico das hepatites virais agudas; um para a testagem do anti-HCV no diagnstico da hepatite C.

Qual o fluxograma recomendado para o diagnstico das hepatites virais agudas em laboratrios de sade pblica?
O Sistema de Vigilncia Epidemiolgica para as hepatites virais do Ministrio da Sade prope que a pesquisa dos marcadores sorolgicos para os casos de infeco aguda, seja realizada somente quando a dosagem da ALT indicar valores iguais ou maiores do que trs vezes o normal. Veja, na pgina seguinte, o fluxograma para o diagnstico etiolgico das hepatites virais agudas.

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Figura 7 - Fluxograma para diagnstico sorolgico das hepatites agudas

Para a compreenso do fluxograma de diagnstico etiolgico das hepatites virais agudas, importante observar que: a amostra reagente tem seu resultado definido como "Amostra Positiva para o marcador testado"; a amostra no-reagente tem seu resultado definido como "Amostra Negativa para o marcador testado"; a amostra indeterminada para qualquer um dos marcadores deve ser retestada em duplicata com o mesmo conjunto diagnstico; na retestagem em duplicata a amostra reagente tem seu resultado definido como "Amostra positiva para o marcador testado"; a amostra no-reagente em duplicata tem seu resultado definido como "Amostra Negativa para o marcador testado"; a amostra indeterminada ou com resultados discordantes tem seu resultado definido como "Amostra Indeterminada para o marcador testado".

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Qual o fluxograma recomendado para o diagnstico da hepatite C em laboratrios de sade pblica?

Observe a seguir o fluxograma recomendado para o diagnstico da hepatite C:

Figura 8 - Fluxograma para diagnstico sorolgico da hepatite C

Para compreenso deste fluxograma importante observar que: a amostra deve ser submetida a um ELISA para deteco do anti-HCV e seu resultado interpretado de acordo com os seguintes critrios: se a razo DO/CO (densidade tica/cut-off) for menor que 0,9 a amostra ser considerada no reagente e seu resultado definido como "amostra negativa para anti-HCV";

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se a razo DO/CO for maior que 0,9 e menor que 1,1, a amostra ser considerada indeterminada para anti-HCV e dever ser testada em duplicata, com o mesmo conjunto diagnstico; se a razo DO/CO for igual ou maior do que 5,0 a amostra ser considerada reagente e seu resultado definido como "amostra positiva para anti-HCV"; se a razo DO/CO for maior do que 1,1 e menor do que 5,0, a amostra ser considerada reagente com baixa relao DO/CO devendo ser testada por Imunoblot; na retestagem em duplicata: a amostra ser considerada negativa, indeterminada, reagente ou reagente com baixa relao DO/CO para anti- HCV, de acordo com os mesmos critrios definidos para a testagem anterior; a amostra indeterminada, com resultados discordantes ou reagente com baixa relao DO/CO dever ser testada por Imunoblot. no teste de Imunoblot: a amostra reagente tem seu resultado definido como "amostra positiva para anti-HCV"; a amostra no reagente tem seu resultado definido como "amostra negativa para anti-HCV"; a amostra indeterminada tem seu resultado definido como "amostra indeterminada para anti-HCV". Ateno: no bloco "Metodologias para Diagnstico Sorolgico das Hepatites Virais", voc encontra mais informaes sobre o critrio recomendado para definir as amostras reagentes a serem testadas por Imunoblot. Lembre-se: os laboratrios de sade pblica devem notificar casos de hepatites virais vigilncia epidemiolgica local.

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Quais os mtodos utilizados para o diagnstico laboratorial das hepatites?

Para o diagnstico das hepatites utilizam-se: dosagem bioqumica; mtodos de biologia molecular; e testes sorolgicos.

Em que consiste a dosagem bioqumica?

A dosagem bioqumica consiste na quantificao por meio de provas bioqumicas das aminotransferases (ALT e AST). Essas enzimas se apresentam com seus nveis aumentados no soro de indivduos com doenas hepticas.
ALT - alanina aminotransferase, transaminase glutmico-piruvica. chamada anteriormente de TGP -

AST - aspartato aminotransferase, denominada anteriormente de TGO transaminase glutmico-oxalactica.

A dosagem bioqumica por sua simplicidade, o mtodo de primeira escolha para se detectar laboratorialmente a inflamao no fgado. Na maioria das hepatites virais, a elevao da ALT o primeiro indicador do processo inflamatrio. Por isso, o Ministrio da Sade, obriga que, na triagem sorolgica de doadores de sangue, seja realizada a dosagem da enzima alanina aminotransferase (ALT). Alm disso, a ALT importante na avaliao da evoluo da doena e da eficcia do tratamento. Mas para se definir qual a etiologia, ou seja, o agente causador da doena preciso realizar testes sorolgicos ou mtodos de biologia molecular.

Em que consistem os mtodos de biologia molecular?

Os mtodos de biologia molecular detectam o cido nucleico do agente infeccioso. Dentre os vrios mtodos existentes, a reao de amplificao de cidos nucleicos a mais empregada atualmente.
Amplificao de cido nucleico - seqncia de reaes que promove o aumento de cpias de uma molcula de DNA ou RNA.

A reao de amplificao de cidos nucleicos permite a produo de grande quantidade de fragmentos especficos do DNA que se deseja detectar na amostra, a partir de um molde inicial do material gentico (cidos nucleicos). Para a deteco de vrus RNA, torna-se necessrio fazer primeiro a transcrio reversa para DNA, ou seja, sntese do DNA, a partir do RNA, realizada pela enzima transcriptase reversa.

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Os mtodos de biologia molecular so amplamente utilizados em laboratrios de pesquisa e de referncia, mas ainda no esto disponveis para a rede de laboratrios. Por isso, a partir daqui sero enfocados os testes sorolgicos que so rotineiramente empregados no diagnstico das hepatites virais.

Em que consistem os testes sorolgicos?

Os testes sorolgicos so testes imunolgicos que detectam antgenos virais e/ou anticorpos especficos no soro ou plasma, permitindo o diagnstico etiolgico das hepatites e o acompanhamento da evoluo da infeco. A ligao especfica entre o antgeno e o anticorpo constitui a base dos testes imunolgicos. Nesses testes so investigados antgenos virais e/ ou anticorpos especficos como as imunoglobulinas da classe M (IgM), que so as primeiras a aparecerem e caracterizam uma infeco aguda, e as da classe G (IgG) que surgem em seguida permanecendo, muitas vezes, por toda a vida.

Que testes sorolgicos podem ser utilizados no diagnstico das hepatites virais?
Para o diagnstico das hepatites virais so utilizados os seguintes testes sorolgicos: hemaglutinao, radioimunoensaio, quimioluminescncia e imunoenzimtico. teste de hemaglutinao o teste em que a reao antgeno-anticorpo evidenciada pela aglutinao de hemcias sensibilizadas com antgenos ou anticorpos. A leitura, em geral, feita a olho nu. Os testes de hemaglutinao para pesquisa de marcadores sorolgicos das hepatites virais so realizados em placa de microtitulao, com diluies seriadas das amostras a serem testadas, permitindo uma anlise quantitativa do ttulo de antgenos ou anticorpos presentes. O ttulo corresponde ltima diluio da amostra em que foi observada aglutinao. Embora seja um teste de fcil execuo e com boa sensibilidade e especificidade, no existem, atualmente, conjuntos diagnsticos disponveis no mercado.

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A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado. A especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado negativo quando o indivduo no est infectado.

teste radioimunoensaio (RIA) o teste que utiliza uma substncia radioativa para deteco da reao antgeno-anticorpo. O resultado definido pela medida da radioatividade e sua leitura feita em equipamento prprio. Embora bastante sensvel, o RIA no muito utilizado devido aos riscos de manipulao, ao curto prazo de validade e s exigncias sanitrias para o descarte do material radioativo. teste de quimioluminescncia o teste que emprega uma substncia luminescente para deteco da reao antgeno-anticorpo. O resultado definido por emisso de luz que captada e analisada em equipamento prprio. Embora seja muito sensvel e especfico, o sistema de deteco por quimioluminescncia exige equipamentos especiais e ainda tem custo elevado. teste imunoenzimtico o teste onde a interao antgeno-anticorpo evidenciada pela ao de uma enzima e o substrato apropriado, e revelada por um cromgeno. Cromgeno - substncia que revela a ao de uma enzima sobre o substrato por meio de mudana de cor. Os testes imunoenzimticos so os mais utilizados porque so de fcil execuo, baixo custo e possibilitam a automao. Por isso, daqui para a frente voc vai ver com detalhes os testes imunoenzimticos.

Quais os testes imunoenzimticos mais utilizados em unidades hemoterpicas e em laboratrios de sade pblica?
O teste imunoenzimtico mais comumente usado em unidades hemoterpicas e em laboratrios de sade pblica o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Como voc j sabe, no diagnstico da hepatite C, em funo dos resultados obtidos no ELISA, algumas amostras so testadas tambm por Imunoblot.

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Tanto o ELISA quanto o Imunoblot apresentam como componentes: fase slida, antgeno, anticorpo, enzima, substrato e cromgenos.
Fase slida: material capaz de adsorver o antgeno ou o anticorpo que ser empregado no teste.

Quais as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico das hepatites virais?
Confira, no Quadro 4, as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico das hepatites virais.
Quadro 4 - Variaes encontradas nos componentes do ELISA Fase Slida placas de microtitulao: produzidas, geralmente, em poliestireno transparente com 96 cavidades ou em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo chato ou arredondado; ou prolas: pequenas esferas de poliestireno. obtido de plasma ou soro humano de indivduo infectado; ou produzido em cultura celular infectada com vrus; ou peptdeo sinttico: fragmento de protena sintetizada pela adio ordenada de aminocidos, de acordo com uma seqncia conhecida de cido nucleico; ou recombinante: protenas sintetizadas em organismos vivos (bactrias ou fungos), a partir de fragmento de cido nucleico modificado. monoclonal: anticorpo extremamente puro e especfico produzido por uma nica clula hbrida; ou policlonal: anticorpo especfico produzido pela inoculao de antgeno em animais de laboratrio. peroxidase. perxido de hidrognio (H2O2) ortofenilenodiamina (OPD); ou tetrametil benzidina (TMB). H2SO4; ou HCI.

Antgeno

Anticorpo

Enzima Substrato Cromgenos Soluo de bloqueio

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A forma de combinar esses componentes caracteriza diferentes tipos de ELISA possibilitando a pesquisa de antgenos e anticorpos especficos.

Quais os tipos de ELISA utilizados para deteco dos marcadores sorolgicos das hepatites A, B e C?
Veja, no Quadro 5, os tipos de ELISA mais utilizados para o diagnstico da infeco pelo vrus das Hepatite A, B e C:
Quadro 5 - Tipos de ELISA mais utilizados
HEPATITES A MARCADORES SOROLGICOS anti-HAV IgM anti-HAV B HbsAg e HBe Ag anti-HBc IgM anti-HBc e anti-HBe anti-HBs C anti-HCV ELISA Captura para IgM Competitivo Sanduche para pesquisa de antgeno Captura para IgM Competitivo Indireto e sanduche para pesquisa de anticorpo Indireto

Ateno: os conjuntos diagnsticos para anti-HAV e anti-HBc detectam anticorpos totais (IgM +IgG). Nos prximos itens voc vai acompanhar a seqncia da reao em cada um dos tipos de ELISA.

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Qual a seqncia de um ELISA sanduche para pesquisa de antgeno?

Veja essa seqncia com uma amostra reagente, na Figura 9.

Figura 9 - Seqncia esquemtica de um ELISA sanduche para pesquisa de antgeno com uma amostra reagente

Observe que: na etapa 1, os anticorpos especficos esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm antgenos especficos que se ligam aos anticorpos da fase slida; na etapa 3, adicionado um conjugado, composto de uma enzima ligada a um anticorpo tambm especfico que interage com o antgeno da amostra; na etapa 4, adiciona-se o substrato e o cromgeno; na etapa 5, a ao da enzima no substrato revelada pelo cromgeno que sofre um processo de oxidao dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A cor varia de acordo com o tipo de cromgeno utilizado. Nesta etapa, adicionada uma soluo de bloqueio que interrompe o processo de oxidao. Se esse processo no for interrompido, haver aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados falso-positivos.
Se no houver antgeno especfico na amostra, ou seja, se ela for uma amostra no reagente, a reao no acontecer e, conseqentemente, no haver desenvolvimento de cor.

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Qual a seqncia de um ELISA indireto?

A Figura 10 apresenta essa seqncia com uma amostra reagente.

Figura 10 - Seqncia esquemtica de um ELISA indireto com uma amostra reagente

No ELISA indireto voc deve observar que: na etapa 1, os antgenos esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam ao antgeno da fase slida; na etapa 3, com a adio de um conjugado composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (anti-imunoglobulina humana) ocorre a interao anti-anticorpo e anticorpo da amostra. Neste caso, o conjugado no utiliza um anticorpo especfico para o antgeno, mas um antianticorpo humano, e por isso o teste considerado indireto; na etapa 4, adicionado o substrato e o cromgeno; na etapa 5, como voc j viu no ELISA tipo sanduche, a ao da enzima do substrato revelada pelo cromgeno, que possibilita o desenvolvimento de cor na amostra reagente. Nesta etapa, adicionada uma soluo de bloqueio que interrompe o processo de oxidao do cromgeno para evitar a ocorrncia de resultados falsopositivos.
Se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for no reagente, a reao no acontecer e conseqentemente no haver desenvolvimento de cor.

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Qual a seqncia de um ELISA de captura para IgM?

A Figura 11 apresenta essa seqncia com uma amostra reagente.

Figura 11 -

Seqncia esquemtica de um ELISA de captura para IgM com uma amostra reagente

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Na seqncia de um ensaio de captura para IgM, importante voc observar que: na etapa 1, os anticorpos anti- (anti-IgM humano) esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos IgM que se ligam aos anticorpos da fase slida. Os anticorpos anti- da fase slida capturam os anticorpos IgM da amostra; na etapa 3, acrescenta-se antgeno especfico do teste que se liga aos anticorpos IgM especficos da amostra; na etapa 4, adiciona-se um conjugado composto de uma enzima ligada a um anticorpo contra esse antgeno especfico; na etapa 5, adiciona-se o substrato e o cromgeno; na etapa 6, do mesmo modo que nos ELISA sanduche e indireto, a ao da enzima sobre o substrato revelada pelo cromgeno que sofre um processo de oxidao, dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A soluo de bloqueio, adicionada nesta etapa, interrompe o processo de oxidao do cromgeno evitando aparecimento de cor em todas as amostras, o que levaria a resultados falso-positivos. Se no houver na amostra anticorpo IgM especfico para o antgeno utilizado no teste, ou seja, se ela for no reagente, a reao no acontecer e, conseqentemente, no haver desenvolvimento de cor.

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Qual a seqncia de um ELISA competitivo?

Veja, na Figura 12, a seqncia de um ELISA competitivo.

Figura 12 -

Seqncia esquemtica de um ELISA tipo competitivo com uma amostra reagente

Como voc pode ver: na etapa 1, os antgenos esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, so adicionados a amostra e o conjugado. O conjugado composto de uma enzima ligada a um anticorpo especfico. Quando existem anticorpos na amostra eles competem com o anticorpo especfico do conjugado pela ligao com o antgeno adsorvido fase slida; na etapa 3, adiciona-se o substrato e o cromgeno; na etapa 4, no ELISA competitivo, quando a amostra reagente a ligao do conjugado no acontece, no h ao da enzima sobre o substrato e, conseqentemente, no h desenvolvimento de cor pelo cromgeno.
Observe que, ao contrrio dos outros testes, no ELISA competitivo a ausncia de cor ao final da reao indica que a amostra reagente e a presena de cor caracteriza a amostra no reagente.

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Ateno: se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for uma amostra no reagente, a ao do conjugado sobre o substrato acontecer e ser evidenciada pelo desenvolvimento de cor promovido pela oxidao do cromgeno. Por isso, nesta etapa adicionada uma soluo de bloqueio que interrompe esse processo de oxidao para evitar o aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados falso-negativos.

Como definir se um resultado de um ELISA reagente, no reagente ou indeterminado?

No ELISA, o resultado de uma reao definido pela leitura da absorbncia ou densidade tica (DO) em espectrofotmetro, utilizando um filtro com comprimento de onda indicado pelo fabricante do conjunto diagnstico. Usualmente, cada conjunto tem sua forma de calcular o cutoff - CO (ponto de corte), acima ou abaixo do qual as amostras so consideradas reagentes, no reagentes ou indeterminadas. Para os ELISA sanduche, indireto e captura para IgM, uma amostra reagente quando a DO encontrada estiver acima do cut-off, e no reagente quando a DO estiver abaixo do cut-off. Para os ELISA competitivos, uma amostra reagente quando a DO encontrada estiver abaixo do cut-off, e no reagente quando a DO estiver acima do cut-off. Em qualquer tipo de ELISA so consideradas indeterminadas as amostras com valores de DO includos na zona cinza (borderline). A zona cinza corresponde faixa de valores em torno do cut-off dentro da qual no se pode ter certeza do resultado.

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Como estabelecer a zona cinza no ELISA?

Em geral, o fabricante do conjunto diagnstico indica como estabelecer a zona cinza. Quando no existir a orientao do fabricante recomenda-se, por medida de segurana, que sejam consideradas indeterminadas as amostras com valores de DO includas no intervalo de 10% a 20% abaixo ou acima do valor do cut-off. Acompanhe um exemplo do clculo da zona cinza com um intervalo de 10%: Elisa com CO = 0,076 0,076 10% do CO = = 0,0076 10 Limite inferior da zona cinza = CO 10 % = 0,076 0,0076 = 0,068 Limite superior da zona cinza = CO + 10% = 0,076 + 0,0076 = 0,083 Como voc pode ver, neste exemplo, so consideradas indeterminadas as amostras com DO de 0,068 a 0,083.

Quais os componentes do Imunoblot para o diagnstico da hepatite C?

Confira, no Quadro 6, as variaes encontradas nos componentes do Imunoblot para o diagnstico da hepatite C.
Quadro 6 Componentes do Imunoblot para o diagnstico da heptite C Fase slida Antgeno do vrus da hepatite C Enzima Substrato Cromgeno membrana: fitas de nitrocelulose peptdeo sinttico; ou recombinante de diferentes fraes antignicas do vrus da hepatite C perxidase perxido de hidrognio (H2O2) 4-cloro 1-naftol

Qual a seqncia de um Imunoblot?

Na Figura 13 est apresentada a seqncia de um Imunoblot com uma amostra reagente.

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Figura 13 -

Seqncia esquemtica de um Imunpoblot de uma amostra reagente

importante voc observar que: na etapa 1, ou seja, na fase slida, diferentes antgenos esto adsorvidos em uma fita de nitrocelulose; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam aos diferentes antgenos da fase slida; na etapa 3, adicionado um conjugado composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (anti-imunoglobulina humana) que interage com o anticorpo da amostra; na etapa 4, adicionado o substrato e o cromgeno; na etapa 5, quando a amostra reagente a ao da enzima sobre o substrato d origem a um produto insolvel que se precipita sobre a fita. A oxidao do cromgeno promove o aparecimento de cor no local da reao dando origem s bandas. Nesta etapa, adicionada gua para lavagem e eliminao da colorao inespecfica que impede a leitura do resultado.
Se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for uma amostra no reagente, a reao no acontecer e, conseqentemente, no sero visualizadas as bandas caractersticas.

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Como definir o resultado do teste Imunoblot?

No Imunoblot o resultado de uma reao definido pela observao das bandas, comparando-se o padro de bandas da amostra com o padro de bandas da fita controle, de acordo com os critrios fornecidos pelo fabricante. As amostras podero ser reagentes, no reagentes ou indeterminadas.

Qual o critrio recomendado para definir as amostras que devem ser testadas por Imunoblot em funo dos resultados obtidos no ELISA?
Recomenda-se o seguinte critrio: Testar por Imunoblot as amostras que, na investigao da Hepatite C, obtiveram, no ELISA, resultados indeterminados ou reagentes com valores da razo DO/CO maior do que 1,1 e menor do que 5,0. Este critrio baseia-se em resultados obtidos por COUROUC e colaboradores (1991), MARTINS e colaboradores (1994) e GONALES (1997). Acompanhe um exemplo da aplicao deste critrio: Num EISA para investigar Hepatite C com CO = 0,329, duas amostras obtiveram os seguintes resultados: 0,600 calculando a razo DO = CO amostra 2: DO = 1,800 calculando a razo DO = CO amostra 1: DO = 0,600 = 1,8 0,329 1,800 = 5,4 0,329

Como voc pode ver, neste exemplo, a razo DO/CO 1,8 indica que a amostra 1 deve ser testada tambm por Imunoblot; a razo DO/CO 5,4 indica que a amostra 2 tem seu resultado definido no ELISA como amostra positiva para anti-HCV e, neste caso, dispensvel o teste por Imunoblot.

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Que tipo de amostra deve ser utilizada para o diagnstico das infeces pelos vrus das hepatites?
Soro ou plasma. Veja informaes sobre a preparao das amostras no manual TELELAB "Coleta de Sangue". Ateno: as amostras no podem estar turvas, lipmicas ou hemolisadas. Em qualquer desses casos elas devem ser descartadas e novas amostras devem ser solicitadas. Manipule sempre as amostras como material potencialmente infeccioso.

Como registrar a entrada das amostras em unidades hemoterpicas?

O registro pode ser feito por sistema manual ou informatizado. De qualquer modo, importante que voc: copie, do rtulo da amostra, e registre na planilha de resultados os dados de identificao do doador e a data da coleta. Os dados devem sempre ser conferidos por duas pessoas. Erros de identificao podem: expor o receptor a riscos de contaminao levar rejeio de um doador apto. Veja um exemplo de planilha de resultados no Anexo 2 deste manual.

Em quantas alquotas devem ser distribudas as amostras, antes das anlises, em unidades hemoterpicas?
Em unidades hemoterpicas, antes de serem analisadas, as amostras de soro ou plasma devem, obrigatoriamente, ser distribudas em no mnimo duas alquotas: uma para os testes de rotina; outra para a contraprova. Recomenda-se se que a alquota da contraprova tenha um volume de aproximadamente 1 ml. A distribuio em um nmero maior de alquotas e o volume das mesmas fica a critrio de cada servio.
A alquota da contraprova deve ficar armazenada obrigatoriamente a 20C e estar disponvel por seis meses para a vigilncia sanitria.

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Como acondicionar e conservar as alquotas, antes de fazer as anlises nas unidades hemoterpicas?
Distribua as alquotas para os testes de rotina, em tubos ou frascos com tampa, previamente identificados com os dados correspondentes; Ateno: as alquotas das amostras podem ser conservadas em geladeira, entre 2 C e 8 C por 72 horas no mximo. Depois desse perodo, elas precisam ser congeladas a 20C; distribua em frascos prprios para congelamento a alquota da contraprova e demais alquotas a serem congeladas; acondicione esses frascos em caixas de papelo ou plstico rgido identificadas com informaes que facilitem a localizao dessas alquotas.

Como registrar a entrada das amostras em laboratrios de sade pblica?

O registro pode ser feito por sistema manual ou informatizado. De qualquer modo, importante que voc: 1. verifique se a identificao da amostra a mesma da solicitao do(s) teste(s); 2. copie da solicitao, e registre numa planilha de resultados, os seguintes itens bsicos: nmero de registro da amostra; nome ou iniciais; procedncia da amostra (unidade que solicitou); data da coleta; sexo; idade; resultados da ALT. Ateno: os dados devem sempre ser conferidos por duas pessoas. Erros de identificao podem levar troca de resultados. Veja um exemplo de planilha de resultados no Anexo 3 deste manual.

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preciso distribuir em alquotas as amostras para anlises nos laboratrios de sade pblica?
Nos laboratrios de sade pblica no existe a obrigatoriedade da alquota para contraprova. No entanto, recomenda-se que a amostra seja distribuda no mnimo em duas alquotas: uma para realizar os testes solicitados, e outra para atender necessidades relacionadas, por exemplo, execuo de testes complementares. Para acondicionar e armazenar as amostras utilize os mesmos procedimentos j apresentados no item anterior. Quais os materiais necessrios para executar um ELISA e um teste de Imunoblot? No Quadro 7 esto os materiais geralmente fornecidos pelo fabricante.
Quadro 7 - Materiais geralmente fornecidos pelo fabricante ELISA placa de microtitulao ou prolas sensibilizadas com antgenos ou anticorpos Imunoblot fitas de nitrocelulose com protenas adsorvidas em bandas pinas plsticas para manipulao de fitas de nitrocelulose canaletas plsticas para a colocao das fitas selos ou tampas de cobertura soro-controle negativo soro-controle positivo solues-tampo para a diluio das amostras e do conjugado soluo-tampo para a lavagem conjugado substrato e cromgeno soluo-tampo para diluir o substrato

selos ou tampas de cobertura soro-controle negativo soro-controle positivo solues-tampo para a diluio das amostras e do conjugado soluo-tampo para a lavagem conjugado substrato e cromgeno soluo-tampo para diluir o substrato soluo de bloqueio de reao

No Quadro 8, a seguir, voc pode conferir os outros materiais necessrios mas no fornecidos pelo fabricante.

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Quadro 8- Materiais no fornecidos pelo fabricante para o ELISA e Imunoblot pipetas manuais de volume ajustvel ( 5 a 50 l, de 50 a 200 l e de 200 a 1.000 l) mono e multicanal ponteiras descartveis para pipetas ajustveis pipetas sorolgicas de 5 ml, 10 ml e 20 ml pra de borracha ou outro auxiliar de pipetagem barquetes (reservatrios) para a utilizao de pipetas multicanal (ELISA) bquer de 1.000 ml provetas de 1.000 ml, 500 ml e 100 ml frasco com tampa de 1.000 ml basto de vidro equipamentos de proteo individual: luvas, mscaras, avental ou jaleco recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2%. soro para controle de qualidade interno da reao. Veja orientaes no curso TELELAB "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica" protocolos (vide bloco "Anexos")

Observe que as pipetas multicanal so utilizadas apenas para os ELISA e os outros materiais so necessrios nos dois testes. Alm dos materiais constantes dos Quadros 7 e 8, o laboratrio deve estar equipado com: banho-maria com termostato para regulagem de temperatura; agitador orbital; estufa com termostato regulvel e sistema de lavagem e de leitura compatveis com os mtodos empregados e com as especificaes dos conjuntos diagnsticos disponveis. Antes de iniciar um procedimento, verifique se os equipamentos esto " em condies adequadas de uso. No curso TELELAB Equipamentos - Utilizao e Monitoramento em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica", voc encontra as orientaes necessrias.

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Quais os procedimentos para executar o ELISA ?

Os procedimentos variam segundo o marcador sorolgico que se deseja detectar, e s vezes para um mesmo marcador, de acordo com o fabricante do conjunto diagnstico. Alguns procedimentos gerais, no entanto, devem ser observados: 1. confira o conjunto diagnstico (componentes, materiais e reagentes) verificando se ele est sob condies adequadas de conservao e dentro do prazo de validade; 2. leia todas as instrues do conjunto diagnstico antes de iniciar a reao; 3. providencie os outros materiais, no fornecidos pelo fabricante, necessrios para a realizao dos testes; Ateno: providencie uma ponteira descartvel para cada amostra e para cada tipo de reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras. 4. leia, antes de iniciar o teste, como preparar todas as solues. Utilize exatamente os volumes indicados, no faa qualquer alterao com o intuito de economizar tempo ou reagentes; 5. deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar a reao; A temperatura ambiente em laboratrios deve estar entre 20C e 26C. 6. homogeneize as amostras; 7. inclua, alm dos controles fornecidos pelo fabricante, o controle de qualidade interno (CQI) da reao. Veja orientaes no curso TELELAB "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica"; 8. faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles e as amostras. Veja um exemplo de um protocolo de ELISA no Anexo 4 deste manual; 9. siga rigorosamente os tempos, as formas de homogeneizao, os ciclos de incubao e lavagem indicados pelo fabricante, tendo o cuidado de evitar a contaminao cruzada das amostras; 10. faa a leitura da absorbncia em espectrofotmetro, utilizando o filtro recomendado pelo fabricante do conjunto diagnstico; Siga as orientaes do fabricante de cada conjunto para o clculo do cut-off.

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11. verifique se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Caso contrrio, faa novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios do fabricante. 12. registre os resultados em sua planilha, no campo correspondente ao marcador sorolgico testado. 13. despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e em Laboratrios de Sade Pblica". Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e equipamentos necessrios. Utilize sempre equipamentos de proteo individual e manipule as amostras como material potencialmente infeccioso.

Quais os procedimentos para executar um Imunoblot?

Lembre-se: de acordo com o fluxograma, no diagnstico da hepatite C, utiliza-se o Imunoblot para as amostras indeterminadas e para auxiliar na avaliao dos resultados das amostras reagentes com DO/CO maior do que 1,1 e menor do que 5,0, obtidos nos ELISA. Os procedimentos variam de acordo com o fabricante do conjunto diagnstico. Seja qual for o conjunto utilizado, alguns procedimentos gerais devem ser observados: 1. confira o conjunto diagnstico (componentes, materiais e reagentes) verificando se ele est sob condies adequadas de conservao e dentro do prazo de validade; 2. leia todas as instrues do conjunto diagnstico antes de iniciar a reao; 3. providencie os outros materiais necessrios para a realizao dos testes, no fornecidos pelo fabricante; Ateno: pegue uma ponteira descartvel para cada amostra e para cada tipo de reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras.

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leia atentamente como preparar todas as solues antes de iniciar o teste. Utilize exatamente os volumes indicados, no faa qualquer alterao com o intuito de economizar tempo ou reagentes; deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar a reao; faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles e o registro das amostras com o nmero existente em cada fita de nitrocelulose. Veja um exemplo de protocolo de Imunoblot no Anexo 5 deste manual; utilize pinas plsticas para manipular as fitas de nitrocelulose; coloque cada uma das fitas em uma canaleta, mantendo a face numerada voltada para cima; mantenha as canaletas cobertas de modo a evitar a mistura do contedo das mesmas; siga rigorosamente os ciclos de lavagem indicados pelo fabricante, tendo o cuidado de evitar a contaminao cruzada das amostras; observe, rigorosamente, todos os volumes, os tempos e as formas de homogeneizao e os perodos de incubao recomendados pelo fabricante; faa a leitura e interprete os resultados de acordo com as recomendaes do fabricante; verifique se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Caso contrrio, faa novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios do fabricante; registre os resultados do teste, de acordo com o seu protocolo de trabalho, em uma planilha de resultados de testes complementares como a apresentada no Anexo 6; despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e em Laboratrios de Sade Pblica".

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Como proceder para garantir a qualidade dos resultados dos testes imunoenzimticos?
No utilize as amostras de soro ou plasma que apresentarem turvao, hemlise ou lipemia. Para maiores informaes consulte o manual "Coleta de Sangue" do TELELAB; no use conjuntos diagnsticos ou reagentes com prazo de validade vencido; verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso. no misture controles, conjugados, tampes, reagentes, prolas, placas, strips ou fitas de diferentes lotes e/ou fabricantes; armazene os conjuntos para diagnstico de acordo com as recomendaes do fabricante; no exponha o substrato luz durante o armazenamento ou incubao da reao, evitando assim a fotodecomposio do mesmo; no coloque o substrato em contato com substncias oxidantes ou metais, para evitar sua degradao evidenciada pela alterao de cor, tornando o produto imprprio para uso; faa a limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos de lavagem, evitando dessa maneira o acmulo de sais e outros compostos qumicos; verifique se o filtro usado para a leitura da absorbncia aquele indicado pelo fabricante; Faa a limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos utilizados na reao. A segurana e a confiabilidade dos testes para diagnstico dependem tambm, entre outros parmetros, da sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade.
A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado. A especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado negativo quando o indivduo no est infectado. A reprodutibilidade de um teste a sua capacidade de obter repetidamente os mesmos resultados em diferentes testes realizados com a mesma amostra, empregando a mesma metodologia e o mesmo conjunto diagnstico.

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ANEXO 1 CORRESPONDNCIA ENTRE OS RESULTADOS DOS TESTES DOS MARCADORES DA HEPATITE B E O ESTGIO/EVOLUO DA INFECO
Resultados dos testes dos marcadores sorolgicos da Hepatite B HBsAg HBeAg Anti-HBc lgM Anti-HBc Anti-HBe Anti-HBs Estgio/evoluo da infeco Perodo de incubao Hepatite B aguda Hepatite B aguda ou Hepatite B crnica Incio da fase de convalescncia Exposio ao HBV Imune infeco passada Imune resposta vacinal Suscetvel infeco pelo HBV

+ + + + + -

+ + -

+ + -

+ + + + + + + + -

+ + -

+ + + -

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ANEXO 2 EXEMPLO DE PLANILHA DE RESULTADOS UTILIZADA EM UNIDADES HEMOTERPICAS

* Segundo a Portaria 1.376 de 19/11/93

ANEXO 3 EXEMPLO DE PLANILHA DE RESULTADO DE SOROLOGIA DE HEPATITES UTILIZADA EM LABORATRIOS DE SADE PBLICA

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ANEXO 4 EXEMPLO DE PROTOCOLO ELISA EM MICROPLACA ENSAIO IMUNOENZIMTICO (ELISA)

Teste:____________________________________ Fabricante: ________________Lote: ___________ Data:__/__/__ Validade:__/__/__

Tcnico responsvel:__________________________________________

1 A B C D E F G H

10

11

12

Mdia dos controles negativos: Mdia dos controles positivos: Valor do cut off: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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ANEXO 5 EXEMPLO DE PROTOCOLO - IMUNOBLOT

N Posio das bandas segundo o fabricante

(esquema somente - no em escala)

Identificao

Colar a fita correspondente

Bandas 1 2 3 4

Resultado

Data: __/__/__ Tcnico:

N do Lote:

Validade:__/__/__ Fabricante:

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ANEXO 6 EXEMPLO DE PLANILHA DE RESULTADOS PARA TESTE COMPLEMENTAR - IMUNOBLOT

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BALAYAN, M. S.; ANDJAPARIDZE, A. E.; SANVINSKAYA, S. S. et al - Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via the fecal-oral route. Intervirology 20: 23-31, 1983. BENSABATH, G.; CATGENAS, P. R. B.; DIAS, L. B.; CRESCENTE, J. A. B.; MIRANDA, E. C. B. M. - Hepatites por vrus, cap 20, pp 313-343 in Doenas Infecciosas e Parasitrias: Enfoque Amaznico. Coord.: Raimundo Nonato Queiroz de Leo, Editora CEJUP, Universidade do Par e Instituto Evandro Chagas, 826 p, Belm, 1997. BLUMBERG, G. S.; ALTER, H. J.; VISNICH, S. - A new antigen in leukemia sera. JAMA, 191: 541-546, 1965. CASTILLO, E.; BENSABATH, G.; MORAES, D. - Hepatites Virais, Captulo XVI. In: Brasil. Ministrio da Sade, Fundao Nacional de Sade, Centro Nacional de Epidemiologia, Guia de Vigilncia Epidemiolgica. Editado pela Fundao Nacional de Epidemiologia. Braslia, DF, Brasil. 1994, pp 179-196. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION: Epidemiology and Prevention of Viral Hepatitis A and E. Set Information Packet. http://www.cdc.gov/publications.htm. 1998. CHOO, Q. L.; KUO, G.; WEINER, A. J.; OVERBY, L. R.; BRADLEY, D. W.;HOUGHTON, M. - Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 244: 359-362, 1989. COUROUC, A. M.; JANOT, C. & THE HEPATITIS STUDY GROUP OF THE FRENCH SOCIETY OF BLOOD TRANSFUSION - Recombinant Immunoblot Assay First and Second Generations on 732 Blood Donors Reactive for Antibodies to Hepatitis C Virus by ELISA. Vox Sang 61: 177180, 1991. FEINSTONE, S. M.; KAPIKIAN, A. Z.; PURCELL, R. H. - Hepatite A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness. Science, 182: 1026-1028, 1973. GONALES, N. S. L. - Hepatite C em doadores de sangue: Diagnstico por transcrio reversa e reao em cadeia da polimerase e sua correlao com os testes imunoenzimticos e "Imunoblot" recombinante, Universidade Estadual de Campinas - Faculdade de Cincias Mdicas, Tese, 1997.

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Agradecimentos: Fundao Hemocentro de Braslia Instituto de Sade do Distrito Federal ISDF Instituto Oswaldo Cruz IOC FIOCRUZ Fundao Nacional de Sade FNS Fundao de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas HEMOAM Fundao de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas UNICAMP Universidade Federal de Santa Catarina UFSC Editora da Universidade de Braslia EDUNB Agradecimento Especial: Beatriz Mac Dowell Soares, Jos Antnio de Farias Vilaa e aos servidores da Fundao Hemocentro de Braslia, pelo apoio incondicional para a execuo deste projeto. Projeto Grfico, arte-final e impresso: