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INSTRUÇÃO DE TRABALHO

1

 

Descrição do Documento

Versão do Documento:

1

Local:

Instituto Nacional de Cardiologia de Laranjeiras (INCL)

Laboratório:

Terapia Celular

Seção no Laboratório:

SALA LIMPA PARA PROCESSAMENTO CELULAR

Nome do Teste:

OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA (CMMO)

Código do Documento:

INCL IT0002 – PROCESSAMENTO DE MEDULA ÓSSEA

Nome do Equipamento:

N.A

Descrição Resumida da Alteração

Revisão 1/2:

 
 

Dados da Amostra

Material:

 

Medula óssea coletada com heparina Sangue periférico coletado sem anticoagulante

Volume Ideal:

 

Vide INCL IT0001-v02- COLETA DE MEDULA ÓSSEA

Volume Específico:

 

Vide INCL IT0001-v02- COLETA DE MEDULA ÓSSEA

Transporte:

 

Medula óssea: Refrigerado (4 -8 ºC) e de forma asséptica

Rejeição da Amostra:

   

N.A.

Acondicionamento:

   

N.A.

Estabilidade:

 

A

Medula Óssea deve ser processada logo após coleta

 

As CMMO devem ser infundidas até duas horas, quando refrigeradas, após

processamento;

A

CMMO para análise em Citometria de Fluxo pode ser analisada até 24hs após

processamento.

Conservação Pré Analítica:

 

Medula óssea: N.A. Soro autólogo: refrigerado (4-8 ºC) até 4hs, após -20 o C

Conservação Pós Analítica:

 

Soro autólogo (-20ºC) Suspensão de mononucleares refrigerado (4-8 o C)

Tratamento Pré Analítico:

   

N.A.

Segurança:

 

Vide manual de Biossegurança - item manipulação de amostras biológicas

 

Método e Princípio

Nome do

 

Método:

Separação mononuclear por gradiente de densidade.

Princípio:

O aspirado de medula óssea após ser diluído com salina apresenta densidade abaixo de 1077. Quando num mesmo tubo e submetidas a centrifugação com força centrífuga controlada, a fração de células mononucleares da medula óssea se encontra em camada acima da camada do reagente Ficoll-Paque, pois apresenta menor densidade que este reagente. Desta maneira, é separada dos eritrócitos e granulócitos presentes na amostra.

 

Equipamentos

Equipamentos:

 

Centrífuga refrigerada, geladeira, microscópio e micropipetas e pipetador automático

Instrumentos Especiais:

Fluxo laminar classe II A2

2

Local Físico do Manual:

Na sala estéril de processamento celular

Manual Informatizado:

No computador do Lab. de Terapia Celular identificado pelo nome do método.

Técnica

Instruções

ATENÇÂO: O ambiente ideal para o processamento da medula óssea e obtenção da CMMO é de sala limpa, composto por uma gradação:

classe 100 (ambiente interno do fluxo laminar),

classe 10.000 (ambiente externo do fluxo laminar),

classe 100.000 (ante-sala de acesso ao laboratório) e, finalmente o ambiente sem controle de partículas.

Quanto menor a classe, menor o número de partículas contadas e mais limpo é o ambiente.

No dia anterior ao procedimento:

Limpar a câmara de fluxo laminar com álcool 70% e manter a luz ultravioleta ligada durante15-18 hs.

No dia do procedimento:

Ligar a câmara de fluxo laminar pelo menos 60 min antes do início dos trabalhos

Retirar os reagentes da geladeira

Separar material de trabalho

Centrifugar o sangue periférico coletado em tubo de soro gel, segundo instruções do INCL IT0001 v02 COLETA DE MEDULA ÓSSEA, SORO E PLASMA em centrífuga clínica (10 minutos a 3000 RPM).Coletar o soro autólogo assepticamente, dentro do Fluxo Laminar, para preparo de solução de infusão de CMMO. O soro restante deverá ser aliquotado em criotubos de 2mL, congelados a -20ºC e posteriormente enviados para o INCL juntamente com as amostras de plasma para determinação de BNP, conforme intruções de arquivo INCL IT0005-v02-TRANSPORTE PARA BNP.

Centrifugar o sangue periférico coletado segundo instruções do INCL IT0001 v02 COLETA DE MEDULA ÓSSEA, SORO E PLASMA em centrífuga clínica (10 minutos a 3000 RPM). Coletar o plasma, aliquotá-lo em criotubos de 2mL e congelar a -20ºC. Proceder o envio da amostra conforme INCL IT0005-v02-TRANSPORTE PARA BNP.

Antes de receber a medula óssea:

O técnico deve paramentear-se de forma asséptica (capote, touca , sapatilha, máscara e luvas estéreis)

Proceder com assepsia e anti-sepsia conforme recomendações para procedimentos cirúrgico

Separar material dentro do fluxo laminar

Aliquotar de maneira estéril em tubos Falcon de 50 ml: salina, meio RPMI e Ficoll para uso durante o procedimento

Calçar luvas estéreis

Abrir campo cirúrgico estéril (70x70cm)

Separar 2 ml de Heparina em seringa estéril

Montar o sistema de filtração (4 hastes e base de apoio em acrílico = mesa de sustentação, embolo e seringa de

vidro para montar os filtros = sistema de filtração), (opcional). Deixar separado sob o campo estéril: 3 pacotes de gaze estéril, 2 beckers,

Aguardar envio da medula puncionada

SEPARAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA

1. Abrir o campo estéril interno (que envolve a cuba rim com as seringas contendo a medula óssea aspirada) somente dentro da capela de fluxo lanimar.

2. Adicionar 2 ml (10.000 unidades) de heparina ao Becker do Kit de filtração de medula óssea*, já devidamente apoiado na mesa de sustentação.

3. Transferir o aspirado de medula óssea das seringas para o recipiente contendo heparina.

4. Esta parte de pré-filtragem é opcional. Montar o sistema de filtração utilizando primeiramente o filtro com a malha mais grossa (60 mesh, 250 µm) no caso do uso do Kit de filtração da University of Washington.

3

6. Usar 25 mL (metade do volume para diluição da medula óssea) de salina estéril para “lavar” internamente o primeiro Becker, despejando também este volume através da malha de filtração mais grossa.

7. Limpar o primeiro Becker com uma gaze estéril limpa.

8. Substituir a malha grossa pela malha fina (100 mesh, 150 µm)

9. Colocar o primeiro Becker (já devidamente limpo) na mesa de sustentação e transferir o conteúdo do segundo Becker de volta para o primeiro Becker através do sistema de filtração (agora com o filtro de malha fina). Usar o êmbolo se o conteúdo não descer apenas com a força da gravidade.

10. Usar os 25ml restantes (volume para completar a diluição da medula óssea) de salina estéril para “lavar” internamente o segundo Becker, despejando também este volume através da malha de filtração mais fina.

11. Neste momento teremos um volume final em torno de 100 a 200 ml (medula óssea + salina estéril na proporção 1:1).

12. Caso a pré-filtração não seja usada reiniciar aqui o procedimento a partir do passo 3. Acrescentar ao recipiente contendo o aspirado de medula e a heparina salina estéril para atingir a uma proporção final (1:1 de medula e salina – se aspirado de medula for 100 ml teremos um volume final de 250 ml). Preparar tubos de centrífuga de 50 ml com 20 ml de Ficoll-Paque, que deverá ser manipulado na câmara de fluxo laminar.

13. Acrescentar cuidadosamente sobre a solução Ficoll-Paque, 25 ml de medula óssea diluída 1:1 em salina, obtendo-se ao final duas fases, que perfazem um volume total de 45 mL em cada tubo.

14. Centrifugar a 550 g por 25 minutos, a temperatura ambiente e sem freio (ou com o tempo máximo de frenagem).

15. Coletar e desprezar camada de gordura no sobrenadante.

16. Coletar o anel de células mononucleares acima da camada de Ficoll-Paque e transferir para dois tubos de centrífuga de 50 ml.

17. Completar o volume dos tubos com meio RPMI

18. Centrifugar a 550 g, por 15 minutos, a 15º C.

19. Ressuspender as células em meio RPMI e juntar os precipitados em um único tubo,completando para 50 ml.

20. Centrifugar a 550 g por 10 minutos, a 15º C e ressupender em 30 ml de salina estéril com 5% de soro autólogo.

21. Centrifugar a 550 g por 10 minutos a 15º C e ressuspender em 1-2 ml de solução salina estéril contendo 5% de soro autólogo.

22. Proceder a contagem das células (em câmaras de Neubauer com Turk e azul de Trypan para estimar a viabilidade celular).

23. Retirar dez milhões de células mononucleares deste volume de 1-2 ml ajustar volume para 1 ml com meio RPMI sem fenol e encaminhar ao INCL para o processo de análise por citometria de fluxo, conforme especificado no Procedimento Operacional Padrão de Transporte de Amostras.

24. Ajustar o volume de células restantes em solução salina (NaCl 0,9%) estéril contendo 5% de soro autólogo.

a. 20 mL para cardiomiopatia dilatada e doença de Chagas

b. 10 mL para infarto agudo do miocárdio

c. 5 mL para doença isquêmica crônica

25. Filtrar a suspensão celular usando os filtros BD para retirar possíveis grumos com dimensão superior a 100 µm (BD

Medimachine Filcon 100 µm Sterile, Syringe-Type, Pkg of 300, cat# 34061 ou BD Cell Strainer 100 µm – cat # 252360).

26. Colocar o volume final da suspensão de células mononucleares em seringas opacas estéreis (seringa revestida de película insufilm n. 35).

a. 2 seringas de 10 ml tipo Luerlock no caso de injeção intra-coronária na cardiomiopatia dilatada e doença de Chagas;

b. 1 seringa de 10 mL tipo Luerlock para injeção intracoronária no infarto agudo do miocárdio;

c. 5 seringas de 1 ml no caso de injeção intra-miocárdica doença isquemica crônica;

Encaminhar as seringas em recipiente estéril com tampa ao laboratório de hemodinâmica (a e b) ou ao centro cirúrgico (c).

27. Caso o paciente seja randomizado para placebo, enviar amostra de células para imunofenotipagem, congelar células restantes e colocar nas seringas opacas apenas solução salina contendo 5% de soro autólogo.

OBS: A quantidade mínima de células necessárias para o procedimento todo é de 1,1 x 10 8 células, posto que deverão ser injetadas no mínimo 10 8 células/paciente.

*A O kit de filtração da Washington University é compsto de um aparato de filtração (a) 140ml já com as malhas de filtração grossa e fina e por base de apoio em acrílico para becker e becker de aço inox (b), utilizamos 2 de 250ml.

4

4 b) QUANTIFICAÇÃO CELULAR POR LÍQUIDO DE TURK. A. Contagem das células nucleadas totais: 1. Diluir

b)

4 b) QUANTIFICAÇÃO CELULAR POR LÍQUIDO DE TURK. A. Contagem das células nucleadas totais: 1. Diluir

QUANTIFICAÇÃO CELULAR POR LÍQUIDO DE TURK.

A.

Contagem das células nucleadas totais:

1.

Diluir a suspensão de células com o Líquido de Turk. A diluição inicial deve ser de 1:100 (10 mL de células diluídas 10X em salina contendo soro autólogo para 90 mL de Líquido de Turk);

2.

Homogeneizar com auxílio de pipetador e ponteira de 200 mL e aplicar uma alíquota (10 mL) na Câmara de Neubauer;

3.

Observar ao microscópio. Todas as células nucleadas coram em azul. As hemácias são mortas e degradadas, por ação do ácido acético contido no Líquido de Turk e não são vistas;

4.

Contar as células encontradas nos 4 quadrantes e fazer os cálculos, conforme apresentado ao final deste anexo (item C).

OBS.: a diluição ideal para a contagem de células na Câmara de Neubauer é aquela que permite a contagem de 20 a 200 células por cada um dos 4 quadrantes da Câmara de Neubauer. Assim, se a contagem inicial de células não estiver dentro desta faixa, fazer nova diluição, aumentando-a ou diminuindo-a, até que seja alcançada a diluição ideal. Sugere- se que se retire uma alíquota de 10 ul de CMMO (pellet de 1ml) e dilua em 90 ul de salina com soro autólogo para obtenção de amostra já diluída 10X para contagem em líquido de Turk e em azul de Trypan.

B.

Preparo de Líquido do Turk: (vide instruções de preparo de reagentes)

C.

Uso da CÂMARA DE NEUBAUER e cálculo da concentração celular:

A câmara de Neubauer possui o desenho de uma grade, a qual é visualizada apenas ao microscópio. Esquematicamente, esta grade é composta por 4 quadrantes localizados um em cada extremidade. No esquema aqui representado, os quadrantes estão nos círculos grandes. Cada quadrante possui 16 quadrados menores.

5

Q - 1

Q - 2

5 Q - 1 Q - 2 Q - 3 Q - 4 Cada quadrante possui

Q - 3

Q - 4

Cada quadrante possui área de 0,1 mm 2 . Ao adaptar uma lamínula de vidro à câmara de Neubauer, obtém-se altura de 0,1 mm. A capacidade de volume é, portanto, de 0,1 mm x 0,1 mm 2 = 0,1 mm 3 (0,1 mm 3 = 0,0001 cm 3 = 0,0001 mL ou 10 -4 mL).

Esta medida padronizada possibilita a quantificação da suspensão celular. Para isto deve-se contar as células presentes nos 4 quadrantes (círculos grandes), no sentido sugerido pela seta para cada quadrante. Em seguida, o número total de células obtido nos 4 quadrantes é dividido por 4 (média) e multiplicado pelo valor da diluição realizada. Ao final, o valor encontrado é multiplicado por 1 x 10 /mL (ordem de grandeza da câmara).

4

Â

Q Q

1

2

Q

3

Q

4

*

4

dil

*

1

¥

10

4

/

mL

=

n o de células/mL \ dil é a diluição (ou a multiplicação das diluições feitas.

DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR POR EXCLUSÃO COM AZUL DE TRYPAN

A. Contagem da células mortas:

1. Diluir a suspensão de células em salina (soro fisiológico) suplementada com 5 a 10% de soro fetal bovino, plasma humano ou albumina humana;

2. Após estar na presença de soro fetal bovino, plasma humano ou albumina humana, diluir a suspensão de células com a

Solução de Azul de Trypan 0,4%, obtendo a diluição de 1:2 (1 parte da suspensão celular para 1 parte da Solução de Azul de Trypan 0,4%);

3. Uma alíquota desta deve ser aplicada à câmara de Neubauer e observada ao microscópio.;

4. As células vivas permanecem refringentes e incolores e as mortas são coradas em azul. Contar as células coradas em

azul presentes nos 04 quadrantes da Câmara de Neubauer (o uso da Câmara de Neubauer é descrito no Anexo 1);

5.

Proceder os cálculos para determinação da viabilidade celular conforme descrito ao final deste anexo.

Obs1.: Com o uso da câmara de Neubauer, para que se alcance a precisão da contagem de células, a diluição total deve permitir a contagem de 20 a 200 células totais (vivas + mortas) por quadrante da câmara de Neubauer. No entanto, deve-se considerar que a 2 a diluição, com a Solução de Azul de Trypan, é sempre de 1:2. A 1 a diluição (em salina) é a que pode ser ajustada.

Obs2.: a mistura da suspensão celular com a Solução de Azul de Trypan deve ser feita IMEDIATAMENTE ANTES DA CONTAGEM.

B.

Preparo da solução de AZUL DE TRIPAN (vide instruções de preparo de reagentes)

6

(1) número de células mortas (azuis) por mL:

 Q1Q2Q3Q4

4

diluições feitas)

* dil *1¥10 4 / mL = n o de células (azuis)/mL \ dil é a diluição realizada (ou a multiplicação das

(2) % de viabilidade:

viabilidade (%) =

vivas * 100

totais

\ vivas são células vivas; e, totais são células vivas + mortas (azuis)

 

INSUMOS (Reagentes, Kits, Padrões, Calibradores e Controles)

 
     

     

Nome do Produto

Marca

Referência

Testes

Localização

Validade

Segurança

 

Amershan-

         

Ficoll-Paque PLUS

Pharmacia

17-1440-02

1

Geladeira

3

anos

Tóxico

RPMI 1640 sem vermelho de fenol

GIBCO

11835-030

5

Geladeira

1 ano

Atóxico

Heparina

Roche

1434802

1

Sala estéril

5

anos

Atóxico

Violeta de Genciana

Sigma

G2039

500

Sala estéril

5

anos

Tóxico

Azul de Trypan (Trypan Blue)

Sigma

T8154

100

Sala Estéril

2

 

Carcinogênico,

anos

Tóxico

Escova de clorexidina

 

RG Anvisa:

 

Sala Estéril

   

2%

Rioquimica

101520.10005

1

3

anos

-

   

RG Ministério

1

     

Cloreto de Sódio Injetável 0,9% - 10 mL

Saúde:

CoreAmp

1.4277.0009.001

Sala Estéril

3

anos

-

 

-3

 
   

RG Ministério

1

Sala Estéril

   

Cloreto de Sódio 0,9% -

100 mL

Halex Istar

Saúde:

103110011

3

anos

-

   

RG Ministério

 

Sala Estéril

   

Luvas Cirúrgicas

Esterelizadas

New Hand

Saúde:

1.0182.4200.04

1

3

anos

-

   

RG Ministério

 

Sala Estéril

   

Luvas de procedimento

New Hand

Saúde:

1

3

anos

-

1.0182.4200.04

 

Compressas de Gaze Hidrófila Estéril

 

RG Anvisa:

 

Sala Estéril

   

Cremer

100.711.50043

1

5

anos

-

Seringa Descartável estéril, atóxica, apirogênica - 20mL

 

RG Anvisa:

 

Sala Estéril

   

Injex

101.606.10007

1

5

anos

-

Seringa Descartável estéril, atóxica, apirogênica - 10mL

 

RG Anvisa:

 

Sala Estéril

   

BD Plastipak

100.334.30030

1

5

anos

-

Seringa Descartável estéril, atóxica, apirogênica - 10mL – Luer Lock

 

RG Anvisa:

 

Sala Estéril

   

BD Plastipak

100.334.30030

1

5

anos

-

Seringa Descartável estéril, atóxica, apirogênica - 5mL

 

RG Anvisa:

 

Sala Estéril

   

Plascalp

101.722.10012

1

5

anos

-

7

Agulha Descartável – 21G1 / 25 X 0,8

 

RG Anvisa:

 

1 Sala Estéril

   

Injex

101.606.10008

5

anos

-

Agulha Descartável – 22G1 / 25 X 0,7

 

RG Anvisa:

 

1 Sala Estéril

   

Injex

101.606.10008

5

anos

-

Agulha Descartável – 22G1 / 40 X 12

 

RG Anvisa:

 

1 Sala Estéril

   

Injex

101.606.10008

5

anos

-

Capote Cirúrgico

 

Isento de RG no Ministério Saúde

 

- Sala de

 

-

 

Esterilizável

Punção

 

Touca descartável

 

Isento de RG no Ministério Saúde

 

1 Sala de

   

Descarpack

Punção

3

anos

Máscara descartável

 

Isento de RG no Ministério Saúde

 

1 Sala de

   

Descarpack

Punção

3

anos

Propé descartável / Sapatília descartável

 

Isento de RG no Ministério Saúde

 

1 Sala de

   

Descarpack

Punção

3

anos

de     Descarpack Punção 3 anos Instruções e preparo Solução fisiológica + soro

Instruções e preparo

Solução fisiológica + soro autólogo (5%):

1. Misturar os reagentes:

1 mL de soro autólogo

19 mL de salina (NaCl 0,9%) estéril

2. Homogeneizar;

3. Armazenar sob refrigeração (4-8 o C).

Obs.: Preparar no dia do procedimento de separação celular.

Líquido de Turk:

1. Misturar os reagentes:

97 mL de água injetável 1 mL de Solução Aquosa de Violeta de Genciana a 1% (em pó - marca SIGMA, catálogo SIGMA - G 2039) 2 mL de acido acético

2. Homogeneizar;

3. Armazenar a temperatura ambiente.

Azul de trypan 0.4%

1. Misturar os reagentes:

0,4 g do pó de azul de trypan (sugestão - marca SIGMA, catálogo SIGMA - T 6146)

100 mL de soro fisiológico (solução NaCl 0,9%)

2. Homogeneizar em agitador magnético por aproximadamente 20 min;

3. Filtrar com papel de filtro. Se possível, filtrar em sistema estéril, com membrana 0,22 µm (sugestão – sistema swinex

35mm, Millipore Inc.) e manter a solução estéril;

4. armazenar a temperatura ambiente.

OBS.: Tal solução pode ser obtida pronta para o uso: Referência: Trypan blue solution, 0,4%, marca SIGMA, catálogo SIGMA - T 8154.

blue solution, 0,4%, marca SIGMA, catálogo SIGMA - T 8154. Alternativas de Procedimentos N.A Calibrador N.A

Alternativas de Procedimentos N.A

Calibradorsolution, 0,4%, marca SIGMA, catálogo SIGMA - T 8154. Alternativas de Procedimentos N.A N.A Calibração N.A

N.A

0,4%, marca SIGMA, catálogo SIGMA - T 8154. Alternativas de Procedimentos N.A Calibrador N.A Calibração N.A

Calibração

N.A

0,4%, marca SIGMA, catálogo SIGMA - T 8154. Alternativas de Procedimentos N.A Calibrador N.A Calibração N.A

Cálculos

8

Concentração celular

Â

Q Q

1

2

Q

3

Q

4

*

4

dil

*

1

¥

10

4

/

mL

Viabilidade celular (%)

Linearidade1 2 Q 3 Q 4 * 4 dil * 1 ¥ 10 4 / mL

N.A

viabilidade (%) =

Interpretação TécnicaViabilidade celular (%) Linearidade N.A viabilidade (%) = vivas * 100 totais = n o de

vivas * 100 totais

=

n o de células/mL \ dil é a diluição

(ou a multiplicação das diluições feitas)

Valores de Referência e Limites de Análise de Consistência

Valor de Referência:

N.A

Revisional:

N.A

 

Controle da Qualidade

Id dos Controles:

N.A

Instruções:

N.A

Frequência:

N.A

Limites:

N.A

Ações Corretivas:

N.A

Registros:

N.A

Controles Alternativos:

N.A

PCEQ:

N.A

(Programa de Controle Externo da Qualidade)

Validação do Método

Através da comparação do rendimento celular obtido em outro laboratório e realização da técnica de imunofenotipagem da fração mononuclear isolada.

Interpretação

Interpretação Clínicada fração mononuclear isolada. Interpretação N.A Correlação N.A Significado Clínico N.A

N.A

Correlaçãoisolada. Interpretação Interpretação Clínica N.A N.A Significado Clínico N.A Interferências N.A Principais

N.A

Significado Clínico

N.A

Interferências

N.A

Principais Referências

1. Boyum, A. Separation of white blood.cells. Nature (1964) 204: 793- 794.

2. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Clin. Invest. (1968) 21 suppl.

97: 77-89.

3. Degushi, Y e Kehrl, JH. Selective Expression of Two Homeobox genes in CD34-Positive Cells from human bone

marrow. Blood (1991) 2: 323-28.

9

Final do Documento - Dados do Documento

Autor do Documento:

Patrícia Cristina dos Santos Costa Fabiana Bergamin Muccillo

Ass:

Data de Criação:

Fevereiro/2005

Aprovação

Aprovado para Implementação:

Data da Implementação:

Autor da Aprovação:

Antônio Carlos Campos de Carvalho

Ass:

Data da Aprovação:

Status Geral do Documento:

Ativa