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I. PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFA
El trmino cromatografa fue ideado por el botnico ruso Tswett en 1906 a partir de las palabras griegas que significan color y escritura. Diseo un mtodo para separar la clorofila y otros pigmentos de las plantas mediante un tubo (columna) lleno de carbonato de calcio seco (empaque de la columna). Vaci sobre la columna una mezcla de disulfuro de carbono y ter de petrleo (fase mvil) y observ que al lavar la columna con ms disolvente los constituyentes del extracto descendan por la columna a distintas velocidades y se separaban en anillos coloreados (ver figura 1).
La fase estacionaria es un slido, o un lquido inmovilizado sobre un soporte slido.

La fase mvil se le conoce como eluyente o acarreador y puede ser un gas o un lquido

Figura 1. El experimento de Tswett.

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La separacin de los componentes de la muestra ocurre debido a que cada componente de la muestra interacta en forma distinta con los componentes de DEFINICIN: La cromatografa se la fase estacionaria. Entre ms afines sean define como la tcnica analtica de los dos, ms difcilmente sern eludos por separacin originado por la competencia el solvente. de dos fases por los componentes de El proceso mediante el cual el eluyente hace que un compuesto salga de la columna se denomina elucin. Al constituyente mayoritario de una solucin se le denomina solvente y al constituyente minoritario soluto. No es necesario que las substancias a separar sean coloridas, pero s debe disponerse de algn mtodo apropiado para su deteccin. En cualquier caso, los resultados se grafican para dar un cromatograma. Cada pico representa un componente distinto de la muestra, y el rea del pico es una medida de la concentracin relativa de ese componente. La figura 2 muestra un cuadro sinptico con los principales tipos de cromatografa y su clasificacin.

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Figura 2. Una clasificacin de los mtodos cromatogrficos.

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MECANISMOS DE SEPARACIN EN CROMATOGRAFA El principio para que se separe una muestra en sus componentes puede ser debido a 5 principales fenmenos fsicos: 1. Adsorcin. En este mecanismo se utiliza una fase estacionaria porosa, con un rea superficial muy grande (por ejemplo, carbn activado o slica gel). El soluto se adsorbe en la superficie de la fase estacionaria. La causa de que se mantenga adsorbido el soluto se debe a la separacin de este a lo largo de la superficie de la fase estacionaria. La cromatografa de adsorcin o Lquido-Slido es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un mtodo importante de la HPLC. Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina, siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen. En general la cromatografa Lquido-Slido es ms adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.

2. Reparto. La fase estacionaria es una pelcula delgada fija sobre un soporte slido previamente preparado. El soluto se separa por el equilibrio que se establece por la solubilidad que tenga el soluto frente a este lquido estacionario y a la fase mvil gaseosa o lquida. Para ilustrar esto, supongamos que tenemos una serie de vasos de precipitado llenos con agua hasta la mitad. Se aade al primero de los vasos una mezcla de las molculas A y B. A posee una Kr (hexano:agua) de 0.9, en tanto que la Kr de B es 0.1. A continuacin se aade un volumen de hexano al primer vaso, se agita, se permite la separacin de las fases y se recupera dicho hexano. El hexano recuperado en este primer vaso se aade al segundo y se aade ms hexano limpio al primer vaso. Ambos se agitan, se dejan separar las fases y se recupera el hexano. El hexano del segundo vaso se pasa al tercero el del primero al segundo y se aade hexano nuevo al primer vaso. Este procedimiento se repite hasta que todos los vasos se llenen con hexano.

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Si el experimento consistiese de 8 vasos, al final la cantidad de A y de B presente en cada vaso (sumando lo contenido en el hexano y el agua) presentar una distribucin como la que se muestra en la figura 3.

Figura 3. Distribucin de A y B en hexano y agua Si juntamos los vasos 1 al 3 por un lado y los vasos 6 al 8 por otro y evaporamos el solvente, habremos separado la sustancia A de la B con una mnima prdida (lo que se qued en los vasos 4 y 5). SEPARACIN POR EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO

Ejemplo del principio de reparto entre dos fases inmiscibles. Cuando una mezcla de molculas disueltas en un solvente determinado se pone en contacto con otro solvente que sea inmiscible con el primero, las molculas disueltas se difundirn hacia la nueva fase hasta alcanzar una concentracin en cada fase (solvente) que depende de la solubilidad relativa de dicha molcula en las fases.

HEXANO

AGUA

Figura 4. Principio de reparto entre dos fases inmiscibles. En la figura 4, las esferas rojas representan molculas muy solubles en hexano y poco solubles en agua, mientras que las esferas verdes representan molculas muy solubles en agua y poco solubles en hexano.

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El resultado es que ahora la fase hexnica contiene a las molculas representadas por esferas rojas y estas se han separado de las otras, que permanecen en el agua. La concentracin de molculas "rojas" en el hexano dividida por la concentracin de molculas "rojas" en el agua, cuando se ha alcanzado el equilibrio, representa el Coeficiente o Constante de Reparto de la sustancia en cuestin entre agua y hexano. Kr = (Concentracin en Hexno)/(Concentracin en el agua). As mismo, se puede calcular un coeficiente de reparto para las molculas "verdes". Es evidente que la Kr("rojas") ser elevada, mientras que la Kr("verdes") ser muy pequea. Una sustancia determinada presentar una Kr diferente para cada par de solventes que se ensaye. Debe advertirse tambin que esta definicin es vlida siempre que los volmenes de solvente empleados sean grandes, a fin de evitar que las soluciones se saturen. Dado que la difusin de las molculas de una fase a la otra es lenta, el proceso debe acelerarse agitando la mezcla de solventes hasta formar una suspensin fina de gotitas de hexano en el agua o viceversa. Para recuperar la fase hexnica se permite que la dos fases se separen por sedimentacin (dado que son inmiscibles y de distinta densidad). Aunque esta separacin de fases tambin puede acelerarse mediante centrifugacin. La separacin puede hacerse ms completa si despus de recuperar el hexano, se aade una nueva cantidad de hexano limpio al agua. Esta vez, las pocas molculas "rojas" presentes en el agua pasarn al hexano y la cantidad de ellas que permanezcan en el agua ser an menor. La eficiencia de la separacin depende del nmero de lavados con solvente y de la diferencia en las constantes de reparto de ambas substancias.

Generalizando:

K= Otro ejemplo:

co nc.de X en el solvent e 1 conc. de X en el solvent e 2

[ X]1 [ X] 2

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En teora, es posible separar una mezcla de substancias realizando un nmero muy grande de extracciones hasta garantizar la pureza deseada. Sin embargo, la extraccin lquido-lquido tiene la desventaja de que es un proceso por lotes, no continuo. Adems, realizar un nmero grande de extracciones es tedioso y se puede perder fcilmente una gran cantidad de muestra entre cada extraccin

el yodo es 85.5 veces ms soluble en tetracloruro de carbono que en agua, de modo que para este sistema el coeficiente de reparto es: K= conc. de yod o en CCl4 co nc.de yodo en H2O = 85 .5

Entonces, una manera sencilla de separar el yodo de una solucin acuosa sera extraerlo con CCl4. El sentido comn nos dice que entre ms extracciones realicemos, ms completa ser la remocin del componente. Aunque no es difcil deducir la frmula bsica para la extraccin por lotes, en esta ocasin la daremos sin demostracin:

V n 2 Wn = W0 KV1 + V2
donde: K coeficiente de reparto para el soluto X entre los solventes 1 y 2 n nmero de extracciones realizadas W0 gramos de X en el solvente 2 antes de cualquier extraccin (iniciales) gramos de X en el solvente 2 despus de n extracciones (finales) Wn V1 volumen del solvente utilizado para cada extraccin V2 volumen del solvente donde est el soluto originalmente Explicaremos el uso de la frmula con un ejercicio. Ejercicio: Supongamos que queremos extraer 2 gramos de soluto X de 50 mL de agua. Como solvente de extraccin se usar cloroformo. Para este sistema se sabe que el coeficiente de reparto es: [ X] 1 [ X]CHCl 3 K= = =3 [ X] 2 [ X] H 2O Qu es mejor: hacer una extraccin con 150 mL de cloroformo, o hacer tres extracciones con 50 mL de cloroformo cada una? Solucin: Identificamos al solvente 1 como el cloroformo. El solvente 2 es el agua. El coeficiente de reparto K est escrito en la forma correcta (conc. 1 / conc. 2). Entonces,

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a) Una sola extraccin (n = 1) con 150 mL de cloroformo V1 = 150 mL de CHCl3 V2 = 50 mL de H2O W0 = 2 g de soluto X hay inicialmente en el agua V 1 2 W1 = W0 KV1 + V2

1 50 W1 = 2 3 (150 ) + 50 = 0 .2 g
Quedaron 0.2 g de X en el agua. Pudimos extraer 2-0.2 = 1.8 g, es decir, el 90 % de X. b) Tres extracciones (n = 3) con 50 mL de cloroformo cada una V1 = 50 mL de CHCl3 V2 = 50 mL de H2O W0 = 2 g de soluto X hay inicialmente en el agua

V 3 2 W3 = W0 KV1 + V2 3 50 = 0 .03125 g W3 = 2 3 (50 ) + 50

Tres extracciones pequeas son mejores que una grande!

Quedaron 0.03125 g de X en el agua. Pudimos extraer 2 - 0.03125 = 1.969 g, es decir, ms del 98 % de X.

3. Intercambio Inico. Para que se efecte la separacin, la fase estacionaria se modifica uniendo a su superficie especies electro activas (aniones o cationes) de forma covalente.
La separacin se realiza debido a las fuerzas electroestticas entre cargas opuestas de la fase estacionaria y los solutos cargados. La fase mvil es un lquido.

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Intercambiadores catinicos La matriz de la columna contiene unidos grupos anionicos con carga negativa.

Intercambiadores aninicos La matriz de la columna contiene unidos grupos catinicos con carga positiva.

Figura 5. Ejemplos de intercambiadores ionicos

Se usa para purificar protenas. Separa molculas en base a su carga inica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las molculas de igual carga salen con el amortiguador. Las molculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de afinidad. Para desprender las protenas adheridas se usa una solucin alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de . La columna puede ser salinidad, o de un solo paso, echando la solucin de de matriz negativa mayor concentracin de sal primero. Al subir la (intercambio catinico) o positiva (intercambio concentracin poco a poco podemos recolectar las aninico). muestras desde las que menos afinidad por la columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elucin, la sal va compitiendo con la protena por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende.

En resumen los factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin.

Figura 6. Principio de la cromatografa de intercambio inico.

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4. Exclusin molecular. Esta separacin se debe al La cromatografa de tamao del componente de la muestra. Se asemeja exclusin, tambin es a un tamiz molecular, en el cual la fase llamada de filtracin en gel o cromatografa de estacionaria es un gel poroso que atrapa a las permeacin en gel. partculas pequeas del soluto, mientras que las grandes, no caben por los poros de este gel y pasan de largo sin ser retenidos. Por lo tanto, las partculas pequeas tardan ms en salir de la columna. El tiempo de elucin es proporcional al peso Este tcnica se emplea molecular de los componentes, por lo que no es en la separacin de muy usada con los compuestos de alto peso protenas de alimentos, determinacin molecular. Este tipo de separacin por tamao y fructosa en de glucosa zumos de difiere de las dems tcnicas de cromatografa en fruta, etc. que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida. La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el volumen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente. Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables, mecnica y qumicamente, tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna.

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Figura 7. Principio de la cromatografa de filtracin en gel. 5. Afinidad. Es la tcnica ms reciente y Se usa ampliamente en la separacin de ms selectiva. Se inmovilizan molculas protenas de alto peso molecular. (como enzimas y anticuerpos) sobre la superficie de la fase estacionaria. Los componentes de la muestra altamente afines a estas molculas se retienen con gran eficacia mientras las que no son afines, pasan de largo a travs de la columna y salen en primera instancia.

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Protenas afines a glucosa unidas a residuos de glucosa (G) en el soporte

Adicin de glucosa (G)

Las proteinas enlazadas a la glucosa son expulsadas sobre la glucosa adicionada Figura 8. Principio de la cromatografa de afinidad.