Alexandre Dias de Arajo Neto u

Bidens sulphurea (Sch. Bip.): efeitos fotodinmico e antibitico dos extratos a o etanlicos de suas ores o
Dissertaao apresentada ` Universidade Federal de c a Uberlndia como requisito parcial para a obtenao a c do t tulo de mestre em Qu mica Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto de Oliveira

Uberlndia a

2011

Dedicatria: o
Dedico este trabalho ` todos os serem humanos que lutam e se esforam para fazer cincia, a c e e, fazendo, acabam tornando-se parte dela. Ainda que com diculdade extrema, jamais se entregam, e nunca se cansam da eterna luta de sair do senso comum, lutando heroicamente com todas as suas foras, armados apenas com cinco sentidos e um crebro, para c e simplesmente responder a pergunta: Por qu? e

Agradecimentos:
Eu sinceramente gostaria de agradeer ` todos aqueles que contribuiram direta ou c a indiretamente com a realizao deste trabalho: ca Ao meu orientador, professor Carlos Alberto de Oliveira (UFU), por suas orientaoes c e pela oportunidade de trabalhar em seu laboratrio, o qual sempre esteve aberto aos o alunos que o procuraram com disposiao para fazer cincia. c e Ao professor Fernando Petacci (UFG-Catalo) pelo fornecimento do extrato de Bidens a sulphurea, a banca pelo tempo cedido na apreciaao do trabalho. Ao professor Domingos c Svio de Miranda (UFU), pelas idias e sugestes e a professora Richele Priscila Severino a e o (UFG-Catalo). a Aos colegas do laboratrio de bioqu o mica e fotobiologia, LABIOFOT do Instituto de Qu mica da Universidade Federal de Uberlndia (UFU), Erick Frana, Bruno Gars, Joo a c ce a Fernando, Lucas Ferreira de Paula, por cada coisa que zeram para compor o ambiente de trabalho e o tornar agradvel como tem sido. a Aos tcnicos do Instituto de Qu e mica por sua dedicaao, ajuda que facilitou e possibic litou este trabalho, pois sem esta, eu jamais teria conseguido devido as solicitaoes que o ` c emprego de professor estadual designado me causa, e, assim com o curto tempo dispon vel que me sobra todas minhas idias seriam natimortas. e Aos Institutos de F sica, Medicina Veterinria e Microbiologia da UFU pela ajuda a concedida. Aos meus pais e amigos pelo apoio. Aqueles que contribuem (ou contribu ram) com a comunidade do Software livre (Open Source), a Free Software Foun`
A A dation, GNU/Linux, sistema de tipograa digital L TEX, L TEX 2 , vocs so os melhores, e a venceremos!

Ep grafe

Aqueles que possuem uma excessiva f em suas prprias teorias ou em suas prprias e o o
idias, no so apenas pobremente dispostos a fazer novas descobertas, mas, fazem tambm e a a e observaes pobres. co

Claude Bernard (1813-1878)

Resumo
Este trabalho teve por objetivo, avaliar alguns efeitos biolgicos do extratos bruto o (etanlico) das ores de Bidens sulphurea (Asterace), os efeitos avaliados foram: cio totoxicidade, efeito antibitico e fototxico. Deu-se nfase aos efeitos fototxicos, pois o o o e o objetivo primrio era avaliar se os pigmentos desta planta poderiam ser utilizados como foa tosensitizadores para a terapia fotodinmica, empregando-se luz emitida por LED, para o a tratamento de um modo no invasivo de dermatoses, tais como a onicomicose. Concluiua se que, das duas variedades da planta estudada (variedades laranja e amarela), a que apresenta maior fototoxicidade tanto quando irradiado por luz branca, e vermelha ( 600 nm), quanto efeito antibitico (no escuro) foi a variedade laranja, a qual tambm o e mostrou uma grande toxicidade frente aos nuplios de Artemia salina quando irradiada a com luz vermelha. Palavras-chave: Bidens sulphurea, terapia fotodinmica, polifenlicos a o

Abstract
This work had the aim to assess some biological eects of the Bidens sulphurea (Asterace) (also know as Cosmos sulphureus), assessed eects were: cytotoxicity, antibiotic and phototoxicity. The phototoxicity was ephasized, since the primary aim of this work was to evaluate if this plants pigments could be used as photosensitizers in the photodynamic therapy, in a non invasive way, using light emitted by LED, for treatment of dermatosis, particularly, onicomicosis. The conclusion of this work is that, of the two Bidens sulphurea varieties studied, the one that bear the greater photodynamic activity, when irradiated with white light, or red light ( 600 nm) and did showed greater antibiotic eect (in the dark) was the orange variety. The orange variety did showed an increase in the toxicidy to the Artemia salina nauplii, when irradiated with red light. Key Words: Bidens sulphurea, photodynamic therapy, polyphenolics

Lista de Figuras
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Distribuio eletrnica do oxignio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 ca o e Diagrama de Perrin-Jablonski . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Bidens torta, em destaque cap tulo com vrias res no centro do cap a o tulo 19

B. sulphurea, variedade amarela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 B. sulphurea, variedade listrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 B. sulphurea, variedade laranja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Cartamina - A aglicona corresponde a parte em negrito . . . . . . . . . . . 30 Condensaao de Claisen-Schmidt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 c Rota biosinttica (genrica) para avonides . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 e e o Diversos tipos de avonides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 o Sistema de numeraao de alguns avonides . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 c o S ntese de um avonol - S ntese de Auwers . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Condensaao aldlica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 c o S ntese da avona - mtodo de Von Kostanecki . . . . . . . . . . . . . . . . 35 e S ntese de uma avona - Reaao de Allan-Robinson . . . . . . . . . . . . . 35 c Rearranjo de Baker-Venkataraman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Reaao de Algar-Flyn-Oyamada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 c S ntese de chalconas - mtodo de Eddarir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 e Reaao original de Suzuki-Miyaura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 c Exemplo de estrutura de uma procianidina . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Aparelho utilizando 600 LED de alto brilho de 8mm . . . . . . . . . . . . . 44 Lanterna de 10 LED de 1w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

23

Espectro UV/VIS do extrato etanlico de B. sulphurea, variedade laranja, o diluiao (1/200) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 c

24

Espectro UV/VIS do extrato etanlico de B. sulphurea variedade amarela, o diluiao (1/200) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 c

25

Espectro UV/VIS do extrato de B. sulphurea variedade laranja, diluiao c (1/200) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

26

Espectro UV/VIS do extrato de B. sulphurea variedade amarela, diluiao c (1/200) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

27

Espectros sobrepostos em diferentes solventes de extratos de B. sulphurea variedade laranja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

Espectro da lmpada uorescente de 20 watts . . . . . . . . . . . . . . . . 57 a Espectro da lmpada UV de 15 watts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 a Determinao do MIC para o extrato irradiado . . . . . . . . . . . . . . . . 61 ca Fluorescncia revelando o crescimento de coliformes . . . . . . . . . . . . . 61 e Azul de metileno utilizado como fotosensitizador . . . . . . . . . . . . . . . 61 Azul de metileno inibe os coliformes at na diluiao 1/16 . . . . . . . . . . 62 e c Inativao fotodinmica de E. coli com lmpada halgena . . . . . . . . . 63 ca a a o B. sulphurea amarela: no irradiada e irradiada . . . . . . . . . . . . . . . 64 a B. sulphurea laranja: no irradiada e irradiada . . . . . . . . . . . . . . . . 64 a Nenhum dos solventes inibiu o crescimento microbiano . . . . . . . . . . . 65 Fotohemlise usando extrato de B. sulphurea laranja . . . . . . . . . . . . 67 o PDA inoculado com 10L de suspenso microbiana (McFarland = 4) . . . 69 a PDA inoculado com 10L de suspenso microbiana (McFarland = 4) . . . 70 a PDA inoculado com 10L de suspenso microbiana (McFarland = 4) . . . 70 a

Sumrio a

Introduo ca 1.1 1.2 1.3

13

Terapia fotodinmica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 a Fotosensitizadores e fotoqu mica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Sobre a fam Asterace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 lia 1.3.1 Classicao botnica do espcimen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 ca a e

1.4

Ensaios de toxicidade com Artemia salina . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.4.1 Vantagens do emprego de A. salina como modelo . . . . . . . . . . 23

1.5 1.6

Desvantagens do emprego de A. salina como modelo . . . . . . . . . . . . 24 Ensaios com microrganismos e eritrcitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 o 1.6.1 1.6.2 1.6.3 Saccharomyces cerevisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Escherichia coli e coliformes fecais . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Eritrcitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 o

1.7 2.8

Sistemas de irradiao luminosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 ca Sobre alguns pigmentos fenlicos e suas s o nteses . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.8.1 S ntese de avonides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 o 2.8.1.1 2.8.1.2 2.8.1.3 2.8.1.4 2.8.1.5 2.8.1.6 S ntese de Auwers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 S ntese via condensaao aldlica . . . . . . . . . . . . . . . 33 c o Mtodo de Von Kostanecki . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 e Reaao de Allan-Robinson . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 c Rearranjo de Baker-Venkataraman . . . . . . . . . . . . . 34 Reaao de Algar-Flynn-Oyamada . . . . . . . . . . . . . . 35 c

2.8.1.7 2.9

Acoplamento de Suzuki-Miyaura . . . . . . . . . . . . . . 36

avonides: algumas atividades biolgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 o o 40

Objetivos gerais e espec cos 2.1 2.2

Objetivos gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Objetivos espec cos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 41

Materiais e mtodos e 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6

Extrato bruto etanlico de B. sulphurea (laranja) . . . . . . . . . . . . . . 41 o Obtenao de extrato bruto liolizado de B. sulphurea (amarela e laranja): . 41 c Obtenao dos espectros UV/VIS de B. sulphurea (amarela e laranja) c . . . 42

Espectros das lmpadas UV e uorescente utilizadas . . . . . . . . . . . . . 42 a Sistemas de irradiao empregados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 ca Metodologia experimental com Artemia salina . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.6.1 3.6.2 Ecloso dos cistos de Artemia salina . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 a Soluo de extrato bruto de B. sulphurea empregada em Artemia ca salina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.6.3 Ensaio de toxicidade em Artemia salina . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.7 3.8 3.9

Experimento de fotohemlise em eritrcitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 o o Fotoinativao de Saccharomyces cerevisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 ca Fotoinativao de coliformes: LED 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 ca . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.10 Efeito antibitico de B. sulphurea em E. coli o

3.11 Fotoinativaao de coliformes com lmpada halgena . . . . . . . . . . . . . 51 c a o Resultados experimentais e discusses o 4.0.1 4.1 4.2 53

Espectros do extrato etanlico de B. sulphurea . . . . . . . . . . . 53 o

Espectros das lmpadas uorescente e UV utilizadas . . . . . . . . . . . . . 57 a Ensaios biolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 o

4.2.1

Mortalidade fotodinmica de Artemia salina . . . . . . . . . . . . . 59 a 4.2.1.1 4.2.1.2 Artemias irradiadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Artemias no irradiadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 a

4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 Concluses o Referncias e

Fotoinativaao de coliformes fecais com aparelho LED 600 . . . . . 60 c Fotoinativaao de coliformes com lmpada halgena . . . . . . . . . 62 c a o Resultados da fotohemlise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 o Efeito antibitico de B. sulphurea em E. coli . . . . . . . . . . . . . 68 o Resultados da fotoinativao de Saccharomyces cerevisi . . . . . . 69 ca 72 74

13

Introduo ca
1.1 Terapia fotodinmica a

A terapia fotodimica (TFD) uma forma de tratamento de enfermidades em que a e so utilizados basicamente de trs elementos(1): a e 1. Fotosensitizador: Geralmente um corante orgnicoi que quando iluminado por e a luz de determinados comprimentos de onda, tm os eltrons de um ou mais de seus e e grupos funcionais, promovidos a um estado excitado de energia. 2. Uma fonte luminosa: Que com a potncia e comprimeto de onda adequados e e capaz excitar o fotosensitizador. 3. Oxignio: O qual recebe a energia adquirida pelo fotosensitizador e promovido e e de seu estado fundamental de energia (tripleto) para um estado excitado (singleto). Neste estado excitado de energia, o oxignio pode dar origem a vrias espcies qu e a e micas diferentes, que normalmente so radicais livres: peroxila, superxido, radical hidroxila etc. a o Estas espcies qu e micas so coletivamente chamadas de ROS, do ingls Reactive Oxygen a e Species, ou Espcies Reativas de Oxignio. e e So estas espcies que vo reagir com algum alvo biolgico. Frequentemente, ao a e a o se empregar TFD, intenciona-se levar a clula alvo a um estado de apoptose, tambm e e conhecido como morte celular programada(2), de modo que a clula se autodestrua e seja e absorvida pelo organismo. Pode-se tambm utilizar a TFD para se inativar patgenos: bactrias, v e o e rus, algas, esporos, etc, pois dada a natureza altamente reativa das ROS, estas normalmente reagem de maneira pouco seletiva, reagindo com vrios grupos funcionais diferentes. Desta forma, a no se espera que um patgeno desenvolva resistncia a TFD, ao contrrio do que vem a o e ` a ocorrendo com os antibiticos tradicionais (3)(4). o
i

Mas no necessariamente, p. ex: cido sil a a cico e dixido de titnio (TiO2 ). o a

14

Uma vantagem prtica muito benca ao paciente sob tratamento com TFD, a capaa e e cidade de se focar a luz irradiante em um ponto espec co do corpo. Pois diferentemente do uso de radiaoes ionizantes, o tempo de vida das expcies reativas, normalmente c e e curto, e logo sua ao ca restrita a poucos mil ca metro de sua geraao, no atingindo c a normalmente outros pontos do corpo. Com o uso de laser irradiados via bra tica, na verdade poss se focar em reas o e vel a de cerca de apenas 1 mm2 . Motivo pelo qual esta tcnica se apresenta muito promissora na atualidade e para e o futuro, pois nos ultimos anos tm-se notado um aumento expressivo no aparecimento e de bactrias resistentes aos antibiticos tradicionais, e estas tem causado epidemias de e o infecoes hospitalares (p. ex: Acinetobacter baumannii (5)). c

1.2

Fotosensitizadores e fotoqu mica

Sabe-se que as molculas de certos pigmentos (fotosensitizadores), sob a aao de e c determinados comprimentos de onda, possuem a propriedade de ter os eltrons de alguns e de seus grupos funcionais (cromforos) promovidos de um estado de energia m o nima ou no excitado (singleto), para um estado excitado de energia (tripleto). a A conguraao eletrnica do estado excitado (tripleto) instvel e possui a tendncia c o e a e natural de relaxar para um estado de energia mais favorvel (menos energtico). Existem a e vrios caminhos que o eltron pode tomar para liberar a diferena de energia entre a e c o estado excitado tripleto e o excitado no singleto: uorescncia, fosforescncia, fosfoa e e rescncia tardia, vibraoes, rotaoes moleculares, etc. e c c Existe a possibilidade da transferncia de energia do grupo cromforo do fotosensitie o zador para o oxignio molecular. O qual, diferentemente da maioria dos pigmentos, no seu e estado fundamental (ou no excitado) existe na conguraao eletrnica tripleto, por isso o a c o oxignio molecular as vezes chamado de oxignio tripleto, 3 O2 , (assim chamado, devido e e e a existncia de trs possibilidades de alinhamento dos dois eltrons desemparelhados da e e e molcula de oxignio) levando a promoao do oxignio molecular a oxignio singleto 1 O2 . e e ` c e ` e Existem duas variedades de oxignio singleto e, usando a notaao espectroscpica ese c o tas podem ser designadas por 1 g O2 e 1 g + O2 , respectivamente. O primeiro o oxignio e e singleto de que se fala sem maiores especicaoes. Em nome da simplicidade, frequentec

15

mente grafado como 1 O2 (6). E uma espcie reativa de oxignioii importante em sistemas e e e biolgicos, principalmente pela sua meia vida relativamente longa, que varia entre 4,2s o em H2 O, at 628s em C6 D6 . e Com estas caracter sticas o 1 g O2 portanto encontra condioes tando de ser formado, c quanto de reagir em meio celular. J o outro oxignio singleto 1 g + O2 , em sistemas a e biolgicos praticamente ignorvel, devido a sua grande entalpia de formaao de 158 o e a ` c kJ mol1 tanto quanto pela sua curt ssima meia vida que, em soluao aquosa, menor c e que 10 ps. A diferena entre as duas espcies de oxignio singleto est no spin dos dois eltrons c e e a e
e a a e do orbital 2p , que na espcie 1 g O2 esto emparelhados, j na espcie 1 g + O2 esto a

desemparelhados em subn veis diferentes.

e O oxignio molecular, possuindo dois de seus eltrons desemparelhados (2p ) parae e

magntico assim como alguns os metais tais como o ferro e o n e quel, p. ex:. Caracter stica comprovada pelo fato de que, ao se derramar oxignio l e quido nos plos de um im, vemos o a o oxignio ser atra em por ambos os plos, exatamente, como um metal paramagntico e do o e faria. J o oxignio singleto diamagntico, e um tipo de ROS muito reativo, pois a a e e e e maioria das molculas orgnicas, em seu estado fundamental de energia, so singletos. e a a Podemos tambm nos valer do princ e pio da conservao da paridade do spin eletrnico, ca o o qual basicamente nos diz que as molculas devem reagir com contrapartes de mesma e paridade, ou seja, singleto com singleto, tripleto com tripleto. A distribuiao eletrnica c o das vrias formas do oxignio, encontram-se sob a forma de diagrama, veja a gura 1. a e Com o advento da mecnica quntica, estes fatos puderam ser explicados com maior a a profundidade. Por exemplo, a aplicaao da teoria de grupo e do modelo LCAOiii , posc sibilitaram a determinao (por questes de simetria de orbitais moleculares, n ca o veis de energia etc.) das caracter sticas espectroscpicas do oxignio singleto, bem como a detero e minaao dos vrios tempos de vida deste em diferentes meios, (dependendo da fase ser c a aquosa, gasosa, etc.), at que decaia para o estado padro, o de oxignio tripleto. e a e Outra conquista importante da mecnica quntica, (com relaao a fotoqu a a c ` mica desta espcie) foi o desenvolvimento do conceito e respectivo clculo do chamado rendimento e a quntico (ou o nmero de molculas de oxignio singleto geradas para cada fton absora u e e o
O oxignio molecular (tripleto) representado como 3 g O2 e e Acrnimo ingls para Linear Combination of Atomic Orbitals, ou combinao linear de orbitais o e ca atmicos, combinao esta que forma os orbitais moleculares o ca
iii ii

16

Figura 1: Distribuiao eletrnica do oxignio c o e vido) das reaes de s co ntese de oxignio singleto. e Em literatura especializada em fotoqu mica, costume se representar estas transies e co eletrnicas, por meio de um esquema grco denominado Diagrama de Jablownski o a (tambm conhecido como Diagrama de Perrin-Jablownski) devido ao seu criador, o e f sico ucraniano Aleksandr Jabloski, que props tal diagrama, em 1935 para explicar n o processos de absorao e emisso de luz por molculas, c a e ons etc. O diagrama de Jablonskiiv (gura 2) ilustra os estados eletrnicos de uma molcula o e e, as poss veis transioes entre eles, bem como as posioes relativas de energia entre os c c mesmos. Em bioqu mica, mais precisamente na area de fotobiologia, costume se dividir os e processos envolvendo oxignio singleto em dois tipos: e Tipo I: Radicais livres (R ) so formados, e a aao biolgica resultante (fotosensia c o tizaao), devida a estes radicais. c e Tipo II: Neste tipo de processo, a energia luminosa (ultravioleta, luz viz vel, etc.) transferida para o oxignio tripleto 3 O2 e, este se transforma em oxignio singleto e e e 1 O2 . E este que age biologicamente, Ao contrrio do que se pensa o oxignio singleto no um radical livre. Pois este a e a e no possui eltrons desemparelhados em seus orbitais moleculares(6). a e
iv

Usaremos a graa romanizada, Jablonski em detrimento da Polonesa Jabloski. n

17

Figura 2: Diagrama de Perrin-Jablonski As linhas onduladas pontilhadas (gura 2) (CIv , CISvi ) so transioes no radiativas a c a ou seja, no ocorre a emisso de ftons, neste caso a energia dissipada sob a forma de a a o e calor. J a linha ondulada marron, representa a dissipaao de energia em movimentos molea c culares. Podemos notar que para o eltron relaxar para um estado menor de energia por e meio de certos fenmenos qunticos, o mesmo altera o seu spin, um exemplo o fenmeno o a e o da fosforescncia, no qual o eltron passa do estado singlete Si para o estado triplete Tj . e e
v Converso Interna = quando um eltron em um orbital de baixa energia interage com um ncleo e a e u e expelido por este vi Cruzamento Intersistema = quando um eltron passa de um estado singleto para um tripleto (e e vice-versa) sem irradiar energia

18

1.3

Sobre a fam Asterace lia

Dentre todas as fam lias das Angiospermas, a fam Asterace, a que possui o lia e maior nmero de espcies, e todas com caracter u e sticas muito similares, apesar de existirem algumas variaoes dentro da fam c lia. Nesta fam lia, as plantas so geralmente ervas, mas tambm so conhecidos represena e a tantes sob a forma de arbustos, trepadeiras e at mesmo arvores. O tipo de or mais e comum, a or tubular que geralmente bissexual, mas existem muitas plantas com e e ores liguladas. O cap tulo oral mais comum aquele em formato de disco, como as e margaridas e girassis(7). o Esta fam vegetal surgiu durante o per lia odo eoceno, a aproximadamente cinquenta e cinco milhes de anos(8). o Suas inorescncias constituem a caracter e stica mais distintiva da fam lia. So gerala mente chamadas de pseudantium vii . Na fam Asterace as verdadeiras ores so frequentemente bem pequenas e encontramlia a se capituladas no centro da estrutura a qual geralmente atribui-se (errneamente) o nome ` o de or. Nas Asteraceas em particular, o pseudantium recebe o nome de calatidium ou caltide que so brcteas modicadas. a a a A gura 3 mostra uma inorescncia de Bidens torta, a qual ilustra uma t e pica inorescncia das Asteraceas. Nota-se que na inorescncia de Bidens torta, as verdadeiras e e ores esto dispostas no cap a tulo (rea dentro do c a rculo cheio), compostas por vrias a ores individuais (dentro do c rculo tracejado). A fam Asterace, possui um nmero to grande de espcies (estimada entre 20.000 lia u a e at 25.000 dependendo dos autores) que o seu estudo em particular, recebe um nome e distinto dentro da botnica: sinanterologia(9). a Este nome tem origem no francs antigo synantheres (a etimologia da palavra, na e e e verdade uma descriao botnica da fam c a lia, um adjetivo que se diz de uma fam de e lia plantas onde os estames so fundidos)viii . a A organizao da fam em tribos deveu-se principalmente ao trabalho pioneiro do ca lia botnico George Bentham, publicado em 1873. Vrias plantas desta fam possuem a a lia
palavra de origem grega, composta a partir dos vocbulos gregos, = pseuds, falso + a e = ant, or = falsa or o viii ` Dictionnaire de lAcadmie franaise, 8eme Edition (1932-5) e c
vii

19

Figura 3: Bidens torta, em destaque cap tulo com vrias res no centro do cap a o tulo grande importncia comercial, p. ex:, o girassol (Helianthus sp.), como fonte de oleo a comest de alta qualidade, a cinerria (Cyneraria sp.), como planta ornamental, o alvel a face (Lactuca sativa), o dente-de-leo (Taraxacum sp.), o absinto (Artemisia absinthium) a utilizado na formulao da bebida absinto, e tambm a to presente nos jardins e oriculca e a turas, tagete ou cravo-francs (Tagetes patula) e ainda a camomila, muito utilizada em e chs (Matricaria sp.(8)). a Neste gnero, (particularmente para a espcie Bidens sulphurea), vrios compostos e e a com atividades biolgicas j foram descritos na literatura. Pode-se citar alguns exemo a plos, tais como vrios tipos de sesquiterpenos (-elemene, -copaene, -cadinene), vrios a a compostos polifenlicos, (avonas, avonis etc.), poliacetilenos (fenilhepta-1,3, 5-triino) o o ocorrendo em Bidens pilosa(10). Muitos destes compostos possuem diversas atividades biolgica. Dentro do grupo o do compostos fenlicos (principalmente avonides) pode-se listar: fungicidas (p. ex:, o o luteona isolada dos frutos de Lupinus luteus), ant todo contra pesticidas do grupo dos imidazis (11), bactericida(12) dentre outras. o

20

1.3.1

Classicao botnica do espcimen ca a e

B. sulphurea (sinon mia: Cosmos sulphureus), ou Cosmo-amarelo, Cosmo do Mxico, e Aster do Mxico ou ainda Pico-amarelo, uma representante da numerosa fam Ase a e lia terace. Originria do Mxico. a e Apesar de ser, provavelmente um dos exemplares mais difundidos em boa parte do planeta, juntamente com o dente-de-leo (Taraxacum sp.), so consideradas como espcies a a e invasivas, mas relativamente pouco estudada(13),(14). O gnero Bidens possui aproximae damente 200 espcies descritas na literatura(15). e No gnero Bidens (do latim bi (dois) + dens (dente) dois-dentes, uma aluso as e a ` duas protuberncias aciculares de seu aqunio, que adere em plos, plumas, roupas etc. E a e e possivelmente a espcie mais comum de seu gnero, sendo encontrada mais facilmente do e e que o exemplar mais conhecido do gnero, Bidens pilosa, ou pico-preto ou simplesmente e a pico.Curiosamente em B. sulphurea, o aqunio no apresenta estes dois dentes. a e a Neste gnero, duas caracter e sticas so ub a quas: a ocorrncia de zoocoria (disperso e a das sementes por animais), e a presena de capitulos, em raio e em disco (da o sinnimo c o da fam Asterace: Composit). lia A espcie extremamente rstica, tolerando facilmente solos pobres, e longos per e e u odos de seca, dispersando-se muito rapidamente, devido a sua caracter stica de orescer o ano todo e, portanto, produzir seus aqunios que se disperso facilmente por meio dos e a mecanismos supracitados. As ores de B. sulphurea so geralmente de uma cor laranja bastante intensa, ocora rendo ocasionalmente, a cor amarela, (cultivares de vrias outras cores j se encontram a a no mercado paisag stico, mas estes no so silvestres.). De acordo com a literatura(16), a a B. sulphurea descrita como: Uma planta anual, herbcea, ereta, muito ramicada, atine a gindo de 80 cm a 120 cm de altura. Suas folhas so membranceas e pilosas, so opostas a a a com margens asperas e pec olos pilosos (17). Suas ores frequentemente apresentam oito ptalas, ocorrendo `s vezes, a presena de e a c duas ou mais ptalas que quebram sua simetria octogonal, sendo este, provavelmente um e trao gentico, e no uma decorrncia de luz, gua nutrientes etc. c e a e a A gura 4 mostra B. sulphurea variedade amarela, a gura 5 a variedade listrada (possivelmente um h brido entre as variedades amarelo e laranja) e, nalmente, a a variedade laranja (gura 6) que mais comumente encontrada que a variedade amarela. e

21

Figura 4: B. sulphurea, variedade amarela

Figura 5: B. sulphurea, variedade listrada Uma vez que as ores so hermafroditas, agentes polinizadores (geralmente abelhas a e borboletas) podem cruzar as variedades, pois coletam plen indiscriminadamente de o ambas (amarela e laranja), sendo poss a existcia de outras. Nota-se que o androceu vel e da variedade amarela amarelo tambm, j o da variedade laranja marrom escuro. e e a e

22

Figura 6: B. sulphurea, variedade laranja

1.4

Ensaios de toxicidade com Artemia salina

O organismo de nome cient co Artemia salina, um crustceo encontrado em lagos a salobros, tem sido empregado como organismo modelo para o ensaio de citotoxicidade bem como fototoxicidade desde o in dos anos 1980(18), quando pesquisadores empregaramcio no pela primeira vez em estudos relacionados a prospeco de novos compostos ativos de ` ca plantas. Dada a sua relativa sensibilidade, A. salina considerado um organismo de alarme e para a poluiao de aguas marinhas(19) (ou salobras em geral, haja vista que habita lagos c onde a salinidade pode variar amplamente). Pois quando do evento de uma contaminao ambiental, frequentemente o primeiro ca e organismo a morrer, portanto muito utilizado em controle de qualidade de euentes e industriais, sendo deste modo, muito importante para as cincias ambientais(20). e O teste de extratos vegetais em A. salina portanto um ensaio preliminar muito e barato, convel e rpido para a averiguao de bioatividade em compostos naturais, a a ca sendo muito conhecido pela sigla inglesa BST (Brine Shrimp Test) ou ainda BSLT (Brine Shrimp Lethality Test).

23

1.4.1

Vantagens do emprego de A. salina como modelo

A fmea deste crustceo ao ser exposta a altas concentraoes de sal (quando uma poa e a ` c c d`gua salobra, ou um lago est evaporando, p. ex:) altera a siologia de seu aparelho a a ovipositor de modo a produzir cistos, ao invs dos ovos. e Estes cisto so os ovos que se adquire em lojas especializadas em aquarismo, com a a casca muito dura, os quais so capazes de perdurar anos enquanto as condioes necessrias a c a ao seu desenvolvimento no forem favorveis (temperatura, pH, salinidade etc.). a a Entretanto, uma vez em condies adequadas, estes so capazes de se desenvolverem co a e eclodir dentro de 24 a 48 horas. Quando em gua com oxignio e dentro de uma ampla a e faixa de salinidade. Uma vez eclodidos, nascem os chamados nuplios, os quais representam o estgio a a de vida deste organismo que de fato se utiliza em ensaios. A. salina apresenta vrias a vantagens importantes que, somadas ajudaram este crutceo a se tornar um organismo a modelo: Pode ser estocado na forma de cistos (pequenos ovos avermelhados) por longos per odos de tempo; No necessita de alimentaao especial; a c Ocupa pouco espao; c Crescimento rpido (24 a 48 horas para a ecloso dos cistos) a a Desenvolve-se em meio no estril; a e Baixo custo e fcil aquisio; a ca Pode viver bem dentro de uma ampla faixa de salinidade, logo no necessrio a e a muito rigor na composiao de seu meio de cultura (cerca de 20g de sal marinho por c litro o bastante, mas pode viver muito bem dentro da faixa de salinidade de cerca e de 5g at quase uma soluo saturada ou por volta de 52g de sal marinho por litro e ca de gua destilada); a

24

1.5

Desvantagens do emprego de A. salina como modelo

As principais desvantagens do emprego de A. salina como organismo modelo so a a cosidervel variaao interlaboratorial dos resultados, que em alguns casos pode chegar a a c cerca de 25%, e intralaboratorial que pode chegar a cerca de 15% quando executados em condioes prximas do ideal por operadores em treinados(21). c o

1.6
1.6.1

Ensaios com microrganismos e eritrcitos o

Saccharomyces cerevisi

Considera-se que, ao testar-se uma substncia, ou uma mistura (como um extrato de a fontes naturais, por exemplo) com relao ao seu potencial antibitico, seja util realizarca o se ensaios com os mais variados tipos de microrganismos: algas, bacterias, protozorios, a leveduras, etc. Cada grupo de microrganismos, possui suas particularidades metablicas que os toro nam suscet veis `s drogas com diferentes mecanismos de aao. Apesar de, claro, exisa c e tirem casos muito bem documentados na literatura, onde uma mesma susbtncia possui a atividade iguais (p. ex:: antibitica) em espcies to distintas quanto protozorios e o e a a bactrias. O que sugere que, as vezes, uma mesma droga pode agir de modo semelhante e ` em espcies dissimilares(22),(23). e Por outro lado, talvez a situao mais recorrente seja a de uma subtncia possuir ca a efeitos distintos em espcies diferentes, devido `s diferenas metablicas entre as espcies. e a c o e Um bom exemplo a droga metronidazol, que possui atividade antibitica contra bactrias e o e (anaerbias principalmente) e protozorios (p. ex.: Giardia lamblia, Entamoeba hystolio a tica, Gardnerella vaginalis etc.)(24). O fungo microscpico Saccharomyces cerevisiae, tem sido muito empregado como moo delo para clulas eucariticas em pesquisas tanto de citologia, biologia molecular quanto e o gentica, desde, o nal da dcada de 1930, com o trabalho pioneiro de Leland H. Hartwell, e e envolvendo estudo de diviso celular(25). a At o presente, o Saccharomyces sp. tem sido empregado como modelo para o estudo e de clulas cancerosas, dado que vrios genes que regulam o crescimento desta levedura, e a so tambm os mesmos envolvidos no desenvolvimento de tumores(26). a e

25

E esperado que o efeito de um extrato vegetal que apresente atividade bactericida seja diferente em leveduras. Leveduras so microrganismos mais complexos (Eucariotos), a possuem membrana celular em geral mais grossa e resistente, utilizam ergosterol ao invs e de colesterol como fazem as clulas dos animais por exemploix , so clulas muito maiores e a e do que a grande maioria das bactrias dentre outras diferenas importantes(27). e c Muitos tipos de fungos so notrios causadores de infeces cutneas, (em cabelo, pele a o co a e unhas). As infeces nas unhas, causadas por alguns destes, so conhecidas como onico a comicoses. So particularmente dif a ceis de serem tratadas, sendo que o uso de medicaao c tpica associada ` sistmica , muitas vezes, necessrio(28). o a e e a Com relao `s onicomicoses, o uso de Saccharomyces sp. como modelo interessante ca a e pois um fungo de crescimento rpido (24-48 horas) e, ainda assim conserva inmeras e a u semelhanas estruturais e metablicas com o gnero de fungos que o principal causador c o e e de onicomicoses, Trichophyton sp. Neste gnero talvez o mais frequentemente isolado e de dermatoses e onicomicoses seja a espcie Trichophyton rubrum, que um fungo com e e crescimento in vitro muito lento, chegando por vezes a demorar cerca de 15 dias para se obter um resultado positivo em meio de cultura adequado(29). Neste trabalho, elegeu-se esta levedura como organismo modelo para o estudo de fungos, devido ao seu baixo custo, e pelo fcil cultivo in vitro. a

1.6.2

Escherichia coli e coliformes fecais

O grupo de bactrias conhecido coletivamente como coliformes, deve seu nome a e ` semelhana que, em geral, suas clulas possuem com a bactria, que certamente a c e e e mais estudada do grupo, Escherichia coli. Coliformes so denidos como bactrias em a e formato de bastonetes, Gram(-), no esporulantes, capazes de fermentar a lactose, quando a encubadas a uma temperatura entre 35 o C-37 o C produzindo cidos e gs carbnico. A ` a a o bactria E. coli se distingue das demais do grupo, por ser exclusivamente de origem fecal, e por fermentar lactose a 44o C e por apresentar certas reaes de colorao caracter co ca sticas em meios de cultura espec cos(30). Por exemplo, neste trabalho foi utilizado o meio de cultura conhecido como FLUORCULT (LMX Broth) c , que uoresce intensamente (azul, sob luz ultravioleta de comprimento de onda adequado), quando a bactria se prolifera. A E. coli possui a enzima e glucoronidase, que capaz de quebrar steres de acido glucurnico. Este meio possui e e o
A membrana das bactrias clinicamente relevantes normalmente composta apenas por lip e e dios, prote nas e eventualmente, polisacar deos nas Gram (-)
ix

26

um derivado glucuronidado da cumarina (conhecido como MUG: 4-metilumbeliferil-betaD-glucoronidopiranos deo), o qual ao ser quebrado pela enzima, libera o composto que uoresce. Este teste extremamente seletivo porque a E. coli uma raridade dentre os e e procariotos por apresentar tal enzima. Esta bactria muito usada como um prottipo de bacteria Gram(-) e conquanto e e o algumas cepas da mesma sejam organismos patognicos perigosos, a E. coli normalmente e e utilizada como um organismo indicador de contaminao por matria fecal em agua. Sua ca e presena portanto indesejada, uma vez que se presente em grande quantidade pode c e indicar a presena de organismos muito mais perigosos (p. ex: bactrias tais como Vibrio c e cholerae x , etc).(31).

1.6.3

Eritrcitos o

Eritrcitos so as principais clulas responsveis pela oxigenao dos tecidos dos vero a e a ca tebrados. Por meio da captao do oxignio do ar, atravs da complexaao deste com o ca e e c ferro presente nos grupos heme da hemoglobina. So tambm conhecidos por glbulos vermelhos, em artigos escritos na lingua inglesa, a e o so frequentemente designados pelo acrnimo RBC, ou Red Blood Cells xi . So clulas a o a e em forma de disco, cncavas, sem ncleo (nos mam o u feros)(32). Neste trabalho, eritrcitos foram usados por causa de sua capacidade de armazenar o oxignio na hemoglobina, a qual tambm contm ferro, que serve como um catalizador e e e para vrias reaoes fotoqu a c micas (exemplo: fotofenton), e por suas membranas celulares conterem acidos graxos insaturados, portanto sens veis ao dano oxidativo(33). Por estas caracter sticas morfosiolgicas, os eritrcitos so alvos particularmente o o a suscet veis a efeitos de fotoxidao. ` ca

1.7

Sistemas de irradiao luminosa ca

Como visto na seao 1.1, a TFD s pode ser aplicada ecazmente, se todos os seus c o trs elementosxii estiverem dispon e veis e forem aplicados de maneira efetiva. Uma vez que o oxignio encontra-se plenamente dispon na maioria dos tecidos em e vel
Bactria causadora da clera e o Clulas Vermelhas Sangu e neas xii Fonte luminosa com potncia e comprimentos de onda adequados, fotosensitizador e oxignio e e
xi x

27

que se aplica a TFD, e existe uma srie de fotosensitizadores adequados dispon e veis (azul de metileno, rosa de bengala, alaranjado de acridina, porrinas, cumarinas, psoralenos, TiO2 , etc.), cada um com suas respectivas seletividades por diferentes tecidos biolgicos, o o fator limitante de grande parte das reaoes fotoqu c micas envolvidas na TFD passa a ser a fonte luminosa. A fonte luminosa deve, obrigatoriamente emitir luz de um comprimento de onda () espec co para ser efetiva, devido a chamada lei de Stark-Einstein, que diz que, com ` relaao aos processos fotoqu c micos, para cada molcula que reage, um quanta de energia e deve ser absorvido pelo sistema. Esta lei pode ser descrita matematicamente como: Emol = NA h Nesta equao Emol a variaao de energia molar envolvida na reaao fotoqu ca e c c mica, onde NA o nmero de Avogadroxiii (34), h a constante de Planckxiv (35) e a frequncia e u e e e do fton incidente. o Ou seja, para cada mol de molculas que reage, um mol de quanta de energia ( ) e h deve ser absorvido. Portanto, como esta equao quantizada, a despeito (idealmente) da ca e potncia da fonte luminosa, se esta no emitir energia na frequncia correta, seus quanta e a e de energia no sero absorvidos e consequentemente no teremos reaoes fotoqu a a a c micas. Esta lei se restringe aos chamados processos fotoqu micos primrios ou seja, a reaao a c direta que o sistema sofre aps a absorao de um mol de fton para cada mol de molculas. o c o e Se a reao apresentar um processo secundrio ou interaoes entre os reagentes que no ca a c a dependam de energia luminosa, ento a equaao no se aplica. a c a Outro caso em que a lei de Stark-Einstein no se aplica, quando a fonte luminosa a e extremamente potente (como em ash fotlise, irradiaao com laser, etc.) pois neste e o c caso, passa a serem poss veis processos bifotnicosxv . o Deve-se lembrar que como o processo de absoro de ftons quantizado, e portanto ca o e o mesmo probabil e stico. Ftons com energia h inadequadas, ainda possuem uma o probabilidade no nula de reagirem (efeito de quntico de tunelamento), fato explorado a a nas tcnicas fotoqu e micas de laser pulsado(36). Deste modo, como se encontram dispon veis vrias fontes luminosas diferentes, (lmpadas a a de vapores metlicos, lmpadas halgenas, diodos emissores de luz (LED), lasers, etc.) a a o
xiii

6.02214179(30) 1023 mol1 xiv 6.62606957(29) 1034 J s xv Processos nos quais dois ftons so absorvidos simultaneamente por uma molcula o a e

28

cada uma com uma faixa de comprimentos de onda espec cos, ecincia luminosa (quane tidade de energia que se tansforma em ftons versus quantidade de energia perdida sob a o forma de calor), preos, dimenses f c o sicas etc. Conquanto o comprimento de onda seja um fator determinante na escolha de uma fonte de irradiao, para um reaao fotoqu ca c mica, se esta n tem a potncia adequada a e o rendimento ser negligencivel portanto, na escolha de uma fonte de irradiaao muito a a c raramente a mais adequada obvia. e

29

2.8

Sobre alguns pigmentos fenlicos e suas s o nteses

A fam Asterace possui vrias espcies que produzem pigmentos usados pelo holia a e mem h milhares de anos. Se considerado um nmero arbitrariamente grande de Asa u teraceas, nota-se que a cor mais abundante presente nesta fam o amarelo, devido lia e principalmente a certos pigmentos tais como chalconas (1,3-difenilpropenona), auronas ` (2-benzilideno-1-benzofurano-3-ona) e avonides. A avona conhecida como luteolina, o (de cor amarela) por exemplo, j foi isolada de vrias dezenas espcies de Asteraceas(37). e a a e Estes pigmentos so em sua grande maioria resultado do metabolismo secundrio das a a plantas, e so formados por unidades C6 : C3 : C6 , considerados como derivados do a 1,3-difenilpropano(38). Outras cores como lils, violeta, azul e vermelho, so causadas principalmente por a a outros avonides como as antocianinas e antocianidinas, bem como a presena de certos o c ctions metlicos (sob a forma de quelatos(39)), em diferentes faixas de pH (antocianinas a a so vermelhas em pH acido e azul em pH bsico). Com a notvel diferena de que estes a a a c dois grupos de molculas (antocianinas e antocianidinas) so catinicas (ction avlio). e a o a Tm-se vrios exemplos de ores amarelas, de Asteraceas muito conhecidas: A calndula e a e (Calendula arvensis), o crisntemo (Chrysantemum sp.), o dente-de-leo (Taraxacum sp.), a a etc. Na verdade o fato destes pigmentos serem to comuns nas Asteraceas, muitas vezes a diculta bastante a identicao exata da espcie, em questo. Alguns autores, chegam a ca e a aludir este fato referindo-se a qualquer Asterace amarela de modo genrico como (sigla e o acrnimo ingls) D.Y.C ou damn yellow composite ou em uma traduao livre praga o e c de composta amarela(40),(41). O crtamo por exemplo, (Carthamus tinctorius) produz um pigmento (na forma de a um glicos deo) (gura 7)xvi a cartamina que, historicamente foi muito utilizado para tingir seda nos pa ses asiticos como o Japo. Existem evidncias arqueolgicas de que esta a a e o planta uma das plantas mais antigas cultivadas pelo homem(42).Este pigmento pode e ser considerado como um d mero de unidades C6 : C3 : C6 , onde a unidade C6 : C3 e derivada do acido cinmico enquanto que a unidade C6 derivado do cido chiqu a e a mico por meio dos aminocidos aromticos fenilalanina, tirosina e triptofano(38). a a
Na verdade, a innita maioria dos pigmentos do grupo dos avonides, encontram-se sob a forma de o glicos deos, somente em rar ssimos casos encontramos o pigmento sob a forma de sua aglicona - ou seja, o avonides sem aucar algum. o c
xvi

30

Figura 7: Cartamina - A aglicona corresponde a parte em negrito Estes compostos, respondem por mais de novecentos de todos os avonidesxvii relao tados na literatura, at o ano de 2003(43). e Uma caracter stica marcante destes pigmentos o fato de que a cor de suas solues e co aquosas (ou alcolicas) torna-se intensamente vermelha em pH alcalino (o simples contato o de uma tira de papel impregnada com o pigmento, com vapores de amnia o bastante o e para se observar esta coloraao), e torna-se amarelo claro em pH cido. c a Os avonides apresentam ainda, duas bandas no espectro UV-VIS muito caraco ter sticos um em, aproximadamente 250 nm e outro em 350 nm. As chalconas podem ser imaginadas retrosinteticamente, como o produto de uma reaao de condensaao de c c Claisen-Schmidt (gura: 8):

Figura 8: Condensaao de Claisen-Schmidt c Na s ntese das chalconas, R frequentemente um grupo fenlico. Apesar de que, e o nas clulas das plantas, a rota biosinttica das chalconas bem mais complexa, envole e e vendo vrios tipos de molculas. A gura 9 mostra um esquema que ilustra o processo a e biosinttico(44): e

Os nomes aurona e avonoide, parecem possuir sua etimologia nos adjetivos latinos aurum - dourado e avus - amarelo, respectivamente

xvii

31

Figura 9: Rota biosinttica (genrica) para avonides e e o Legenda com respeito a gura 9: ` FAL: Fenilalanina amnia-liase; C4H: cinamato-4-hidroxilase; 4CL: 4-coumaroil:CoAo ligase; CHS: chalcona sintase; CHI: chalcona isomerase; FSI: avona sintase; FSII: citocromo P450 avona sintase; IFS: citocromo P450 isoavona sintase; FHT: avanona 3--hidroxilase; DFR: dihidroavonol 4-redutase; LAR: leucoantocianidina sintase; ANS: antocianidina sintase; 3GT: UDPG-avonide 3-O-glucosil transferase. As siglas em vero melho indica as enzimas do citocromo P450. Estes pigmentos (gura 10) representam uma classe muito complexa, porque frequentemente existe a possibilidade de formao de glicos ca deos com inmeros de aucares u c diferentes, oligmeros, d o meros, tr meros(45) etc. Na gura 11 pode-se ver o esquema de numerao de alguns tipos de avonides segundo Veitch e Grayer(43). ca o Nota-se que a principal caracter stica que distingue as chalconas e diidrochalconas dos

32

Figura 10: Diversos tipos de avonides o

Figura 11: Sistema de numerao de alguns avonides ca o avonides a ausncia de ciclizaao (anel C) entre os anis A e B. o e e c e

2.8.1

S ntese de avonides o

Encontram-se na literatura, diversas metodologias para a s ntese orgnica destes coma postos, j a muito estabelecidas. Certamente, alguns mtodos so mais explorados do que a e a outros. Para a s ntese de chalconas por exemplo, a metodologia mais explorada via e condensaao aldlica dada a sua simplicidade e, por ser uma reaao clssica da qu c o c a mica orgnica, (desenvolvida ainda no sculo XIX)(46). a e Convm, destacar alguns mtodos clssicos de s e e a ntese de avonides, bem como alo guns menos conhecidos. Neste texto, considerou-se o termo avonide como um termo o genrico para se designar as avonas, dihidroavonas, isoavonas, auronas, chalconas, e antocianidinas, bem como seus glicos deos e pol meros (taninos).

33

2.8.1.1

S ntese de Auwers

Trata-se de uma reaao de s c ntese de avonol, descrita em 1908 pelo qu mico alemo a Karl Von Auwers. Consiste em uma condensaao aldlica entre uma cumarona e o benc o zalde do, catalizada por acido, formando uma chalcona. Esta em seguida reage com bromo, e posteriormente o produto desalogenado em meio bsico resultando em um e a 3-hidroxiavonol (gura 12):(47)

Figura 12: S ntese de um avonol - S ntese de Auwers

2.8.1.2

S ntese via condensao aldlica ca o

A condensao aldlica pode ser descrita genericamente, como a adio de um enolato ca o ca de um alde ou cetona ao grupo carbonila de um segundo alde ou cetona. Os produtos do do iniciais desta condensaao, 2-hidroxialde (aldol) ou 2-hidroxicetona (cetol), podem a c do seguir, desidratarem-se e formarem um composto carbon lico , -insaturado.(47) Um caso particular desta reaao, quando o enolato de uma cetona, adiciona-se ao grupo c e carbonila de um alde no enolizvel ou vice-versa e conhecida como condensao de do a a e ca Claisen-Schmidt. Uma reao clssica da qu ca a mica orgnica que, apesar de conceitualmente simples, a ainda que com modicaes segue sendo extremamente importante para a s co ntese orgnica a destes compostos, devido a sua versatilidade na formaao de ligaoes carbono-carbono. c c Esta reao foi realizada em 1880-81(48, 49), consistiu na reao do benzalde com ca ca do a acetofenona, conforme g. 13: Atualmente, a denominaao de reaao aldlica empregada para as reaao de qualquer c c o e c enolato, no importando a sua origem (alde a do, cetona, amida etc.) e um composto

34

Figura 13: Condensaao aldlica c o carbon lico. Utilizando-se hidroxiacetofenonas e hidroxibenzalde dos poss obter as e vel vrias agliconas dos avonides naturais. a o 2.8.1.3 Mtodo de Von Kostanecki e

Este mtodo, tambm chamado de mtodo de Emilewicz-Kostanecki (devido ao qu e e e mico polons Stanislaw Von Kostanecki)xviii , provavelmente um dos primeiros mtodos eme e e pregados para a s ntese de avonas, descrito inicialmente em 1898. A reaao consiste na c halogenaao (em geral a bromaao), de 2-hidroxi, ou 2-acetoxi chalconas, e a posterior c c desalogenaao empregando-se soluao aquosa alcalina, ` quente. Uma reao competitiva c c a ca desta reaao, a qual, por muito tempo a impediu de ser largamente e empregada a c e ciclizaao da dialochalcona inicial, em uma aurona. c Posteriormente, Von Auwers e Anshtz (1921) mostraram que 4-alcoxiavonas podeu riam ser obtidas com excelentes rendimentos, apenas empregando-se uma soluao alcolica c o a frio. Assim, contornando a -halo--alcoxicetona a qual cicliza para aurona, uma reaao ` c caracter stica de dihaletos de chalcona contendo grupos doadores de eltrons nas posies e co orto e para do anel B(50) (gura 14). 2.8.1.4 Reao de Allan-Robinson ca

A chamada reao de Allan-Robinson, consiste na s ca ntese de avonas e isoavonas pela condensao de O-hidroxiarilcetonas com anidridos de acidos aromticos e seus sais ca a sdicos(51): (gura 15) o 2.8.1.5 Rearranjo de Baker-Venkataraman

O chamado rearranjo de Baker-Venkataraman consiste em um rearranjo catalizado por base de O-aciloxicetonas em -dicetonas, as quais so intermedirios fundamentais a a
xviii

Myszkw, Polnia, 1860-1910 o o

35

Figura 14: S ntese da avona - mtodo de Von Kostanecki e

Figura 15: S ntese de uma avona - Reao de Allan-Robinson ca na s ntese de avonas(52): (gura 16)

Figura 16: Rearranjo de Baker-Venkataraman

2.8.1.6

Reao de Algar-Flynn-Oyamada ca

Uma reaao muito simples e prtica para a s c a ntese de avonis a oxidaao de chalo e c conas empregando-se apenas o perxido de hidrognio, esta reaao ocorre atravs de um o e c e intermedirio dihidroavonol: (gura 17)(53) a

36

Figura 17: Reao de Algar-Flyn-Oyamada ca 2.8.1.7 Acoplamento de Suzuki-Miyaura

A reao de Suzuki-Miyaura (frequentemente chamada apenas de acomplamento de ca Suzuki) foi publicada inicialmente em 1979 e, envolve o acoplamento catalisado por complexos de paldio entre acidos organobornicos. A reaao originalmente (gura 18) visava a o c apenas o acoplamento de compostos ar licos, com o desenvolvimento de novos catalisadores o mtodo, passou a ter uma aplicaao maior.(54) e c A reaao atualmente inclui como reagentes alm dos compostos ar c e licos, alcanos, alcenos e alcinos, e alm dos acidos bornicos utiliza-se tambm triuoroboratos (triatos), e o e organoboranos e boronatos (gura 19). Em 2003, Said Eddarir e colaboradores publicaram a s ntese de chalconas baseandose no acoplamento de Suzuki-Miyaura. A reaao consiste na reao de Suzuki entre c ca cloretos de cinamo e acidos fenilbornicos ou entre cloretos de benzo e acidos fenilla o la vinilbornicos (gura 18).(55) o O cido fenilvinilbornico foi preparado pela borilaao do parametoxiestireno, pelo a o c pinacolborano catalisado pelo complexo de Rdio [RhCl(cod)2 ], resultando no ster pio e naclico do cido parametoxifeniletilbornico, este, foi clivado usando-se periodato em o a o THF/gua, produzindo o cido parametoxifeniletilbornico, necessrio para o acoplaa a o a mento de Suzuki-Miyaura (gura 18):

37

Figura 18: S ntese de chalconas - mtodo de Eddarir e

Figura 19: Reao original de Suzuki-Miyaura ca

2.9

avonides: algumas atividades biolgicas o o

Os avonides de um modo geral apresentam efeitos: antioxidantes(56)(57) (capao cidade de reagir com ROS,xix muito envolvidas nos processos inamatrios(58)(59) e de o envelhecimento celular), fungicidas(60), quelantes(61)(62), bactericidas, bacteriostticos, a retardadores do envelhecimento celular, moduladores da permeabilidade de eritrcitos huo manos(63), radioprotetores(64) e ltro solar(65) (devido ao fato de seus picos de absorao c se encontrarem nas bandas de UV-B (320-280 nm) e UV-C (280-100 nm)). Uma vez que estes compostos apresentam frequentemente dois ou mais grupos hidroxila ligados ao anel benznico, estes compostos so muito suscet e a veis a oxidaao, eles c encontram-se quase sempre na forma de glicos deos, pois os aucares estabilizam o anel c
xix

vide seo cap ca tulo 1:Introduo ca

38

aromtico.(66) a Nos avonides o tipo de aucar (glicose, frutose etc.) que esterica o oxignio do o c e grupo fenol caracter e stico de uma espcie vegetal, e por vezes, dentro de uma mesma e espcie, aucares diferentes ligados a um mesmo avonide caracterizam uma linhagem e c o gentica distinta da planta produtora. Ou seja, poss a existncia em uma determie e vel e nada escie vegetal, de duas plantas ou mais plantas que so morfologicamente idnticas, e a e mas que ao serem analisadas quimicamente, chega-se a concluso de que ambas produa zem um mesmo avonide ligados a aucares diferentes. Assim as plantas podem ser o c classicadas em quimiotipos diferentes.(67)(68) Atualmente os avonides so considerados marcadores qu o a micos, usados na classicaao logentica das plantas(69). c e Como exemplos de efeitos antifngicos, pode-se citar uma chalcona extra do cerne u da da madeira de Platymiscium yucatanum (Leguminosae) popularmente conhecida no Mxico e como granadillo, ativa contra os fungus Coriolus versicolor e Lenzites trabea(70). Segundo alguns autores, uma dieta rica em avonides, tm sido associada a uma o e melhor resistncia dos eritrcitos de mam e o feros aos danos causados por radicais livres oxigenados (perxido, superxido, peroxila, hidroxila, etc.), e ainda com uma chance o o reduzida de desenvolvimento de doenas card c acas.(71) Em particular, as procianidinas (gura 20), tem demonstrado efeitos positivos sobre a estimulaao do sistema imune e diminuiao do estresse oxidativo(72). c c

Figura 20: Exemplo de estrutura de uma procianidina O fato de os avonides, de um modo geral, aumentarem a resistncia dos eritrcitos o e o ao dano oxidativo, particularmente util, uma vez que estas clulas possuem uma suse e ceptibilidade mpar a este tipo de dano, devido a uma conuncia de fatores (ver seao e c 1.6.3): Quanto aos seus efeitos anti-inamatrios, experimentos com avonides tm apreseno o e tado uma srie de evidncias que demonstram a inibio de uma ampla gama de citocinas e e ca

39

pr-inamatrias. Apesar de at o presente momento no ter sido estabelecido ainda um o o e a mecanismo que explique as bases moleculares deste efeito antiinamatrio, vrios artigos o a demonstram esta ao teraputica na cl ca e nica mdica(73). e Existem ainda, estudos que indicam que um poss mecanismo, seria um decrscimo vel e da produao de NO (xido n c o trico). A respeito dos efeitos antibiticos dos avonides, o o pode-se citar o uso do glicos deo orizin no tratamento da malria. Este mostrou baixa a toxicidade aos eritrcitos e um bom IC50 (concentrao na qual 50% dos parasitas moro ca reram).(74)

40

Objetivos gerais e espec cos

2.1 Objetivos gerais

Este trabalho teve por objetivo a averiguao qualitativa da existncia de efeitos ca e antibitico e fotodinmico empregando-se os extratos etanlicos brutos das ores de B. o a o sulphurea, uma representante da fam Asterace. lia

2.2

Objetivos espec cos

Procurou-se encontrar alguma aplicaao prtica para o referido efeito, por meio de c a experimentos envolvendo inativao fotodinmica de microrganismos patognicos (colica a e formes fecais), citotoxicidade em Artemia salina, fotohemlise de eritrcitos de carneiro e o o fotoinativao de levedura da espcie Saccharomyces cerevisiae. ca e Procurou-se testar o extrato de B. sulphurea em um ensaio que pudesse demonstrar tanto a existncia de efeitos pr como anti oxidantes, uma vez que na literatura existem e o relatos da existncia de avonides em B. sulphurea(13),(14),(75) e estes so notrios ane o a o tioxidantes(76) e fotoprotetores(77). Logo, o objetivo espec co foi a observao de ambos ca os efeitos em um unico experimento por meio da variaao dos parmetros experimentaisi . c a

Veja o experimento de fotohemlise, na pg. 66, no qual ambos efeitos, oxidante e antioxidante foram o a observados.

41

Materiais e mtodos e
3.1 Extrato bruto etanlico de B. sulphurea (laranja) o

Separou-se as brcteas (desprezando-se os cap a tulos) de cerca de 300 ores (aproximadamente 50g) de B. sulphurea variedade laranja. As brcteas foram trituradas na a potncia mxima por 1 minuto e meio em um liquidicador contendo 200 mL de lcool e a a et lico comercial hidratado 96 o Gl. Separou-se de seu sobrenadante, uma pasta composta pelas brcteas mo a das. Aqueceu-se a soluo em uma jarra de vidro de 500 mL, em um ca forno de microondas com potncia de 900 Watts, e frequncia de trabalho de 2450 MHz), e e at a ebuliao (o que demorou aproximadamente 40 segundos). Logo aps, com a soluao e c o c ainda quente, ltrou-se em papel de ltro (marca Wattman), e a soluo nal armazenada ca em recipiente plstico opaco e bem vedado sob refrigerao, a -20 o C. a ca

3.2

Obteno de extrato bruto liolizado de B. sulphuca rea (amarela e laranja):

Preparou-se um extrato bruto concentrado das ores de B. sulphurea variedadee laranja e amarela, para que fosse utilizado nos experimentos de fotohemlise e de Inao tivao fotodinmica de coliformes fecais, procedendo-se da seguinte maneira: ca a Coletou-se ores de B. sulphurea no per odo da manh, em Uberlndia, no Bairro a a Cidade Jardim (Latitude: -18.95019 e Longitude: -48.29129). As ores foram secas no escuro, cando 5 dias ` temperatura ambiente e 5 dias ` 37o C. a a As ores foram maceradas e, 20g do p das ores secas receberam 200 mL de soluao o c de etanol 80% (160 mL de etanol absoluto e 40 mL de gua destilada), e caram no escuro a por 5 dias, com agitao ocasional. ca 50 mL do material extra foram liolizados, at a obtenao de um slido escuro. do e c o 500 mg deste material foi dissolvido em 1000L etanol absoluto (soluo estoque EtOH ), ca outros 500 mg foram dissolvidos em 1000L de soluao salina (soluo estoque salina) c ca ambas soluoes foram armazenadas em refrigerador a -20o C em tubos tipo Eppendorf. c

42

3.3

Obteno dos espectros UV/VIS de B. sulphurea ca (amarela e laranja)

Leu-se os espectro UV/VIS do extrato etanlico bruto de B. sulphurea preparado o tanto pelo mtodo da seao 3.1 quanto pelo mtodo da seo 3.2. Utilizou-se um espece c e ca trofotmetro marca HACH, modelo DR/4000 U (faixa de operaao: 190 nm-1100 nm), o c com uma cubeta de quartzo com caminho tico de 1 cm. o Procedeu-se da seguinte forma: para o extrato obtido pelo mtodo da secao 3.1 e c retirou-se a linha base (190 nm-1000, passos de 2 nm) com 5L de etanol hidratado comercial 96 o Gl dilu em 2000L de agua destilada. Em seguida efetuou-se a varredura do na faixa de 190 nm-1000 nm (passos de 2 nm). Para o extrato obtido pelo mtodo da seao 3.2, tirou-se a linha base usando-se 2000L e c de soluao salina e na varredura do extrato foi usado 10L de soluo estoque EtOH (paras c ca ambas as variedades) em 2000L de soluo salina. ca Em um segundo momento, tirou-se a linha base usando-se 2000L de soluao salina c mas a varredura foi feita usando 10L de soluo estoque salina. ca Na gura 27 (seao de resultados) os espectros foram obtidos dissolvendo-se cerca c de 100 L do extrato etanlico bruto de B. sulphurea variedade laranja, obtido pelo o mtodo da seao 3.1 em 2000 L do solventes: agua destilada, ciclohexano, dimetile c sulfxido (DMSO) e etanol absoluto, respectivamente. o Para este espectro tirou-se a linha base utilizando-se 2000 L dos solventes puros (Merck) grau espectroscpicoi , usando-se uma cubeta de quartzo com 1cm de caminho o otico.

3.4

Espectros das lmpadas UV e uorescente utilia zadas

Visando-se comparar o espectro de absorao dos extratos empregados com os espectros c de emisso das lmpadas utilizadas nos experimentos, decidiu-se registrar os espectros de a a duas fontes luminosas diferentes: A lmpada uorescente de 20 watts empregada no a experimento de fotohemlise e a lmpada UV compacta empregada na visualizaao das o a c placas cromatogrcas, ambas da marca OSRAM. a
i

Assim como o grau de todos os demais solventes utilizados na leitura dos espectros.

43

Para tanto, empregou-se o espectrgrafo de alta resoluao (0.02 nm) HR 4000 (marca o c Ocean Optics) acoplado ao sensor (tipo CCD) TCD1304AP (marca Toshiba). Registrouse os espectros de ambas as lmpadas conforme orientao do fabricante do equipamento. a ca Os dados encontram-se descritos na seao de resultados experimentais (guras 28 e 29). c

3.5

Sistemas de irradiao empregados ca

Neste trabalho foram confeccionados e testados 4 sistemas de irradiaao em que se c utilizaram fontes luminosas bastante distintas: Lmpada halgena: Lmpada halgena de 250 watt (2, 1J cm2 ) a o a o O aparelho consistiu em uma lmpada de retroprojetor (dicrica) montada dentro da a o carcaa metlica de uma fonte de alimentaao eltrica e, acima desta, um retngulo c a c e a de vidro transparente, com cerca de 10x20x6cm, oco, dentro do qual se fazia circular agua. A gua entrava por um tubo lateral conectado a uma mangueira de ltex e a a era retirada pela ao gravitacional por outro lado ` semelhana de um condensador ca a c de Liebig. LED: Seiscentos diodos de iluminao de 8 mm de alto brilho (8000 mcd), m ax ca 630nm O sistema foi composto por seiscentos LED de 8 mm com ngulo de abertura de 120o a (marca ZX) (ver gura 21), soldados lado a lado, de modo que suas extremidades retas se tocassem, em uma placa de fenolite. Estes foram ligados ` uma fonte a de alimentaao do tipo simtrica e alimentados com 12 volts a 20 mA, conforme c e orientao do fabricante. Este sistema doravante ser denominado LED 600. ca a Lmpadas uorescentes: Aparelho constitu por quatro lmpadas uorescena do a tes de 20 watts cada. Aparelho composto por 4 lmpadas uorescentes tubulares de 38 cm (marca OSa RAM), montadas dentro de uma caixa retangular (60x40x75cm) de ao, pintada por c dentro e por fora com tinta epxi na cor branca. As lmpadas foram espaadas de o a c cerca de 5 cm uma da outra. LED: LED de 1 watt da marca Cree, angulo de abertura de 120o , m ax 630nm O sistema (ver gura 22) foi confeccionado usando-se o corpo de uma lanterna emborrachada (impermevel), onde instalou-se os LED, no total de dez, no local a original da lmpada, uma placa de circuito impresso circular (ocupando toda a area a

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da parte frontal da lanterna). O sistema foi conectado a uma fonte de alimentao ca apropriada de 12 volts. Cada LED consome cerca de 1 watt.

Figura 21: Aparelho utilizando 600 LED de alto brilho de 8mm

45

Figura 22: Lanterna de 10 LED de 1w

46

3.6
3.6.1

Metodologia experimental com Artemia salina

Ecloso dos cistos de Artemia salina a

Colocou-se cerca de 300 mg de cistos em um bquer de 2 L com soluao composta por e c 20g de sal marinho por litro de gua destilada. Sobre o bquer instalou-se uma lmpada a e a halgena de 10 watts e mateve-se o bquer sob agitao por 24 horas, com o aux do o e ca lio ar comprimido de uma bomba comum de aqurio. a

3.6.2

Soluo de extrato bruto de B. sulphurea empregada em ca Artemia salina

Para os ensaios empregando-se o crustceo Artemia salina, utilizou-se a soluo rea ca sultante do procedimento descrito na seao 3.1, dilu no prprio meio de cultura no c da o qual os cistos do crustceo eclodiram. Foram feitas diluioes (em triplicata) usando-se a c entre 50L a 200L do extrato etanlico bruto (descrito na referida seo). Anotou-se os o ca resultados, os quais encontram-se descritos na seo Resultados experimentais. ca

3.6.3

Ensaio de toxicidade em Artemia salina

Antes de seu emprego, retirou-se a soluao estoque (extrato preparado na seao 3.1) c c da geladeira e aguardou-se a mesma atingir a temperatura ambiente. Com o aux lio de micropipetas, retirou-se al quotas da soluao estoque e diluiu-se nas solues salinas c co contendo em mdia 10 artemiasii por tubo. e Marcou-se os tubos a caneta informando a quantidade de extrato adicionado (em ` triplicata): 50 L, 80 L etc. Ajustou-se o volume nal dos tubos para 3 mL, nos quais diluiu-se o extrato bruto de B. sulphurea (preparado como na seao 3.1). c Disps-se os tubos em leiras, em um suporte para tubos de ensaio, cada leira era o acompanhado de um branco. Ou seja, uma soluao salina com artemias sem extrato c mas com o mesmo volume de etanol contido em cada diluiao adicionado. O qual serviu c para avaliar-se a taxa de mortalidade normal (devido a manipulao, irradiaao etc.) ` ca c aps as 24 horas de absorao, dividiu-se os tubos em dois grupos: o c No grupo A irradiou-se as artemias (no aparelho de LED 600 descrito neste texto)
E dif garantir-se pegar sempre dez artemias porque as mesmas ao nascerem, so muito parecidas cil a com as cascas de seus ovos, cascas estas que, as vezes, so coletas acreditando-se serem nuplios de a a artemias.
ii

47

por 30 minutos e no dia posterior contou-se a quantidade de Artemia mortas (entre 8-24 horas de absorao) no grupo B, as artemias no foram irradiadas cando no escuro por c a mais 24 horas. O tempo de irradiaao foi sempre o mesmo: 30 minutos, a altura desde o arranjo de c 600 LED at os tubos tambm era sempre a mesma, cerca de 8 cm. e e O tempo de incubaao foi sempre de 24 horas. Ou seja, o per c odo durante o qual o crustceo foi exposto ao extrato etanlico (extra ` quente) de B. sulphurea variedade a o do a laranja, antes da irradiao por 30 minutos no aparelho LED 600 quando a irradiao ca ca ocorreu, ou seja na tabela 1. A contagem de artemias ocorreu 48 horas aps a adiao do o c extrato. Passadas 48 horas, derramou-se a soluo de cada tubo em uma placa de Petri sob conca tador de colnias microbiolgicas, com o aux de uma lupa, contou-se os crustceos vivos o o lio a e mortos. Considerou-se o espcime como morto quando este no apresentava movimento e a por 30 segundos. Anotou-se os resultados, os quais encontram-se na seo Resultados ca experimentais.

3.7

Experimento de fotohemlise em eritrcitos o o

A m de se avaliar a existncia de efeitos fotodinmicos com relao ao extrato das e a ca ptalas de B. sulphurea, empregou-se eritrcitos de carneiro (gentilmente cedidos pelo Inse o tituto de Medicina Veterinria da Universidade Federal de Uberlndia), os quais encuboua a se com solues do extrato bruto de B. sulphurea em soluao siolgica (0,9 % NaCl), co c o tanto mantidos no escuro (avaliao do componente citotxico), quanto irradiados no ca o aparelho de lmpadas uorescentes (seao 3.5). a c Disps-se as lmpadas a uma distncia de cerca de 8cm das placas de 24 poos utilio a a c zadas no experimento, o qual desenvolveu-se, segundo o seguinte protocolo: Eritrcitos de carneiro: o Obteve-se sangue de carneiro com heparina (anticoagulante) e centrifugou-se este a ` 1500 rpm por 10 minutos, coletou-se o corpo de fundo (eritrcitos) e desprezou-se o o sobrenadante (soro). Os eritrcitos foram lavados com um volume de soluo salina o ca (0,9 %) dez vezes maior do que o volume ocupado por estes no tubo de centr fuga, repetiu-se este procedimento foi repetido por trs vezes. e Suspeno de eritrcitos: ca o

48

Preparou-se uma suspenao de eritrcitos obtidos no c o tem anterior anterior, com a concentrao de 0,8% (v/v), em soluo salina ca ca Diluioes sucessivas: c Em placas de 24 poos, diluiu-se o extrato bruto liolizado de B. sulphurea (laranja e c amarela, ver seo 3.2) sucessivamente nas concentraes de 1/200 (1 L de extrato ca co bruto para 200 L de soluao salina) at 1/3200, todas as diluies foram feitas em c e co triplicata e o volume nal em cada poo foi de 100 L. c Adio de eritrcitos de carneiro: ca o Aps o passo anterior, adicionou-se a cada poo igual volume de suspenso de o c a eritrcitos de carneiro ` 0,8%, logo a concentrao de eritrcitos nal foi de 0,4%, o a ca o pois o volume nal passou a ser de 200 L. Incubao e irradiao: ca ca Incubou-se a placa de 24 poos com o arranjo acima descrito, no claro e no escuro por c 30 minutos e 180 minutos, ou seja, uma placa permaneceu no escuro por 30 minutos outra por 180, outra placa foi irradiada por 30 minutos outra por 180 minutos. As placas foram irradiadas por 4 lmpadas uorescentes de 20 watts (marca OSRAM) a a uma distncia de 8 cm. a Controles positivo e negativo: Em todo o experimento, manteve-se (para a hemlise dos eritrcitos) controles posio o tivos e negativo, respectivamente. O controle positivo, (100% de hemlise) foi feito o com gua destilada e o negativo (0% de hemlise) em soluo salina ` 0,9% a o ca a Centrifugao: ca Aps o per o odo de incubao, o material foi removido de cada um dos poos e ca c centrifugado a 14000, rpm por 2 minutos, ` temperatura ambiente. ` a Coleta do material: Coletou-se os sobrenadantes e lu-se em espectrofotmetro a absorbncia da soluao e o a c em 540 nm (pico de absoro da hemoglobina). ca

3.8

Fotoinativao de Saccharomyces cerevisi ca

Visando-se avaliar o potencial fototxico contra fungos, o extrato etanlico bruto o o (secao 3.1) de B. sulphurea (laranja), foi testado contra a levedura S. cerevisiae (empregouc se como fonte destas leveduras o fermento para pes marca Itaiquara). a

49

Como procedimento experimental para avaliaao quanto aos poss c veis efeitos fotodinmicos do extrato etanlico adotou-se a seguinte tcnica (todos os procedimentos foram a o e tambm realizados no escuro, ou seja, sem irradiaao): e c 1. Preparou-se uma suspenso estoque de clulas de S. cerevisi na concentraao de 4 a e c na escala de McFarland, partindo-se de cultura de S. cerevisi feita em gar PDA a (Potato Dextrose Agar, ou Agar Dextrose Batata). 2. Retirou-se uma al quota de de 10 L da suspenso preparada no a tem anterior e inoculou-se esta suspenso em placas de Petri, contendo 20 mL de agar PDA pelo a mtodo Pour plate e 3. Volumes de extrato etanlico bruto (seo 3.1) de 250 L, 500 L, 850 L e 1000 L o ca (em triplicata) foram dilu das diretamente em placas de Petri com 20 mL de agar PDA. Esta diluiao foi realizada em seguida ao c tem anterior, ou seja, adicionou-se o inculo juntamente com o extrato etanlico de B. sulphurea. o o 4. Irradiou-se estas placas por 15 minutos com o aux da lanterna de LEDiii , colocoulio se a extremidade luminosa a uma distncia de cerca de 8 cm da placa de Petri. a 5. Como BRANCO adotou-se o seguinte critrio: e placas de Petri apenas com agar (para se testar uma poss contaminao, vel ca denominado de CONTROLE) placas inoculadas e irradiadas (para se testar o efeito somente da luz) placas inoculadas e no irradiadas (para se estimar o crescimento normal das a colnias) o placas com agar, somente com o extrato (para se testar uma poss conta vel minaao do extrato). c placas inoculadas contendo apenas o solvente (etanol hidratado) eram irradiadas (para se avaliar algum efeito do etanol quando irradiado) 6. As placas eram postas em estufa, e mantidas a 37 o C por 24 horas. ` 7. Aps 24 horas de incubao as placas de Petri foram postas em contador de colnias o ca o e contou-se o nmero destas. u 8. As placas eram fotografadas e algumas destas fotos consideradas mais relevantes, encontram-se em Resultados experimentais.
iii

Veja a gura 22

50

3.9

Fotoinativao de coliformes: LED 600 ca

O extrato etanlicos bruto de B. sulphurea, preparado conforme 3.1 foi avaliado quanto o a sua potencial atividade fotodinmica, com relaao aos coliformes presentes em uma agua a c contaminada (coletada de vasos sanitrios). Utilizou-se o meio de cultura comercial FLUa ORCULT (LMX Broth) c (como caldo) para a cultura. Todos os tubos foram inoculados com 100L da gua contaminda, a qual no momento da coleta apresentava-se l a mpida e sem detergentes, desinfetantes etc. Diluiu-se sucessivamente o extrato etanlico no caldo de cultura (1/2 = 1000 L de o extrato etanlico para 1000 L de caldo, 1/4 = 500 L de extrato etanlico para 1500 o o L de caldo etc.). Irradiou-se os tubos por 10 minutos a uma distncia de 8 cm de suas a bases no aparelho LED 600, ento, encubou-se os tubos por 48 horas em estufa mantida a a 37 o C. O etanol utilizado no preparo do referido extrato, foi dilu nas mesmas propores do co do extrato de modo que servisse como controle, para se avaliar se uma poss inibio vel ca do crescimento da bactria era devido ao etanol. e Os tubos nos quais se efetuaram as diluioes do extrato foram ento fotografados aps c a o o per odo de irradiaao (gura 21). Procedeu-se ento, partindo-se do extrato etanlico, c a o a determinaao do MIC(78)iv , para se determinar qual a concentraao m ` c c nima do extrato etanlico que efetivamente inibe o crescimento de E. coli no caldo. o Considerou-se o MIC atingido quando encontrou-se uma concentraao em que aps a c o irradiaao dos tubos, no mais se observasse efeito fotodinmico. c a a O MIC obtido foi comparado com o que se obteve utilizando uma soluao de 0, 1M ol c L1 de azul de metileno (Merck) irradiado nas mesmas condioes descritas para o extrato c etanlico de B. sulphurea. o A fotos com os resultados encontram-se na seao 4.2.2. c

3.10

Efeito antibitico de B. sulphurea em E. coli o

Visando-se encontrar-se o MIC do o extrato etanlico de B. sulphurea (tanto da vao riedade laranja quanto da amarela, diluiu-se o extrato etanlico em caldo de cultura o (FLUORCULT c ) inoculado com 50L de suspenso de Escherichia coli ATCC 25922, a
iv

Do ingls Minimum Inhibitory Concentration ou Concentrao Inibitria M e ca o nima

51

grau 2 na escala de McFarland, (aproximadamente 6 108 UFCv ). Diluiu-se o extrato etanlico conforme preparado na seao 3.1 nas propores: 1/1, o c co ou seja 1000 L de extrato etanlico para 1000 L de caldo de cultura inoculado, e deste o modo proporcionalmente para todas a diluies subsequentes: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 e 1/32, co o volume nal era aproximadamente 2000 L. Os tubos foram incubados por 48 horas em estufa mantida a 37 o C (no escuro, para tentar-se isolar qualquer atividade fotodinmica), todos os ensaios foram realizados em a triplicata. Aps este per o odo, procedeu-se a avaliao da inibio do crescimento bacteriano pela ca ca inspeao visualvi , bem como pela cultura em placas de Petri e avaliaao do nmero de c c u UFC. Para realizar-se a contagem, transferiu-se 10 L de suspensaao do tubos para a placas c de Petri contendo gar PCA (Plate Count Agar ) e espalhados pelo mtodo Pour plate. a e Estas placas foram colocadas em estufa a 37o C por 24h. Ao m das quais, realizou-se a contagem dos microorganismos que sobreviveram ao extrato etanlico com o aux de o lio um contador de colnias tradicional. Anotou-se os resultados. o

3.11

Fotoinativao de coliformes com lmpada halgena ca a o

Utilizou-se o aparelho de irradiaao que utiliza-se de uma lmpada halgena dicrica c a o o (ver seo 3.5) como fonte luminosa para se testar a capacidade do extrato etanlico de B. ca o sulphurea (variedades amarela e laranja), de inativar fotoquimicamente coliformes fecais presentes em gua contaminada, coletada de vasos sanitrios. a a O extrato de B. sulphurea utilizado, foi o preparado na seao 3.2 (liolizado). Utilizouc se uma placa com 96 poos na qual efetuou-se diluioes sucessivas da agua contaminada c c juntamente com os extratos etanlicos, em vrias propores, segundo o protocolo: o a co Agua contaminada por coliformes fecais, foi utilizada pura, e dilu com agua destida lada nas propores de 1/5, 1/10 e 1/100. Ou seja, as proporoes de agua contaminada co c para agua destilada foram respectivamente: 10L para 50L, 10L para 100L e 10L para 1000L.
Unidades Formadoras de Colnias o Neste caso, foi utilizada uma lmpada ultravioleta uorescente compacta com comprimento de onda a de 365 nm
vi v

52

O extrato etanlico de B. sulphurea foi dilu com agua destilada nas propores o do co de 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 e 1/6400 de extrato para gua destilada a respectivamente. Agua contaminada foi ento adicionada (100L) aos poos da placa, a c contendo as diluies seriais do extrato etanlico. co o Logo aps, a placa foi incubada no escuro por 10 minutos e, em seguida, irradiada o por 10 minutos, pela lmpada halgena do aparelho descrito (2, 1J cm2 ). 100L de a o caldo FLUORCULT foi ento adicionado a cada poo da placa, e a mesma foi incubada a c em estufa a 37o C por 48 horas em cmara hmida. Anotou-se os resultados, os quais a u encontram-se dispostos na tabela 34 juntamente com as fotos do experimento, na seao c Resultados experimentais. Para a variedade amarela, nem todas as cocentraes foram ensaiadas, devido a falta co ` de material (ores amarelas), deste modo indicou-se este fato pela sigla ND ou no a determinado. Os ensaios foram realizados em triplicatas para a gura 36 e em duplicata para todas as demais guras. Quando no indicado na prpria gura, o controle de a o crescimento foi realizado na ultima coluna da placa (coluna 8), na qual no foi adicionado a extrato de B. sulphurea. Nesta coluna de controle adicionou-se apenas o caldo de cultura e o inculo. o

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Resultados experimentais e discusses o

4.0.1 Espectros do extrato etanlico de B. sulphurea o

Figura 23: Espectro UV/VIS do extrato etanlico de B. sulphurea, variedade laranja, o diluiao (1/200) c A gura 23 mostra a grande absorbncia na regio que vai de cerca de 200 nm at a a e aproximadamente 240 nm. Nota-se ainda duas bandas pouco separadas. Uma mais estreita que vai de cerca de 250 nm at 300 nm. Outra mais larga que se inicia em e aproximadamente 300 nm e vai at cerca de 420 nm. A cor do extrato devido a esta e e ultima banda. Como esta banda est compreendida na regio do violeta, o extrato mostra a a coloraao laranja amarelada. c Nota-se pela gura 24 basicamente as mesmas bandas com a mesma intensidade que na gura 23, apenas com pequenos deslocamentos. Nesta diluiao (1/200) ambos extratos c possuem colorao praticamente idntica a olho n: so ambos amarelados. A diferena ca e ` u a c de cor entre as variedades amarela e laranja evidenci-se somente em concentraoes mais c altas.

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Figura 24: Espectro UV/VIS do extrato etanlico de B. sulphurea variedade amarela, o diluiao (1/200) c Pode-se notar pelas guras 25 e 26 que o espectro UV/VIS do extrato etanlico o liolizado de B. sulphurea variedade amarela, dissolvido em soluao salina absorve mais c fortemente no ultravioleta (mais precisamente em cerca de 200 nm) do que os extratos liolizados das variedades laranja (tanto dissolvido em etanol quanto em salina) e do que o extrato da variedade amarela dissolvida em etanol. O aumento na absorbncia de a e cerca de 50% maior: 1.5 no extrato da variedade amarela em salina contra 1.0 para todos os outros casos.

Figura 25: Espectro UV/VIS do extrato de B. sulphurea variedade laranja, diluiao c (1/200) Alm deste aumento na absorbncia na regio do ultravioleta, pode-se tambm notar e a a e que a banda na regio de 250 nm at 300 nm melhor denida nos espectros dos extratos a e e

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dissolvidos em soluao salina. Alm disto, a absorbncia na regio de 300 nm at cerca c e a a e de 420 nm menos intensa do que no extratos dissolvidos em etanol. e

Figura 26: Espectro UV/VIS do extrato de B. sulphurea variedade amarela, diluiao c (1/200) A gura 27, mostra espectros obtidos em diferentes solventes, todos sobrepostos em um unico grco, utilizando-se estrato etanlico bruto estra a quente de B. sulphurea a o do ` variedade laranja.

Figura 27: Espectros sobrepostos em diferentes solventes de extratos de B. sulphurea variedade laranja Nota-se por estes espectros que, em todos os solventes utilizados (exceto o ciclohexano), o extrato de B. sulphurea absorve fortemente luz azul vis apenas na regio do vel a

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violeta (450-475 nm). Nota-se ainda que, a pesar do extrato em ciclohexano ser apenas ligeiramente amarelado (fraca coloraao devido ` absorao muito pequena na regio do vis c a c a vel) o mesmo absorve vrias ordens de grandeza a mais do que nos outros solventes. Pela gura 27, a nota-se ainda que a despeito da absorbncia na regio do vis ocorrer em regi prxima a a vel a o a observada nos espectros obtidos com o estrato liolizado, ela mais intensa no estrato e obtido com etanol a quente. Sendo a absorbncia obtida em DMSO particularmente ` a intensa. Assim, interessante que o extrato tenha mostrado atividade fotodinmica quando e a irradiado com os LEDs ( > 600 nm), pois a absoro na regio de emisso destes muito ca a a e baixa. Por outro lado, sabe-se que os tecidos biolgicos, so em geral muito permeveis ` luz o a a a de comprimentos de onda longos (regio do vermelho para o infravermelho, ou cerca de a 620 nm at 750 nm), assim talvez a baixa absorao de luz neste comprimento de onda e c tenha sido ao menos em parte compensada pela grande penetraao nas clulas estudadas. c e

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4.1

Espectros das lmpadas uorescente e UV utilia zadas

A gura 28 mostra o espectro de emisso (em unidades arbitrrias) da lmpada de 20 a a a watts empregada no experimento de fotohemlise. Os picos agudos so devidos a emisso o a ` a atmica dos diferentes elementos qu o micos presentes nas lmpadas: Hg, Th, Yb, Eu etc. a Comparando-se este espectro, com os espectros de absorao dos vrios extratos de B. c a sulphurea, vemos que nenhuma das duas fontes luminosas (lmpada uorescente e UV) a cobrem efetivamente o espectro de absorao dos extratos. c A lmpada UV a que mais emite dentro da faixa de absorao mxima dos extraa e c a tos, fato vericado experimentalmente pela grande uorescncia que o extrato apresenta e quando irradiado com esta lmpada. a Um arranjo que melhor emitiria dentro do espectro de absoro dos extratos de B. ca sulphurea seria uma juno das duas lmpadas. ca a Como o aparelho utilizado no experimento de fotohemlise possui 4 bocais para o lmpadas uorescentes, pode-se pensar em combinar lmpadas UV e uorescentes brana a cas 2 a 2, de modo a se expandir a banda de emisso, no sentido de cobrir ao mximo o a a espectro de absorao dos extratos de B. sulphurea. c

Figura 28: Espectro da lmpada uorescente de 20 watts a

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Figura 29: Espectro da lmpada UV de 15 watts a

4.2

Ensaios biolgicos o

Com relaao as tabelas 1 e 2, nota-se que a despeito do espectro de emisso dos LED c a do aparelho LED 600 estar pouco sobreposto com o de absoro do extrato etanlico de ca o B. sulphurea empregado, ainda assim obteve-se um efeito fototxico bastante mensurvel o a em relaao a toxidade do extrato no escuro (no irradiado). c ` a

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4.2.1

Mortalidade fotodinmica de Artemia salina a

Abaixo, encontram-se dispostas as tabelas onde se resume os resultados dos experimentos empregando A. salina. Conforme descrito na seo Materiais e mtodos empreca e gados (3.6, pg. 46). a 4.2.1.1 Artemias irradiadas Tabela 1: Artemias irradiadas, diluio: 100-140 L ca 100 L 120 L 140 L Vivas Mortas Vivas Mortas Vivas Mortas 11 1 Branco 12 0 Branco 11 2 5 5 Tubo 1 2 6 Tubo 1 1 13 3 6 Tubo 2 3 7 Tubo 2 0 12 1 9 Tubo 3 0 11 Tubo 3 0 9 31,03% 68,97% %x 17,24% 82,76% %x 2,86% 97,14%

n 1 Branco 2 Tubo 1 3 Tubo 2 4 Tubo 3 5 %x

4.2.1.2

Artemias no irradiadas a Tabela 2: Artemias no irradiadas, diluiao: a c 100 L 120 L Vivas Mortas Vivas Mortas 12 0 Branco 11 1 10 1 Tubo 1 11 0 8 0 Tubo 2 9 1 9 0 Tubo 3 9 0 94,43% 3,57% %x 96,67% 3,33% 100-140 L 140 L Vivas Mortas Branco 11 0 Tubo 1 6 4 Tubo 2 7 4 Tubo 3 8 4 %x 63,64% 36,36%

n 1 Branco 2 Tubo 1 3 Tubo 2 4 Tubo 3 5 %x

Pode-se notar um salto na toxidade do extrato (tabela 2) entre os volumes adicionados de extrato de 120 L e 140 L. Para um aumento de apenas 20 L de volume de extrato adicionado (16,67% a mais) a porcentagem de mortalidade aumentou mais de dez vezes. Passando de 3,36% para 36,36%. Este aumento no pode ser atribu ao etanol utilizado a do no extrato pois em todos os brancos (controle) apenas uma Artemia morreu (tabela 2, volume adicionado de 120 ). Nota-se ainda (tabela 1) que o aumento na taxa de mortalidade para as artemias irradiadas foi mais linear do que no caso onde a toxidade foi avaliada no escuro (tabela 2).

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4.2.2

Fotoinativao de coliformes fecais com aparelho LED 600 ca

A gura 30 mostra, o extrato etanlico de B. sulphurea aps 48 horas de incubao o o ca em estufa ` 37 o C, dilu com o meio de cultura FLUORCULT e incubado com agua a do contaminada com coliformes fecais. Analisando a gura 30 percebe-se que at na diluiao de 1/4 o extrato estanlico de B. e c o sulphurea (laranja) inibe o crescimento dos coliformes completamente (aps a irradiaao o c por 10 minutos com o arranjo de LED descrito), pois o meio de cultura amarelo e quando e ocorre crescimento das bactrias, o meio de cultura libera um cromforo azuli , assim o e o meio de cultura ca esverdeado (resultado da mistura das cores amarelo e azul). Desta forma, (veja na gura 30), poderia-se supor que na diluio 1/8 (extrato/caldo ca de cultura) as bactrias j se proliferaram em grande nmero. Mas, apesar da cor a e a u ` luz branca se mostrar esverdeada, ela no uma conrmao de crescimento massivo de a e ca bactrias. A gura 31 mostra o porqu: apenas a partir do tubo 1/16 percebe-se a e e uorescncia do caldo, indicando crescimento de coliformes em grande nmero. e u As guras 32 e 33, mostram o grande valor prtico da uorescncia do meio de cultura: a e Como tanto o azul de metileno quanto o meio de cultura positivo para coliformes so a azuis, no poss detectar-se (a olho n em luz branca) em qual concentraao o efeito a e vel u c inibidor do azul de metileno passou a ndar. Mas sob uma luz UV ( 360nm), podemos notar facilmente, veja a gura 33 que apenas na diluio de 1/32 os coliformes proliferamca se em abundncia. a Por estas imagens pode-se comprovar o efeito fotodinmico do extrato etanlico de a o B. sulphurea. O efeito do extrato, que uma complexa mistura de muitos compostos, e e comparvel ao do Azul de metileno que uma substncia pura e considerado um fotosena e a sitizador clssico. a A Asteracea B. sulphurea, jamais havia sido descrita na literatura como possuindo qualquer atividade fotodinmica, tampouco antibitica. J seu uso folclrico como antia o a o malrico, havia sido descrito ainda em 1915 pelo mdico carioca Dr. Jos Monteiro da a e e Silva(79) em sua Flora Medicinal.

Portanto caso o crescimento tenha sido massivo, o meio se tornar completamente azul. a

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Figura 30: Determinaao do MIC para o extrato irradiado c

Figura 31: Fluorescncia revelando o crescimento de coliformes e

Figura 32: Azul de metileno utilizado como fotosensitizador

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Figura 33: Azul de metileno inibe os coliformes at na diluio 1/16 e ca

4.2.3

Fotoinativao de coliformes com lmpada halgena ca a o

Foi observada fotoinativaao signicativa para diluioes de at 1/400, dependendo da c c e concentrao do inculo e variedade da planta utilizada no extrato. A variedade laranja ca o demonstrou atividade fotodinmica cerca de duas vezes superior a variedade amarela. a A incubao no escuroii mostrou atividade do extrato at a diluio de 1/200. Os ca e ca solventes etanol e dimetilsulfxido no mostraram atividade nem no escurou nem ao o a serem irradiados, quando testados nas mesmas proporoes do extrato de B. sulphurea. c Pode-se atribuir o enorme aumento da atividade do extrato neste experimento, em relaao ao experimento empregando-se o sitema LED 600, devido principalmente a dois c fatores: Preparao do extrato: O extrato utilizado no experimento do aparelho LED 600, foi ca preparado usando-se cerca de 50g de ores frescas e extra com etanol ` quente, do a (o que aumenta o poder de solubilidade do extrato). Mas o tempo de contato entre as ores e o solvente foi curto. J o extrato utilizado no experimento com a lmpada halgena foi o extrato liolizado, preparado a partir de cerca de 20g de a o ores desidratadas, portanto muito mais concentrado. Comprimento de onda da fonte luminosa: A fonte de irradiaao empregada no exc perimeto do LED 600, foram diodos emissores de luz que emitem luz praticamente monocromtica. Comparando-se com os espectro obtidos para os extratos de B. a sulphurea iii (ambas variedades), vemos que o extrato absorve muito pouco na regio a
ii iii

Quando no houve irradiao da placa. a ca Veja a seo 4.0.1, pgina 53 ca a

63

de emisso dos LED. a Assim, a lmpada halgena que uma fonte policromtica e muito mais potente do a o e a que os 600 LED, alm de cobrir todo o espectro de absorao do extrato etanlico, e c o ainda o fez com uma potncia muito maior, mesmo na estreita regio do espectro e a coberta pelos LED. A gura 34 mostra um resumo numrico dos resultados das guras 35 e 36iv . Podee se perceber por esta tabela que o extrato etanlico liolizado de B. sulphurea de ambas o variedades apresenta claramente tanto efeito antibitico, ou seja, toxidade no escuro, o quanto efeito fototxico (ou fotodinmico). Nota-se claramente que existe um grande o a aumento da toxidade no extrato quando irradiado pela lmapda halgena. Pois quando a o uma suspenso concentrada de coliformes (gua contaminada no dilu a a a da) foi testada frente ao extrato, o mesmo causou inibiao do crescimento bacteriano na diluiao (mdia) c c e de apenas 1/200 no escuro chegando a inibir o crescimento dos coliformes at na diluio e ca de 1/800 (experimento A3 ) quando irradiado.

Figura 34: Inativaao fotodinmica de E. coli com lmpada halgena c a a o Percebe-se que o extrato etanlico da variedade laranja de B. sulphurea cerca de o e 100% mais inibidor ao crescimento de coliformes fecais quando irradiado com lmpada a halgena do que o extrato da variedade amarela. O extrato etanlico da variedade laranja o o
iv

Legenda para estas guras: N.I no irradiado e Irrad = irradiado) a

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chegou a inibir o crescimento bacteriano quando dilu at 1/1600, (inculo dilu de do e o do 1/100) enquanto que a variedade amarela chegou a atingir 1/800. Nota-se ainda que a toxidade no escuro (efeito antibitico) do extrato etanlico de ambas variedade de o o B. sulphurea foram muito semelhantes (mdia de 1/200) e fracamente dependente da e concentrao inicial do inculo. Estes testes mostram claramente a correlaao entre a ca o c fototoxidade e os pigmentos que conferem a cor laranja.

Figura 35: B. sulphurea amarela: no irradiada e irradiada a

Figura 36: B. sulphurea laranja: no irradiada e irradiada a

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Figura 37: Nenhum dos solventes inibiu o crescimento microbiano A gura 37 mostra o resultado da incubaao dos coliformes fecais com diferentes c solventes, sob as mesmas condioes empregadas para os extratos de B. sulphurea. Notac se que nenhum dos solventes empregados, nas concentraes testadas foi capaz de inibir co o crescimento de coliformes, evidenciado pela forte uorescncia do meio de cultura em e todos os poos. Portanto, pode-se descartar a possibilidade de os coliformes terem sido c inibidos devido aos solventes utilizados na preparaao dos extratos de B. sulphurea de c ambas variedades.

66

4.2.4

Resultados da fotohemlise o

Vericou-se que, somente ocorreu hemlise dos eritrcitos aps 180 minutos, com o o o irradiaao ou no escuro. Aps 30 minutos, no foi vericada hemlise signicativa, tanto c o a o para os eritrcitos irradiados quanto para os que parmeneceram no escuro. o Eritrcitos totalmente hemolisados (controle positivo, ou 100% de hemlise) com gua o o a destilada produziram uma leitura (em unidades arbitrrias de absorbncia = u.a) em 540 a a nm, de 0,0208. A hemlise basal (controle negativo, ou 0% de hemlise) produziu uma o o leitura (em unidades arbitrrias de absorbncia) de 0,0050. a a Legenda para o grco da fotohemlise (gura 38): a o NIrrad/30min: No irradiado (permaneceu no escuro) incubado por 30 minutos a NIrrad/180min: No irradiado (permaneceu no escuro) incubado por 180 minutos a Irrad/30min: Irradiado (luz branca, 4 lmpadas uorescentes de 20 watts, a 8 cm) incubado por a ` 30 minutos Irrad/180min: Irradiado (luz branca, 4 lmpadas uorescentes de 20 watts, a 8 cm) incubado por a ` 180 minutos 0.005: Hemlise basal, ou 0% de hemlise (em soluao siolgica) o o c o 0.0208: Hemlise 100%, em gua destilada o a Pode-se notar seguindo-se a linha de hemlise basal (linha zul claro, Abs: 0.0050 o u.a) que, para as diluioes 1/1600 e 1/3200 (ambas irradiadas por 180 minutos) a foc tohemlise sofrida pelos eritrcitos foi na verdade menor do que a hemlise basal, ou seja, o o o nesta condioes os eritrcitos foram protegidos do dano fotoxidativo pelo extrato de B. c o sulphurea.

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J se olharmos para as diluioes 1/200, no casos irradiado ou no por 180 minutos, a c a veremos a absorbncia foi signicativamente maior do que a apresentada pelo controle a positivo (100% de hemlise). o Logo, a absorbncia nestes dois casos, foi maior do que a apresentada por toda a a hemoglobina presente nos eritrcitos aps ser liberada em soluo por hemlise total com o o ca o agua destilada. Por conseguinte, o extrato de B. sulphurea apresentou neste caso, um fenmeno de o hipercromismo, pois a absorbncia da soluao aumentou bastante, sem que a massa de a c soluto tenha aumentado, o que indica que alguma espcie qu e mica em soluo teve sua ca estrutura molecular alterada, talvez por alguma reao fotoqu ca mica. Como a hemoglobina contm ferro e o extrato de B. sulphurea mostrou grande facie lidade em complexar com este e, a absortividade molar do produto desta complexaao c parece ser ordens de grandeza maior do que a do extrato isoladamente, convm insvestigare se este fenmeno em maior detalhe, em um trabalho posterior. o

Figura 38: Fotohemlise usando extrato de B. sulphurea laranja o

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4.2.5

Efeito antibitico de B. sulphurea em E. coli o

Para ambas as variedades de B. sulphurea, notou-se o efeito antibitico at a diluiao o e c de 1/8, a partir da qual a E. coli passou a se proliferar. Em todos os casos onde houve a proliferaao bacteriana, a contagem das unidades forc madoras de colnias revelaram concentraoes UFC = 2, 5107 para B. sulphurea variedade o c laranja, e para a variedade amarela UFC = 5, 0 107 enquanto que o controle (suspenso a bacteriana em soluo salina) revelou UFC da ordem de 108 e o Branco (soluao salina ca c estril) no revelou UFCs. e a Usando-se o etanol como branco, j na concentrao de 1/4, a contagem bacteriana a ca do tubo contendo apenas etanol (e inoculado com E. coli ) foi virtualmente idntica a e do tubo contendo a suspenso bacteriana em soluao salina, ou seja, pode-se descartar a c a hiptese de que o efeito antibitico observado com o extrato etanlico de B. sulphurea o o o seja devido ao etanol, usado como solvente. E interessante notar que, como a contagem de bactrias no tubo contendo o extrato e de B. sulphurea variedade amarela, foi cerca de 100% maior do que a do tubo contendo o extrato da variedade laranja, a presena de efeito antibitico est relacionada com a c o a presena de pigmentos que conferem a cor laranja. Pode-se ao menos em parte atribuir c o efeito antibitico aos avonides que conferem esta cor ao extrato, tais como a aurona o o sulfuretina(80)(81). Como o fentipo amarelo bem menos comum do que o laranja, a presena dos o e c pigmentos que conferem a planta o fentipo laranja pode estar relacionada de alguma o forma a algum tipo de adaptao evolutiva contra, doenas causadas por bactrias. ca c e

69

4.2.6

Resultados da fotoinativao de Saccharomyces cerevisi ca

As guras 39, 40 e 41 mostram o experimento da fotoinativaao da levedura S. cerec visi. Nota-se que, para uma inoculaao de 10 L de uma suspenso com concentraao c a c de clulas de S. cerevisi de aproximadamente 4 na escala de McFarland (nmero de e u clulas em suspenso aproximadamente igual a 1x108 UFC) o nmero de colnias ine a u o e contvel(maior do que cerca de 300 UFC)v em ambos os casos: no primeiro caso apenas a com o inculo e no segundo com 1 mL de etanol hidratado. o Todavia nota-se que a densidade de colnias na placa de Petri onde se adicionou o o etanol menor (gura 40), indicando que nesta concentraao (1 mL de etanol 96 o GL para e c 20 mL de agar PDA) de etanol, o mesmo por si s txico para as leveduras. Pela gura oe o

Figura 39: PDA inoculado com 10L de suspenso microbiana (McFarland = 4) a 41 nota-se que a despeito de a concentrao nal de colnias ser incontvel percebe-se ca o a que o nmero de colnias bem menor do que no branco (gura 39) e menor do que u o e no caso do etanol apenas (gura 40).

Normalmente aceita-se que o nmero de UFC para ser signicativo, deve estar compreendido entre u 20 e 300 UFC aproximadamente.

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Figura 40: PDA inoculado com 10L de suspenso microbiana (McFarland = 4) a

Figura 41: PDA inoculado com 10L de suspenso microbiana (McFarland = 4) a E necessrio observar que, a irradiao foi feita com a lanterna de led (gura 22, a ca pgina 45), simplesmente irradiando-se a luz da lanterna a cerca de 8 cm de altura da a placa de Petri, em ambiente aberto. Ou seja, pela foto, nota-se que boa parte da luz espalhada no ambiente, tornando a irradiaao muito menos eciente do que poderia, e c caso fosse feita em uma cmara fechada, onde toda a luz fosse revertida a placa de Petri. a ` E, mesmo assim, obteve-se resultados mensurveis. Outro ponto poss a vel de melhoria, seria o uso ou de LED com um ngulo de abertura menor, para que haja um menor a

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espalhamente de luz, ou um arranjo de lentes convergentes, de modo a se focar melhor a energia luminosa na area de aplicaao. c A atividade antimictica do extrato etanlico no irradiado, at a diluiao de 500 o o a e c L para 20 mL de agar, negligencivel. Em concentraoes maiores, cerca de 1 mL de e a c extrato etanlico para 20 mL de agar PDA, os efeitos passam a ser melhor percebidos, o mas os efeitos txicos do etanol passam a ser preponderantes, como mostra a gura 40, o onde nota-se uma menor concentraao de colnias de S. cerevisi. c o

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Concluses o
Notou-se que o desempenho do extrato de Bidens sulphurea como fotosensitizador, alm de depender da sua concentraao no meio, contagem bacteriana inicial do inculo, e c o tipo de clula empregada (levedura, coliforme, eritrcito, etc.) fortemente dependente e o e da fonte de irradiaao luminosa empregada. O comprimento de onda desta, alm de sua c e potncia, inuenciam sobremaneira os resultados. e Experimentos com coliformes fecais demonstraram que a atividade do extrato pode aumentar em ordens de grandeza dependendo da maior ou menor sobreposiao da banda c de emisso da fonte luminosa empregada (LED 600, lmpada halgena etc) com a banda a a o de absorao dos extratos. c O sistema constitu de lmpada halgena e empregando o extrato liolizado, mostroudo a o se o mais promissor por causa da melhor sobreposiao de seu espectro de emisso com c a o espectro de absoro do extratos para a aplicao na terapia fotodinmica. Etretanto ca ca a uma melhoria futura interessante seria utilizar-se LED de potncia ( 1 watt) que emitam e no comprimento de oda onde ocorre a maior absorao dos extratos, cerca de 450-475 nm. c Pois os LED possuam a interessante vantagem da melhor ecincia luminosa, ou seja, e produzem mais ftons de luz consumindo menos corrente eltrica e consequentemente geo e rando menores quantidades de calor e gastos econmicos com energia eltrica, radiadores o e de calor etc. Conclui-se que a variedade laranja de B. sulphurea apresenta maior atividade fotodinmica (em relaao a todas as fontes luminosas empregadas) e antibitica do que a a c ` o variedade amarela. Mesmo tendo-se utilizado fontes luminosas que emitem muito pouco dentro da faixa de absorao dos extratos de B. sulphurea (O LED 600 emite numa regio em que os extratos c a absorvem muito pouco, cerca de 630nm), ainda se observaram efeitos fotodinmicos a bastante signicativos, sendo comparveis aos obtidos com o azul de metileno, que absorve a fortemente na regio do vermelho. a Com base em relatos da literatura, e em alguns testes qu micos simples (espectro UV/VIS), nota-se grande concentraao de compostos fenlicos nos extratos de B. sulphuc o

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rea, os quais deveriam proteger do dano fotodinmico, agindo como antioxidantes por a exemplo. Entretanto, o que se observou experimentalmente foi que em pelo menos um experimento (fotohemlise), dependendo da concentraao de extrato no meio de cultura, o c o extrato pode ser tanto fototxico quanto fotoprotetor. o Os diferentes extratos mostraram atividade fotodimica frente a clulas to diferentes a e a quanto eritrcitos, bactria Gram(-)i , uma levedura e contra textitA. salina. o e Este fato sugere que em todos os casos possivelmente exista um mecanismo de aao c genrico, como a gerao de oxignio singleto, o que torna o desenvolvimento de resistncia e ca e e frente aos extratos por parte de patgenos pouco provvel. o a

Os coliformes fecais estudados.

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Referncias e
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