hisA TRASFORMAZIONE Incorporaziome di molecole di DNA (ricombinanti o non) da parte di cellule ospiti “competenti” Miscela di cellule competenti del ceppo FB251 hisB e di molecole di DNA plasmidico phisA Una frazione delle cellule competenti incorpora molecole di DNA Quesito Quesito
Come riconoscere, tra tutte
le cellule (qualche miliardo) potenzialmente trasformabili, i cloni positivi, cioè quelli che hanno incorporato il plasmide ricombinante phisA? Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidina La La moltiplicazione moltiplicazione di di queste queste cellule cellule porterà porterà alla alla comparsa comparsa di di colonie colonie resistenti resistenti alla alla tetraciclina tetraciclina Quesito Quesito
Come Come verificare verificare se se esiste esiste una una colonia colonia contenente contenente unun plasmide plasmide capace capace di di complemetare complemetare la mutazione his la mutazione his?? Estrazione Estrazione DNA DNA plasmidico plasmidico da da tutte tutte le le colonie colonie (miscela (miscela di di plasmidi plasmidi ricombinanti ricombinanti) ) Extraction of Extraction of plasmid plasmid DNA DNA from all from all reombinant reombinant clones clones
Transformation Transformation of of hisA hisA E.coli E.coli cells cells
Ability of Ability of mutant mutant plasmids plasmids to to hisA complement hisA complement Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina ma NON ISTIDINA
E ISTIDINA MA NON ISTIDINA ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE Terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina E ISTIDINA MA NON ISTIDINA Il promotore del gene his portato dal plasmide ricombinante NON è riconosciuto dalla RNA-polimerasi di E. coli ...
ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE
Terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina E ISTIDINA MA NON ISTIDINA Il gene his NON è stato clonato
ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE
Terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina E ISTIDINA MA NON ISTIDINA CRESCITA di ALCUNE COLONIE Terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina E ISTIDINA MA NON ISTIDINA
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