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COMPLEMENTAZIONE DI

UNA MUTAZIONE
FENOTIPO
Y

-
PLASMIDE X
Cromosoma

TRASFORMAZIONE

-
X
PLASMIDE
Cromosoma

Y
P

Plasmide
X-
Cromosoma
FENOTIPO
X

-
PLASMIDE X
Cromosoma

TRASFORMAZIONE

-
X
PLASMIDE
Cromosoma

X
P
+
Plasmide
X
Cromosoma
His Phenotype

hisB+hisA-hisF+
E. coli FB182 X

hisA
His Phenotype

leuC
hisB+hisA-hisF+
E. coli FB182 X

hisA

hisA
hisB+hisA-hisF+
E. coli FB182 X

hisA
TRASFORMAZIONE
Incorporaziome di molecole di DNA
(ricombinanti o non)
da parte di
cellule ospiti “competenti”
Miscela di cellule competenti del ceppo
FB251 hisB e di
molecole di DNA plasmidico phisA
Una frazione delle cellule competenti
incorpora molecole di DNA
Quesito
Quesito

Come riconoscere, tra tutte


le cellule (qualche miliardo)
potenzialmente trasformabili, i
cloni positivi,
cioè quelli che hanno incorporato
il plasmide ricombinante phisA?
Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidina
La
La
moltiplicazione
moltiplicazione
di
di
queste
queste cellule
cellule
porterà
porterà alla
alla
comparsa
comparsa di di
colonie
colonie
resistenti
resistenti alla
alla
tetraciclina
tetraciclina
Quesito
Quesito

Come
Come verificare
verificare se
se esiste
esiste
una
una colonia
colonia contenente
contenente unun
plasmide
plasmide capace
capace
di
di complemetare
complemetare
la mutazione his
la mutazione his??
Estrazione
Estrazione
DNA
DNA
plasmidico
plasmidico
da
da tutte
tutte
le
le colonie
colonie
(miscela
(miscela di
di
plasmidi
plasmidi
ricombinanti
ricombinanti) )
Extraction of
Extraction of plasmid
plasmid DNA
DNA
from all
from all reombinant
reombinant clones
clones

Transformation
Transformation of of
hisA
hisA E.coli
E.coli cells
cells

Ability of
Ability of mutant
mutant plasmids
plasmids to
to
hisA
complement hisA
complement
Piastra di terreno selettivo contenente
tetraciclina ma NON ISTIDINA

Replica-plating

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina


E ISTIDINA MA NON ISTIDINA
ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE
Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA
Il promotore del gene his portato dal
plasmide ricombinante NON è riconosciuto
dalla RNA-polimerasi di E. coli ...

ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE


Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA
Il gene his NON è stato clonato

ASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE


Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA
CRESCITA di ALCUNE COLONIE
Terreno contenente tetraciclina
su terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINA
MA NON ISTIDINA