L’ingegneria genetica

Prof. Renato Fani

Dipartimento di Biologia Animale e Genetica
Università degli Studi di Firenze

Prof.
Prof. Renato Fani
INGEGNERIA GENETICA

1. Che cosa è ?
2. Finalità ?
3. Quando nasce ?
4. Quali sono gli strumenti ?

Prof.
Prof. Renato Fani
1. Che cosa
è ? INGEGNERIA GENETICA
NON è
una disciplina scientifica

E’
un insieme di tecniche, di protocolli
che permettono
la manipolazione del DNA

Sinonimi •Manipolazione genica

:
•Tecnologia del DNA ricombinante

Prof.
Prof. Renato Fani
2. Finalità?

FINALITA’ della
INGEGNERIA GENETICA

Inizialmente l’ingegneria genetica

nasce con la “semplice” finalità di

ISOLARE, ANALIZZARE, MANIPOLARE e STUDIARE

singoli elementi
del patrimonio genetico di un
organismo
(animale, vegetale o batterico).
 3. Quando nasce ?

L’ INGEGNERIA GENETICA nasce agli inizi degli anni ‘70

quando si capì il meccanismo con cui gli ENZIMI DI
RESTRIZIONE tagliano il DNA.

Nel 1973, con la messa a punto della tecnologia del DNA

RICOMBINANTE, cominciava una nuova era della
GENETICA e della BIOLOGIA MOLECOLARE e non soltanto
di essa.
 CLONAGGIO
MOLECOLARE
(GENICO)
Inserire un frammento
di DNA
( dell’organismo che si sta studiando)
in un VETTORE
( generalmente un plasmide)

Molecola RICOMBINANTE
(CHIMERA)
che viene introdotta in una
CELLULA OSPITE
(generalmente un batterio)
 VETTORE Frammento

?
di DNA da
clonare

cromosoma

Molecole
ricombinanti
( chimere)

Cellula ospite
(batterio)
?
 Quesito

In che modo si può

generare una chimera
molecolare ?
4. Strumenti ?
STRUMENTI NECESSARI per una
MANIPOLAZIONE GENETICA

a) VETTORE molecolare

b) DNA da clonare

c) FORBICI molecolari

d) COLLANTE molecolare

e) CELLULE ospiti
a) Vettore
molecolare

Elemento centrale del clonaggio è il

VETTORE

Una molecola di DNA (plasmide, fago) con caratteristiche

biologiche proprie

nella quale viene integrato l’inserto e

che è capace di essere introdotto, per trasformazione,

in una cellula ospite (un batterio)
PLASMIDI OC

CCC
a) Vettore
molecolare
Plasmidi
DNA
plasmidi CROMOSOMICO

•Molecole di DNA a doppia elica circolari o (più raramente) lineari

•Duplicazione autonoma rispetto al DNA cromosomico ⇒ all’interno di

una cellula batterica sono presenti molte copie (fino a 500-600) dello
stesso plasmide
 FUNZIONE dei PLASMIDI

• geni per la resistenza ad antibiotici

• geni per la fissazione dell’azoto

• geni per la simbiosi

• geni per la degradazione di composti aromatici e di altri

composti organici

I plasmidi possono trasferirsi da una cellula batterica all’altra per

mezzo della coniugazione o della trasformazione

I plasmidi sono assai diffusi nei batteri isolati dall’ ambiente naturale e
l’informazione genetica che risiede in questi vettori plasmidici può fluire
all’interno di una specie o tra specie microbiche diverse
 Plasmidi
ARTIFICIALI
Mappa
Mappa del
del vettore
vettore
plasmidico
plasmidico pCRII
pCRII
b) DNA da clonare

DNA di un qualsiasi provenienza:

batterica, vegetale, animale o virale
c) Forbici molecolari

ENZIMI DI RESTRIZIONE

• enzimi di origine batterica

• tagliano il DNA a doppia elica in sequenze

specifiche, diverse per ogni enzima

•le sequenze riconosciute variano da 4 a 8 bp,

e sono palindromiche, a simmetria binaria
c) Forbici molecolari
Il taglio operato da un enzima di restrizione può essere di
due tipi

1) la sequenza viene tagliato al centro ⇒

⇒ estremità piatte

2) la sequenza viene tagliata in maniera asimmetrica,

lasciando le estremità 5’ (o quelle 3’) più lunghe di
quelle 3’ (o quelle 5’) ⇒
⇒ estremità coesive, appiccicose
c) Forbici molecolari

Enzima Sequenza

CCCGGG
SmaI GGGCCC

GAATTC
EcoRI CTTAAG

CTGCAG
PstI GACGTC
c) Forbici molecolari

Estremità coesive, appiccicose

5’ G A T C 3’
3’ C T A G 5’

G A T C 5’
3’
5’
3’
C T A G
d) Collante molecolare

DNA Ligasi

Salda covalentemente nucleotidi adiacenti

sulla stessa elica
e) Cellule ospiti

• batteri ( Escherichia coli, Bacillus subtilis )

• lieviti

• cellule vegetali

• cellule animali
 Quesito

In che modo questi

strumenti possono essere
utilizzati per generare una
chimera molecolare ?
Sito di riconoscimento
per BamHI

Enzima di
restrizione
BamHI
Plasmide Plasmide
“linearizzato”
(circolare)
ELETTROFORESI SU
ELETTROFORESI SU GEL
GEL DI
DI AGAROSIO
AGAROSIO

--

++
Controllo negativo
Marker
 ELETTROFORESI SU
ELETTROFORESI SU GEL
GEL DI
DI AGAROSIO
AGAROSIO
Plasmide nativo

OC Plasmide tagliato
CCC
L --

++

Marker Marker
 DNA
“passeggero”

“VETTORI” PLASMIDICI SEQUENZA da CLONARE

Trattamento con
enzima di
restrizione BamHI

PLASMIDE “LINEARIZZATO
Ligasi
Mappa
Mappa del
del vettore
vettore
plasmidico
plasmidico pCRII
pCRII
TRASFORMAZIONE
Incorporaziome di molecole di DNA
(ricombinanti o non)
da parte di
cellule ospiti “competenti”
Miscela di cellule competenti e di
molecole di DNA
Una frazione delle cellule competenti
incorpora molecole di DNA
 1. Come riconoscere le cellule che albergano un plasmide
(ricombinante o non)
da quelle che non sono state trasformate?

2. Come riconoscere i cloni cellulari contenenti plasmidi

ricombinanti da quelli contenti il solo vettore?

3. Come riconoscere, tra i trasfprmanti che contengono i

plasmidi ricombinanti, quello positivo,
cioè quello in cui è inserito il frammento che ci interessa?
 Quesito
Quesito

Come riconoscere, tra tutte

le cellule (qualche miliardo) che
hanno incorporato molecole di DNA, i
cloni positivi,
cioè quelli che hanno incorporato
un plasmide (ricombinante o non)?
E’ essenziale la presenza , nel vettore, di almeno
un “segnale”, un “marcatore” genetico che
permetta di riconoscere le cellule che hanno
ricevuto un plasmide (ricombinante o non)

Marcatore X

PLASMIDE
 Quale tipo di marcatore genetico?

Resistenza ad un antibiotico (ad esempio

ampicillina)

r
Amp

PLASMIDE
Mappa
Mappa del
del vettore
vettore
plasmidico
plasmidico pCRII
pCRII
Piastra di terreno selettivo contenente ampicillina
Piastra di terreno selettivo contenente ampicillina
 La
La
moltiplicazione
moltiplicazione
di
di
queste
queste cellule
cellule
porterà
porterà alla
alla
comparsa
comparsa di di
colonie
colonie
resistenti
resistenti
all’ampicillina
all’ampicillina
 La possibilità di riconoscere cellule che
portano un plasmide da quelle che non lo
contengono è solo il primo passo!

Infatti tra le cellule resistenti all’ampicillina

non è possibile, a priori, distinguere quelle
che hanno ricevuto un plasmide integro
(vettore) da quelle che hanno incorporato un
plasmide ricombinante (chimera)
Quesito
Quesito

Come
Come riconoscere
riconoscere ii cloni
cloni cellulari
cellulari
contenenti
contenenti plasmidi
plasmidi
ricombinanti
ricombinanti da da quelli
quelli contenenti
contenenti
ilil solo
solo vettore?
vettore?
ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO DAI
SINGOLI CLONI

ANALISI ELETTROFORETICA
Tuttavia è troppo dispendioso estrarre il
DNA plasmidico da centinaia di cloni

E’ necessario disporre di un sistema

alternativo:
ad esempio una sequenza di DNA la cui
interruzione ne provochi l’ inattivazione

INATTIVAZIONE INSERZIONALE
 E’ necessario disporre di un vettore
plasmidico che contenga (almeno) due
marcatori genetici diversi
Resistenza a due diversi antibiotici
(ampicillina e tetraciclina)
Sito di restrizione unico
(ad esempio BamHI)

r
Amp Tetr

PLASMIDE
Ampr Tetr Ampr

Frammento di DNA inserito

nel sito BamHI

Inattivazione del gene che conferisce alle cellule

ospiti la resistenza alla tetraciclina

Il plasmide conferisce alle cellule Il plasmide conferisce alle cellule

ospiti la resistenza alla ampicillina ospiti la resistenza alla ampicillina
ed alla tetraciclina
Le cellule vengono inizialmente seminate
su piastre di terreno selettivo
contenente ampicillina
Piastra di terreno selettivo contenente ampicillina
Piastra di terreno selettivo contenente ampicillina
 Per distinguere i cloni contenente i plasmidi
ricombinanti da quelli che portano il solo vettore

Replica su terreno contenente i due

antibiotici (ampicillina e tetraciclina)

A- cellule contenenti il solo vettore sono

resistenti ad entrambi gli antibiotici
B- cellule contenenti un plasmide
ricombinante sono resistenti alla sola
ampicillina
Piastre di terreno selettivo contenenti:

ampicillina replica ampicillina e

tetraciclina
 Piastre di terreno selettivo contenenti:

ampicillina ampicillina e
tetraciclina

Colonie resistenti alla ampicillina Cellule contenenti un plasmide ricombinante

Colonie resistenti alla ampicillina ed Cellule contenenti il vettore

alla tetraciclina
 CONTROLLO

ESTRAZIONE del DNA PLASMIDICO da CLONI

RESISTENTI all’AMPICILLINA e SENSIBILI alla
TETRACICLINA

ANALISI ELETTROFORETICA
Mappa
Mappa del
del vettore
vettore
plasmidico
plasmidico pCRII
pCRII
 Risultato della trasformazione

Cellula “celeste” Cellula “bianca”

Colonia “celeste” Colonia “bianca”

Isolamento di trasformanti
ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO
DAI SINGOLI CLONI

ANALISI ELETTROFORETICA
Mappa
Mappa del
del vettore
vettore
plasmidico
plasmidico pCRII
pCRII
Analisi di restrizione
 Determinazione della sequenza
nucleotidica del frammento
amplificato e clonato

TTTCCGTGTAGAACATCCTTATGGTCACCATAAACGTGCTGCAAC
ACCAGAAGATCCAGCATCTTCACAAATGGGTGAAACATTCTATGA
GTTTTGGCCTCGTACAGTAATTGGTTCATTCAAATCAGCTGTAGA
AATTGAAACCACACGTTTAAAACGTAAAGGTAAAGAATTCTGGTC
TACAGACAATGAGTTGTTGCAAGGTTGGGGTATGAGTGCTGCATT
TCATGCTTCTATGGTTGGTATCTTTGGTAAAGGTGTAATTCCATA
TTTAGCAACACAAGCATTCTATGGAATTAGTTTATTTGAAATTAT
TAACTATATTGAACACTATGG
Ricerca in banca dati di sequenze
omologhe

Identificazione della sequenza

 ANALISI
ANALISI DELLA
DELLA SEQUENZA
SEQUENZA
NUCLEOTIDICA
NUCLEOTIDICA

Gene
Gene X
X
Sequenza
Sequenza
nucleotidica Traduzione
Traduzione
nucleotidica

Sequenza
Sequenza
BLASTn
BLASTn aminoacidica
aminoacidica

Identificazione
Identificazione BLASTp
della BLASTp
della sequenza
sequenza
 Risultato: la ricerca ha trovato 37
sequenze simili ; 5 di esse hanno valori
di E molto bassi, quindi sono sequenze
molto simili a quelle di batteri
appartenenti al genere
Acinetobacter
 TRADUZIONE

5' 3' Frame 1

FPCRTSLWSP-TCCNTRRSSI FTNG-NI L-VLASYSNWFIQI SCRN-NHTFKT-R-RI LV

YRQ-VVARLGYECCI SCFYGWYLW-RCNSI FSNTSI LWN-FI -NY-LY-TLW

5' 3' Frame 2

FRVEHPYGHHKRAATPEDPASSQMGETFYEFWPRTVI GSFKSAVEI ETTRLKRKGKEFWS

TDNELLQGWGMSAAFHASMVGI FGKGVI PYLATQAFYGI SLFEI I NYI EHY

5' 3' Frame 3

SV-NI LMVTI NVLQHQKI QHLHKWVKHSMSFGLVQ-LVHSNQL-KLKPHV-NVKVKNSGL

QTMSCCKVGV-VLHFMLLWLVSLVKV-FHI -QHKHSMELVYLKLLTI LNTM
BLASTn
BLASTn BLASTp
BLASTp

Acinetobacter