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MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO: La cintica de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones ms utilizadas por la ingeniera alimentaria y la biotecnologa, por lo tanto, es sumamente importante conocer la forma de cuantificacin de los mismos, sus formas de aplicacin, las ventajas y desventajas de los diferentes mtodos, y sobre todo el monto econmico de cada uno de ellos. El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos. MTODOS DIRECTOS: Recuento del nmero de clulas en una cmara Peso seco celular Determinacin de nitrgeno o de protenas totales Determinacin de DNA 1-Mtodos directos: PESO SECO CELULAR: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula MTODOS INDIRECTOS: Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxgeno Liberacin de dixido de carbono Concentracin de un enzima constitutivo Decoloracin de un colorante Incorporacin de precursores radiactivos Medida de la turbidez

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pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. ABSORCIN: Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

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Fig. 1 Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0). Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco ( g/ml-mg/ml). La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

PESO HMEDO: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la

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masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextrano) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. VOLUMEN DE CLULAS EMPACADAS Y NMERO DE CLULAS: El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra: Recuento microscpico de partculas Recuento electrnico de partculas Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son: Recuento de colonias Mtodo del nmero ms probable Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es

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un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa. RECUENTO MICROSCPICO: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando microscopa de contraste de fase. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen determinado usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rpido y sencillo; pero no permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas muertas. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

Fig. Cmara de recuento de Petroff-Hausser Tcnicas de recuento en placa: Se coloca en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas aisladas dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que el nmero de estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas . Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima opcin permite 40

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realizar el recuento de microorganismos microaerfilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisin de luz por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamente las clulas vivas.
SISTEMAS DE CULTIVO

I. Cultivo en Batch
La evolucin del cultivo en el tiempo, sigue una curva tpica la cual recibe el nombre de curva de crecimiento en batch. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente diferenciables. En primer lugar existe una fase donde prcticamente no hay divisin celular pero s aumento de la masa individual de los microorganismos (fase lag o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento ocurre a velocidad especfica ( ) mxima y constante = m (fase exponencial). Al final de esta fase se alcanza la mxima concentracin microbiana. Posteriormente hay un rpido perodo de desaceleracin y se entra en la fase estacionaria la cual es causada por agotamiento de algn nutriente (el sustrato limitante) o bien por acumulacin de inhibidores. Durante esta fase la concentracin microbiana (o de biomasa) permanece constante. Finalmente se llega a una ltima etapa donde la concentracin de biomasa disminuye por autolisis o como consecuencia del metabolismo endgeno (fase de decaimiento). La duracin de cada una de estas fases es funcin del microorganismo en estudio y de la composicin del medio de cultivo. En particular la fase lag depende adems de la fase de crecimiento en que se encuentran las clulas en el momento de ser sembradas y de la composicin del medio de cultivo en que fueron crecidas. Si ste es igual a la composicin del medio en que se van a sembrar y las clulas estn en fase exponencial, la duracin de la fase lag, en general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que constituye tiempo perdido.

De la definicin de velocidad de formacin de obtenemos rx = .x

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