Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina / Escuela de Medicina

Bioquímica

PRACTICOS Nº03 Y Nº04

Estudio de la
Cinética
Enzimatica
INTEGRANTES /Pilar L. Navarrete
Briones
Yael R. Oñate Antilao
María J. Pérez Fernández
Carlos F. Pino Contreras
CARRERA / Medicina
SECCIÓN / Nº2
DOCENTES Dr. Reginaldo Del
Pozo,Ph. D.
BQ Javier Grandón
BQ Mirna Muñoz, M.Sc
QA German Rotter
FECHA / Jueves 24 de
Mayo de 2007
Espacio para la intro y los objetivos…

Materiales práctico Nº3//

 Pipetas de 2, 5 y 10 ml.
 Propipeta
 Vortex

 13 Tubos de ensayo.
 Vaso de incubación

 Gradilla.
 Cubetas

 Micropipeta. 5-50µl ; 50-200

 Espectrofotómetro
µly 200-1000µl  Aparato para incubación??
 Puntas para micropipetas  Soporte universal
 Vaso precipitado de 50ml.  Toalla absorbente
 Cronómetro

Reactivos empleados para la determinación de la actividad

enzimática:

• Tampón : Glicina/NaOH 0.1M (PH 9.4), NaCl 0.1% (p/v)

• Sustrato : β-glicerofosfato de sodio 0.003M
• Enzima : Fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Merck, 0.005 g/ml
buffer)

Reactivos empleados para la determinación de fosfato:

• Reactivo Molibdato : Molibdato de amonio 2.5% en H2SO4 5N

• Solución Reductora : Acido 1,2,4-
aminonaftolsulfónico
• Solución estándar de fosfato : Fosfato de sodio 1µmol/ml

Método//

Procedimiento actividad practica nº 1:

a) Preparar 10 tubos numerados, agregando en cada uno de ellos 2ml. de Agua y 1ml.
de Reactivo Molibdato (ácido); el objetivo, es que este medio ácido detenga la
reacción enzimática y que el Molibdato reaccione con el fosfato liberado en la reacción
dando la coloración azul, para poder cuantificar

b) En forma paralela, se agregan los siguientes componentes en un vaso de incubación:

 12 ml del tampón glicina descrito anteriormente
  12 ml de β-glicerofosfato de sodio
 8.5 ml de agua destilada.
Ahora, llevar el vaso de incubación al baño de incubación por 6-7 minutos hasta
que la solución alcance 37ºC, esto es lo que se denomina Pre-incubación; luego que
la solución alcanzó esta temperatura agregar 3.5mlde solución de enzima y agitar
suavemente la mezcla.

c) Al momento en que la enzima entra en contacto con la solución uno de los integrantes
del grupo de trabajo comienza a medir el tiempo con un cronómetro.
Simultáneamente se retira una alícuota de 3 ml para ser dispensada en el tubo Nº 1,
que contiene molibdato acido y se agita en el vortex (con ello se obtiene el tiempo
cero, donde no ha ocurrido la reacción cataliza por la enzima)

d) Se debe mantener el vaso de incubación en el baño a 37ºC y repetir el procedimiento,

es decir, sucesivamente se deben sustraer 3ml de la mezcla a los 5, 10, 15, 20, 25,
30, 40, 50 y finalmente a los 60 minutos; todos se deben vaciar en sus respectivos
tubos y agitar inmediatamente en el vórtex.

e) Durante los lapsos de tiempo mas largos que nos quedaban buscamos y elegimos las
cubetas (dentro de un rango inferior 0,015) y también preparamos un blanco con 1ml
de reactivo de Molibdato y 8,6 de agua destilada; y dos estándar con 1ml de Reactivo
de Molibdato, 1ml de solución de sulfato y 7,6 ml. de agua destilada. Homogenizar
cada uno de ellos en el vórtex.

f) Una vez listos los 10 primeros tubos completar con 3,6 ml de agua destilada cada uno
de ellos y agitar en el vórtex.

g) Finalmente, cuando esten todos los tubos listos se completan cada uno con 0.4 ml de
solución Reductora, incluyendo al blanco y estándar, agitar en el vórtex y
mantenerlos 10 minutos a temperatura ambiente.

h) Luego de dejar reposar los tubos por aproximadamente 10 minutos a temperatura

ambiente, se dispensan en cubetas para su lectura en espectrofotómetro a 620 nm de
longitud de onda, se observan y se analizan los resultados obtenidos.

Tabla Resumen Nº1: muestra las cantidades de reactivos dispensadas para cada tubo.
Componentes B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Std.
Tubos N° co. x2
Tiempo 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60
Incubación (min)
Molibdato NH4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
(ml)

Agua destilada - 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 -
(ml)

Alícuota - 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 -
incubación (ml)
Solución Fosfato - - - - - - - - - - - 1
Std. (ml)
Agua destilada 8.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3. 3.6 3.6 7.6
6
Solución 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0. 0.4 0.4 0.4
reductora (ml) 4

Resultados práctico nº3 //

Los resultados obtenidos en la lectura con espectrofotómetro de las muestras

provenientes de los tubos fueron usados para calcular la concentración del producto
formado, teniendo como dato la absorbancia de nuestro estándar, de concentración
1µmol/ml. La lectura de la absorbancia del estándar (preparado en duplicado) fue:
Estándar 1  0.329 ; Estándar 2  0.336
El promedio entre estas dos cifras nos da la absorbancia que corresponde a la
concentración 1µmol/ml. Como la absorbancia de cada muestra es directamente
proporcional a su concentración, se calcularon los valores de concentración
correspondientes a cada tubo. Estos valores se ilustran en la siguiente tabla:
 Cantidad de µmoles de PO4H-
Tubo Tiempo Absorbanci producto menos
(minutos) a formado: (µmoles µmoles de PO4H- a los 0
de PO4H-) minutos
1 0 0.212 0.637 0
2 5 0.253 0.760 0.123
3 10 0.291 0.874 0.237
4 15 0.329 0.988 0.351
5 20 0.955 1.066 0.429
6 25 0.393 1.180 0.543
7 30 0.411 1.234 0.597
8 40 0.436 1.309 0.672
9 50 0.466 1.399 0.762
10 60 0.484 1.453 0.816

>>>Cálculo de la concentración: Se basa en establecer una relación de

proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración

1µmol/ml  0.333 X= (Absorbancia de la

muestra) × 1
X  (valor de Absorbancia de la muestra) 0.333
(estándar)

Cabe destacar que este método de cálculo se emplea en todos los experimentos del
presente informe, para obtener la concentración de las muestras (en el práctico nº4 se
prepara un nuevo estándar)
 Tubo Tiempo Velocidad de reacción
(minutos) (µmoles PO4H-/5 minutos)
1 0 ----------
2 5 0.123
3 10 0.114
4 15 0.114
5 20 0.078
6 25 0.114
7 30 0.054
8 40 0.038
9 50 0.045
10 60 0.027

Discusión práctico nº3 //

La cinética enzimática se preocupa del estudio de la velocidad de las reacciones

catalizadas por enzimas, lo que nos proporciona información directa acerca del
mecanismo de la reacción catalítica y de especificidad de la enzima, “fosfatasa alcalina
de ternera” utilizada en este práctico.
Durante la actividad práctica observamos y cuantificamos la actividad enzimática
en relación con la velocidad que tenía la enzima a medida que avanzaba el tiempo de
incubación de esta.
Para poder cuantificar este cambio en la actividad enzimática a través del tiempo,
se midió la cantidad total de producto formado, es decir el “fosfato de sodio” en
relación al tiempo transcurrido de haber sido agregada la enzima a la solución con su
sustrato β-glicerofostafo de sodio, este producto se pudo medir detectando la
presencia de fosfato en la solución ya que este forma un compuesto azulado al unirse al
Molibdato y la solución reductora, leyendo su Absorbancia en el espectrofotómetro,
a una longitud de onda de 620nm. Recordando de los prácticos anteriores que esta
absorbancia es proporcional a la cantidad de fosfato presente en el producto; por lo que a
mayor cantidad de fosfato generado por la reacción, mayor absorbancia tendrá la
solución.
 Reacción catalizada
por la enzima
Fosfatasa Alcalina
de ternera
La medida de la velocidad de reacción se realiza siempre en condiciones óptimas
para la enzima fosfatasa alcalina, o sea un pH=7,4 y una temperatura de 37ºC, por lo
que fue de mucha importancia la preincubación de la solución; ya que solo después de 6
a 7 minutos en el baño termorregulador, sistema en el que hay agua destilada
calibrada que mantiene a la Tº deseada, gracias a un termostato electrónico;
comprobando que esta necesita un medio optimo para poder reaccionar y cumplir su
función, que es disminuir la energía de activación, por lo que se debe continuar con
la incubación, ya que un aumento en la Tº, provoca un aumento de la velocidad de la
reacción hasta la Tº optima, ya que después de aproximadamente 45ºC, se comienza a
producir desnaturalización térmica de la enzima, ya que esta es una proteína.
Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas altera
su carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie, método utilizado en el
practico al incorporar el reactivo Molibdato que llevaba Acido Sulfúrico 5N.,para poder
cuantificar.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración
inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la
cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos la siguiente
gráfica responde a un comportamiento tipico de Michaelis-Menten:
Esto se debe a que en un principio la concentración
de producto era cero por lo que el equilibrio estaba
estaba dezplazado a la formación de estos, por lo que
cuando [S] es pequeña, la velocidad inicial es
directamente proporcional a la concentración de
sustrato, y por tanto, la reacción es de primer
orden. A altas [S], el enzima se encuentra saturada
por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S].
En este punto, la reacción es de orden cero y la
velocidad es máxima (Vmax). Esto se explica ya que en
un comienzo todas las enzimas todas las enzimas se
encuentran desocupadas listas para formar el
complejo enzima sustrato, pero con el pasar del tiempo se encuentran ocupados los sitios
activos de estas enzimas, por lo que existe una disminución gradual de la velocidad de
reacción, llegando a la saturación, donde hay un equilibrio entre productos y reactantes.
Ser rigurosos durante el desarrollo del práctico es importante en aspectos como
medir volúmenes exactos, la responsabilidad de integrante que maneja el tiempo, la
lectura en el espectrofotómetro; para asi tener datos reales de la actividad de la Fofatasa
Alcalina en los determinados gráficos.
*****%%Errores de laboratorio se ven reflejados en los gráficos, por:
Medición errónea de la alícuota
Tiempo de verter alícuotas
Medida espectrofotómetro, por una mala calidad de las cubetas
Agitación en el vortex
Error inherente humano
Tal vez se requiere mas tiempo para ver el punto de equilibrio, pero por razones
prácticas no se puede.

Materiales práctico nº4 //

Reactivos:

* Buffer: Glicina/ Na OH 0.1 (ph: 9,4), NaCl 0,1% (p/v).

* Sustrato: β- Glicerofosfato de Sodio 6,0 mM.
* Enzima: Fosfatasa Alcalina de Intestino de Ternera.
* Reactivo de Molibdato: Molibdato de Amonio 2,5% en H2S045N.
* Solución reductora: Acido 1, 2,4-aminonaftolsulfónico.
* Solución Estándar de Fosfato: Fosfato de Na 1μmol/ml.

Implementos:

* 13 tubos de Ensayo.
* Cubetas para Espectrofotómetro.
* Espectrofotómetro.
* Vórtex.
* Pipetas.
* Pro pipeta.
* Baño temorregulado.
* Gradillas.
* Micropipeta.
* Puntas para Micro pipetas.
* Crónometro.

Método//

>>Determinación de la influencia de la concentración de SUSTRATO en

la velocidad de reacción de una enzima:

El Procedimiento de realizó a partir del siguiente esquema de trabajo:

1º Aplicamos todos los reactivo en orden ascendente. Poniendo particular cuidado en las
VARIACIONES de concentración de Sustrato.

2º Preincubacion a 37º en Baño Termorregulado,al igual que en al actividad práctica N°3

3º “PUNTO CRÍTICO” adición de la enzima, mezcla rápida en vórtex,

incubación en baño termorregulado a 37º de cada tubo por 10 minutos
exactos.

4º “PUNTO CRÍTICO” Cumplidos los 10 minutos exactos en cada tubo

se agregó REACTIVO de MOLIBDATO a las soluciones, en este punto se detiene la
reacción enzimática, mezcla en Vórtex.

5º Adición de Agua destilada a todos los tubos 3,6 ml.

6º Preparación de solución estándar y Blanco.

7º Adición de de Solución Reductora a todos los tubos, Mezcla en vórtex.

8º Tras un periodo de 10 minutos lectura espectrofotométrica de todas las soluciones a

660 nanometros (nm) de longitud de onda.

Durante los lapsos de tiempo más largos que nos quedaban buscamos y elegimos las
cubetas para la lectura espectrofotometrica, cuyo material presentaba un mínimo de
absorbancia.

La solución Blanco y los Standares fueron preparados según el siguiente esquema de

trabajo.
**las mismas soluciones fueron utilizadas en ambos procedimientos experimentales.

Dato Importante
 Importancia de vortereo (uso
del Vórtex) Homogenización de
>>Determinación de la influencia de la concentración de ENZIMA en la
velocidad de una reacción enzimática:

El esquema de trabajo es el siguiente:

1º Adición de todos lo reactivos en orden ascendente ,menos la solución enzimática.

2º Incubación en baño termorregulado 37º.

3º PUNTO CRÍTICO Adición de las DISTINTAS concentraciones de

enzima (pipeteamos cada tubo), mezcla rápida en Vórtex, inicio del tiempo
cronometrado, incubación en baño Termorregulado 37º por 10 minutos cada
tubo.
4º PUNTO CRÍTICO Tras los 10 minutos exactos de incubación de cada
tubo adición del Reactivo de Molibdato, con lo cual la reacción es detenida,
mezcla en vórtex.

5º Adición de 3,6 ml de agua destilada a todos los tubos, incluidos los estándar y
blanco???.

6º Adición de solución reductora, mezcla en vórtex.

7º Tras 10 minutos como mínimo desde el paso previo se realizó la lectura de

absorbancia en el espectrofotómetro.

Todos los valores de Absorbancia medidas en el 2º experimento

debieron ser sometidas a un Factor de Corrección de -0,370
otorgado por el Profesor encargado.
Dato Importante  El factor de
corrección compensa el retardo de la
Enzima, respecto del momento en que es
aplicada a la solución, la Fosfatasa Alcalina
es una enzima muy eficiente trabaja
inmediatamente después de ser aplicada ,
de ahí que el factor de correción sea tan
Resultados práctico nº3 //

Experimento nº1:

Usando como referencia la Absorbancia leída del estándar (Estándar nº1 0.384;
Estándar nº2 0.381) que en promedio fue de 0.383, se calculo la concentración de
producto formado para cada tubo con el método ya mencionado anteriormente. Como
transcurrió un tiempo de 10 minutos de reacción para todos los tubos, obtenemos así el
valor de la velocidad inicial de reacción medida en µmoles de PO4H- / 10 minutos.

Concentración de Absorbancia Velocidad inicial

Tubo β-Glicerofosfato de (µmoles de PO4H-
Sodio /10 minutos)
(µmoles )
1 4 1.269 3.313
2 3 1.119 2.922
3 2 0.809 2.112
4 1 0.412 1.076
5 0.5 0.329 0.859
Calculo de la Km y Vmax aproximadas

Tubo 1 1 .
Nº . Velocidad Inicial
[β-glicerofosfato de
sodio]
1 0.25 0.302
2 0.33 0.342
3 0.50 0.473
4 1.00* 0.929*
5 2.00 1.164

>>Cálculo de la Km y Vmax exactas

 Mediante la ecuación de la recta obtenida al graficar los recíprocos de la
concentración de Sustrato y de la Velocidad inicial, se puede obtener un valor mas exacto
de la Km y de la Vmax.
La ecuación de la recta de la línea de tendencia de nuestro gráfico es:

y=0.486x + 0.195
En un gráfico de doble recíproco…

-1 . = Intersección eje X -1 . = -0.195 -1 . = -0.401 Km= -1 .

2.49 µmoles
Km Km 0.486 Km -0.401

1 . = Intersección eje y 1. = 0.195 Vmax= 1 . 5.128 µmoles

Vmax Vmax 0.195 10 minutos

Experimento nº2:

En esta experiencia, los resultados de Absorbancia fueron arreglados al sumarles un

factor de corrección. Luego con el resultado obtenido se calcularon las concentraciones
de producto, y en consecuencia, las velocidades de reacción en cada caso.

Tubo Preparación Absorbancia Velocidad (Vmax)

Nº enzimática: Absorbancia + (µmoles PO4H-
Fosfatasa Factor de /10 minutos)
Alcalina corrección
(ml) (-0.370)
1 0.1 0.427 0.057 0.149
2 0.2 0.584 0.214 0.559
3 0.4 0.748 0.378 0.987
4 0.6 0.858 0.488 1.274
5 0.8 0.950 0.580 1.514
Discusión práctico nº4 //

>>Dadas las características de las reacciones catalizadas por enzimas cuya

actividad se ve afectada por varias distintas variables:

1)Ph.
2)Temperatura adecuada.
3)Tiempo de incubación de la reacción.
4)Concentración de la enzima.
5)Concentración de sustrato
6)Presencia de activadores o inhibidores.

Buffer: Glicina/ Na OH 0.1 (ph: 9,4), NaCl 0,1% (p/v), otorga el ph adecuado para la
fosfatasa alcalina cuyo máximo rendimiento, como su nombre lo indica, se registra en un
medio alcalino.

Temperatura: 37º otorgada por el baño termorregulado, en su interior incubamos todos

los tubos previo y durante la reacción enzimática, asegurándonos de otorgar a la enzima
la temperatura óptima de trabajo.

Tiempo de incubación: Lo logramos mediante el uso adecuado del Cronómetro.

Concentración de Enzima: en el 1º experimento se mantuvo constante pues se quería

medir sólo el efecto de la concentración de sustrato en la actividad de la fosfatasa
alcalina.
Concentración de Sustrato: En el 2º experimento de mantuvo constante pues sólo se
quería medir la influencia de las variaciones en la concentración de enzima sobre la
actividad de la misma.
Presencia de Activadores u Inhibidores: nos aseguramos de que estas variables no
existieran al preparar y medir nuestro reactivo blanco y las soluciones estándar.

>> Reactivo de Molibdato y su doble función:

H2SO4: Solución STOP disminuye el ph (acidifica el medio) de la fosfatasa alcalina y la

desnaturaliza deteniendo la actividad enzimática y por consiguiente la reacción.

Molibdato de Amonio: se une al Fosfato inorganico

liberado por la fosfatasa alcalina a partir del Sustrato: β-
Glicerofosfato de Sodio 6,0 mM.

Solución Reductora: Colorea el complejo formado

entre el Fosfato formado y el Molibdato. Esto porque la
forma reducida del complejo adquiere una coloracion
caracteristica. Los colores mostrados en el círculo de la
izquierda corresponden a la gama de colores que
pudimos presenciar tras aplicar la solución reductora.

>>De la fosfatasa Alcalina:

 Esta enzima hidroliza grupos fosfato de una variedad
de moléculas orgánicas. Consiste de dos cadenas de
polipéptidos que al plegarse, contiene regiones
considerables de estructuras secundarias Alfa y Beta,
así como también regiones plegadas sólidamente en
forma de espiral aleatoria. ( imagen subunidad de
Fosfatasa Alcalina)
Esta enzima se encuentra en casi todos los los tejidos
del cuerpo (con gran variedad de isoenzimas), pero es
mayor su presencia en: Hígado, Vías biliares y Huesos.
La cuantificación de la Fosfatasa Alcalina es de
particular importancia en distintos exámenes clínicos
pues su aumento sumado a otras proteínas como GAMMA GT es indicador de trastornos
hepáticos tales como obstrucción de las vías biliares.
La Fosfatasa Alcalina se encuentra normalmente aumentada durante el crecimiento de
los huesos de niños y adolescentes, su aumento en etapas posteriores es indicador de
trastornos óseos.
Se ha propuesto como método no invasivo el estudio de “Isoenzimas de la Fosfatsa
Alcalina en el suero de pacientes con insuficiencia renal”, en cuyo caso la distribución de
las mismas se ve alterada, asociando esto a complicaciones óseas e intestinales
asociadas al fallo renal.

Conclusiones //

Podemos concluir que:

La absorbancia de las muestras, está en relación directa con la concentración de fosfato

liberado en la reacción, siendo éste el

Un cambio drástico en la variación de pH a la cual trabaje una enzima, es capaz de

detener su acción catalítica, y por tal, detener su función, ocasionando un freno en la
reacción propiamente tal.

El decremento de la variación de absorbancia entre las muestras en distintos tiempos,

está relacionada con la disminución de la velocidad de reacción a medida que se viera
manipulada la variable independiente; en este caso, el tiempo de cada muestra para que
se llevase a cabo la reacción.

Al ir aumentando la concentración de enzima en la reacción, la velocidad de reacción va

aumentando, pues le es más difícil al sustrato poder saturar la cantidad de enzima
presente, y por tal, si más sustrato puede reaccionar, ésta concentración de sustrato será
directamente proporcional a la velocidad de reacción que dé.
A bajos niveles de concentración de enzima, la reacción es más lenta, porque llega a un
punto de saturación más fácilmente, y por tal, la baja concentración de sustrato
necesario para alcanzar dicho punto, es proporcional a la baja velocidad resultante en tal
reacción.

Mientras mayor sea la concentración de sustrato, más rápida será la reacción, pues la
velocidad termina siendo proporcional a la concentración de sustrato, alcanzando el
punto de saturación de la enzima, que corresponde al punto óptimo de su trabajo.

A bajas concentraciones de sustrato, la reacción es más lenta, pues la velocidad de

reacción, donde sólo el sustrato es la variable, se hace proporcional a éste.