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RIGENERAZIONE IN VITRO

La differenziazione di un determinato organo è un processo


“de novo” non derivante da primordi preesistenti nei tessuti,
caratterizzato da modificazioni morfologiche, biochimiche e
strutturali delle cellule che costituiscono il tessuto di
origine.

In vitro si distinguono due processi di


differenziazione: 1) l’organogenesi
ovvero il processo di sviluppo che
porta alla formazione di organi
individuali quali gemme e radici;

2) l’embriogenesi ovvero la
formazione di piante a partire da
embrioni non zigotici.
Se osserviamo
citologicamente un callo
che prolifera su un
terreno di mantenimento,
notiamo che esso è
caratterizzato da cellule
parenchimatiche
altamente vacuolate con
citoplasma sparso ed un
nucleo disposto alla
periferia della cellula.
L’inizio del processo di differenziazione
può essere documentato con l’apparizione
di elementi tracheidali ed una discreta
regolarizzazione della divisione. Infatti,
mentre in una struttura disorganizzata la
divisione cellulare è un processo “random”,
quando un callo viene trasferito su un
mezzo che permette la differenziazione, in
un lasso di tempo che va dai 2 agli 8 giorni
di coltura, possono essere localizzati centri
di intensa attività mitotica. Le divisioni
continue in questi centri portano alla
formazione di zone meristematiche o
“meristemoidi” generalmente localizzati
sulla superficie del callo, ma presenti anche
all’interno. Le cellule dei meristemoidi sono
piccole, ricche di plasma, con grossi nuclei
e nucleoli, prive di vacuoli, e con una parete
molto sottile. Le cellule dei meristemoidi
sono inoltre in stretta continuità le une con
le altre. All’inizio, un meristemoide è
plastico, capace di dare origine sia ad un
primordio radicale, sia ad un germoglio o a
primordi capaci di differenziarsi poi in
embrioidi. La specializzazione delle cellule
è un evento successivo mediato dai
regolatori della crescita.
ORGANOGENESI

La fase iniziale dell’organogenesi è la


differenziazione dei meristemoidi. I
meristemoidi appaiono apolari, ma
l’attività di divisione porta alla
formazione di specifici primordi lungo
un’asse unidirezionale. Un primordio di
un organo, sia una radice, sia una gemma
è una struttura unipolare in continuità
con il tessuto di origine (il callo ad
esempio). Gli elementi vascolari nel
primordio appaiono ad uno stadio
successivo e possono avere sempre
continuità con quelli del callo. Durante la
formazione del meristemoide
scompaiono anche le sostanze di riserva
come l’amido, ed i corpi paracristallini
che caratterizzano esclusivamente un
parenchima.
L’organogenesi viene detta diretta se non si ha la fase di
sdifferenziazione cellulare e i primordi si sviluppano
direttamente dai tessuti della pianta. Viene detta indiretta,
invece, quando gli organi si sviluppano da un callo.

ORGANOGENESI DIRETTA:
ESPIANTO PRIMARIO >
MERISTEMOIDE >
PRIMORDIO (radice o
germoglio)

ORGANOGENESI INDIRETTA:
ESPIANTO PRIMARIO >
CALLO > MERISTEMOIDE >
PRIMORDIO (radice o
germoglio)
Fattori di controllo dell’organogenesi

1)Fattori chimici:
•Auxine: IAA (acido indole-acetico, auxina naturale);
NAA (acido naftalene acetico)
IBA (acido idrossibutirrico)
2,4-D (acido 2,4 dicloro-fenossi-acetico)

Alti livelli di auxine controllano la crescita disorganizzata delle cellule e la


promozione di radici.

•Citochinine: Zeatina-riboside (naturale, isolata dal mais)


Kinetina (6-furfuril-amino-purina)
BAP (6-benzil-amino-purina)
SD-8339 (6-tetra-idro-pirano)
2-IP (6-7-7-Dimetil-allil-amino-purina)
•Basi puriniche: adenina, guanina
•Derivati dell’urea

Alti livelli di citochinine promuovono la differenziazione di germogli.


Gibberelline, acido abscissico ed etilene: interagiscono con auxine e
citochinine nella formazione di primordi in coltura in vitro di diverse specie
vegetali.
2)Fattori fisici ed ambientali:

• Terreni di coltura solidi

• Qualità e quantità della luce

• Temperatura ed umidità

• Potenziale osmotico del mezzo di coltura


Un tessuto differenziato può anche EMBRIOGENESI
essere indotto a differenziare embrioni.
Queste strutture, a differenza dei
primordi di radici e di gemme, sono
strettamente bipolari con un polo da cui
originerà la radichetta primaria ed un
polo da cui origineranno i cotiledoni.
Questo tipo di struttura è stato
variamente denominato: embrione,
embrioide, embrione avventizio, embrione
somatico, embrione accessorio, embrione
soprannumerario ed anche neomorfo.
L’uso più comune del termine resta
“embrioide”. In un embrioide il polo
caratterizzato da una biforcazione darà
origine ad una gemma, mentre la stretta
base (la caratteristica distintiva
dell’embrione) darà origine alla radice.
L’embrioide, inoltre, non è in stretta
continuità con il tessuto di origine ma è
una struttura indipendente
La formazione di embrioni in coltura è stata dimostrata la
prima volta nel 1958 in una coltura di radici di carota, ma
numerose altre Umbrellifere e diverse altre specie fra cui
diverse monocotiledoni, sono capaci di formare embrioni.
Si ritiene che gli embrioni possano
originare da gruppi di cellule anche
senza passare da una fase di
sdifferenziazione cellulare. Le cellule
da cui originano gli embrioni sono
meristematiche, piccole, ricche di
citoplasma e con grossi nuclei.
Queste cellule sviluppano pro-embrioni
e poi differenziano gemme: in questo
caso l’embriogenesi è detta diretta.
Se l’embriogenesi è indiretta, cioè la formazione di embrioni avviene passando
attraverso una fase di sdifferenziazione cellulare (callo), la maggior parte
degli embrioni ha origine da cellule alla periferia del callo, singole cellule che
danno origine a piccolissimi aggregati embriogenici che subiscono le
modificazioni meristematiche.
L’embrione non zigotico o “somatico” è
funzionalmente equivalente all’embrione
zigotico.
E’ generalmente accettato che gli
embrioni derivino da una singola cellula
al contrario dell’origine pluricellulare
degli organi e questo è un aspetto molto
importante da considerare ai fini del
miglioramento genetico.
La formazione di un embrione è caratterizzata da tre fasi: una (0-3
giorni) di crescita lenta (formazione del pro-embrione); una seconda (3-4
giorni) durante cui le cellule si dividono rapidamente e formano una
struttura globulare; una terza fase (4-6 giorni) nuovamente a crescita
lenta. La seconda fase è di cruciale importanza. Alla fine di questa fase in
una struttura globulare possono essere distinte tre regioni: una regione
trasparente destinata a differenziare una gemma (polo cotiledonare), una
regione opaca destinata a differenziare la radice, ed un’altra regione
opaca che non cresce.
Fattori di controllo dell’embriogenesi

1) DIVERSE COMPONENTI DEL MEZZO DI COLTURA:


• Sali di azoto ≥ 5 µM/g di tessuto fresco (KNO3; NH4; latte di cocco;
idrolisati di caseina; miscele di aminoacidi)
• Sali di potassio
• Aminoacidi (glutamina, alanina, serina, prolina)
• Auxine ( da 0.5 a 25 µM) (trattamento 5-7 giorni)

2) CONTROLLO GENETICO (non tutte le specie formano embrioni)

3) TESSUTO-SPECIFICITA’ (ovari immaturi, giovani infiorescenze, picciolo


fogliare, meristemi)

4) SPECIFICITA’ CELLULARE

5) POSIZIONE NEL MEZZO DI COLTURA (verticale secondo l’asse


radice>gemma)
Un problema comune in
alcune specie vegetali è
l’occorrenza casuale di
strutture
embriogeniche non
zigotiche anormali. Le
irregolarità più
frequenti sono
rappresentate da
aberrazioni nella forma
e nel numero dei
cotiledoni e da
anormalità nello sviluppo
dei meristemi.
Induzione fiorale: mediante la coltura in vitro di
tessuti è possibile la formazione di fiori sebbene
questo sia un evento poco frequente se
confrontato alla possibilità di ottenere gemme
ed embrioni.
Fattori di controllo:
•una stretta correlazione tra contesto fisiologico
dell’espianto di partenza e risposta
morfogenetica. In Nicotiana tabacum la
formazione di fiori è stata osservata a partire
da espianti derivati da regioni dell’infiorescenza:
segmenti dello stelo della parte basale della
pianta formavano gemme vegetative, segmenti
dell’infiorescenza formavano gemme fiorali.
In alcune specie, tuttavia, la formazione di fiori
è possibile a partire da cotiledoni o da segmenti
radicali.
•vernalizzazione dell’espianto
• appropriate condizioni di fotoperiodo (giorno
corto).
•mezzi di coltura con basse concentrazioni di sali
ad eccezione dell’azoto ed alte concentrazioni di
zuccheri, con citochinine, adenina ed ABA,
mentre auxine e gibberelline sembrano inibire
l’induzione fiorale.
TECNICHE DI COLTURA IN VITRO E RIGENERAZIONE:
POTENZIALI APPLICAZIONI

1. Colture di callo, di cellule in sospensione, di protoplasti:


→ selezione ed isolamento di linee cellulari mutanti e
rigenerazione di piante con caratteristiche migliorate:
alta produttività; resistenza a stress biotici ed abiotici
(fattori ambientali); produzione di ibridi somatici;
produzione di aploidi.
La coltura in vitro è mutagena di per sé. La variabilità indotta
dalla coltura in vitro viene definita “variabilità somaclonale”
(Larkin and Scowcroft, 1981) ed è caratterizzata da un ampio
spettro di mutazione con una frequenza spontanea ≈ 10-2.

Diversi studi hanno evidenziato in cellule e tessuti in vitro:

•mutazioni puntiformi
•aberrazioni cromosomiche
•mutazioni genomiche (aploidia, poliploidia, aneuploidia)
•variazioni di tipo epigenetico: fenomeni di amplificazione e
deamplificazione di sequenze geniche, metilazione e
demetilazione del DNA.
•Inserzione di elementi trasponibili.
Variazione somaclonale documentata in colture di cereali.
Caratteristica variata
Specie
Avena sativa Aneuploidie, interscambi tra cromosomi
Hordeum spp. Variazioni del numero cromosomico,
morfologia della spiga, albinismo,
accestimento, bande isoenzimatiche
Lolium spp. Numero cromosomico, forma e
dimensione delle foglie, sviluppo del fiore
Oryza sativa Fertilità del seme, albinismo, altezza
della pianta, data di emergenza della
spiga
Panicum spp. Dimensione della pianta e delle foglie,
accestimento
Saccharum spp. Numero cromosomico, morfologia della
pianta e della foglia, mancanza di tricomi
Saccharum officinarum Resistenza a patogeni, percentuale di
fibra, numero degli steli, lunghezza
Sorghum bicolor Fertilità, portamento della pianta
Triticum turgidum Numero cromosomico
Zea mays Altezza della pianta, numero dei nodi,
disposizione delle foglie e delle spighe,
fertilità del polline, numero
cromosomico, mutazioni nell’endosperma
e in plantula
Metodi di micropropagazione:

→ Rigenerazione da apici meristematici: ottenimento di


piante non contaminate da virus; micropropagazione di
orchidee
→ Rigenerazione da ipocotile: alta efficienza di
moltiplicazione

→ Rigenerazione da segmenti fogliari: propagazione su


larga scala di ornamentali

→ Rigenerazione da segmenti radicali: propagazione di


orchidaceae

→ Rigenerazione da endosperma: ottenimento di triploidi


con caratteristiche agronomiche migliorate; ottenimento
di aploidi.

→ Rigenerazione da polline: ottenimento di aploidi


Rigenerazione da polline