Efecto antiteratgeno del t de Panax ginseng sobre malformaciones embrionarias en ratas Wistar inducida por infusin de Ruta sp Hernndez

Coln Pedro, Maldonado Viloria Ana Karen, Romero Bez Oscar, Romero Ramrez Juan Carlos, Valencia Saavedra Luis Daniel, Valenzuela Cern Ana Karen Laboratorio de Metodologa Cientfica III Carrera de Biologa FES Iztacala Universidad Nacional Autnoma de Mxico
RESUMEN El uso de la ruda (Ruta sp) puede remontarse varios aos atrs, siendo utilizada sobre todo para los dolores menstruales, al ingerirla con flor de la borraja y con la de la sanguinaria se produce aborto, y tambin se utiliza para purgar la matriz, cuando el aborto ya se ha producido. R. chalepensis, tiene un efecto teratgeno y embriotxico, y se ha demostrado que altera la migracin celular en el sistema nervioso central. En Mxico el Panax ginseng es una planta poco utilizada, sin embargo es una hierba medicinal cuyo uso esta difundido en todo el mundo. Se sabe que el ginseng tiene propiedades antioxidantes, caracterstica que comparte con otros antiteratgenos. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto antiteratgeno del t de P. ginseng sobre embriones de ratas Wistar tratadas con t de Ruta sp. Se obtuvieron ratas Wistar, que fueron cruzadas y divididas en grupos El control negativo, recibi 2 ml de infusin de ruda, al grupo experimental se le administraron 2 ml de infusin de ruda y como uso diario el t de ginseng, al grupo testigo se le administraron 2 ml de agua potable va sonda durante el mismo periodo de tiempo. Despus del da 21 se sacrific a las ratas y se obtuvieron los fetos los cuales fueron medidos y pesados, posteriormente se repartieron para el anlisis seo, anlisis de Wilson y actividad de catalasa. En el anlisis a nivel seo no se encontraron malformaciones en ningn caso. En el anlisis de Wilson el grupo de Ruta sp y Ruta sp-Panax ginseng presento un incremento en las malformaciones de ojos, odos y nariz con una mayor incidencia en el ltimo grupo mencionado. El ginseng estimula el sistema antioxidante intrnseco, pero no contrarresta totalmente el efecto teratgeno de Ruta sp. Con respecto a catalasa se encontr una disminucin significativa entre los niveles de el grupo tratado con Ruta sp en comparacin del grupo control, mientras que en el grupo tratado con ruda y ginseng mostro niveles intermedios de catalasa, presentando diferencias significativas entre ambos grupos

Palabras clave: Ruta sp, rata, catalasa, teratognesis, Panax ginseng, antiteratgeno, antioxidante, desarrollo, feto. INTRODUCCIN Hasta hace cinco dcadas se crea que la placenta servia como una barrera, que protega al feto de los efectos adversos de los frmacos. El desastre de la talidomida cambi completamente esta idea demostrando que la exposicin del feto a frmacos durante los periodos crticos del desarrollo poda producir daos irreversibles (Koren et al.,1998). Pases como EE.UU. usaron dicho medicamento durante el final de la dcada de los 50 y la mayora de los 60, este fue el medicamento mas utilizado contra las nauseas y vmitos en el embarazo, posteriormente fueron presentadas muchas demandas por posible teratogenicidad del frmaco. Despus de esto se supo que la administracin de este tipo de frmacos a mujeres embarazadas puede alcanzar al embrin o al feto acrecentando el riesgo potencial de presentar posible teratogenicidad (Vallve., 1987). Aunque no todas las malformaciones pueden ser atribuidas al uso de frmacos. La causa del 40% de las malformaciones es de origen desconocido, mientras que de 12% a 25% de estas malformaciones se debe a defectos genticos, siendo el sndrome de Down el ms frecuente. Otro 20% son debido a las interacciones entre factores hereditarios y factores ambientales, como pueden ser productos qumicos enfermedades o infecciones en la madre, mientras que en presencia de diabetes las malformaciones se dan hasta en un 90% (Gurnee, 2001). Algunas plantas frecuentemente usadas por sus propiedades medicinales, han demostrado tener un efecto teratognico en embriones de ratn (Arenas y Savitry, 1994), un ejemplo de esto es la ruda. El uso de la ruda (Ruta sp) puede remontarse varios aos atrs, siendo utilizada sobre todo para los dolores menstruales despus del parto, para tratar la dismenorrea, como emenagogo y para alimentar y cerrar la matriz despus del alumbramiento, todos estos usos relacionados con su capacidad para modificar la contractilidad uterina, tambin es usada para controlar casos de epilepsia, hemorragias, dolores de cabeza, reumatismo y gota. Al ingerirla con flor de la borraja y con la de la sanguinaria se produce aborto, y tambin se utiliza para purgar la matriz, cuando el aborto ya se ha producido (Martnez, 2008). Benavides et al, (2000) encontraron que R graveolens tiene un efecto nocivo sobre el desarrollo pre y post implantacin en ratones. Mientras que Zeichen et al., (2000) reportan que R. chalepensis, tiene un efecto embriotxico en ratones, evaluado por histopatologa, y demostraron la inhibicin del desarrollo del timo

que alterara la migracin celular en el sistema nervioso central, lo que provoca que los ratones disminuyan de peso. Sin embargo, existen plantas antiteratgenas, las cuales se caracterizan por detener o inhibir las malformaciones, entre las que podemos encontrar al ginseng (Panax ginseng). Esta es una hierba medicinal que esta difundida en todo el mundo. Pases como China, Corea y Japn la han utilizado por muchos siglos, como un tnico y adaptgeno. Algunos estudios experimentales y clnicos tambin han demostrado que el ginseng posee efectos benficos en gran variedad de condiciones patolgicas como enfermedades cardiovasculares, cncer, deficiencia inmune y desordenes neuro degenerativos, atribuyndoselo a las saponinas (ginsenosidos) y triterpenos, los cuales son los principios activos de este (Yuan y Dey, 2001). La composicin qumica de las diferentes especies de Ginseng es relativamente similar, en general, tienen un efecto especifico en una parte del cuerpo (Vuksan et al., 2000). Algunas especies tienen efectos sobre el sistema nervioso central, tambin tiene efectos benficos como antioxidante. Estudios realizados in vivo muestran un buen efecto en casos de diabetes mellitus y problemas inflamatorios (Li y Chu, 1997). Lee et al., (2008) comprobaron que el ginseng negro tiene una efectiva proteccin contra la teratognesis inducida por etanol, a travs del aumento en la actividad antioxidante en los embriones. Con lo revisado anteriormente se sabe que el ginseng tiene propiedades antioxidantes (Lee et al., 2008), caracterstica que comparte con otros anti teratgenos como el cido flico (Cipollone et al., 2008). En base a estos antecedentes, es posible que el ginseng muestre efecto antiteratgeno contra la Ruta sp. MATERIALES Y MTODOS Material vegetal. La planta de Ruta sp se obtuvo en comercios locales de la zona metropolitana y fue identificada en el herbario de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, logrndose identificar hasta el gnero, por lo cual no fue proporcionado un nmero de registro. Preparacin del t de Panax ginseng y la infusin de Ruta sp. Se utiliz un sobre de uso comercial de 3 g de t de Panax ginseng Tegin y se puso a hervir durante cinco minutos en 250 ml de agua. La infusin de Ruta sp se prepar con 10 g de hoja seca en 100 ml de agua. Ambas se filtraron con una

gasa. El t y la infusin fueron colocados en botellas obscuras para evita la oxidacin por la luz (Assucao et al., 2009).

Sujetos experimentales Se utilizaron 12 ratas hembras vrgenes de 10-12 semanas de edad de la cepa Wistar con un peso de 250-300 g, los animales se mantuvieron bajo condiciones estndar, a una temperatura de 18-24 C; fotoperiodo de 12 horas luz/oscuridad, con alimento y agua ad libitum. Las ratas se aparearon durante toda la noche, en etapa de estro, despus de ser cruzadas fueron examinadas por lavado vaginal en busca de espermatozoides, para confirmar la cpula, si se verificaba la presencia, este se tomaba como el da cero de preez. Se asignaron tres grupos al azar cada uno con 4 ratas Wistar preadas, todos los grupos recibieron durante el periodo post copula (da 8-19) va sonda 2 ml segn el grupo. Al testigo se le administr agua potable, el control negativo recibi infusin de ruda y el grupo experimental se le administraron 2 ml de infusin de Ruta sp y t de ginseng como uso diario. Al da 21 post copula las hembras fueron sacrificadas por sobredosis (pentobarbital sdico) va Intraperitonial para determinar: tamao de camada, nmero de cuerpos lteos, porcentaje de sitios de implantacin y reabsorciones fetales. Posteriormente los fetos fueron enumerados del uno al tres, estos se asignaron en el siguiente orden el primer feto para anlisis seo, segundo para anlisis de rganos y el tercero para actividad de catalasa y as sucesivamente, para luego ser medidos, pesados. Anlisis estadstico Los datos cuantitativos: medidas, peso y catalasa se analizaron por medio de un anlisis de varianza de un factor. RESULTADOS Cuantificacin de parmetros generales En la tabla 1 se muestra el tamao de camada, porcentaje de implantaciones y reabsorciones y nmeros de cuerpos lteos obtenidos de cada uno de los grupos (Testigo, R. sp y R. sp- P. ginseng). En la figura 1 se presenta las diferencias entre el largo, en la figura 2 ancho y en la figura 3 peso, de los diferentes grupos de fetos.

Tamao de camada % de implantacin # de cuerpos lteos % de reabsorcin

testigo 13.25 1.89 88.89 15 2.45 0

R. sp 13.75 2.5 74.08 18.5 1.73 0

P. ginseng 16.5 2.12 95 17.5 3.53 0

Tabla 1: En esta tabla se muestra los parmetros generales de cada grupo: testigo, R. sp y R. spP. ginseng, esto en ratas Wistar gestantes del da 21, con una n= 4, 4 y 2 respectivamente 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 TESTIGO RUDA Largo de fetos de rata RUDA-GINSENG

Figura. 1 En la grafica se presenta el promedio del largo de los fetos de las ratas Wistar desviacin estndar, en la cual no se presentan diferencias significativas (p>.05), del grupo testigo, ruda, ruda-ginseng, con una n=24, 20 y 15 respectivamente.

Centimetros

1.6 1.4 1.2 Centimetros 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 TESTIGO RUDA Ancho de fetos de rata RUDA-GINSENG

Figura. 2 En la grafica se presenta el promedio del ancho de los fetos de las Ratas Wistar desviacin estndar, en la cual se presentan diferencias Significativas entre el grupo testigo y el grupo ruda (p<.05), del grupo testigo, ruda, ruda-ginseng, con una n=20, 20 y 14 respectivamente. 8 7 6 Gramos 5 4 3 2 1 0 TESTIGO RUDA Peso de fetos de rata Figura. 3 En la grafica se presenta el promedio del peso de los fetos de las ratas Wistar desviacin estndar, en la cual no se presentan diferencias significativas (p>.05), del grupo testigo, ruda, ruda-ginseng, con una n=24, 20 y 15 respectivamente. RUDA-GINSENG

Evaluacin de la doble tincin de hueso y cartlago. El grupo de R. sp y R.sp-P. ginseng obtuvieron resultados similares en comparacin con el grupo control, ya que no se observ malformacin alguna en el desarrollo del hueso y cartlago de los fetos de rata, puesto que la tincin se present de manera homognea en los grupos.

A)

B)

C)

Fig. 4.- CABEZA. En estas imgenes se observan los crneos de los fetos de distintos grupos (A.Control, B.- R. sp y C.- R. sp P. ginseng) en los cuales no se muestra malformacin alguna, dado que se muestra una tincin homognea.

A)

B)

C)

Fig. 5.- DORSO. Lo mismo sucede en la parte dorsal de los fetos (A, B, C) ya que se observa una tincin homognea en la cual no se puede observar dao malformacin alguna.

A)

B)

C)

Fig. 6. PATAS. De igual manera, en las imgenes de la parte inferior de los fetos no se observa dao malformacin alguna, pues, tanto el hueso como el cartlago se aprecian con una total normalidad.

Evaluacin de malformaciones a nivel de rgano. En el anlisis de Wilson modificado por Barrow y Taylor se muestran las malformaciones de los fetos en la piel (fig.5) en los ojos (fig.6) y en la nariz (fig.7) mostrando muy poco efecto antiteratgeno, comparndose entre los diferentes grupos, como se muestra en la tabla 2.

TESTIGO OJOS OIDOS EXTREMIDADES 0 0 0

RUDA 75% 75% 75%

RUDA-GINSENG 71.00% 71% 14.00%

Tabla 2: En esta se muestra el porcentaje de malformaciones presentes en ojos, odos y extremidades de los fetos de ratas Wistar de 21 das tratadas con Agua, Ruda y Ruda-Ginseng.

A)

B)

Fig. 5 Piel. En esta imagen se puede observar el deterioro de la piel y anaftalmia en el feto. En la comparacin del feto control y el feto de ruda-ginseng, se nota claramente el dao en la piel y ojo. El grupo de ruda-ginseng presento un aumento en la frecuencia de hematomas en la piel.

A)

B)

Fig. 6 Ojos. En la imagen se muestra dos distintos grupos A) Control, B) Ginseng-ruda se ve claramente la anaftalmia (ausencia del ojo izquierdo) en el grupo de Ginseng-ruda en comparacin del grupo control que no presento ninguna malformacin en ojos.

A)

B)

Fig. 7 Nariz. En la imagen A) Control, B) Ginseng-ruda se observa las protuberancias que tuvo el grupo de Ginseng-ruda en los orificios de la nariz comparndolo con el grupo control que no tuvieron ningn tipo de estorbo nasal.

Evaluacin de la actividad de catalasa en hgado En la figura 8 se muestra que existe diferencia significativa (p<0.05) entre los grupos, mostrando niveles ms bajos en el grupo de ruda y un incremento significativo en el grupo de ruda y ginseng sin alcanzar los niveles normales.

Fig. 8 Actividad de catalasa en fetos de 21 das de cada grupo. En la figura se muestra el promedio desviacin estndar, con una n=19, 20 y 14 respectivamente.

DISCUSIN Mediante el anlisis realizado a las imgenes que nos muestran la evaluacin de hueso y cartlago de los grupos Testigo, R. sp y R. sp- P. ginseng, se determin que no se present malformacin alguna en los fetos, estas observaciones se lograron gracias al empleo de la tcnica de Doble tincin (Kimmel y Trammel., 1981) ya que permite una completa y detallada observacin de huesos sin necesidad de utilizar otras tcnicas costosas, siendo un mtodo muy til para la deteccin de anomalas esquelticas en animales de laboratorio, sin embargo en los trabajos revisados no se encontr que se llevara acabo el anlisis a nivel seo y cartlago, por lo cual, en el presente trabajo se decidi realizar dicho anlisis, aunque no se encontr evidencia alguna de que R. sp llegara a causar algn dao a este nivel. Se encontr una disminucin significativa en la actividad de catalasa en el grupo tratado con Ruda sp en comparacin del grupo control. Se piensa que esto es provocado por los compuestos oxidantes que posee la ruda basados en los hallazgos de Zeichen et al (1997) quienes encontraron que la Ruta sp cambia el fenotipo de la placenta y las clulas de la membrana endotelial, provocando as la alteracin hemodinmica de la placenta facilitando la generacin y liberacin de sper xidos. Mientras que en el grupo tratado con Ruta sp y P. ginseng mostro niveles intermedios de catalasa, presentando diferencias significativas contra ambos grupos, lo cual coincide con lo propuesto por Lee et al (2009) quien reporta que el mecanismo protector del P. ginseng en anomalas del desarrollo se debe a la expresin de varios genes que codifican para las enzimas antioxidantes. El P. ginseng tiene efectos antioxidantes que protegen a las protenas de los radicales libres. Dicha actividad antioxidante a su vez provee un efecto hepatoprotector, al aumentar la actividad de la peroxidasa glutation heptica, esta intervencin antioxidante del ginseng se ve aumentada por una dbil recaptura de los radicales libres (http://www.cimed.ucr.ac.cr/, 2009). Muchos efectos farmacolgicos de los ginsenosidos aun siguen desconocidos, estudios previos (Lee et al., 1987) mostraron que P. ginseng produca un incremento pequeo pero significativo en el citocromo heptico microsomal P450, este efecto fue dado por un ginsenosido desconocido, debido a que no se encontr estudio alguno sobre la bioqumica del P. ginseng. Por lo que se encuentra la relacin con la enzima P450 y la catalasa en el incremento pequeo pero significativo de su actividad. La gran variedad de ginsenosidos y que an se desconoce su funcin especfica en el organismo ya que tienen un efecto especifico gracias a las hormonas esteroidales que sirven como receptores de cada uno de ellos. Se puede decir que se tuvo un efecto antioxidante en la enzima catalasa pero un desarrollo tardo por un ginsenosido desconocido.

Estudios realizados con el P. ginseng han mostrado un retraso del crecimiento celular de las clulas cancerosas, sirvindoles como un cotratamiento contra el cncer (Benavides et al., 2000). CONCLUSIN La Ruta sp no provoc malformaciones a nivel seo y cartlago en los fetos de rata de la cepa Wistar. El ginseng estimula el sistema antioxidante intrnseco. El ginseng tuvo una ligera disminucin en el efecto teratognico de la Ruta sp. EXPECTATIVAS Probar mayores concentraciones de Panax ginseng para observar si se presenta un mejor efecto antiteratgeno. Realizar estudios sobre los compuestos moleculares de Ruta sp. y Panax Ginseng. Realizar cortes histolgicos para un mejor estudio a nivel celular en ambos tratamientos. Analizar otras enzimas como superoxidodismutasa, dismutasa, glutatin peroxidasa y lipoperoxidacin membranal para comprobar si influyen en la actividad antioxidante del P. ginseng. REFERENCIAS Arenas, P y Savitry, G.P. (1994). La ruda: Ruta chalepensis (L) Rutacea. Dominguenza. 11: 7-25. Assuncao, M; Marques, M; Carvalho, F; Lukoyanov, N; Andrade, J. (2010). Chronic green tea consumption prevents age-related changes in rat hippocampal formation. Neurobiol of aging. Benavides, U.G; Trujillo, G; D`Arraigo, U; Paredes, J; Pino. (2000). Evaluacin toxicolgica preliminar de Ruta graveolens, Origanum vulgare y Persea americana sobre embriones de ratn. Revista Per. Biol. 7(1):86-88. Cipollone, D; Amati, F; Carsetti, R; Placidi, S; Biancolella, M; D'Amati, G;Novelli, G; Siracusa, G; Marino, B. (2008). A multiple retinoic acid antagonist induces conotruncal anomalies, including transposition of the great arteries, in mice. Cardiovasc Pathol 15:194202.

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