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ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DE ANTOCIANINAS EN DIFERENTES VARIEDADES DE MAÍZ (Zea mays) BOLIVIANO Cuevas Montilla E. 1 , Antezana A. 2 y Winterhalter P. 1

1 Institut für Lebensmittelchemie, Technische Universität Braunschweig, Schleinitzstrasse 20, 38106 Braunschweig, Alemania 2 Universidad Mayor San Simón Cochabamba, Sucre a Parque la Torre, Cochabamba, Bolivia

Palabras clave: Antocianinas, Maíz morado, Zea mays, cromatografía en contracorriente, HSCCC

INTRODUCCION

Estudios epidemiológicos efectuados en varios países evidencian que el consumo de frutos y vegetales reducen enfermedades coronarias además de minimizar los riesgos de cáncer Se ha descrito que algunos compuestos fenólicos de origen vegetal presentan dentro de la célula actividad antioxidante, reduciendo la concentración de radicales libres, y en algunos casos logran establecer grupos de quelación con iones metálicos Los mecanismos involucrados de los agentes antioxidantes establecen donación de electrones o átomos de hidrógeno a los radicales libres. Los agentes antioxidantes presentes en alimentos pueden reducir trombosis, activar macrófagos e inhibir la tendencia a la peroxidación [1] Entre los compuestos que han merecido dichos estudios se encuentran las antocianinas, debido a la presencia de sustituyentes -OH, los cuales son moléculas con alto poder antioxidante [2]

La presencia de antocianinas en las variedades pigmentadas del maíz, lo hace un producto potencial para el suministro de colorantes y antioxidantes naturales. Por ello el estudio de los pigmentos del maíz morado (Zea Mais) ha despertado un interés sin precedentes. La diversidad genética del maíz se distribuye en razas. En América se han originado el 90% de todas las razas. Según Goodman y Brown (1988), en América hay 260 razas de las que 132, aproximadamente la mitad, se encuentran en la región andina. Dos factores son la causa de esa gran diversidad: la variación en usos y la gran variación ecológica. La diversidad fenotípica del maíz en la región andina se expresa en una extraordinaria variabilidad en color, tamaño, forma, textura del grano y de la mazorca.[3]

El maíz es un elemento cultural de la misma importancia que el lenguaje, el vestido, la música, la culinaria, las costumbres y otras manifestaciones culturales. La vigencia de las razas de maíz es universal. Las razas se mantienen en el tiempo. Hay muchas evidencias de que las razas de maíz son más perennes que otras manifestaciones culturales. Se mantienen porque constituyen un fuerte elemento cultural. Si desaparecen las culturas desaparecen también las razas de maíz.

En Bolivia el maíz es uno de los cultivos más importantes constituyendo uno de los alimentos básicos de la población. Uno de los objetivos es lograr que en EEUU y en la UE también se produzcan alimentos a base de maíz pigmentado. La idea es "generalizar" el consumo, minoritario en la mayoría de países, excepto zonas de México Actualmente el desarrollo de la tecnología en este país centroamericano ha permitido explotar el maíz como una materia prima de gran importancia para la industria, tanto en lo básico como en la complementaria.

OBJETIVOS

Bolivia es uno de los centros de diversificación del género Zea y la producción y consumo del maíz morado es importante, pero se ha estudiado poco las antocianinas en variedades bolivianas. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar la composición y perfil de antocianinas en variedades de maíz morado cultivadas en Bolivia.

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El objetivo principal es como mencionamos anteriormente buscar las vías de explotar el maíz como una materia prima para la industria a largo plazo. Debido a ello se abre una gran posibilidad de emplear maíces pigmentados para la extracción industrial de sus pigmentos, debido a que por los volúmenes de producción y por la naturaleza de los mismos, es factible desarrollar una industria competitiva, orientada a satisfacer una de las grandes necesidades, de alimentación, cosméticos y salud, al producir pigmentos del tipo de las antocianinas con una alta capacidad biológica. Por lo que es necesario realizar estudios como el presente, para poder lograr la extracción, purificación, estabilización y conocimiento químico de estos componentes de naturaleza pigmentada en el maíz

ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS SISTEMA ANTIOXIDANTE

Como respuesta a la permanente producción de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) que dañan estructuras biológicas, el organismo atenúa estos efectos deletéreos por medio de la acción de sistemas antioxidantes. Los antioxidantes son sustancias que se encuentran en pequeñas concentraciones en comparación a un sustrato oxidable, que retrasa o inhibe significativamente la oxidación del sustrato, y también estabiliza las EROS mediante la cesión de un H + y las convierte en compuestos no radicalarios. Otras definiciones hablan de antioxidante como cualquier sustancia que, al estar presente en bajas concentraciones comparada a las de un sustrato oxidable, previene o retarda la oxidación de dicho sustrato y que protege a los sistemas biológicos frente a efectos potencialmente perjudiciales tanto de procesos como reacciones que causan excesivas oxidaciones [4].

Existen diferentes sistemas de defensa antioxidante en el organismo. Uno de ellos está conformado por sistemas enzimáticos como la superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa, siendo éstas la primera defensa contra los radicales libres que actúan neutralizando a estas especies altamente reactivas en moléculas menos dañinas para la célula. Otros sistemas, no enzimáticos, están conformados por compuestos como caroteniodes, glutatión reducido y las vitaminas C y E que estabilizan las EROs o también que provocan la quelación de iones metálicos de elementos de transición como hierro y cobre, que al estar en estado reducido potencian su autoxidación y generación de anión superóxido[5].

Los antioxidantes aportados por la dieta disminuyen los efectos de las EROs. Son variados los alimentos que están constituidos por estas sustancias y cada vez más utilizados por las personas tanto por medio del consumo directo de vegetales y frutas que los incluyen, como también por medio del uso de fármacos. Entre los antioxidantes ingeridos por la dieta se destacan las vitaminas E y C, los betacarotenos, procianidinas y polifenoles.

POLIFENOLES

Compuestos orgánicos que estructuralmente presentan un grupo -OH unido a un anillo aromático, se conocen como compuestos fenólicos y aquellos en que se repite este radical son conocidos como polifenoles. Los compuestos de esta familia presentan variados efectos beneficiosos para la salud: prevención contra cáncer, propiedades antiinflamatorias, antialérgicas, antitumorales, antimicrobianas, vasorelajantes y antioxidantes. Entre sus acciones antioxidantes encontramos la inhibición de la formación de EROs por medio de la inhibición de enzimas productoras de EROs como la xantino oxidasa, o la quelación de los elementos traza involucrados en la producción de los mismos; el atrapamiento directo de EROs y el up-regulation de los sistemas antioxidantes endógenos [6].

Los polifenoles estabilizan las EROs al capturarlas formando el radical aroxilo (FI-O · ), para luego reaccionar con un segundo radical, con lo cual adquieren una estructura quinona estable [6].

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Los polifenoles más estudiados actualmente son los provenientes del extracto seco estandarizado de Vitis vinifera que contienen antocianinas, procianidinas y proantocianidinas, entre otros, los cuales son sustancias bioactivas. Estos actúan atrapando los radicales libres para luego tranformarlo en especies no radicalarias, por inhibición de la acción enzimática de elastasa e hialuronidasa. Estudios clínicos demuestran que el uso terapéutico de los polifenoles provenientes de la Vitis vinifera, reducen la incidencia de enfermedades cardiovasculares; disminuye el riesgo de insuficiencia cardiaca; alivio de síntomas en pacientes con insuficiencia venosa.

Dentro de este grupo encontramos a las antocianinas, que se diferencian de otros polifenoles por poseer azúcares dentro de sus grupos funcionales y, en su mayoría, presentar varios grupos –OH. Las diferencias individuales entre los antocianinas dependen del número de grupos hidroxilo, la naturaleza y número de azúcares que están unidos a la molécula, a la posición de esa unión y la naturaleza y número de ácidos aromáticos unidos al azúcar en la molécula [2].

ANTOCIANINAS

Las antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul), son el grupo más importante de

pigmentos solubles al agua visibles para el ojo humano[7]. Las antocianinas forman parte de

la familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenólicos. Los colores rosa, rojo,

azul, malva y violeta de las flores, frutas y verduras se deben a la presencia de estos

pigmentos[8].

Las antocianinas se localizan principalmente en la piel de frutas como manzanas, peras, uvas, zarzamoras, ciruelas, de flores como la jamaica, rosas y verduras como col morada y maíz morado. La función que cumplen es la de atraer seres vivos (principalmente insectos y pájaros) para propósitos de polinización y dispersión de semillas. La diferencia de color entre las frutas, flores y verduras depende de la naturaleza y concentración de antocianinas. Existen factores adicionales que afectan el color como el pH de la célula, el efecto de copigmentación determinado por la presencia de otros flavonoides, temperatura, luz, etc.[9]

Las antocianinas, al igual que otras sustancias polifenólicas, se encuentran en la naturaleza en forma de glicósidos, siendo conocidas sus agliconas como antocianidinas, a las cuales se les une un azúcar por medio de un enlace ß-glicosídico. Se trata de flavonoides, es decir, sustancias derivadas del núcleo flavano, con un anillo-A benzoil y un anillo-B hidroxicinamoil.

La estructura de la antocianina es el 2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio. Cuando el residuo de azúcar es un hidrolizado de la antocianina, el resultado es la aglicona, conocida como se menciona anteriormente como antocianidina. Las más comunes formas de antocianidinas son: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, malvidina y petunidina En la Figura 1 se muestran los diferentes tipos de antocianinas.

Las clases comunes de glucósidos son: 3-monósido, 3-biósido y 3-triósido, así como

también 3,5-diglicósido y más raramente el 3,7-diglicósido con glucosa, galactosa, arabinosa (es uno de los más frecuentes) y xilosa. Las antocianinas poseen uniones de azúcar en el anillo-B 3´ y 5´-hidroxilos. Los dos tipos más importantes de glucósidos son: el 3-monósidos

y el 3-4-diglicósido. Como regla el 3-hidroxil siempre tiene un azúcar, exceptuando 3- desoxipelargonidina, 3-desoxicianidina y 3-desoxidelfina [10].

Además de la glucosilación, la introducción de moléculas aciladas es un efecto que ocurre ampliamente. Los grupos comunes de acilo son los ácidos aromáticos de los cuales los más comúnmente encontrados son ácidos hidroxicinámicos: p-coumárico, cafeico y ferúlico, y más raramente el hidroxibenzoico. El color particular de cada antocianina depende del

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número y orientación de los grupos hidroxilos y metoxilos. Un incremento en la hidroxilación produce un color azul, mientras un incremento en la metoxilación produce un color rojo.

un incremento en la metoxilación produce un color rojo. Figura 1. Estructura y sustituyentes de las

Figura 1. Estructura y sustituyentes de las antocianinas (Rodríguez- Saona y Wrolstad, 2001)[11]

Aglicona

R

1

R

2

Petunidina

OH

OCH 3

Malvidina

OCH 3

OCH 3

Pelargonidina

H

H

Delfinidina

OH

OH

Cianidina

OH

H

Peonidina

OCH 3

H

Todas las antocianinas son derivadas del catión flavilo básico. Se conocen más de 100, las diferencias entre ellas se debe al número de grupos hidróxilos, el grado de metoxilación de éstos grupos, así como la naturaleza y el número de los ácidos aromáticos y alifáticos presentes en la molécula. De todas las antocianinas existentes, sólo seis son de interés enlos alimentos: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina y malvidina (Figura 1). Los restantes son menos frecuentes y se encuentran en algunas hojas [9].

Es común que una misma antocianidina interaccione con más de una clase de carbohidrato para formar diferentes antocianinas; la pelargodina es la que produce el color rojo escarlata de algunas flores y de las fresas; la delfinidina se encuentra en las berenjenas y la cianidina en col roja, higos, cerezas, ciruelas, y otros frutos.

BIOSINTESIS DE LAS ANTOCIANINAS

Las antocianinas se sintetizan a partir de la condensación de dos moléculas precursoras (Figura 2): malonil Co A y p-cumaril-CoA, las que más tarde formarán anillos A y B respectivamente.

Las antocianinas son sintetizadas por varias rutas. Sobresalen dos, la del ácido shikímico y la del ácido malónico. En la ruta del ácido shikímico se convierten carbohidratos simples derivados de la glicólisis, de la ruta de las pentosas fosfato y ciclo de Calvin en diversos ácidos orgánicos como el cinámico, p-coumárico, cafeico, ferúlico, clorogénico y fenilalanina

Cabe resaltar que esta ruta sintética también es compartida por otros compuestos fenólicos. La principal reacción de biosíntesis de los flavonoides es la condensación de los acilos provenientes de cumaril-CoA y tres moléculas de malonil-CoA catalizada por la enzima chalcona isomerasa que lleva a cabo la isomerización de chalcona a flavona, misma que es convertida en flavones o antocianinas. Los pasos finales en la síntesis de antocianinas son las acilaciones y las glicosilaciones, primero en el C-3, para estabilizar el catión flavilio

[9].

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Phosphoenolpyruvat + Erythrose-Phosphat OH HOOC OH Shikimisäure OH HO COOH HO COOH OH Phenylalanin NH
Phosphoenolpyruvat + Erythrose-Phosphat
OH
HOOC
OH
Shikimisäure
OH
HO
COOH
HO
COOH
OH
Phenylalanin
NH 2
Gallussäure
COOH
HO
COOH
HO
COOH
Zimtsäure
HO
HO
Ferularsäure
Kaffeesäure
COOH
p-Cumarsäure
HO
p-Cumarsäure-CoA
Acetyl-CoA
MalonylCoA
OH
HO
OH
Chalcon
OH
O
OH
OH
HO
O
HO
O
HO
O
Flavanon
OH
OH
O
OH
O
OH
O
OH
Isoflavon
Flavanonol
OH
OH
HO
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
+
Flavon
HO
O
HO
O
Flavan-3-ol
OH
OH
OH
O
OH
Flavonol
Anthocyanidin
Figura 2. Biosíntesis de Polifenoles (MACHEIX, FLEURIET und BILLOT, 1990)[12]

FACTORES QUE ALTERAN LA ESTABILIDAD DE LA ANTOCIANINA

La estabilidad de las antocianinas depende de factores como enzimas, pH, temperatura, oxígeno, luz, metales, etc. Investigaciones recientes demostraron que existen antocianinas con ciertas características, presentando una mayor estabilidad debido al desarrollo de ciertos mecanismos:

1. asociación intramolecular: acilación

2. asociación intermolecular: copigmentación

3. interacciones con otros compuestos

4. polimerización [8].

EFECTO DEL PH

Este es uno de los factores más importantes. Las antocianinas son más estables en un medio ácido que en un medio neutro o alcalino. En medio ácido la forma predominante es la del ión flavilio, el cual da el color rojo, cuando esta es sometida a pH básico o alcalino, el ión flavilio es susceptible al ataque nucleofílico por parte del agua, produciéndose la pseudobase carbinol, esto es a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras.[13]

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Conociendo esto, las antocianinas tienen su máxima expresión de color a pH ácidos (pH1), y su forma incolora se produce a pH neutros o alcalinos, debido a esta característica se utilizan a las antocianinas a pH ácido o ligeramente neutro en la industria alimenticia. En la Figura 3 se muestra el comportamiento de la antocianina a diferentes pH’s.

R R 1 1 3' OH 3' OH 4' 4' OH + HO O 5'
R
R
1
1
3'
OH
3'
OH
4'
4'
OH
+
HO
O
5'
HO
- OH
O
5'
R
7 R
7
2
2
3
3
H +
5 OR
5 OR
OH
OH
Catión flavilio, rojo
Pseudobase carbinol, incolora
+
- OH
H
+
- OH
H
R
R
1
1
3'
3'
OH
OH
4'
4'
HO
O
+
HO
O
5'
HO
- OH
5'
7 R
7 R
2
2
3
3
H +
5 OR
5 OR
OH
OH
Base quinoidal, azul
Chalcona, amarilla

Figura 3. Estructura de las antocianinas en función al pH

TEMPERATURA

La antocianina es destruida por el calor durante el procesamiento y almacenamiento. Un

incremento logarítmico en la destrucción de la antocianina ocurre con un incremento en la temperatura. Timberlake (1986) observó que el equilibrio entre las estructuras es endotérmico, en una dirección de izquierda a derecha:

Base quinoidal Cation flavilio Pseudobase carbinol Chalcona.

A altas temperaturas el equilibrio cambia hacia chalconas. El retorno de chalconas a

flavilio es lento.[14]

COPIGMENTACIÓN

La copigmentación es la interacción electrónica planar en los grupos cromóforo de las antocianinas. Los cambios producidos por el copigmento en la región visible del espectro del pigmento es correlacionada con la transformación de la antocianina en agua, estas formas se producen por el ataque nucleofílico del agua.

El ión flavilio es casi planar y muestra una deslocalización electrónica, que se extiende

por todo el grupo cromóforo, mientras que la forma hemiacetal tiene dos anillos aromáticos sin conjugar y un anillo central en cual no es planar, por que tiene un carbono tetrahédrico, por lo tanto el ión flavilio es la única especie capaz de copigmentar, por su forma planar. La copigmentación provoca un efecto hipercrómico. Debido a la baja estabilidad de la copigmentación, se requiere de grandes concentraciones de copigmentos[15].

La debilidad de la copigmentación es esencialmente de origen entrópico. De hecho, experimentos de variación de la temperatura en sistemas diferentes pigmento-copigmento, se encontró un cambio de entropía negativa por el equilibrio de la copigmentación. El pigmento y copigmento en su estado inicial son especies independientes, durante su asociación es

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sostenida fuertemente el complejo formado con una reducción simultánea de los grados de libertad, todo este proceso tiende a una oposición de copigmentación. La copigmentación es usual en la naturaleza y contribuye a la profusión de colores en las flores y algunos tejidos. Abe et al (1977) propusieron el término "copigmentación intermolecular" para la asociación débil de antocianinas con compuestos, modificando así el color y la estabilidad del complejo formado; y "copigmentación intramolecular para el enlace fuerte que forman grupos de ácidos orgánicos con las antocianinas [16].

La copigmentación intermolecular de antocianinas con otros flavonoides produce un incremento en la absorbancia a una longitud de onda visible (efecto hipercrómico), así como un desplazamiento a longitudes de onda mayores del máximo de absorbancia (efecto batocrómico); la copigmentación intramolecular es la responsable por la estabilidad del color de antocianinas que poseen dos o más grupos acilos aromáticos. El color se intensifica al incrementar el contenido de ácidos orgánicos como el cinámico y malónico[8]

EFECTOS POSITIVOS DE LAS ANTOCIANINAS SOBRE LA SALUD

Las antocianinas poseen conocidas propiedades farmacológicas utilizadas para la terapia de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones realizadas con extractos de Vitis vinifera ricos en antocianinas, han mostrado que disminuyen la fragilidad y permeabilidad capilar; también efectos antiinflamatorios y actividad antiedema. Además tienen la propiedad de proteger los vasos sanguíneos del daño ocasionado por los altos niveles de azúcar en la

diabetes.[17]

Las antocianinas protegen de muchas maneras. Primero, neutralizan las enzimas que destruyen el tejido conectivo. Segundo, su capacidad antioxidativa previene los oxidantes del tejido conectivo dañado. Finalmente, reparan proteínas dañadas en las paredes de los vasos sanguíneos.

Experimentos en animales han demostrado que la suplementación con antocianinas previenen efectivamente la inflamación y el subsecuente daño a vasos sanguíneos. Esta habilidad antiinflamatoria de las antocianinas también ayuda contra las reacciones alérgicas. Por otro lado se ha observado que su potencial antioxidante va en contra de radicales superóxidos y peróxidos de hidrógeno a través de numerosos mecanismos, por ejemplo: la cianidina: Protege la membrana celular de lípidos de la oxidación por una variedad de sustancias peligrosas. La cianidina es un antioxidante 4 veces más fuerte que la vitamina E. La pelargonidina protege el radical amino de la tirosina del peroxinitrilo, un antioxidante altamente reactivo. Por otro lado, la delfinidina interfiere con el radical hidroxil, uno de los oxidantes del cuerpo humano[18].

La capacidad antioxidante se relaciona con el número de grupos –OH que presenten y el lugar de la sustitución.Cuando se ingieren, las antocianinas son destruidas en parte por la flora intestinal y las que son absorbidas se eliminan por la orina y la bilis, con previas transformaciones

Gracias a esta capacidad antioxidante, las antocianinas son catalogadas como agentes nutracéuticos. Varios trabajos reportan sus efectos benéficos al prevenir la proliferación de células cancerígenas, protección contra enfermedades del corazón y prevención del daño a lípidos de alimentos.

Debido al interés de la sustitución de los colorantes sintéticos por su posible toxicidad, se han buscado nuevas fuentes de colores naturales, como las antocianinas presentes en los maíces pigmentados

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MAÍZ MORADO (Zea Mays) COMO FUENTE DE ANTOCIANINAS

Zea mays es una gramínea anual originaria de las Américas introducida en Europa en el siglo XVI. Actualmente, es el cereal con mayor volumen de producción en el mundo, superando al trigo y el arroz. En la mayoría de los países de América, el maíz constituye la base histórica de la alimentación regional y uno de los aspectos centrales de la cultura mesoamericana. El uso principal del maíz es alimentario. Puede cocinarse entero, desgranado (como ingrediente de ensaladas, sopas y otras comidas). La harina de maíz (polenta) puede cocinarse sola o emplearse como ingrediente de otras recetas. El aceite de maíz es uno de los más económicos y es muy usado para freir alimentos[19]

El maíz morado es una variedad de maíz que posee la coronta y los granos de color morado y es originario del altiplano andino (Bolivia y Perú). Contiene diferentes tipos de Antocianinas, siendo la cianidina-3- ß-glucósido, su pigmento mayoritario el cual es un importante antioxidante. Figura 4 nos muestra la gran variedad de coloraciones del maíz morado

muestra la gran variedad de coloraciones del maíz morado Figura 4. Maiz morado También el extracto

Figura 4. Maiz morado

También el extracto de maíz morado puede ser usado en productos ácidos (p. ej. bevidas, jugos) donde se desee un color rojo. A un colorante extraído a partir del de maíz morado se le clasifica con el número E-163 (EEC). Además del pigmento principal cianidina- 3-glucósido, se han encontrado en variedades de maíz morado: pelargonidina - 3- glucósido, peonidina-3-glucósido, cianidina-3-maloilglucósido, pelargonidina-3-malonilglucósido, y peonidina-3 - malonilglucósido) en extractos comerciales de maíz morado [20] y granos del mismo [21]. Además, cianidina - 3-dimalonilglucósido como compuesto minoritario en algunas variedades.

Las Antocianinas del maíz morado son más estables que la Enocianina de la uva, a la luz, al calor y principalmente a los cambios de pH. Las Antocianinas del maíz Morado a un pH entre 3 y 3.5 permanecen de un color rojo amarillento, mientras que la Enocianina se torna azulada en esa condición.

LA CROMATOGRAFÍA CONTRACORRIENTE (CCC)

La cromatografía a contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografía líquido-líquido, donde tanto la fase estacionaria como a fase móbil son líquidas.La cromatografía contracorriente es la técnica cromatográfica de separar solutos por sus diferentes coeficientes de distribución en dos solventes inmiscibles.

Desde su nacimiento hace casi 60 años la tecnología se ha desarrollado cada vez más. Mediante la eliminación de soportes sólidos, se evita la adsorción permanente de la sustancia

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analizada en la columna, y se puede recuperar casi el 100 %. El instrumento también es de fácil conmutación entre los distintos modos de funcionamiento con sólo cambiar los disolventes. Con la cromatografía líquido-líquido, los investigadores no están limitados por la composición de las columnas disponibles en el comercio para su aparato. Casi cualquier par de soluciones inmiscibles pueden ser utilizados en cromatografía líquido-líquido, y la mayoría de los aparatos se pueden manejar en el modo estándar o en fase inversa. Los costes del disolvente también son generalmente más baratos que para HPLC, y el costo de los adsorbentes sólidos se elimina por completo. Otra de las ventajas es que los experimentos realizados en el laboratorio puede ser llevadas fácilmente a escala industrial. La CCC se puede concebir como un proceso en tres etapas: la mezcla, la estabilización, y la separación (aunque a menudo se produce de forma continua). La mezcla de las fases es necesaria para que la superficie de la interfase entre ellos tenga un gran tamaño, y se pueda mover el analito entre las fases de acuerdo a su coeficiente. Un coeficiente de partición es la relación de la cantidad de analito encontrada en cada uno de los disolventes en equilibrio, y está relacionado con la afinidad del analito por uno de los disolventes sobre los otros. La fase móvil se mezcla con la fase estacionaria a lo largo de toda la columna. El grado de retención de la fase estacionaria (inversamente proporcional a la cantidad de fase estacionaria perdida o "sangrada" en el curso de una separación) es un parámetro crucial. Los instrumentos de mayor calidad tienen una gran retención de la fase estacionaria. El tiempo de estabilización es una propiedad del sistema de disolvente y la matriz de la muestra, teniendo ambas una gran influencia en la retención de la fase estacionaria.

A partir de los 80, el Dr Yoichiro Ito con su desarrollo de la centrífuga planetaria inició la era de la High Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) a la que pertenecen la mayor parte de equipos que se fabrican hoy

Bomba Detector Coil
Bomba
Detector
Coil

Inyector

Disolución

Fraccionador

día.[22]

Figura 5. Esquema de un equipo de HSCCC según SUTHERLAND (1987)[23]

Ventajas de La Cromatografía Contracorriente de Alta Velocidad (HSCCC)

Gran capacidad de carga, hasta el 10% del volumen de la columna, rango amplio:

desde miligramos hasta decenas de gramos en el mismo equipo

Adsorción no irreversible, se recupera el 100% del analito. Tanto la fase estacionaria como la fase móvil son líquidos, por lo que la muestra puede recuperarse sin ningún tipo de pérdida. (No hay problemas de adsorción o cambios catalíticos)

Se usa menos solvente (10-25%) que en los procesos equivalentes de HPLC

Puede trabajar con extractos brutos que contienen partículas

Reproducible: el perfil de la elución está sólo en función de la relación entre la tasa de distribución y el volumen de la fase estacionaria

Puede ser usada como un proceso cromatográfico o de extracción

Puede ser usada en Fase Inversa o Fase Normal, o intercambiarlas durante el proceso

Ideal para la automatización

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MATERIALES Y MÉTODOS Maíces utilizados en el estudio

Se utilizaron seis muestras de grano pigmentado colectadas en cuatro diferentes departamentos de Bolivia. La información sobre sitios y clave de colecta, color de grano, y la ubicación del pigmento en el mismo, se presenta en la tabla 1.

Tabla 1. Descriptores de los maices analizados

Denominación Proveniencia Clave Color/Ubicación (Departamento) Ayzuma (1) Chuquisaca BO2M - 903
Denominación
Proveniencia
Clave
Color/Ubicación
(Departamento)
Ayzuma
(1)
Chuquisaca
BO2M - 903
Púrpura/aleurona
Tuimuru
(2)
Cochabamba
BO2M -1876
Púrpura/aleurona
Huaca Songo
(3)
Cochabamba
BO2M -1540
Rojo/pericarpio
Checchi
(4)
Cochabamba
BO2M -1844
Púrpura, moteado/aleurona
Oke
(5)
Potosí
BO2M-1433
Púrpura/aleurona
Kulli
(6)
Cochabamba
BO2M-1866
Negro/pericarpio, tusa =
morada

MÉTODO DE AISLAMIENTO DE ANTOCIANINAS A PARTIR DE MAÍZ MORADO EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

Las muestras analizadas en este trabajo, corresponden a los concentrados obtenidos apartir de las diferentes variedades de maíz arriba mencionados. Estas muestras fueron facilitadas por el Dr. Gonzalo Ávila desde el Centro de Investigaciones Ficoecogenéticas de Pairumani, Fundación Simón I. Patiño, Cochabamba, Bolivia La Figura 6 nos muestra un esquema del proceso de extracción, caracterización y purificación de las antocianinas del maíz morado

Maíz molido 1) Extracción con MeOH:ácido acético 19:1 2) Rotaevaporación, liofilización Extracto crudo 1) 2)
Maíz molido
1)
Extracción con MeOH:ácido acético
19:1
2)
Rotaevaporación, liofilización
Extracto crudo
1)
2)
3)
Adsorción en amberlita XAD-7
Lavado con agua
Elución con MeOH/Ác. acético
19:1
4)
Rotaevaporación
5)
Liofilización
LC-MS/MS
Extracto XAD-7
HPLC-DAD
Fraccionamiento con HSCCC
LC-MS/MS
Fracciones
Control de pureza con HPLC
Mezcla de
substancias
Purificación por medio de HPLC
preparativa
Substancia pura
Figura 6. Esquema de extracción y procedimiento de purificación de las antocianinas

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Aproximadamente 100 g de grano entero de cada variedad fueron molidos con un procesador de alimentos doméstico, desengrasados 2 a 3 veces con n-hexano con agitación por aprox. 5 horas, posteriormente secado a temperatura ambiente por 12 horas y finalmente extraídos con una mezcla de metanol:ácido acético: (19:1 v/v), a temperatura ambiente y con agitación, durante 24 h cada una. El extracto así obtenido fue rotaevaporado, congelado a - 24°C y liofilizado en un tiempo aproximado de 48 horas.

Una vez redisuelto en agua, se aplicó a una columna de Amberlita XAD-7 (Sigma- Aldrich, St Louis, MO), utilizando como disolvente de lavado agua, y como eluyente metanol:ácido acético: (19:1 v/v) y finalmente rota evaporado y liofilizado nuevamente.

Separación del extracto XAD 7 por medio de cromatografía a contracorriente de alta velocidad (HSCCC)

El extracto XAD 7 obtenido fue fraccionado con al ayuda de un equipo de HSCCC. La pureza e identidad de las fracciones así obtenidas fueron controladas por HPLC-DAD y Cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) sucesivamente. Las muestras antes de inyectarse se filtraron a través de un acrodisco de 0.45 m (Millipore, Bedford, MA), inyectando un volumen de 20mL. Se usó como sitema de solventes: éter terbutilmetílico/n-butanol/acetonitrilo/agua 2:2:1:5, acidificado con 0,1% de ácido trifluoroacético. La velocidad de flujo fue 4,0 mL min 1 . La detección de las antocianinas se realizó a 520 nm y el modo de elución utilizado fue "Head to tail" (fase liviana = menos densa como fase estacionaria)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IDENTIFICACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS

Se identificaron dos antocianinas mayoritarias en todas las variedades de maíz morado estudiadas, independientemente de su origen: cianidina-3-glucósido (42,5%), y cianidina-3- (6"malonil)-glucósido (30,7%).

Los tiempos de retención de las antocianinas mayoritarias fueron 24,01 y 33,56 min, respectivamente, valores que coinciden con los estándares utilizados para su identificación (Figura 8). Los resultados concuerdan con los reportados por Fossen et al. (2001)[24], quienes encontraron las mismas antocianinas en flores y hojas de maíz morado y señalan, al igual que De Pascual-Teresa et al. (2002)[21] y Schwarz et al. (2003)[25], a la cianidina-3-glucósido como la antocianina mayoritaria en maíz morado, seguida por la cianidina-3-(6"malonil)- glucósido.

Se pudo observar que existen diferencias en el perfil de antocianinas minoritarias entre especies de maíz; que si bien son mínimas como lo demuestra la Figura 7, ocasionan una diferencia enorme en el color y pigmentación de las diferentes variedades de maíz morado. Esta variación se define en colores que van desde el rojo, pasando por el morado (completo o moteado) hasta el casi negro en el caso del Kulli.

La siguiente Tabla Nr.2 nos presenta de manera resumida identificación y características espectroscópicas de las antocianinas minoritarias de las diferentes variedades de de Maíz morado analizadas en nuestro estudio. Una comparación directa entre las 6 variedades estudiadas la podemos apreciar gráficamente en la Figura 7, en la cual observamos tanto la similitud en el perfil antociánico (Antocianinas mayoritarias) como las diferencias en el perfil de las menores (La enumeración va de acuerdo con Tabla 1)

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Tabla 2. Identificación y características espectroscópicas de las antocianinas minoritarias

Variedad Antocianinas (minor) tR [M]+ MS/MS (min) (m/z) (m/z) Ayzuma peonidina-3-glucósido 31.78 463 301
Variedad
Antocianinas (minor)
tR
[M]+
MS/MS
(min)
(m/z)
(m/z)
Ayzuma
peonidina-3-glucósido
31.78
463
301
pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido
36,99
519
271, 433
Tuimuru
pelargonidina-3-glucósido
26,63
433
271
Aún no caracterizado
30.51
535
287
Huaca Songo
pelargonidina-3-glucósido
26,63
433
271
peonidina-3-glucósido
31.78
463
301
pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido
36,99
519
271, 433
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido
38,81
549
301, 463
Checchi
Aún no caracterizado
36,06
635
475, 306
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido
38,81
549
301, 463
Oke
pelargonidina-3-glucósido
26,63
433
271
Aún no caracterizado
30.51
535
287
peonidina-3-glucósido
31.78
463
301
pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido
36,99
519
271, 433
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido
38,81
549
301, 463
Kulli
Aún no caracterizado
30.51
535
287
peonidina-3-glucósido
31.78
463
301
pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido
36.99
519
271, 433
cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucósido
37,82
621
287, 449
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido
38,81
549
301, 463
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido 38,81 549 301, 463 Figura 7. Cromatograma de HPLC comparativo de las variedades

Figura 7. Cromatograma de HPLC comparativo de las variedades estudiadas

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Las antocianinas en las semillas de maíz morado de las variedades analizadas, son de tipo simple y no aciladas, ya que su estructura está conformada por el grupo cromóforo y únicamente un azúcar, que es la glucosa . Esta estructura química minimiza pues su uso potencial como colorantes naturales para alimentos, ya que son menos estables a cambios de pH que las aciladas; sin embargo, poseen una actividad antioxidante sobresaliente, por lo que las antocianinas del maíz morado pueden considerarse valiosas como agentes antioxidantes

[25]

Para una mejor caracterización y elucidación espectroscópica de las antocianinas extraídas, sobretodo de aquellas minoritarias, se hace necesario el aislamiento y purificación de más cantidades de extracto y es pecisamente aquí donde se despliegan todas las ventajas de la cromatográfia contracorriente , que nos permite llegar de manera fácil, rápida y eficiente a tal objetivo. A continuación se describen los resultados de la separación HSCCC ejemplarmente en el Maíz variedad Kulli.

FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO XAD 7 DE MAÍZ KULLI POR MEDIO DE HSCCC

Para la separación se utilizaron 500 mg del extracto XAD 7. Las separaciones se realizaron por cromatografía en contracorriente a alta velocidad HSCCC y el equipo utilizado para tal operación fue un modelo CCC-1000. La Figura 8 nos muestra el cromatograma HSCCC a una longitud de onda de 520 nm.

Se obtuvo un total de 4 Fracciones

más la fracción residuo llamada coil, que fueron separadas con ayuda de cromatografía de capa fina. El control de la identidad y pureza de las fracciones separadas fueron monitoreadas con ayuda de HPLC-DAD y Cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) sucesivamente. HSCCC Fr. 1 (llamada fracción de ruptura) está

compuesta mayoritariamente por pigmentos poliméricos, Fracción 2 contiene un pigmento identificado tentativamente como un dimero de

4 1 2 3 Absorbance [520nm]
4
1 2
3
Absorbance [520nm]

70

140

210

280

350

Time [min]

flavanol y cianidina-3,5-diglucósido,

Figura 8. Cromatograma HSCCC de Maíz Kulli 520 nm

llamado (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucósido y que ya ha sido identificada en anteriores estudios en un polvo colorante a base de maíz morado[26]. Una purificación sucesiva y análisis con Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se encuentran en curso. Fracción 3 contiene mayormente copigmentos y ningúna antocianina. La fracción 4 contiene el compuesto mayoritario de la variedad, cianidina-3-glucósido, con una pureza de 80% y el compuesto minoritario con un ión molecular [M]+ (m/z) de 477 y una fragmentación del ión molecular de MS/MS 287, lo que nos señala que se trata de un derivado de la cianidina Una purificación sucesiva y análisis con Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se encuentran igualmente en curso. Finalmente en la fracción Coil se enriquecieron entre otros, el segundo pigmento mayoritario cianidina-3-(6"malonil)-glucósido con una pureza de 60% y el resto es una fracción mezclada que contiene pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido, peonidina-3-(6"malonil)-glucósido y la antocianina no acilada peonidina-3-glucósido como componentes minoritarios. A continuación nos resumen Figura 9 y Tabla 3 las características

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cromatográficas y espectrometricás de las antocianinas aisladas y caracterizadas a partir de la variedad de maíz morado denominada Kulli

1 4 a 2 3 7 5 6
1 4
a
2 3
7
5 6

Figura 5. Cromatograma HPLC- DAD del extracto XAD 7 de maíz Kulli a 520 nm

Tabla 3. Identificación y características espectroscópicas de las antocianinas de Maíz morado variedad Kulli

pico a

compuesto

tR

Área

[M]+

MS/MS

 

(min)

(%)

(m/z)

(m/z)

1

cianidina-3-glucósido (mayor)

23.98

42,5

449

287

2

Aún no caracterizado

30.51

2,5

535

287

3

peonidina-3-glucósido

31.78

1,8

463

301

4

cianidina-3-(6"malonil)-glucósido (mayor)

33.57

30,7

535

287, 449

5

pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido

36.99

1,9

519

271, 433

6

cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucósido

37,82

2.6

621

287, 449

7

peonidina-3-(6"malonil)-glucósido

38,81

3,1

549

301, 463

a

(epi)catequina- cianidina-3,5-diglucósido

6,67

10,8

899

306, 449

a enumerado de acuedo con Figura 8

Una purificación sucesiva de las fracciones obtenidas con HSCCC y análisis con Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de las mismas, así como también estudios preliminares sobre la capacidad antioxidante de los diferentes extractos y sustancias purificadas se encuentran actualmente en curso

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CONCLUSIONES

La composición de antocianinas presente en los maíces

originarios de Bolivia es muy

similar a la que presentan algunos mesoamericanos ya descritos en estudios anteriores.

Las antocianinas mayoritarias identificadas en los granos de maíz de las variedades estudiadas fueron la cianidina-3-glucósido y la cianidina-3-(6"malonil)-glucósido respectivamente

Las técnicas de cromatografía en contracorriente y HPLC son herramientas primordiales para la extracción y caracterización de las antocianinas, ya que permiten una purificación y separación a gran escala para la ejecución de estudios y análisis posteriores (por ejemplo

además de que permiten enriquecer y

concentrar componentes minoritarios para su completa elucidación. Por la naturaleza química de las antocianinas identificadas en las variedades de maíz morado estudiados, su uso potencial sería como fuente de antioxidantes, más que como colorantes naturales.

TEAC, DPPH, estudios de biodisponibilidad etc

);

EQUIPOS Y PARÁMETROS

1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

a) analítica

Bomba:

Jasco PU-980 Intelligent HPLC Pump

Detector:

Jasco MD-910 Multiwavelength Detector

Inyector:

Rheodyne 7125 con inyector de muestra de 20 µL

Degasificador: Jasco DG-980-50 3-Line Degaser

Software:

Borwin-PDA Versión 1.0

Columnas:

Luna 5 C18 (2), 250 × 4,6 mm (Phenomex, Aschaffenburg)

Synergi (250 x 4,6 mm, 5 µm), Phenomenex)

b) preparativa

Bomba:

Knauer HPLC-Pump K-1001

Detector:

Knauer K-2600 Variable Wavelength Monitor

Inyector:

Knauer K-55960 con inyector de muestra de 200 µL

Software:

Eurochrom 2000 para Windows V.2.05

Columna:

Luna 5 C18 (2), 250 × 10 mm (Phenomex, Aschaffenburg)

2. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (LC-MS)

Equipo:

Esquire-LC, Bruker Daltonics (Bremen); LC-ESI-MS/MS con Ion Trap Mass Spectrometry

Software:

HP ChemStation con EsquireControl, Análisis

Bomba:

HP Series 1100 HPLC Pump G1312A BinPump

Detector:

Merck Hitachi L-4000 UV Detector

Registrador:

Shimadzu C-R6A Chromatopac

Inyector:

Rheodyne 7725, on inyector de muestra de 20 µL

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SISTEMA DE SOLVENTES (DISOLUCIONES) Y GRADIENTE

Disolución A:

Agua/Acetonitrilo/Ácido fórmico 87:3:10 (v:v:v)

Disolución B:

Agua/Acetonitrilo/Ácido fórmico 40:50:10 (v:v:v)

Flujo:

0,5 ml/min

Gradiente:

0 min 6% B, 20 min 20% B, 35 min 40% B, 40 min 60% B, 45 min 90% B, 55 min 6% B

3. HIGH SPEED COUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY (HSCCC)

Equipo:

High Speed modelo CCC-1000 Pharma-Tech Research Corporation, Triplecoil;

Volumen total Triplecoil: 850 mL

Bomba:

Jasco, Biotronik HPLC-Pump BT 3020

Detector:

Knauer K-2501

Inyector :

20 mL

Fraccionador:

Pharmacia LKB Super Frac Fraction Collector

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