MEMORIAS DEL ENCUENTRO FINAL ALFA LAGROTECH Cartagena, Colombia, 21-26 de Septiembre de 2008.

ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE ANTOCIANINAS EN DIFERENTES VARIEDADES DE MAZ (Zea mays) BOLIVIANO Cuevas Montilla E.1, Antezana A.2 y Winterhalter P.1
Institut fr Lebensmittelchemie, Technische Universitt Braunschweig, Schleinitzstrasse 20, 38106 Braunschweig, Alemania 2 Universidad Mayor San Simn Cochabamba, Sucre a Parque la Torre, Cochabamba, Bolivia
Palabras clave: Antocianinas, Maz morado, Zea mays, cromatografa en contracorriente, HSCCC
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Estudios epidemiolgicos efectuados en varios pases evidencian que el consumo de frutos y vegetales reducen enfermedades coronarias adems de minimizar los riesgos de cncer Se ha descrito que algunos compuestos fenlicos de origen vegetal presentan dentro de la clula actividad antioxidante, reduciendo la concentracin de radicales libres, y en algunos casos logran establecer grupos de quelacin con iones metlicos Los mecanismos involucrados de los agentes antioxidantes establecen donacin de electrones o tomos de hidrgeno a los radicales libres. Los agentes antioxidantes presentes en alimentos pueden reducir trombosis, activar macrfagos e inhibir la tendencia a la peroxidacin[1] Entre los compuestos que han merecido dichos estudios se encuentran las antocianinas, debido a la presencia de sustituyentes -OH, los cuales son molculas con alto poder antioxidante [2] La presencia de antocianinas en las variedades pigmentadas del maz, lo hace un producto potencial para el suministro de colorantes y antioxidantes naturales. Por ello el estudio de los pigmentos del maz morado (Zea Mais) ha despertado un inters sin precedentes. La diversidad gentica del maz se distribuye en razas. En Amrica se han originado el 90% de todas las razas. Segn Goodman y Brown (1988), en Amrica hay 260 razas de las que 132, aproximadamente la mitad, se encuentran en la regin andina. Dos factores son la causa de esa gran diversidad: la variacin en usos y la gran variacin ecolgica. La diversidad fenotpica del maz en la regin andina se expresa en una extraordinaria variabilidad en color, tamao, forma, textura del grano y de la mazorca.[3] El maz es un elemento cultural de la misma importancia que el lenguaje, el vestido, la msica, la culinaria, las costumbres y otras manifestaciones culturales. La vigencia de las razas de maz es universal. Las razas se mantienen en el tiempo. Hay muchas evidencias de que las razas de maz son ms perennes que otras manifestaciones culturales. Se mantienen porque constituyen un fuerte elemento cultural. Si desaparecen las culturas desaparecen tambin las razas de maz. En Bolivia el maz es uno de los cultivos ms importantes constituyendo uno de los alimentos bsicos de la poblacin. Uno de los objetivos es lograr que en EEUU y en la UE tambin se produzcan alimentos a base de maz pigmentado. La idea es "generalizar" el consumo, minoritario en la mayora de pases, excepto zonas de Mxico Actualmente el desarrollo de la tecnologa en este pas centroamericano ha permitido explotar el maz como una materia prima de gran importancia para la industria, tanto en lo bsico como en la complementaria. Bolivia es uno de los centros de diversificacin del gnero Zea y la produccin y consumo del maz morado es importante, pero se ha estudiado poco las antocianinas en variedades bolivianas. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar la composicin y perfil de antocianinas en variedades de maz morado cultivadas en Bolivia.
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INTRODUCCION

OBJETIVOS

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El objetivo principal es como mencionamos anteriormente buscar las vas de explotar el maz como una materia prima para la industria a largo plazo. Debido a ello se abre una gran posibilidad de emplear maces pigmentados para la extraccin industrial de sus pigmentos, debido a que por los volmenes de produccin y por la naturaleza de los mismos, es factible desarrollar una industria competitiva, orientada a satisfacer una de las grandes necesidades, de alimentacin, cosmticos y salud, al producir pigmentos del tipo de las antocianinas con una alta capacidad biolgica. Por lo que es necesario realizar estudios como el presente, para poder lograr la extraccin, purificacin, estabilizacin y conocimiento qumico de estos componentes de naturaleza pigmentada en el maz
ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS SISTEMA ANTIOXIDANTE

Como respuesta a la permanente produccin de Especies Reactivas de Oxgeno (EROs) que daan estructuras biolgicas, el organismo atena estos efectos deletreos por medio de la accin de sistemas antioxidantes. Los antioxidantes son sustancias que se encuentran en pequeas concentraciones en comparacin a un sustrato oxidable, que retrasa o inhibe significativamente la oxidacin del sustrato, y tambin estabiliza las EROS mediante la cesin de un H+ y las convierte en compuestos no radicalarios. Otras definiciones hablan de antioxidante como cualquier sustancia que, al estar presente en bajas concentraciones comparada a las de un sustrato oxidable, previene o retarda la oxidacin de dicho sustrato y que protege a los sistemas biolgicos frente a efectos potencialmente perjudiciales tanto de procesos como reacciones que causan excesivas oxidaciones [4]. Existen diferentes sistemas de defensa antioxidante en el organismo. Uno de ellos est conformado por sistemas enzimticos como la superxido dismutasa, catalasa y glutatin peroxidasa, siendo stas la primera defensa contra los radicales libres que actan neutralizando a estas especies altamente reactivas en molculas menos dainas para la clula. Otros sistemas, no enzimticos, estn conformados por compuestos como caroteniodes, glutatin reducido y las vitaminas C y E que estabilizan las EROs o tambin que provocan la quelacin de iones metlicos de elementos de transicin como hierro y cobre, que al estar en estado reducido potencian su autoxidacin y generacin de anin superxido[5]. Los antioxidantes aportados por la dieta disminuyen los efectos de las EROs. Son variados los alimentos que estn constituidos por estas sustancias y cada vez ms utilizados por las personas tanto por medio del consumo directo de vegetales y frutas que los incluyen, como tambin por medio del uso de frmacos. Entre los antioxidantes ingeridos por la dieta se destacan las vitaminas E y C, los betacarotenos, procianidinas y polifenoles.

POLIFENOLES

Compuestos orgnicos que estructuralmente presentan un grupo -OH unido a un anillo aromtico, se conocen como compuestos fenlicos y aquellos en que se repite este radical son conocidos como polifenoles. Los compuestos de esta familia presentan variados efectos beneficiosos para la salud: prevencin contra cncer, propiedades antiinflamatorias, antialrgicas, antitumorales, antimicrobianas, vasorelajantes y antioxidantes. Entre sus acciones antioxidantes encontramos la inhibicin de la formacin de EROs por medio de la inhibicin de enzimas productoras de EROs como la xantino oxidasa, o la quelacin de los elementos traza involucrados en la produccin de los mismos; el atrapamiento directo de EROs y el up-regulation de los sistemas antioxidantes endgenos [6]. Los polifenoles estabilizan las EROs al capturarlas formando el radical aroxilo (FI-O), para luego reaccionar con un segundo radical, con lo cual adquieren una estructura quinona estable [6].

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Los polifenoles ms estudiados actualmente son los provenientes del extracto seco estandarizado de Vitis vinifera que contienen antocianinas, procianidinas y proantocianidinas, entre otros, los cuales son sustancias bioactivas. Estos actan atrapando los radicales libres para luego tranformarlo en especies no radicalarias, por inhibicin de la accin enzimtica de elastasa e hialuronidasa. Estudios clnicos demuestran que el uso teraputico de los polifenoles provenientes de la Vitis vinifera, reducen la incidencia de enfermedades cardiovasculares; disminuye el riesgo de insuficiencia cardiaca; alivio de sntomas en pacientes con insuficiencia venosa. Dentro de este grupo encontramos a las antocianinas, que se diferencian de otros polifenoles por poseer azcares dentro de sus grupos funcionales y, en su mayora, presentar varios grupos OH. Las diferencias individuales entre los antocianinas dependen del nmero de grupos hidroxilo, la naturaleza y nmero de azcares que estn unidos a la molcula, a la posicin de esa unin y la naturaleza y nmero de cidos aromticos unidos al azcar en la molcula [2].
ANTOCIANINAS

Las antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul), son el grupo ms importante de pigmentos solubles al agua visibles para el ojo humano[7]. Las antocianinas forman parte de la familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenlicos. Los colores rosa, rojo, azul, malva y violeta de las flores, frutas y verduras se deben a la presencia de estos pigmentos[8]. Las antocianinas se localizan principalmente en la piel de frutas como manzanas, peras, uvas, zarzamoras, ciruelas, de flores como la jamaica, rosas y verduras como col morada y maz morado. La funcin que cumplen es la de atraer seres vivos (principalmente insectos y pjaros) para propsitos de polinizacin y dispersin de semillas. La diferencia de color entre las frutas, flores y verduras depende de la naturaleza y concentracin de antocianinas. Existen factores adicionales que afectan el color como el pH de la clula, el efecto de copigmentacin determinado por la presencia de otros flavonoides, temperatura, luz, etc.[9] Las antocianinas, al igual que otras sustancias polifenlicas, se encuentran en la naturaleza en forma de glicsidos, siendo conocidas sus agliconas como antocianidinas, a las cuales se les une un azcar por medio de un enlace -glicosdico. Se trata de flavonoides, es decir, sustancias derivadas del ncleo flavano, con un anillo-A benzoil y un anillo-B hidroxicinamoil. La estructura de la antocianina es el 2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio. Cuando el residuo de azcar es un hidrolizado de la antocianina, el resultado es la aglicona, conocida como se menciona anteriormente como antocianidina. Las ms comunes formas de antocianidinas son: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, malvidina y petunidina En la Figura 1 se muestran los diferentes tipos de antocianinas. Las clases comunes de glucsidos son: 3-monsido, 3-bisido y 3-trisido, as como tambin 3,5-diglicsido y ms raramente el 3,7-diglicsido con glucosa, galactosa, arabinosa (es uno de los ms frecuentes) y xilosa. Las antocianinas poseen uniones de azcar en el anillo-B 3 y 5-hidroxilos. Los dos tipos ms importantes de glucsidos son: el 3-monsidos y el 3-4-diglicsido. Como regla el 3-hidroxil siempre tiene un azcar, exceptuando 3desoxipelargonidina, 3-desoxicianidina y 3-desoxidelfina [10]. Adems de la glucosilacin, la introduccin de molculas aciladas es un efecto que ocurre ampliamente. Los grupos comunes de acilo son los cidos aromticos de los cuales los ms comnmente encontrados son cidos hidroxicinmicos: p-coumrico, cafeico y ferlico, y ms raramente el hidroxibenzoico. El color particular de cada antocianina depende del

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nmero y orientacin de los grupos hidroxilos y metoxilos. Un incremento en la hidroxilacin produce un color azul, mientras un incremento en la metoxilacin produce un color rojo. Aglicona Petunidina Malvidina Pelargonidina Delfinidina Cianidina
Figura 1. Estructura y sustituyentes de las antocianinas (Rodrguez- Saona y Wrolstad, 2001)[11]

R1 OH OCH3 H OH OH OCH3

R2 OCH3 OCH3 H OH H H

Peonidina

Todas las antocianinas son derivadas del catin flavilo bsico. Se conocen ms de 100, las diferencias entre ellas se debe al nmero de grupos hidrxilos, el grado de metoxilacin de stos grupos, as como la naturaleza y el nmero de los cidos aromticos y alifticos presentes en la molcula. De todas las antocianinas existentes, slo seis son de inters enlos alimentos: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina y malvidina (Figura 1). Los restantes son menos frecuentes y se encuentran en algunas hojas [9]. Es comn que una misma antocianidina interaccione con ms de una clase de carbohidrato para formar diferentes antocianinas; la pelargodina es la que produce el color rojo escarlata de algunas flores y de las fresas; la delfinidina se encuentra en las berenjenas y la cianidina en col roja, higos, cerezas, ciruelas, y otros frutos. Las antocianinas se sintetizan a partir de la condensacin de dos molculas precursoras (Figura 2): malonil Co A y p-cumaril-CoA, las que ms tarde formarn anillos A y B respectivamente. Las antocianinas son sintetizadas por varias rutas. Sobresalen dos, la del cido shikmico y la del cido malnico. En la ruta del cido shikmico se convierten carbohidratos simples derivados de la gliclisis, de la ruta de las pentosas fosfato y ciclo de Calvin en diversos cidos orgnicos como el cinmico, p-coumrico, cafeico, ferlico, clorognico y fenilalanina Cabe resaltar que esta ruta sinttica tambin es compartida por otros compuestos fenlicos. La principal reaccin de biosntesis de los flavonoides es la condensacin de los acilos provenientes de cumaril-CoA y tres molculas de malonil-CoA catalizada por la enzima chalcona isomerasa que lleva a cabo la isomerizacin de chalcona a flavona, misma que es convertida en flavones o antocianinas. Los pasos finales en la sntesis de antocianinas son las acilaciones y las glicosilaciones, primero en el C-3, para estabilizar el catin flavilio [9].
BIOSINTESIS DE LAS ANTOCIANINAS

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Phosphoenolpyruvat + Erythrose-Phosphat

OH HOOC OH Shikimisure OH HO HO OH Gallussure COOH COOH NH2 Phenylalanin

HO HO Ferularsure

COOH

COOH HO HO COOH Zimtsure

Kaffeesure

COOH p-Cumarsure HO

p-Cumarsure-CoA Acetyl-CoA MalonylCoA HO OH Chalcon OH O OH HO O HO O Flavanon OH OH O Isoflavon OH OH HO O HO O OH OH Flavan-3-ol OH OH Anthocyanidin OH O OH O Flavanonol OH HO O OH OH

OH

O HO O OH OH O Flavonol

OH HO + O

OH

Flavon

Figura 2. Biosntesis de Polifenoles (MACHEIX, FLEURIET und BILLOT, 1990)[12] FACTORES QUE ALTERAN LA ESTABILIDAD DE LA ANTOCIANINA

La estabilidad de las antocianinas depende de factores como enzimas, pH, temperatura, oxgeno, luz, metales, etc. Investigaciones recientes demostraron que existen antocianinas con ciertas caractersticas, presentando una mayor estabilidad debido al desarrollo de ciertos mecanismos: 1. asociacin intramolecular: acilacin 2. asociacin intermolecular: copigmentacin 3. interacciones con otros compuestos 4. polimerizacin [8].
EFECTO DEL PH

Este es uno de los factores ms importantes. Las antocianinas son ms estables en un medio cido que en un medio neutro o alcalino. En medio cido la forma predominante es la del in flavilio, el cual da el color rojo, cuando esta es sometida a pH bsico o alcalino, el in flavilio es susceptible al ataque nucleoflico por parte del agua, producindose la pseudobase carbinol, esto es a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras.[13]

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Conociendo esto, las antocianinas tienen su mxima expresin de color a pH cidos (pH1), y su forma incolora se produce a pH neutros o alcalinos, debido a esta caracterstica se utilizan a las antocianinas a pH cido o ligeramente neutro en la industria alimenticia. En la Figura 3 se muestra el comportamiento de la antocianina a diferentes pHs.
R
3'
+
1

R
4'

OH
-OH

3'

4'

OH

HO
7

5' 3

HO
7

OH
5' 3

OR

H+

OR

Catin flavilio, rojo

H+
-OH

OH

Pseudobase carbinol, incolora

H+
4' -OH

OH

R
3'

R
3'

OH
-OH

4'

OH

HO
7

5' 3

HO
7

HO

O
5' 3

OR

H+

OR

Base quinoidal, azul

OH

OH

Chalcona, amarilla

Figura 3. Estructura de las antocianinas en funcin al pH TEMPERATURA

La antocianina es destruida por el calor durante el procesamiento y almacenamiento. Un incremento logartmico en la destruccin de la antocianina ocurre con un incremento en la temperatura. Timberlake (1986) observ que el equilibrio entre las estructuras es endotrmico, en una direccin de izquierda a derecha: Base quinoidal Cation flavilio Pseudobase carbinol Chalcona. A altas temperaturas el equilibrio cambia hacia chalconas. El retorno de chalconas a flavilio es lento.[14]
COPIGMENTACIN

La copigmentacin es la interaccin electrnica planar en los grupos cromforo de las antocianinas. Los cambios producidos por el copigmento en la regin visible del espectro del pigmento es correlacionada con la transformacin de la antocianina en agua, estas formas se producen por el ataque nucleoflico del agua.

El in flavilio es casi planar y muestra una deslocalizacin electrnica, que se extiende por todo el grupo cromforo, mientras que la forma hemiacetal tiene dos anillos aromticos sin conjugar y un anillo central en cual no es planar, por que tiene un carbono tetrahdrico, por lo tanto el in flavilio es la nica especie capaz de copigmentar, por su forma planar. La copigmentacin provoca un efecto hipercrmico. Debido a la baja estabilidad de la copigmentacin, se requiere de grandes concentraciones de copigmentos[15]. La debilidad de la copigmentacin es esencialmente de origen entrpico. De hecho, experimentos de variacin de la temperatura en sistemas diferentes pigmento-copigmento, se encontr un cambio de entropa negativa por el equilibrio de la copigmentacin. El pigmento y copigmento en su estado inicial son especies independientes, durante su asociacin es
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sostenida fuertemente el complejo formado con una reduccin simultnea de los grados de libertad, todo este proceso tiende a una oposicin de copigmentacin. La copigmentacin es usual en la naturaleza y contribuye a la profusin de colores en las flores y algunos tejidos. Abe et al (1977) propusieron el trmino "copigmentacin intermolecular" para la asociacin dbil de antocianinas con compuestos, modificando as el color y la estabilidad del complejo formado; y "copigmentacin intramolecular para el enlace fuerte que forman grupos de cidos orgnicos con las antocianinas [16]. La copigmentacin intermolecular de antocianinas con otros flavonoides produce un incremento en la absorbancia a una longitud de onda visible (efecto hipercrmico), as como un desplazamiento a longitudes de onda mayores del mximo de absorbancia (efecto batocrmico); la copigmentacin intramolecular es la responsable por la estabilidad del color de antocianinas que poseen dos o ms grupos acilos aromticos. El color se intensifica al incrementar el contenido de cidos orgnicos como el cinmico y malnico[8] Las antocianinas poseen conocidas propiedades farmacolgicas utilizadas para la terapia de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones realizadas con extractos de Vitis vinifera ricos en antocianinas, han mostrado que disminuyen la fragilidad y permeabilidad capilar; tambin efectos antiinflamatorios y actividad antiedema. Adems tienen la propiedad de proteger los vasos sanguneos del dao ocasionado por los altos niveles de azcar en la diabetes.[17] Las antocianinas protegen de muchas maneras. Primero, neutralizan las enzimas que destruyen el tejido conectivo. Segundo, su capacidad antioxidativa previene los oxidantes del tejido conectivo daado. Finalmente, reparan protenas daadas en las paredes de los vasos sanguneos. Experimentos en animales han demostrado que la suplementacin con antocianinas previenen efectivamente la inflamacin y el subsecuente dao a vasos sanguneos. Esta habilidad antiinflamatoria de las antocianinas tambin ayuda contra las reacciones alrgicas. Por otro lado se ha observado que su potencial antioxidante va en contra de radicales superxidos y perxidos de hidrgeno a travs de numerosos mecanismos, por ejemplo: la cianidina: Protege la membrana celular de lpidos de la oxidacin por una variedad de sustancias peligrosas. La cianidina es un antioxidante 4 veces ms fuerte que la vitamina E. La pelargonidina protege el radical amino de la tirosina del peroxinitrilo, un antioxidante altamente reactivo. Por otro lado, la delfinidina interfiere con el radical hidroxil, uno de los oxidantes del cuerpo humano[18]. La capacidad antioxidante se relaciona con el nmero de grupos OH que presenten y el lugar de la sustitucin.Cuando se ingieren, las antocianinas son destruidas en parte por la flora intestinal y las que son absorbidas se eliminan por la orina y la bilis, con previas transformaciones Gracias a esta capacidad antioxidante, las antocianinas son catalogadas como agentes nutracuticos. Varios trabajos reportan sus efectos benficos al prevenir la proliferacin de clulas cancergenas, proteccin contra enfermedades del corazn y prevencin del dao a lpidos de alimentos. Debido al inters de la sustitucin de los colorantes sintticos por su posible toxicidad, se han buscado nuevas fuentes de colores naturales, como las antocianinas presentes en los maces pigmentados
EFECTOS POSITIVOS DE LAS ANTOCIANINAS SOBRE LA SALUD

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MAZ MORADO (Zea Mays) COMO FUENTE DE ANTOCIANINAS Zea mays es una gramnea anual originaria de las Amricas introducida en Europa en el siglo XVI. Actualmente, es el cereal con mayor volumen de produccin en el mundo, superando al trigo y el arroz. En la mayora de los pases de Amrica, el maz constituye la base histrica de la alimentacin regional y uno de los aspectos centrales de la cultura mesoamericana. El uso principal del maz es alimentario. Puede cocinarse entero, desgranado (como ingrediente de ensaladas, sopas y otras comidas). La harina de maz (polenta) puede cocinarse sola o emplearse como ingrediente de otras recetas. El aceite de maz es uno de los ms econmicos y es muy usado para freir alimentos[19] El maz morado es una variedad de maz que posee la coronta y los granos de color morado y es originario del altiplano andino (Bolivia y Per). Contiene diferentes tipos de Antocianinas, siendo la cianidina-3- -glucsido, su pigmento mayoritario el cual es un importante antioxidante. Figura 4 nos muestra la gran variedad de coloraciones del maz morado

Figura 4. Maiz morado

Tambin el extracto de maz morado puede ser usado en productos cidos (p. ej. bevidas, jugos) donde se desee un color rojo. A un colorante extrado a partir del de maz morado se le clasifica con el nmero E-163 (EEC). Adems del pigmento principal cianidina3-glucsido, se han encontrado en variedades de maz morado: pelargonidina - 3- glucsido, peonidina-3-glucsido, cianidina-3-maloilglucsido, pelargonidina-3-malonilglucsido, y peonidina-3 - malonilglucsido) en extractos comerciales de maz morado [20] y granos del mismo [21]. Adems, cianidina - 3-dimalonilglucsido como compuesto minoritario en algunas variedades. Las Antocianinas del maz morado son ms estables que la Enocianina de la uva, a la luz, al calor y principalmente a los cambios de pH. Las Antocianinas del maz Morado a un pH entre 3 y 3.5 permanecen de un color rojo amarillento, mientras que la Enocianina se torna azulada en esa condicin.
LA CROMATOGRAFA CONTRACORRIENTE (CCC)

La cromatografa a contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografa lquido-lquido, donde tanto la fase estacionaria como a fase mbil son lquidas.La cromatografa contracorriente es la tcnica cromatogrfica de separar solutos por sus diferentes coeficientes de distribucin en dos solventes inmiscibles. Desde su nacimiento hace casi 60 aos la tecnologa se ha desarrollado cada vez ms. Mediante la eliminacin de soportes slidos, se evita la adsorcin permanente de la sustancia
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analizada en la columna, y se puede recuperar casi el 100 %. El instrumento tambin es de fcil conmutacin entre los distintos modos de funcionamiento con slo cambiar los disolventes. Con la cromatografa lquido-lquido, los investigadores no estn limitados por la composicin de las columnas disponibles en el comercio para su aparato. Casi cualquier par de soluciones inmiscibles pueden ser utilizados en cromatografa lquido-lquido, y la mayora de los aparatos se pueden manejar en el modo estndar o en fase inversa. Los costes del disolvente tambin son generalmente ms baratos que para HPLC, y el costo de los adsorbentes slidos se elimina por completo. Otra de las ventajas es que los experimentos realizados en el laboratorio puede ser llevadas fcilmente a escala industrial. La CCC se puede concebir como un proceso en tres etapas: la mezcla, la estabilizacin, y la separacin (aunque a menudo se produce de forma continua). La mezcla de las fases es necesaria para que la superficie de la interfase entre ellos tenga un gran tamao, y se pueda mover el analito entre las fases de acuerdo a su coeficiente. Un coeficiente de particin es la relacin de la cantidad de analito encontrada en cada uno de los disolventes en equilibrio, y est relacionado con la afinidad del analito por uno de los disolventes sobre los otros. La fase mvil se mezcla con la fase estacionaria a lo largo de toda la columna. El grado de retencin de la fase estacionaria (inversamente proporcional a la cantidad de fase estacionaria perdida o "sangrada" en el curso de una separacin) es un parmetro crucial. Los instrumentos de mayor calidad tienen una gran retencin de la fase estacionaria. El tiempo de estabilizacin es una propiedad del sistema de disolvente y la matriz de la muestra, teniendo ambas una gran influencia en la retencin de la fase estacionaria. A partir de los 80, el Dr Yoichiro Ito con su desarrollo de la centrfuga planetaria inici la era de la High Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) a la que pertenecen la mayor parte de equipos que se fabrican hoy da.[22]

Inyector

Bomba Detector Disolucin

Coil Fraccionador
Figura 5. Esquema de un equipo de HSCCC segn SUTHERLAND (1987)[23]

Ventajas de La Cromatografa Contracorriente de Alta Velocidad (HSCCC) Gran capacidad de carga, hasta el 10% del volumen de la columna, rango amplio: desde miligramos hasta decenas de gramos en el mismo equipo Adsorcin no irreversible, se recupera el 100% del analito. Tanto la fase estacionaria como la fase mvil son lquidos, por lo que la muestra puede recuperarse sin ningn tipo de prdida. (No hay problemas de adsorcin o cambios catalticos) Se usa menos solvente (10-25%) que en los procesos equivalentes de HPLC Puede trabajar con extractos brutos que contienen partculas Reproducible: el perfil de la elucin est slo en funcin de la relacin entre la tasa de distribucin y el volumen de la fase estacionaria Puede ser usada como un proceso cromatogrfico o de extraccin Puede ser usada en Fase Inversa o Fase Normal, o intercambiarlas durante el proceso Ideal para la automatizacin
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Se utilizaron seis muestras de grano pigmentado colectadas en cuatro diferentes departamentos de Bolivia. La informacin sobre sitios y clave de colecta, color de grano, y la ubicacin del pigmento en el mismo, se presenta en la tabla 1. Tabla 1. Descriptores de los maices analizados Denominacin Proveniencia (Departamento) Ayzuma (1) Chuquisaca Tuimuru (2) Cochabamba Huaca Songo (3) Cochabamba Checchi (4) Cochabamba Oke (5) Potos Kulli (6) Cochabamba Clave BO2M - 903 BO2M -1876 BO2M -1540 BO2M -1844 BO2M-1433 BO2M-1866 Color/Ubicacin Prpura/aleurona Prpura/aleurona Rojo/pericarpio Prpura, moteado/aleurona Prpura/aleurona Negro/pericarpio, tusa = morada

MATERIALES Y MTODOS Maces utilizados en el estudio

MTODO DE AISLAMIENTO DE ANTOCIANINAS A PARTIR DE MAZ MORADO EXTRACCIN Y PURIFICACIN

Las muestras analizadas en este trabajo, corresponden a los concentrados obtenidos apartir de las diferentes variedades de maz arriba mencionados. Estas muestras fueron facilitadas por el Dr. Gonzalo vila desde el Centro de Investigaciones Ficoecogenticas de Pairumani, Fundacin Simn I. Patio, Cochabamba, Bolivia La Figura 6 nos muestra un esquema del proceso de extraccin, caracterizacin y purificacin de las antocianinas del maz morado
Maz molido
1) 2) Extraccin con MeOH:cido actico 19:1 Rotaevaporacin, liofilizacin

Extracto crudo
1) 2) 3) 4) 5) Adsorcin en amberlita XAD-7 Lavado con agua Elucin con MeOH/c. actico 19:1 Rotaevaporacin Liofilizacin

LC-MS/MS

Extracto XAD-7

HPLC-DAD

Fraccionamiento con HSCCC

LC-MS/MS

Fracciones
Control de pureza con HPLC

Mezcla de substancias
Purificacin por medio de HPLC preparativa

Substancia pura

Figura 6. Esquema de extraccin y procedimiento de purificacin de las antocianinas

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Aproximadamente 100 g de grano entero de cada variedad fueron molidos con un procesador de alimentos domstico, desengrasados 2 a 3 veces con n-hexano con agitacin por aprox. 5 horas, posteriormente secado a temperatura ambiente por 12 horas y finalmente extrados con una mezcla de metanol:cido actico: (19:1 v/v), a temperatura ambiente y con agitacin, durante 24 h cada una. El extracto as obtenido fue rotaevaporado, congelado a 24C y liofilizado en un tiempo aproximado de 48 horas. Una vez redisuelto en agua, se aplic a una columna de Amberlita XAD-7 (SigmaAldrich, St Louis, MO), utilizando como disolvente de lavado agua, y como eluyente metanol:cido actico: (19:1 v/v) y finalmente rota evaporado y liofilizado nuevamente. Separacin del extracto XAD 7 por medio de cromatografa a contracorriente de alta velocidad (HSCCC) El extracto XAD 7 obtenido fue fraccionado con al ayuda de un equipo de HSCCC. La pureza e identidad de las fracciones as obtenidas fueron controladas por HPLC-DAD y Cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) sucesivamente. Las muestras antes de inyectarse se filtraron a travs de un acrodisco de 0.45 m (Millipore, Bedford, MA), inyectando un volumen de 20mL. Se us como sitema de solventes: ter terbutilmetlico/n-butanol/acetonitrilo/agua 2:2:1:5, acidificado con 0,1% de cido trifluoroactico. La velocidad de flujo fue 4,0 mL min 1. La deteccin de las antocianinas se realiz a 520 nm y el modo de elucin utilizado fue "Head to tail" (fase liviana = menos densa como fase estacionaria)
RESULTADOS Y DISCUSIN IDENTIFICACIN DE LAS ANTOCIANINAS

Se identificaron dos antocianinas mayoritarias en todas las variedades de maz morado estudiadas, independientemente de su origen: cianidina-3-glucsido (42,5%), y cianidina-3(6"malonil)-glucsido (30,7%). Los tiempos de retencin de las antocianinas mayoritarias fueron 24,01 y 33,56 min, respectivamente, valores que coinciden con los estndares utilizados para su identificacin (Figura 8). Los resultados concuerdan con los reportados por Fossen et al. (2001)[24], quienes encontraron las mismas antocianinas en flores y hojas de maz morado y sealan, al igual que De Pascual-Teresa et al. (2002)[21] y Schwarz et al. (2003)[25], a la cianidina-3-glucsido como la antocianina mayoritaria en maz morado, seguida por la cianidina-3-(6"malonil)glucsido. Se pudo observar que existen diferencias en el perfil de antocianinas minoritarias entre especies de maz; que si bien son mnimas como lo demuestra la Figura 7, ocasionan una diferencia enorme en el color y pigmentacin de las diferentes variedades de maz morado. Esta variacin se define en colores que van desde el rojo, pasando por el morado (completo o moteado) hasta el casi negro en el caso del Kulli. La siguiente Tabla Nr.2 nos presenta de manera resumida identificacin y caractersticas espectroscpicas de las antocianinas minoritarias de las diferentes variedades de de Maz morado analizadas en nuestro estudio. Una comparacin directa entre las 6 variedades estudiadas la podemos apreciar grficamente en la Figura 7, en la cual observamos tanto la similitud en el perfil antocinico (Antocianinas mayoritarias) como las diferencias en el perfil de las menores (La enumeracin va de acuerdo con Tabla 1)

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Tabla 2. Identificacin y caractersticas espectroscpicas de las antocianinas minoritarias Variedad Ayzuma Tuimuru Huaca Songo Antocianinas (minor) peonidina-3-glucsido pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido pelargonidina-3-glucsido An no caracterizado pelargonidina-3-glucsido peonidina-3-glucsido pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido peonidina-3-(6"malonil)-glucsido An no caracterizado peonidina-3-(6"malonil)-glucsido pelargonidina-3-glucsido An no caracterizado peonidina-3-glucsido pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido peonidina-3-(6"malonil)-glucsido An no caracterizado peonidina-3-glucsido pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucsido peonidina-3-(6"malonil)-glucsido tR (min) 31.78 36,99 26,63 30.51 26,63 31.78 36,99 38,81 36,06 38,81 26,63 30.51 31.78 36,99 38,81 30.51 31.78 36.99 37,82 38,81 [M]+ (m/z) 463 519 433 535 433 463 519 549 635 549 433 535 463 519 549 535 463 519 621 549 MS/MS (m/z) 301 271, 433 271 287 271 301 271, 433 301, 463 475, 306 301, 463 271 287 301 271, 433 301, 463 287 301 271, 433 287, 449 301, 463

Checchi Oke

Kulli

Figura 7. Cromatograma de HPLC comparativo de las variedades estudiadas

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Las antocianinas en las semillas de maz morado de las variedades analizadas, son de tipo simple y no aciladas, ya que su estructura est conformada por el grupo cromforo y nicamente un azcar, que es la glucosa . Esta estructura qumica minimiza pues su uso potencial como colorantes naturales para alimentos, ya que son menos estables a cambios de pH que las aciladas; sin embargo, poseen una actividad antioxidante sobresaliente, por lo que las antocianinas del maz morado pueden considerarse valiosas como agentes antioxidantes [25] Para una mejor caracterizacin y elucidacin espectroscpica de las antocianinas extradas, sobretodo de aquellas minoritarias, se hace necesario el aislamiento y purificacin de ms cantidades de extracto y es pecisamente aqu donde se despliegan todas las ventajas de la cromatogrfia contracorriente , que nos permite llegar de manera fcil, rpida y eficiente a tal objetivo. A continuacin se describen los resultados de la separacin HSCCC ejemplarmente en el Maz variedad Kulli.
FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO XAD 7 DE MAZ KULLI POR MEDIO DE HSCCC

Para la separacin se utilizaron 500 mg del extracto XAD 7. Las separaciones se realizaron por cromatografa en contracorriente a alta velocidad HSCCC y el equipo utilizado para tal operacin fue un modelo CCC-1000. La Figura 8 nos muestra el cromatograma HSCCC a una longitud de onda de 520 nm.
4 1 2

70

140

210

280

350

Time [min]

Se obtuvo un total de 4 Fracciones ms la fraccin residuo llamada coil, que fueron separadas con ayuda de cromatografa de capa fina. El control de la identidad y pureza de las fracciones separadas fueron monitoreadas con ayuda de HPLC-DAD y Cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) sucesivamente. HSCCC Fr. 1 (llamada fraccin de ruptura) est compuesta mayoritariamente por pigmentos polimricos, Fraccin 2 contiene un pigmento identificado tentativamente como un dimero de flavanol y cianidina-3,5-diglucsido,

Absorbance [520nm]

Figura 8. Cromatograma HSCCC de Maz Kulli 520 nm llamado (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucsido y que ya ha sido identificada en anteriores estudios en un polvo colorante a base de maz morado[26]. Una purificacin sucesiva y anlisis con Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) se encuentran en curso. Fraccin 3 contiene mayormente copigmentos y ningna antocianina. La fraccin 4 contiene el compuesto mayoritario de la variedad, cianidina-3-glucsido, con una pureza de 80% y el compuesto minoritario con un in molecular [M]+ (m/z) de 477 y una fragmentacin del in molecular de MS/MS 287, lo que nos seala que se trata de un derivado de la cianidina Una purificacin sucesiva y anlisis con Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) se encuentran igualmente en curso. Finalmente en la fraccin Coil se enriquecieron entre otros, el segundo pigmento mayoritario cianidina-3-(6"malonil)-glucsido con una pureza de 60% y el resto es una fraccin mezclada que contiene pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido, peonidina-3-(6"malonil)-glucsido y la antocianina no acilada peonidina-3-glucsido como componentes minoritarios. A continuacin nos resumen Figura 9 y Tabla 3 las caractersticas
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cromatogrficas y espectrometrics de las antocianinas aisladas y caracterizadas a partir de la variedad de maz morado denominada Kulli 1 4

a 2 3 5 7 6

Figura 5. Cromatograma HPLC- DAD del extracto XAD 7 de maz Kulli a 520 nm

Tabla 3. Identificacin y caractersticas espectroscpicas de las antocianinas de Maz morado variedad Kulli picoa 1 2 3 4 5 6 7 a compuesto cianidina-3-glucsido (mayor) An no caracterizado peonidina-3-glucsido cianidina-3-(6"malonil)-glucsido (mayor) pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucsido peonidina-3-(6"malonil)-glucsido (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucsido a enumerado de acuedo con Figura 8 tR (min) 23.98 30.51 31.78 33.57 36.99 37,82 38,81 6,67 rea (%) 42,5 2,5 1,8 30,7 1,9 2.6 3,1 10,8 [M]+ (m/z) 449 535 463 535 519 621 549 899 MS/MS (m/z) 287 287 301 287, 449 271, 433 287, 449 301, 463 306, 449

Una purificacin sucesiva de las fracciones obtenidas con HSCCC y anlisis con Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) de las mismas, as como tambin estudios preliminares sobre la capacidad antioxidante de los diferentes extractos y sustancias purificadas se encuentran actualmente en curso

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CONCLUSIONES La composicin de antocianinas presente en los maces originarios de Bolivia es muy similar a la que presentan algunos mesoamericanos ya descritos en estudios anteriores. Las antocianinas mayoritarias identificadas en los granos de maz de las variedades estudiadas fueron la cianidina-3-glucsido y la cianidina-3-(6"malonil)-glucsido respectivamente Las tcnicas de cromatografa en contracorriente y HPLC son herramientas primordiales para la extraccin y caracterizacin de las antocianinas, ya que permiten una purificacin y separacin a gran escala para la ejecucin de estudios y anlisis posteriores (por ejemplo TEAC, DPPH, estudios de biodisponibilidad etc..); adems de que permiten enriquecer y concentrar componentes minoritarios para su completa elucidacin. Por la naturaleza qumica de las antocianinas identificadas en las variedades de maz morado estudiados, su uso potencial sera como fuente de antioxidantes, ms que como colorantes naturales. EQUIPOS Y PARMETROS 1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) a) analtica Bomba: Detector: Inyector: Software: Columnas: b) preparativa Bomba: Detector: Inyector: Software: Columna: Knauer HPLC-Pump K-1001 Knauer K-2600 Variable Wavelength Monitor Knauer K-55960 con inyector de muestra de 200 L Eurochrom 2000 para Windows V.2.05 Luna 5 C18 (2), 250 10 mm (Phenomex, Aschaffenburg) Jasco PU-980 Intelligent HPLC Pump Jasco MD-910 Multiwavelength Detector Rheodyne 7125 con inyector de muestra de 20 L Borwin-PDA Versin 1.0 Luna 5 C18 (2), 250 4,6 mm (Phenomex, Aschaffenburg) Synergi (250 x 4,6 mm, 5 m), Phenomenex)

Degasificador: Jasco DG-980-50 3-Line Degaser

2. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRA DE MASAS (LC-MS)

Equipo:

Esquire-LC, Bruker Daltonics (Bremen); LC-ESI-MS/MS con Trap Mass Spectrometry

Ion

Software: Bomba: Detector: Registrador: Inyector:

HP ChemStation con EsquireControl, Anlisis HP Series 1100 HPLC Pump G1312A BinPump Merck Hitachi L-4000 UV Detector Shimadzu C-R6A Chromatopac Rheodyne 7725, on inyector de muestra de 20 L
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SISTEMA DE SOLVENTES (DISOLUCIONES) Y GRADIENTE

Disolucin A: Agua/Acetonitrilo/cido frmico 87:3:10 (v:v:v) Disolucin B: Agua/Acetonitrilo/cido frmico 40:50:10 (v:v:v) Flujo: Gradiente: 0,5 ml/min 0 min 6% B, 20 min 20% B, 35 min 40% B, 40 min 60% B, 45 min 90% B, 55 min 6% B High Speed modelo CCC-1000 Pharma-Tech Research Corporation, Triplecoil;

3. HIGH SPEED COUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY (HSCCC)

Equipo:

Volumen total Triplecoil: 850 mL Bomba: Detector: Inyector : Jasco, Biotronik HPLC-Pump BT 3020 Knauer K-2501 20 mL

Fraccionador: Pharmacia LKB Super Frac Fraction Collector

REFERENCIAS

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