UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

LABORATORIO DE BIOSNTESIS Y BIOTECNOLOGA

PRACTICA #1

PRODUCCIN DE ACIDO CTRICO POR Aspergillus niger

Alumnos: BRAVO ESPINOSA DE LOS MONTEROS FRANCISCO JAVIER

WENDY RANGEL S.

EQUIPO: 7

SEMESTRE 2012-1

Practica # 1: produccin de acido ctrico por Aspergillus niger.

Objetivos: Realizar la produccin de acido ctrico mediante fermentacin sumergida empleando como microorganismo productor a Aspergillus niger. Evaluar el crecimiento de Aspergillus niger mediante la determinacin de la constante de velocidad de crecimiento (), el tiempo de duplicacin (Td) y la curva de crecimiento del microorganismo. Determinar los rendimientos de acido ctrico producido y biomasa con respecto a la cantidad de sustrato proporcionado, asi como la cantidad de producto generado respecto a la cantidad de biomasa. Observar el comportamiento de la curva de formacin de productos con respecto al crecimiento Resultados:
CURVA DE CRECIMIENTO Tabla 1. Datos de biomasa
t de fermentacin (hrs.)

X (mg/mL) 7.39 8.00 8.50 9.03 11.59 14.88 19.11 24.53 31.55 40.55 36.60 40.45 36.60 40.45 40.45

45.00 40.00 35.00 30.00 X (mg/mL) 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0

Grfico 1. Curva de Crecimiento

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Fase lag

20 40 60 Tiempo de Fermentacin (hrs.)

80

DETERMINACIN DE LA VELOCIDAD ESPECFICA DE CRECIEMIENTO Tabla 2. Ln de Biomasa (X)

t de fermentacin (hrs.)

ln X

Grfico 2. Velocidad especfica de crecimiento

2.00 2.08 2.14 2.20 2.45 2.70 2.95 3.20 3.45 3.70 3.60 3.70 3.60 3.70
4 3.5 3 2.5 ln X 2 1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 tiempo de fermentacin (hrs.) 80

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

y = 0.0501x + 1.4488 R = 1

3.70 Constante de velocidad especfica de crecimiento

h rs -1

DETERMINACIN DEL TIEMPO DE DUPLICACIN (Td) Td= ln 2 = 0.69314718 0.05 = 13,863 h.

DETERMINACIN DE SUSTRATO CONSUMIDO Tabla 3. Curva Patrn

Glu. (mg/mL)

Abs 1 0.117 0.324 0.551 0.855 0.91

Abs 2 0.183 0.422 0.555 0.734 0.896

Abs promedio 0.15 0.373 0.553 0.7945 0.903

0.2 0.4 0.6 0.8 1

Grfico 3. Curva Patrn

1 0.8 Absorbancia 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Concentracin de Glucosa mg/mL

y = 0.9638x - 0.0236 R = 0.9891

Concentracion de glucosa al tiempo 0 = Concentracion de glucosa al tiempo final =

Tabla 4. Eficiencia de uso de sustrato tiempo de fermentacin (hrs)

0.324 mg/mL 0.0249 mg/mL

Sustrato (mg/mL) 20 19.4 18.8 18 16.5 14.8 13 11.5 9.8 8 6.3 4.7 3 3.2 3.4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

25 Concentracin de sustrato 20 15 10 5 0

Grafica 4. Eficiencia de uso de sustrato

Sustrato (mg/mL)

20 40 60 Tiempo de fermentacin

80

EUSproblema

Si-Sf Si

20.0-3.4 3.4 0.3240.0249 0.324

4.88

EUSdatos

Si-Sf Si

0.923

DETERMINACIN DE ACIDEZ (CUANTIFICACIN DE PRODUCTO OBTENIDO) Tabla. 5 Acidez/ Producto

tiempo de % de acidez fermentacin (%P) (hrs)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

5 5.5 6.25 7 7.5 7.55 8.25 9 9.55 10 21.3 32.5 45 44 43

50 45 40 35 30 %P 25 20 15 10 5 0 0

Grafica 5. Acidez: Aparicin de Prducto

% de acidez (%P)

20

40 60 Tiempo de fermentacin

80

Yp/s = Yx/s = Yp/x =

Pf-Pi Si-Sf Xf-Xi Si-Sf Pf-Pi Xf-Xi

x100 x100 x100

RENDIMIENTOS 43.0-5.0 = 20.0-3.4 40.45-7.39 = 20.0-3.4 43.0-5.0 = 40.45-7.39

x100 x100 x100

= = =

228.92 % 199.16 % 114.94 %

CARTOGRAMA
tiempo de fermentacin (hrs) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 X (mg/mL) 70 80

% de acidez (%P)

(mg/mL) Grfico 6.X Cartograma (mg/mL)

Sustrato

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

5 5.5 6.25 7 7.5 7.55 8.25 9 9.55 10 21.3 32.5 45 44 43

20 19.4 18.8 18 16.5 14.8 13 11.5 9.8 8 6.3 4.7 3 3.2 3.4

7.39 8.00 8.50 9.03 11.59 14.88 19.11 24.53 31.55 40.55 36.60 40.45 36.60 40.45 40.45

% de acidez (%P)

Sustrato (mg/mL)

0.050 hrs -1

Td 13,863 h.

Tabla 6. Cuadro Resumen EUS datos EUS problema 0.923 4.88

Yp/s

Yx/s

Y/px

228.92 % 199.16 % 114.94 %

Discusin de resultados: Dentro de la bibliografa se menciona que la velocidad especifica de crecimiento como su nombre lo indica tiene un valor caracterstico para cada tipo de microorganismo empleado segn sus caractersticas nutricionales, la composicin del medio, al igual que la temperatura y el pH del mismo. Este valor al ser calculado nos indica la rapidez con la que un microorganismo se desarrolla en el medio lo que nos permite tener una mayor certeza de en que tiempo se alcanza la concentracin adecuada de microorganismos para iniciar con el proceso de produccin de nuestro metabolito de inters, y se ve alterado el valor con respecto a la concentracin del sustrato utilizado en el medio. Velocidad especifica de crecimiento: Bacteria 0.9 h-1 Levadura 0.45 h-1 Hongo filamentoso 0.25 h-1 Nuestro resultado fue de 0.05 h-1

Aunque estos valores representan un promedio de muchas especies en medios de referencia se puede tomar como indicadores a la hora de comparar el resultado de nuestros datos y concluir si se llevo a cabo con xito el experimento. Por otro lado el tiempo de duplicacin nos indica el tiempo requerido para que la clula se divida o para que la poblacin de un organismo se duplique en nmero. Dentro de la grafica 5 se presenta el porciento de producto (acidez), en este punto se puede observar como esta grafica se comporta de igual forma que la curva de crecimiento, y esto nos da a entender que durante la fase lag y log la produccin o aparicin de producto es baja ya que las enzimas que catalizan el ciclo de krebs se encuentran mucho mas activas durante este intervalo lo que evita la acumulacin del producto, sin embargo cuando se compara en el cartograma esta misma grafica se puede observar como cuando el microorganismo a llegado a la fase de mantenimiento el producto empieza a acumularse en grandes cantidades dentro del medio; es debido a este comportamiento que podemos saber que el acido ctrico es producido como un metabolito secundario por A. niger. Lo que se trata de representar en el cartograma es tan solo la relacin que existe entre la curva de crecimiento, el uso del sustrato y la produccin del metabolito; aqu se puede observar como al ir avanzando el crecimiento del hongo el sustrato es utilizado y como entre mas sustrato sea utilizado se va presentando una mayor concentracin de nuestro producto.

Conclusiones: Actualmente la mayor parte del acido ctrico producido mundialmente se obtiene mediante el mtodo de fermentacin sumergida y siendo utilizado como microorganismo principal Aspergillus niger debido a que este microorganismo en condiciones de deficiencia de hierro produce acido ctrico en grandes cantidades para ser utilizado como agente quelante del hierro para lograr cumplir con sus necesidades metablicas; es debido a este comportamiento del microorganismo por lo que se utiliza preferentemente a las especies de A. niger sobre otros microorganismos para la produccin del acido ctrico. Por otra parte se debe de tener en cuenta que los resultados usados para elaborar los clculos pertenecen a un caso terico ya que debido a las circunstancias relacionadas al horario de clase era imposible realizar tomas de muestra en intervalos de tiempo mas corto lo que explicara el porque al intentar leer las muestras en el espectro los valores eran prcticamente iguales. Aunque no se pudieron utilizar nuestros datos para la determinacin de todos los parmetros del proceso, pudimos utilizarlos para observar que aunque el cultivo se contaminara efectivamente se produjo el acido ctrico, esto quedo evidenciado al realizar la titulacin del medio.

Bibliografia: Madigan M., Martinko J. & Parker J. Brock Biologia de los microorganismos 10. Ed. Prentice Hall Espaa 975 976.

http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap5_mi.pdf