MOLECULAR MEDICINE TODAY, JANUARY 1998 Reviews

Avances en terapia génica de

desordenes mitocondriales
Jean-Marc Collombet and Charles Coutelle
Los desordenes mitocondriales están caracterizados por deficiencias proteicas que afectan la estructura y
función de la mitocondria. La deficiencia de proteínas es causada por mutaciones tanto en genes nucleares
como en el genoma mitocondrial. La mayoría de los enfoques actuales de la terapia génica de desordenes
mitocondriales tienen como objetivo la expresión de la secuencia genética correctiva mediante la
expresión nuclear/citoplasmática. Sin embargo, el genoma mitocondrial y su sistema de expresión
autónoma ofrecen el potencial de una estrategia alternativa de terapia génica: la introducción de
secuencias de genes nucleares dentro del genoma mitocondrial y su expresión mediante el sistema de
expresión genética de la mitocondria. Además de su potencial para terapia génica, la introducción y
expresión de un gen exógeno en la mitocondria proporcionaría una herramienta invaluable para la
comprensión de la expresión del genoma mitocondrial y su regulación.

La mitocondria es un organelo pequeño (0.5

– 1 μm) localizado en el citoplasma de todas
las células eucariotas (revisado en ref. 1).
Son las responsables de la generación de
~90% del total de suministro de ATP de una
célula, la principal fuente de energía de la
cual depende la vida de la célula. El número
de mitocondrias por célula (10 – 2.000 en
células somáticas y más de 100.000 en
ovocitos) es dependiente de los
requerimientos energéticos del respectivo
órgano. Órganos metabólicamente muy
Traductores activos como el hígado, el cerebro y el
Scarlet Rissi
Juan Torres músculo esquelético poseen el mayor
Mª Jose Perez número de mitocondrias y son los
Sofía Mena
Yael Oñate principales órganos afectados por patologías
Luis Ziehe mitocondriales.
Carlos Pino
Paula Rozas
Karina Romero
La mitocondria contiene su propio genoma,
el ADN mitocondrial (mtADN). Cada
Edición
Darío Vásquez
mitocondria tiene 2 – 10 copias de mtADN,
que codifica para algunas de las proteínas
Segundo Medicina UCSC 2007 involucradas tanto en la síntesis de ATP
 citoplasma de la célula y luego
transferidas a la mitocondria
por un sistema específico de
transporte.

La mitocondria esta compuesta

por dos estructuras altamente
especializadas: la membrana
externa y la membrana interna,
las cuales la dividen en dos
compartimentos: el espacio
intermembrana y la matriz.

Los constituyentes principales

de la membrana externa son
canales que facilitan el
transporte a través de la
membrana de moléculas con
una masa molecular hasta 10
kDa. Esta membrana contiene
también enzimas que
Figure 1. The human mitochondrial genome, genetic and transcription map. HSP,
promoter for heavy (H) strand transcription; LSP, promoter for light (L) strand
convierten lípidos en sustratos
transcription; OH and OL, origins of replication for H and L strands, espectively; D- para ciclos metabólicos
loop, displacement loop; 12S and 16S rRNA, mitochondrial 12S and 16S ribosomal localizados en la matriz
RNAs; ND 1 to ND 6, genes encoding complex I subunits; Cyt b, cytochrome b of
complex III; COX I to COX III, genes encoding complex IV subunits; ATPase 8 and
mitocondrial.
ATPase 6, genes encoding ATPase/ATP synthase; F, V, L, I, M, W, D, K, G,R, H, S, T,
Q, A, N, C, Y, E, P, transfer RNAs using single letter amino-acid abbreviations. La membrana interna se
Numbered portions of the genome represent transcripts of H and L strands encuentra muy doblada para
according to Ref. 4. crear crestas que aumentan la
como de ARN ribosomal mitocondrial (rARN) superficie de la membrana. Es
y ARN de transferencia (tARN). La presencia impermeable a iones, una propiedad esencial
de un genoma que se replica y expresa para mantener un gradiente electroquímico
autónomamente en la mitocondria ha sido para la función de la ATPasa/ATP sintasa, una
explicada por la endocitosis de procariotes en enzima localizada en la membrana interna
eucariotas primitivas, seguido por el que produce ATP por fosforilación oxidativa.
desarrollo de una relación simbiótica. No Dos otros tipos de proteína son componentes
obstante, la mitocondria ha perdido mucha integrales de la membrana interna: canales
de su autonomía durante la evolución, como específicos que regulan la transferencia de
consecuencia de la disminución del tamaño sustratos a través de la membrana, y
de su genoma. Son completamente proteínas de la cadena respiratoria
dependientes de proteínas codificadas por el (complejos I, II, III y IV). Estas últimas generan
genoma nuclear, las que son sintetizadas en el la posterior reoxidación de dos coenzimas
NADH + H y FADH, localizadas en la matriz y
que permiten la transferencia electrónica y el
bombeo de protones para crear el gradiente
electroquímico.
La matriz contiene enzimas involucradas en la
oxidación de piruvato y ácidos grasos, el ciclo
del ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs) y el
ciclo de la urea. También contiene el mtADN,
polisomas mitocondriales, tARN y varias
enzimas necesarias para la replicación
autónoma, transcripción y traducción del
mtADN.
El genoma mitocondrial
Muchos genes mitocondriales de mamiferos
han sido secuenciados, ellos son circulares,
ADN de doble hebra con un tamano de 16 –
17 Kb. Los origenes de replicacion para de las
2 hebras de AND tienen diferentes lugares en
este AND. El genoma mitochondrial guarda 37
genes. Ellos codifican los 2 ARN ribosomales,
22 ARN de transferencia y 13 genes mas que
codifican subunidades de muchos complejos
de la cadena de respiracion mitochondrial; 28
de estos genes estan ubicados en la banda H
de la hebra de mtDNA, de los cuales 12 o 13
codifican subunidades proteicas. Los genes
restantes estan localizados en la hebra L. La
presencia de genes de las dos hebras implica
que ambas son transcribibles.
El mtDNA esta organizado en genes contiguos
sin intrones.Las secuencias intergenicas son
raras. La mas larga, la D-Loop (Loop de
dislocacion), es de alrededor de 1 Kb de
longitude, contiene muchas zonas de
regulacion de replicacion y transcripcion del
genoma mitochondrial.
Muchas caracteristicas diferencian el genoma
mitochondrial del nuclear (1) El mtDNA es
inherentenmente maternal, siendo
transmitido por el citoplasma del oocito. Hay
una muy baja cantidad de mitocondrias
paternales en los espermatozoides, los cuales
son eliminados en el embrion, tienen un
efecto insignificante en el contenido
mitochondrial del descendiente. (2) El
genoma mitocondrial no es replicado en
sincronizacion con la division cellular. (3) El
codigo genetico mitochondrial de mamiferos
difiere del codigo gentico universal en 4
codones (UGA: Stop --7 Trp; ADA: He --7 Met;
AGA: Arg --7 Stop; AGG: Arg --7 Stop). (4) La
mayor frecuencoia de mutaciones en el
genoma mitochondrial (10 a 100 veces mas
que en el genoma nuclear), es probable por el
resultado de la carencia de histonas y su
efecto protector, y quiza por la ausencia de
un sistema de reparacion de AND efectivo y
exacto. Como sea, esto ultimo es aun
controversial. (5) En contraste a los
inherentes desordenes geneticos causados
por mutaciones en el genoma nuclear los
cuales estan presentes en todas las celulas del
individuo, pacientes con enfermedades
mitocondriales raramente tienen solo mtDNA
mutante (homoplasmy). En general el tipo
salvaje (wild-type) y mtDNA mutante
coexisten en sus celulas (heteroplasmy), y la
cantidad de los 2 tipos varia segun los tejidos
y celulas a traves de la vida, debido de la
distribucion al azar de mitocondrias en las
celulas hijas durante la division cellular. Por
cada tejido, un diferente umbral de mtDNA
mutante tiene que ser alcanzado antes que el
fenotipo patologico, causado por la mutacion,
se manifieste
Desórdenes mitocondriales
Tradicionalmente los desórdenes
mitocondriales han sido definidos como
condiciones heredadas causadas por
deficiencias de proteínas que funcionan en la
mitocondria (revisado en referencias 13, 14).
No obstante, las mutaciones mitocondriales
adquiridas han sido reconocidas como
contribuyentes en enfermedades
degenerativas.
Pacientes con mitocondriopatías se presentan
con una variedad de síntomas clínicos, y la
manifestación en un órgano depende no sólo
de la expresión de los genes mutados en el
tejido, sino también en los requerimientos
energéticos del respectivo tejido. Los órganos
mas usualmente afectados son el corazón,
músculo esquelético y Sistema Nervioso
Central, pero otros órganos pueden estar
involucrados, cada uno por si solo o en
combinación.
Las enfermedades mitocondriales se pueden
clasificar bioquímicamente en tres categorías:
1) Deficiencias de enzimas involucradas en el
transporte de solutos a través de las
membranas mitocondriales. 2) Deficiencias de
enzimas de ciclos metabólicos en las
mitocondrias. 3) Deficiencias de la cadena
respiratoria que principalmente causan
miopatías mitocondriales. Diferentes
mutaciones en el genoma nuclear, algunas de
las cuales han sido identificadas, son
responsables de las dos primeras categorías
de defectos.
Se han observado muchas deficiencias en la
cadena respiratoria. Estas son: 1) deficiencias
en cada uno de los complejos, encontradas en
el siguiente orden de frecuencia: Complejo I >
IV > III > II y V. 2) Deficiencias combinadas (en
general de I y IV) y 3) Mas raramente
deficiencias generalizadas de la cadena
respiratoria. Algunas de estas deficiencias,
como las del complejo V son resultado de
mutaciones en el genoma nuclear.
De todos modos, mutaciones de delecion del
genoma mitocondrial también son
responsables de un número de neuropatías
mitocondriales causadas por deficiencia de la
cadena transportadora de electrones.
Mutaciones Puntuales
Mutaciones puntuales ocurren en el ARNt
mitocondrial, en genes de RNAr y en genes
codificantes de proteínas. Mutaciones de
genes que codifican de ARNt (asociado con
Myoclonic epilepsy and ragged red fiber
(MERRF) y encefalomiopatía mitocondrial con
acidosis láctica y episodios stroke-like) y ARNr
(asociado con sordera inducida por
aminoglicosido (AID)) son de herencia
materna y conducen a una traducción
ineficiente de ARN mensajeros
mitocondriales.
Mutaciones en genes codificantes de
proteínas (asociados con la neuropatía óptica
hereditaria de Leber (LHON) y debilidad
muscular neurogénica, ataxia y retinitis
pigmentosa (NARP)) son responsables de
sustituciones aminoacidicas en la secuencia
proteica y también son de herencia materna.
Mutaciones en el gen de ATPasa 6 también se
heredan maternalmente y en el síndrome de
Leigh. De todas formas, este síndrome ha sido
recientemente relacionado con una
deficiencia en el complejo II de origen
nuclear.
Deleciones
Las deleciones del ADN mitocondrial se
encuentran en miopatias oculares, síndrome
de Kearns-Sayre, enfermedad de Pearson y
síndrome de Wolfrom. Estas deleciones
ocurren casualmente en una región particular
del ADN mitocondrial, lindado en el inicio del
gen para COX I (codificante de las
subunidades del complejo I) y el final del gen
de citocromo b. El tamaño de estas
deleciones varia entre 1 y 8 Kb, y se han
clasificado mas de 120 deleciones diferentes.
Dos de ellas son llamadas comunes, porque
están presentes en cerca de un 60% de los
pacientes afectados por deleción. La herencia
mendeliana recesiva y dominante se muestra
en oftalmoplejia progresiva externa (PEO);
pacientes que poseen deleciones múltiples de
2.0-10.0 kb y por lo menos dos loci nucleares
han sido relacionados a su presencia. Se ha
sugerido que estos codifican factores
nucleares que son importados en la
mitocondria y juegan un rol importante en
replicación mitocondrial. Mutaciones o
ausencia de estos factores pueden causar
deleciones por una replicación defectuosa del
ADN mitocondrial.
Duplicaciones
También han sido reportadas duplicaciones
en el DNA mitocondrial. Duplicaciones
parciales se originan por inserción de una
molécula de DNAmt delecionado en una
molécula normal. En las duplicaciones en
tandems dos ADNmt forman un dímero. El
ADNmt duplicado de tamaño variante entre
23 y 26.5 kb pueden, en algunos casos,
representar un estado intermedio para la
formación de moléculas de ADNmt
delecionado.
Fig.2
Localización de las mutaciones puntuales,
deleciones y duplicaciones más comunes en
el genoma mitocondrial, responsables de
desórdenes. Las mutaciones puntuales se
indican con una flecha en la posición del
nucleótido en el genoma mitocondrial de
acuerdo a la numeración en ref.4. Los
números entre paréntesis representan la
posición de las mutaciones menos frecuentes.
Los nombres de los síndromes asociados
aparecen entre paréntesis: LHON neuropatía
óptica de Leber; NARP debilidad muscular
neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa;
MERRF epilepsia mioclonica asociada a
ragged red fibers; MELAS encefalomiopatia
mitocondrial, acidosis láctica episodios stroke-
like; PEO oftalmoplejia progresiva externa;
AID sordera inducida por aminoglicosido. 1 y
2 indican la región de las deleciones 4997 y
7436 pb, respectivamente; 3 indica la región
del síndrome de la delecion autonómica
dominante y de muchos de los casos
espontáneos de deleción.
Los tratamientos actuales para el
trastorno mitocondrial
En la actualidad, no hay un tratamiento eficaz
para la mayoría de los trastornos
mitocondriales El principal criterio que se ha
utilizado hasta la fecha es la aplicación de un
tratamiento farmacológico para evitar los
defectos metabólicos o para favorecer
las rutas metabólicas alternativas. Por
ejemplo, el benzoato de sodio o el
fenilacetato de sodio se da a los pacientes con
defectos enzimáticos situado en el ciclo de la
urea con el fin de desarrollar una ruta
alternativa para la excreción del exceso de
nitrógeno metabólico. Para las miopatías
mitocondriales, los electrones aceptores
como los de la vitamina C, los de la
Menadiona, los de la ribot1avin o los de la
coenzima Q 10 se utilizan para compensar
deficiencias en los complejos de la cadena
respiratoria de electrones. Esto mejora la
condición del paciente en el corto plazo, pero
no puede detener la progresión de la
enfermedad. En los casos más graves, se ha
intentado el trasplante de órganos: por
ejemplo, los trasplantes de hígado por
deficiencias es la ornitina transcarbamilasa
(OTC) y el trasplante de corazón para la
cardiomiopatía
Terapia génica para los trastornos
mitocondriales
La terapia génica puede proporcionar
estrategias para el tratamiento causal de tales
patologías. Este enfoque puede ser definido
como la entrega de un homólogo funcional de
un gen defectuoso de una célula somática, a
fin de corregir una deficiencia de las funciones
celulares. Idealmente, esto debería conducir a
la persistencia de la expresión de genes
terapéuticos en los niveles fisiológicos
adecuados en las células, después de una sola
aplicación. La obtención de este objetivo por
recombinación homóloga in vivo en este
momento no es factible por razones técnicas.
Sin embargo, varias estrategias alternativas
de terapia génica que se han desarrollado,
son también aplicables a algunas patologías
mitocondriales
Reparto genético al núcleo celular
Para corregir una deficiencia causada por una
mutación en un gen nuclear, la estrategia más
obvia es complementar el gen defectuoso,
mediante el uso de una terapia (génica) que
emplee un vector expresante del gen
correcto después de alcanzar el núcleo
celular. En este caso, el transgen es transcrito
en el núcleo, y a continuación el transcrito es
transportado al citosol para la transducción.
La proteína Normal Resultante es trasportada
selectivamente hacia la mitocondria
mediante un mecanismo de Importación
Natural basado en la identificación de una
secuencia peptidica señal (alrededor de 20
residuos aminoacídicos ubicados en el
extremo N- Terminal de la secuencia de la
proteína activa), esta es posteriormente
incluida en la matriz mitocondrial. Esta
aproximación deducida a partir de la CLASICA
estrategia de terapia génica desarrollada para
genes nucleares codificantes, y la opción de
un sistema vector portador de genes
terapéuticos define la eficiencia de la
transfección, el nivel y la duración de la
expresión de genes terapéuticos y los
posibles efectos del sistema.
Sistemas de Reparto genético empleando
Vectores virales recombinantes (ver tabla) y
no virales pueden ser usados para esta
aproximación. Sin embargo, ellos son aun
poco eficientes para el reparto génico y son
actualmente usados mayoritariamente para
transferir plásmidos, los cuales (presentando
un problema), no son mantenidos por las
células en división por lo que requieren
repetidas aplicaciones. No es una sorpresa
que los vectores no-virales NO hayan sido
usados en acercamientos para terapia de
enfermedades mitocondriales.
Dado el bajo número de genes nucleares
conocidos codificantes para proteínas
mitocondriales y la ausencia de modelos
animales para enfermedades mitocondriales,
solo unos pocos experimentos de terapia
génica han sido intentados para corregir este
tipo de patologías. Sin embargo, 2 modelos
en ratones para la deficiencia de OTC, en
ratones del tipo sparse-fur (Spf)) y Spf –ash
(donde ash stands para anormalidad de piel y
cabello), han otorgado la base de la terapia
genica para esta enfermedad usando vectores
adenovirales y retrovirales, demostrando la
prueba para el principio de la terapia génica
en enfermedades mitocondriales
cromosomalmente no hereditarias.
La inyección endovenosa de un 1ª generación
de vector adenovirus conteniendo el OTC
cDNA de rata en ratones Spf-ash recién
nacidos produjo variados incrementos en la
actividad hepática OTC en algunos animales,
por otro lado la transferencia viral del gen
OTC fue expresada en un ratón de 15
semanas después de la administración viral,
mostrando una actividad hepática OTC de
50% del nivel normal y normalizando el
Sparse- Fur fenotipo característico de los
ratones con deficiencia OTC.
Usando una 2ª generación de adenovirus OTC
construido, un grupo de científicos (Ye et al),
consiguió la corrección del defecto
metabólico en los ratones Spf adultos por un
periodo de 2 semanas. Una corrección
bioquímica parcial de la deficiencia OTC fue
también obtenida en hepatocitos primarios
de ratones Spf Y Spf –ash, después de la
transducción con un vector retroviral
conteniendo el OTC cDNA humano.
Deficiencias en branched-chain Cetoácido
Deshidrogenasa (BKDH) y Ornitina
Aminotransferasa (OAT) también se han
intentado tratar con estrategias de expresión
nuclear. Mueller et al, obtuvieron una
corrección total de la deficiencia BCKDH en
fibroblastos cultivados después de haber sido
infectados con retrovirus expresantes de
secuencias génicas codificantes para la
subunidad E2 del complejo multienzimático
BCKDH, el 75% de la actividad nativa de esta
enzima fue encontrada en estos fibroblastos
en cultivo al menos 7 semanas después de la
transducción . Sullivan et al obtuvieron una
sobreexpresión de la actividad nativa OAT en
más de 150 ocasiones en epitelio
pigmentador de la retina humana cultivado
usando una 1ª generación de vectores
adenovirales.
Estos acercamiento convencionales basados
en terapia génica podrían ser usados también
para corregir enfermedades mitocondriales
causadas por una sóla mutación en una
proteína codificada por el genoma
mitocondrial, como en el caso de LHON o
NARP. En cada caso, la diferencia en el código
genético entre el núcleo y la mitocondria
tiene que ser tomado en cuenta para la
construcción de una secuencia genética
correctiva. Gracias a los grandes avances en la
síntesis de oligonucleótidos y la tecnología
PCR, este problema ha sido resuelto. En
síntesis, una secuencia codificante para una
secuencia peptídica señal específica,
necesaria para el proceso de importación de
la proteína terapéutica hacia la mitocondria,
debería ser añadida la región 5´ (prima) del
gen terapéutico.
Nagley et al, demostraron la potencialidad de
esta aproximación terapéutica para la
corrección de los defectos en el DNA
mitocondrial, en levaduras mutantes con una
delección en el gen de la ATP-asa 8. Después
de la expresión nuclear del gen modificado
para la ATP-asa 8 mitocondrial en las
condiciones ya mencionadas, una subunidad
ATP-asa 8 funcional fue sintetizada en el
citosol e importada hacia la mitocondria,
corrigiendo de esta forma el defecto ATP-
ásico en este organismo.
Entrega génica a la mitocondria
Ya que el genoma mitocondrial de los
mamíferos es esencialmente un episoma
multi-copiado presente en todos los tipos
celulares; nosotros, además de otros
investigadores, hemos presentado la
interrogante de si este genoma puede ser
manipulado con el fin de corregir una
mutación mitocondrial o si puede incluso
expresar un gen extraño dentro de la
mitocondria. Como la mitocondria posee su
propia maquinaria de replicación,
transcripción y traducción, un gen exógeno
insertado dentro del mtDNA puede ser
propagado y expresado de manera estable,
sin ser integrado dentro del genoma nuclear.
Además, si la mitocondria puede ser
explotada para este propósito, quizás puede
ser usada también como un sistema de
entrega no-patogénico y no-inmune. Sin
embargo, a pesar del pequeño tamaño del
genoma mitocondrial, el progreso en esta
área está quedando muy atrás de los avances
en la transferencia génica nuclear.
Probablemente, el desafío más importante en
el presente es el de desarrollar
procedimientos para la introducción de DNA
en la mitocondria. Idealmente, esto debería
lograrse con células intactas o incluso tejido.
Sin embargo, la doble membrana
mitocondrial ha hecho de esto una tarea
desafiante, incluso con el organelo aislado.
Como se señalo anteriormente, estas
membranas presentan estrictas barreras
físicas y funcionales, las que son atravesadas
naturalmente solo por procesos selectivos de
transporte activo. Si se usan otros medios
para entrar, la membrana interna debe ser
atravesada sin pérdida del estado dual de las
membranas, que es esencial para la función
mitocondrial.
Mecanismos de importación naturales para
ácidos nucleicos son solo conocidos en unas
pocas moléculas de RNA. tRNA ha
demostrado, in vivo e in vitro, ser
selectivamente importado dentro de la
mitocondria de levadura; este transporte
requiere, en el sistema in vivo, la presencia de
al menos 2 proteinas citoplasmáticas. Un
mecanismo similar en células de mamífero es
hasta ahora desconocido, pero se piensa que
un nucleótido-135 de RNA, codificado
nuclearmente, es requerido para el
procesamiento de RNA mitocondrial y, por lo
tanto, debe ser importado dentro de la
mitocondria. Sin embargo, esto es aun
controversial y, por ser estos mecanismo de
transporte desconocidos, su uso para la
importación de ácidos nucleicos foráneos no
es factible.
Varias técnicas para la introducción de DNA
foráneo en la mitocondria han sido probadas.
Intentos tempranos de transferir fagos
liposomalmente encapsulados y marcados
fluorescentemente en mega-mitocondrias de
células de hígado de ratón, no han sido
continuados, probablemente por la baja
eficiencia de este procedimiento.
Bombardeo biolístico
Varias investigaciones han exitosamente
introducido DNA externo en mitocondrias y
cloroplastos, respectivamente, de la levadura,
Chlamydomonas y plantas mediante
bombardeo biolístico de todas las células con
DNA unido a partículas de tungsteno de ~0,5-
1 μm. Aunque no sin problemas, esto ha
conducido a la restauración de la funcion de
estos organelos, pero no ha sido un éxito en
células de mamíferos o en aisladas
mitocondrias de mamíferos.
Secuestro de la vía de importación de
proteínas
El cotransporte de DNA con proteínas
nucleares codificadas, que son naturalmente
importadas hacia la mitocondria, o en el uso
de sus péptidos de señal de objetivo
mitocondrial, es una aproximación fisiológica
a este problema. Oligonucleótidos (24
nucleotidos) puedes ser transferidos in Vitro
hacia aisladas mitocondrias de levaduras
como conjugados con una proteína de fusion
que contiene una presecuencia mitocondrial
(derivado del precursor de la subunidad IV de
la citocromo oxidasa de la levadura) y una
enzima nuclear codificada modificada (mouse
dihidrofolato reductasa). En una extensión a
este enfoque, Seibel han introducido una
secuencia de 320 bp de DNA externo,
covalentemente ligado a un oligopeptido N-
terminal liderador de secuencia de OTC en
mitoconrdias de ratas; 37% de este conjugado
fue completamente traslocado en la matriz.
La efectiva escisión de la presecuencia del
DNA exógeno por el procesador peptidasa
mitocondrial (MPP) después de la traslocacion
podría ser esencial para permitir una eficiente
replicación y transcripcion, y la conformacion
lineal del DNA en este concepto podria
tambien poseer un problema por su
replicación y expresión en la mitocondria. Los
autores especulan que esta aproximación
podría ser usada en combinación con
transferidor mediado por liposoma del DNA-
proteina conjugada en las celulas. Esto podria,
de todas formas, decrecer substancialmente
la eficiencia de todo el procedimiento.
Taylor han recientemente sugerido el uso de
este método mediante la introducción de
oligomeros de acido nucleico de proteina
antisentido en la mitocondria para
selectivamente inhibir la replicación de
genomas mitocondriales defectuosos en
enfermedades mitocondriales causadas por
un defecto mtDNA heteroplasmico.
Electroporación
Una aproximación electroporética (la
electroporación es una técnica que se basa en
la aplicación de un elevado voltaje a las
células durante un periodo de tiempo muy
corto. Durante ese tiempo las células
despolarizan sus membranas y se forman
pequeños orificios por los que penetran las
moléculas (proteínas, DNA etc) que se
encuentran alrededor. Pasada la
despolarización muchas células sufren daños
irreparables y mueren (en muchos casos más
del 90%) pero algunas (5 al 10%
habitualmente) se recuperan y han
incorporado las moléculas deseadas. La
ventaja de esta técnica es que se aplica a
millones de células a la vez y habitualmente
se obtienen eficiencias de entrada de las
moléculas del 100% de las células que
sobreviven (centenares de miles a millones). )
para introducir un plásmido de DNA exógeno
de 7.2 kb en la matriz de una mitocondria
aislada ha sido desarrollada en nuestro
laboratorio recientemente. DNA
completamente funcional puede ser
introducido en una mitocondria intacta (como
lo han demostrado ensayos enzimáticos de
enzimas marcadoras, medición del estado de
acoplamiento mitocondrial y microscopia
electrónica). También hemos insertado,
recientemente, una secuencia de DNA que
codifica para la OTC humana (ornitina
transcarbamilasa del inglés ornithine
transcarbamylase, EC 2.1.3.3) según el uso del
codón mitocondrial, en el genoma
mitocondrial, entre dos tRNAs contiguos,
dándole el potencial de ser procesado
correctamente desde el transcrito primario
mitocondrial. Así como con el procedimiento
descrito anteriormente, para la introducción
de DNA en la mitocondria por medio de
targeting de péptidos, el único criterio para
juzgar el futuro potencial de éste método
para terapia génica es la función. Por lo tanto
estamos actualmente trabajando en la
introducción de este procedimiento en
mitocondrias aisladas y probando su
expresión en un sistema transcripción-
traducción in organello. Si se puede mostrar
la expresión exitosa de la secuencia de DNA
introducida, el próximo paso sería la
introducción de la mitocondria manipulada en
células.
Introducción de mitocondrias
“terapéuticas” en células.
Debería ser posible microinyectar la
mitocondria que contiene este genoma
modificado en hepatocitos deficientes en OTC
y en ovocitos de ratones spf o spf-ash (siglas
para sparse fur (spf) y sparse fur-abnormal
skin and hair respectivamente),
proporcionando el primer sistema modelo
para la corrección in vitro e in vivo de
enfermedades mitocondriales, a través de la
manipulación del genoma mitocondrial.
Otro medio para la introducción in vitro de
mitocondrias manipuladas en células puede
ser la endocitosis. Tal procedimiento podría,
quizás, ser mejorado cubriendo a la
mitocondria con secuencias básicas de
péptidos que lleven un ligando diana. Hemos
usado tal idea para la entrega de genes
mediada por receptor y hemos demostrado
que un ligando diana de integrina permite la
captación intracelular eficaz de un
bacteriófago al interior de células de
mamíferos.
Recientemente, Kagawa y Hayashi han
mostrado la corrección de células con un
modelo de deficiencia mitocondrial por
medio de la transferencia de mitocondrias
normales por fusión citoplástica in vitro. Ellos
sugieren que podría ser posible usar esta
técnica como una estrategia terapéutica in
vivo mediante la infusión de citoplastos que
contengan mitocondrias normales. Estos
citoplastos podrían ser generados a partir de
las células heteroplásmicas de un paciente
por selección in vitro de mitocondrias
normales, seguido de tratamiento con
citocalasina. Los citoplastos deberían fundirse
con las células afectadas, complementándolas
con mitocondrias normales a un nivel por
sobre el umbral necesario para prevenir la
manifestación de la enfermedad.
Observaciones
La expresión de una secuencia de ADN
extranjeras en las mitocondrias de mamífero
aislado abriría el camino para nuevos
enfoques experimentales en comprender el
genoma y la manipulación de expresión y su
regulación, que podría dar lugar a estrategias
de corrección genética de las enfermedades
mitocondriales. El logro de este objetivo y / o
la introducción eficaz de las mitocondrias en
su conjunto somáticas in vivo de las células
diana sería el último requisito para su
aplicación en terapia genética. Todavía queda
un largo camino por recorrer. Sin embargo, la
introducción de toda manipulación de
organelos es, en principio, similar a la del
problema en vivo de la entrega de
construcciones de cromosomas artificiales. En
caso de resolverse, una vez más, en analogía
con el sistema de cromosomas artificiales,
sería posible comenzar a abordar la multitud
de problemas que tendrán que ser resueltos
por el uso de las mitocondrias y su sistema de
la expresión de los genes, no sólo para la
corrección de las enfermedades
mitocondriales, pero Quizá también por lo Peptido lider: Una breve secuencia de
general estable, y no la integración de aminoácidos situados en la N - terminal de
vectores de genes terapéuticos para la algunas proteínas inmaduros. Tiene la capacidad
entrega. de orientar las proteínas intracelulares a su sitio
de funcion tales como mitocondria o al retículo
Glosario endoplasmático. El péptido líder es escindida
Cromosomas Artificiales: un mínimo episomal fuera funcional en la proteína madura.
estable de genes que contienen la construcción
Megamitocondria: Grandes mitocondrias hasta
de telómeros, orígenes de la replicación del ADN
alrededor de seis veces el tamaño de las
y elementos para la función del centrómero.
mitocondrias normales, generados in vivo en
Puede replicarse y segregar durante la división
ratones con la alimentación por cuprizone.(bis-
celular como una entidad independiente y puede
ciclohexanona oxaldihidrazona)
llevar grandes fragmentos genómica del gen de
interés en las células diana. Vectores no virales: Estos evitan la toxicidad /
inmunogenicidad y la posible inserción de
Bombardeo biolistica: Medios físicos de la
mutagénesis /oncogénesis de vectores virales.
entrega de genes a las células por bombardeo de
Liposomas catiónicos con la capacidad de obligar
alta velocidad (pistola de particulas) de las células
a la transferencia de ADN entre las células por
con micropartículas de tungsteno recubiertas con
endocitosis / fagocitosis son las más utilizadas.
el ADN de interés.
Vectores virales: Virus recombinantes se prestan
Fusion de citoplastos: Citoplasto son células
normalmente para replicación deficientes por la
enucleadas por una combinación de
eliminación de partes esenciales de la naturaleza
centrifugación y tratamiento de citocalasina.
del tipo de genoma, que son sustituidos por un
Cuando el citoplasto se fusiona con células
casete que contiene la expresión de genes
nucleadas, ellas transfieren sus mitocondrias a la
terapéuticos.
otra celula.

Heteroplasmido: describe celulas que contienen

ambos: mutante y tipo salvaje de genoma
mitocondrial.

Histonas: son un grupo de proteinas cargadas

muy positivamente. Son la principal proteina
contenida en el núcleo y juega un rol fundamental
en el empaquetamiento del DNA como
estructuras de cromatina.

Homoplasmido: descripción de celulas que

contienen ambos genomas mitocondriales,
mutante y “salvaje” (entiéndase como natural)

Transcripción/Traducción en organelos: porque

de las caracteristicas especificas de la expresión
genica mitocondrial, transcripcion/traducción
mitocondrial in Vitro tiene que llevarse a cabo con
las mitocondrias aisladas intactas.