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Introduo
Don't waste clean thinking on dirty enzymes!!!
Introduo
Desta maneira, a enzima alvo pode finalmente ser estudada
Introduo
Nenhuma enzima purificada at a absoluta homogeneidade!!!
Ensaio
O ensaio pode ser realizado? Sensibilidade, acurcia, preciso Disponibilidade de substratos, custo
Aditivos ao tampo
Ativadores, inibidores.... Conservadores da atividade
Ensaios enzimticos
Padronizao de unidades:
1. Quantidade de substrato consumido ou produto formado em mol; 2. Tempo da reao (minutos); 3. Quantidade de enzima (mg)
Atividade enzimtica
mol/min Unidade 1 unidade: quantidade de enzima que catalisa a transformao de 1 unidade de massa de substrato ou formao de produto (geralmente mol) por minuto sobre as condies de pH e temperatura definidas.
Atividade especfica
Unidades/mg
Ensaios enzimticos
Componentes: Mix:
Tampo para estabilizar o pH Substrato (s) Cofatores ou ativadores
Temperatura tima da enzima
Ensaios enzimticos
Metodologias
Substrato consumido
Produto formado
Ensaios enzimticos
Ponto Final
Metodologias
Cinticos Acoplados
Substrato consumido
Complementao gnica
Produto formado
Reagente stop
Mix Enzima
timolftalena monofosfato
timolftalena
Fosfato inorgnico
pH alcalino=cor azul
Ensaios cinticos
abs/tempo
Mix
Enzima
Ensaios cinticos
Avaliao do consumo de substrato Teste da atividade da DAHP sintase
Fosfoenolpiruvato COOH
Eritrose 4-fosfato OH H
H2O
COOH C
+
P O C CH2
O C H2 OH O
_ O _ CH P 2
HO
OH
DAHP Sintase
EC 4.1.2.15
OH 3-desoxi-D-arabino- heptulosonato 7-fosfato
Ensaios cinticos
Avaliao do consumo de substrato Teste da atividade da DAHP sintase
Consumo de PEP/s
0,35 Absorbncia a 232 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160
abs/60 s = 0,1
PEP232 nm =2,8 x 103 M -1 cm-1
Tempo em segundos
Ensaios cinticos
Avaliao do produto formato Teste da atividade da PNP
Metilguanosina Metilguanina
Formao de produto
0,35 Absorbncia a 360 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 50 100 Tempo em segundos 150 200
Ensaios cinticos
Ensaio da variao da absorbncia da coenzima associada Ensaios utilizando a reao inversa Teste da atividade da chiquimato desidrogenase
Ensaios acoplados
Verificao da formao do produto utilizando-o como substrato para outra reao enzimtica Atividade da EPSP sintase
Metilguanina
Complementao gnica
Uso de mutantes para comprovar que a construo gnica capaz de reparar os mutantes Atividade da desidroquinato sintase
oriC
ADAPTADOR
Kan(R)
pUP410
aroB LeuD
RBS1
KpnI (2431) Xho I (2016)
Presena de suplementos
Mix
Enzima
Excesso de Substrato
Atividade enzimtica linearmente dependente do volume de enzima adicionado reao. A velocidade proporcional concentrao enzimtica. Medida da real da velocidade inicial.
Tcnica stopped-flow : Mais apropriada para observao de reaes rpidas; A real velocidade inicial a [substratos] baixas j transcorreu em mix manual.
Reaes no estado prestacionrio: Ligao ao substrato, liberao de produtos, associao a cofatores, alteraes no pH e temperatura....
Estado pr estacionrio
http://bcs.whfreeman.com/stryer/pages/bcs- ain.asp?v=chapter&s=08000&n=00010&i=99010.01&o=|00040|00010|&ns=0
Componentes da tabela de purificao: Quantidade total de protena (mg) Atividade total (U) Atividade especfica (U/mg) Purification fold: aumento da atividade especfica Rendimento (%): recuperao da atividade em cada passo
Imobilizao Enzimtica
100.000 compostos/dia!!!!!!!
Desenvolvimento de frmacos
OBRIGADA!!!