Filtracin en gel - 1 (Farmacia)

CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL

1.- FUNDAMENTO TERICO La cromatografa de exclusin o filtracin en gel es una clase de cromatografa slido-lquido que permite la separacin de molculas en funcin de su tamao. En este tipo de cromatografa la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatogrfico. El gel est constituido por partculas esfricas que tienen poros de un determinado tamao. Las molculas de pequeo tamao difunden a travs de los poros de las partculas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las molculas grandes no entran en los poros de las partculas del gel y por ello eluyen rapidamente en lo que se denomina volumen vacio de la columna, se dicen que son excluidos del gel. De esta forma, las molculas se separan en funcin de su tamao, eluyendo en orden decreciente de peso molecular. Se definen los siguientes parmetros: Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel como los valores extremos (mximo y mnimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar. Volumen de elucin es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna. Volumen de exclusin de la columna al volumen al que eluyen las molculas de tamao superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partculas de gel.

Malla de partculas entrecruzadas en un gel hidratado

Muestra cargada

Las partculas pequeas pueden penetrar

Las partculas grandes quedan excluidas

Partcula de gel Molcula de la muestra de tamao molecular inferior al poro del gel Molcula de la muestra de tamao molecular superior al poro del

1.2. - MATERIALES PARA LA FILTRACIN EN GEL Un gel es una red tridimensional cuya estructura est entrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polmeros hidroflicos e insolubles cuyas cadenas polimricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta prctica se utilizar el gel dextrano. El gel de dextrano (polmero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, segn el tamao de poro, proporcionando lmites de exclusin comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican por una denominacin de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retencin de agua del

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gel multiplicada por 10. Propiedades de algunos geles de Sephadex (gel dextrano) Peso molecular, lmites de fraccionamiento Tipo G10 G15 G25 G50 G75 G100 G150 G200 polisacridos hasta 700 pptidos/protenas hasta 700 agua retenida (g/g gel seco) 1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0 vol. de gel hidratado (ml/g gel seco) 2 3 5 10 12-15 15-20 20-30 30-40

hasta 1 500 100 - 5 000 500 - 10 000 1 000 - 50 000 1 000 - 100 000 1 000 - 150 000 1 000 - 200 000

hasta 1 500 1 000 - 5 000 1 500 - 30 000 3 000 - 80 000 4 000 - 150 000 5 000 - 400 000 5 000 - 800 000

1.3. - APLICACIONES DE LA FILTRACIN EN GEL

Adems de utilizarse para la separacin de sustancias de distintos pesos moleculares o para la purificacin de protenas, se emplea para la determinacin de pesos moleculares de protenas. Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una relacin lineal entre el volumen de elucin y el logaritmo del peso molecular de las protenas. Por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elucin de una protena desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada con protenas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente su peso molecular.

Ve-Vo K= Vs Molculas de peso molecular desconocido

Ve = volumen de fase mvil necesario para eluir la molcula de inters Vo = volumen de exclusin Vs = volumen de la fase estacionaria Vs = Vt-Vo Vt = volumen total de la columna

Log Pm

Esta tcnica puede tambin proporcionar un mtodo para el tratamiento de una protena con un determinado reactivo. Este ser uno de los aspectos a ensayar en el presente experimento.

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SEPARACIN DE LAS DISTINTAS FORMAS DE OXIGENACIN DE LA HEMOGLOBINA En esta prctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25 (dextrano de alto entrecruzamiento, pequeo tamao de poro), aprovechndose la diferente velocidad de avance de la hemoglobina frente a los reactivos de pequeo tamao (ferricianuro y ditionito). El ferricianuro (Fe[CN]63-) es un agente oxidante, capaz de oxidar el Fe2+ de la oxihemoglobina (rojo vivo) a Fe 3+, transformndose en ferrocianuro Fe(CN)64- (amarillo). Esta forma de la hemoglobina se denomina metahemoglobina (marrn). El ditionito (S2O42-) es un agente reductor, capaz de reducir el Fe3+ de la metahemoglobina a Fe2+. A esta forma de la hemoglobina se le denomina desoxihemoglobina (rojo pardo). La desoxihemoglobina capta el oxgeno disuelto en el tampn transformndose en oxihemoglobina (rojo vivo). Se aplicar a nuestra columna de sephadex G-25 una disolucin de ditionito sdico y posteriormente una muestra de metahemoglobina observndose una serie de bandas en funcin de las reacciones que tienen lugar. 2. - MATERIAL Y REACTIVOS

Material
.- Columna de cromatografa .- Pipetas Pasteur .- Tubo graduado .- Vaso o Erlenmeyer

Reactivos
.- Sephadex G-25 .- Tampn fosfato 20 mM, pH = 7.0 .- Ferricianuro potsico .- Azul dextrano (2 mg/ml) .- Ditionito sdico (=hidrosulfito sdico, Na2S2O4) (solucin recin preparada de10 mg/ml en tampn fosfato) .- Muestra: Hemolizado 3. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 3.1. - Preparacin del hemolizado: Se recoge la sangre de rata en tubos de vidrio graduados con heparina 1% como anticoagulante. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 5 minutos, aspirando el plasma con pipeta Pasteur. Se resuspenden los hemates en 4-5 ml de NaCl 0.9%, se agita y se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones. Esta operacin de lavado se repite dos veces ms. Los hemates se hemolizan aadiendo 4 volmenes de agua destilada y 0,4 volmenes de cloroformo, se agita y se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos. Recoger el sobrenadante. 3.2. - Hinchado del gel: Se aaden 25 ml de tampn fosfato por gramo de gel. Se deja hasta el da siguiente. De este modo, se consigue la estructura de retcula tridimensional que permite la separacin de las molculas de la muestra ya que cada bolita de gel seco absorbe el tampn, aumentando su volumen . Se partir del gel hinchado. 3.3. - Empaquetado de la columna: Con la llave de la columna cerrada se comienza a aadir, usando una pipeta Pasteur, aproximadamente 15 ml de suspensin del gel, dejndola resbalar por la pared de la columna para evitar que se formen burbujas de aire en el interior del gel. Con el tiempo, el gel va sedimentando. Cuando haya unos 2-3

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cm de gel sedimentado se abre la llave permitiendo la salida del exceso de tampn, facilitando de esta manera el empaquetado. El gel empaquetado debe tener una altura de 10 cm. El lecho del gel debe quedar perfectamente uniforme y plano. IMPORTANTE: en todo momento debe evitarse, mediante el control de la llave y la adicin de tampn, que el gel llegue a secarse. La adicin a la columna se har siempre con pipeta Pasteur, con cuidado y por la pared para evitar distorsionar el lecho del gel. 3.4. - Medida del volumen de exclusin: .- Dejar fluir el tampn hasta que el menisco alcance el lecho del gel, evitando que ste se seque. Cerrar la llave. .- Aadir cuidadosamente con la pipeta Pasteur 2 gotas de la solucin de azul de dextrano. Abrir la llave hasta que la banda de azul dextrano entre completamente en el gel y cerrar de nuevo. Aadir a la parte superior del gel un poco de tampn (2 mm de altura). .- Poner un tubo graduado para recoger el lquido que sale de la columna (eluato). Abrir la llave, dejar entrar la capa de tampn en el gel. Continuar aadiendo ms tampn a la columna hasta que la banda azul salga por abajo. Anotar el volumen recogido cuando salga de la columna el centro de la banda de azul dextrano. Este es el volumen de exclusin de la columna. .- Lavar la columna haciendo pasar tampn hasta la completa eliminacin del azul dextrano. 3.5. - Tratamiento de la hemoglobina del hemolizado: .- Se parte de unos 10 ml de hemolizado (de color rojo vivo). Aadir una punta de esptula de ferricianuro potsico slido y mezclar, con lo que la hemoglobina del hemolizado se transformar en metahemoglobina (de color marrn). .- Se debe tener preparada y a mano una pequea cantidad de disolucin recin preparada de ditionito sdico y del hemolizado tratado con ferricianuro. .- Dejar fluir el tampn justo hasta antes de que la superficie del gel quede seca. y cerrar la llave. .- Aadir cuidadosamente con pipeta Pasteur unas 2-3 gotas de la disolucin de ditionito sdico. Abrir la llave y dejarlo fluir dentro de la columna, cerrando la llave justo cuando el menisco alcance la superficie del lecho de gel. .- Depositar con una pipeta 2 ml de tampn fosfato. Dejarlo entrar en el gel y cerrar la llave. .- Pipetear sobre la columna cuidadosamente 6 gotas de hemolizado tratado con ferricianuro (conteniendo la metahemoglobina). Abrir la llave y dejar fluir la muestra hasta que entre en el gel. Cerrar la llave. .- De nuevo aadir una pequea cantidad de tampn y dejarlo entrar en el gel. Manteniendo la llave abierta, llenar la columna con tampn para que contine la elucin de las distintas muestras aadidas. .- Observar y anotar los cambios que se van produciendo en la hemoglobina a su paso por la columna, as como la banda amarilla de ferricianuro que se observa. Ir aadiendo ms tampn si es necesario para evitar que se agote y el gel se llegue a secar. .- Continuar la adicin de tampn hasta que todo el gel quede blanco y proceder al desempaquetado de la columna, recuperando el Sephadex para su posterior. 4. - TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS 4.1. - Cul es el volumen de exclusin obtenido para la columna? 4.2. - Anotar y justificar lo que se ha observado durante la cromatografa e indicar en un dibujo las bandas que han ido apareciendo y a qu molcula corresponden.

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