BILIRUBIN D -w

Bilirrubina Directa
DMSO. Sin blanco de muestra
Determinacin cuantitativa de bilirrubina IVD
Conservar a 2-8C PRINCIPIO DEL METODO La bilirrubina reacciona con una sal de diazonio midindose fotometricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubinglucurnido y bilirrubina libre ligada a la albmina, solo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilizacin con dimetilsulfxido (DMSO) y urea para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinacin de la bilirrubina indirecta se determina tambin la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de bilirrubina presente en la muestra ensayada1,2. SIGNIFICADO CLINICO La bilirrubina se origina por la degradacin de la hemoglobina, es transportada del bazo al hgado y se excreta en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas ms probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total: Aumento de la hemlisis, alteraciones genticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyeticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa: Colestasis heptica, alteraciones genticas y alteraciones hepticas1,5,6. El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio. REACTIVOS

4. 5.

Mezclar e incubar exactamente 3 minutos a 15-25C. Leer la absorbancia (A) del Patrn y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mnimo 60 minutos.

CALCULOS Con Patrn: ( A ) Muestra x Conc. Patrn = mg/dL de bilirrubina D ( A ) Patrn Con Factor: (A) Muestra x Factor* = mg/dL bilirrubina D en la muestra

*Factor:

Concentracin del Patrn ; Factor terico = 8,5 ( A ) Patrn ( A ) Blanco Patrn

Factor de conversin: mg/dL x 17,1 = mol/L. CONTROL DE CALIDAD Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados: SPINTROL H Normal y Patolgico (Ref. 1002120 y 1002210) Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, se debe revisar el instrumento, los reactivos y la calibracin. Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias. VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina Directa Hasta 0,25 mg/dL Hasta 4,27 mol/L Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CARACTERISTICAS DEL METODO Rango de medida: Entre el limite de deteccin 0,04 y el limite de linealidad 20 mg/dL. Si la concentracin de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2. Precisin:
1

R1 R2 Opcional

5 mmol/L 3 mol/L Urea 1 mol/L cido sulfrico (SO4 H2) BILIRUBIN CAL Patrn de bilirrubina 20 mg/dL Cod:1002250

Sal de diazonio

PRECAUCIONES cido sulfrico: Corrosivo (C). R34: Provoca quemaduras. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acudir a un mdico. S30: No echar jams agua a este producto. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico.

PREPARACION Reactivo de trabajo (RT): Reconstituir ( ) el contenido de un vial de R 1 en 1 mL de agua destilada. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Aadir la mezcla al frasco R 2, tapar y mezclar suavemente. Estabilidad: 1 mes a 2-8C, protegido de la luz.
CONSERVACION Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8C, protegidos de la luz y se evita la contaminacin durante su uso. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partculas y turbidez.

Media (mg/L) SD CV (%)

Intraserie (n= 20) 0,85 2,49 0,01 0,04 1,45 1,72

Interserie (n= 20) 0,78 2,73 0,03 0,11 4,98 3,96

Sensibilidad analtica: 1 mg/dL = 0,002 A. Exactitud: Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemticas significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales (x): Los resultados obtenidos con 50 muestras fueron los siguientes: Coeficiente de regresin: (r) 0,9918. Ecuacin de la recta de regresin: y= 1,008x + 0,0013. Las caractersticas del mtodo pueden variar segn el analizador utilizado. INTERFERENCIAS Interfiere a partir de concentraciones de: Hemoglobina (0,6 g/L) y 2 Trigliceridos (5,60 mmol/L) . Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren con la 3,4 determinacin del bilirrubina . NOTAS 1. Para la determinacin de bilirrubina en neonatos, pipetear 50 L de muestra. Multiplicar el resultado obtenido por 2. 2. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicacin de este reactivo en distintos analizadores. BIBLIOGRAFIA
1. 2. 3. 4. 5. 6. Kaplan A et al. Bilirubin. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1238-1241, 436 and 650. Bonora R et al. A single reagent method for determination of total and conjugated bilirubin with a centrifugal analyzer. Clin Cim 1983; 128: 407-414. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.

MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 590 nm. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS 1 Suero o plasma libre de hemlisis . Proteger de la luz. Estabilidad de la muestra: 4 das a 2-8C o 2 meses a 20C. PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . 590 nm (570-610) Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 15-25C 2. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta: RT (mL) Agua destilada (L) Muestra(Nota 1) / Patrn (L) Blanco 1,0 100 -B. Directa 1,0 -100

PRESENTACION

Ref: 1001047

Cont.

10 x 20 mL

BSDTT43

Ed.2003

SPINREACT,S.A. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: spinreact@spinreact.com

BILIRUBIN D -w

Bilirubin Direct
DMSO. Without sample blank
Quantitative determination of bilirubin IVD Store at 2-8 C
PRINCIPLE OF THE METHOD Bilirubin reacts with diazonium salt and is measured photometrically. Of the two fractions presents in serum, bilirubin-glucuromide and free bilirubin loosely bound to albumin, only the former reacts directly in aqueous solution (bilirubin direct), while free bilirubin requires solubilization with dimethylsulphoxide (DMSO) and urea to react (bilirubin indirect). In the determination of indirect bilirubin the direct is also determined, the results correspond to total bilirubin. The intensity of the color formed is proportional to the bilirrubin concentration in the sample1,2. CLINICAL SIGNIFICANCE Bilirubin is a breakdown product of hemoglobin, it is transported from the spleen to the liver and excreted into bile. Hyperbilirubinemia results from the increase of bilirubin concentrations in plasma. Causes of hyperbilirubinemia: Total bilirubin: Increase hemolysis, genetic errors, neonatal jaundice, ineffective erythrpoiesis, and drugs. Direct bilirubin: Hepatic cholestasis, genetic errors, hepatocellular damage1,5,6. Clinical diagnosis should not be made on a single test result; it should integrate clinical and other laboratory data. REAGENTS R1 R2 Optional Diazonium salt 5 mmol/L Urea 3 mol/L Sulphuric acid (H2SO4) 1 mol/L BILIRUBIN CAL Bilirubin Standard 20 mg/dL Ref: 1002250

4. 5.

Mix and incubate exactly for 3 minutes at 15-25C. Read the absorbance (A) of the samples and Standard, against the Blank. The colour is stable for at least 60 minutes.

CALCULATIONS - With Standard: ( A ) Sample x Conc. Standard = mg/dL bilirubin D ( A ) S tan dard - With Factor: (A) Sample x Factor* = mg/dL bilirubin D in the sample *Factor:
Concentration of S tan dard ; Theoretical factor = 8.5 ( A ) S tan dard ( A ) S tan dard Blank

Conversion factor: mg/dL x 17.1 = mol/L. QUALITY CONTROL Control Sera are recommended to monitor the performance of assay procedures: SPINTROL H Normal and Pathologic (Ref. 1002120 and 1002210). If control values are found outside the defined range, check the instrument, reagent and calibration for problems. Each laboratory should establish its own Quality Control scheme and corrective actions if controls do not meet the acceptable tolerances. REFERENCE VALUES Bilirubin Direct Up to 0.25 mg/dL Up to 4.27 mol/L These values are for orientation purpose; each laboratory should establish its own reference range. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Measuring range: From detection limit 0.04 to linearity limit 20 mg/dL. If the concentration is greater than linearity limit dilute 1/2 the sample with ClNa 9 g/L and multiply the result by 2. Precision:
1

PRECAUTIONS Sulphuric acid: Corrosive (C). R34: Causes burn. S26: In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and sep medical advice. S30: Never add water to this product. S45: In case of accident or if you feel unwell, sep medical advice immediately. PREPARATION Working reagent (WR): Dissolve ( ) the contents of one vial R 1 in 1 mL of distilled water. Cap and mix gently to dissolve contents. Add the mixture to the R 2 bottle. Cap and mix gently Working reagent stability: 1 month at 2-8C, protected from light.
STORAGE AND STABILITY All the components of the kit are stable until the expiration date on the label when stored tightly closed at 2-8C, protected from light and contaminations prevented during their use. Do not use reagents over the expiration date. Signs of reagent deterioration: - Presence of particles and turbidity.

Mean (mg/L) SD CV (%)

Intra-assay (n=20) 0.85 2.49 0.01 0.04 1.45 1.72

Inter-assay (n=20) 0.78 2.73 0.03 0.11 4.98 3.96

Sensitivity: 1 mg/dL = 0.002 A. Accuracy: Results obtained using SPINREACT reagents (y) did not show systematic differences when compared with other commercial reagent (x). The results obtained using 50 samples were the following: Correlation coefficient (r): 0.9918. Regression equation: y= 1,008x + 0,0013. The results of the performance characteristics depend on the analyzer used. INTERFERENCES 2 Haemoglobin (0.6 g/L) and Triglycerides (6.60 mmol/L), may interfere . A list of drugs and other interfering substances with bilirubin determination 3,4 has been reported by Young et. al . NOTES 1. For bilirubin determination in newborns, pipette 50 L of sample. Multiply the result by 2. 2. SPINREACT has instruction sheets for several automatic analyzers. Instructions for many of them are available on request. BIBLIOGRAPHY
1. 2. 3. 4. 5. 6. Kaplan A et al. Bilirubin. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1238-1241, 436 and 650. Bonora R et al. A single reagent method for determination of total and conjugated bilirubin with a centrifugal analyzer. Clin Cim 1983; 128: 407-414. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.

ADDITIONAL EQUIPMENT - Spectrophotometer or colorimeter measuring at 590 nm. - Matched cuvettes 1.0 cm light path. - General laboratory equipment. SAMPLES 1 Serum or plasma, free of hemolisis . Protect samples from direct light. Stability: Bilirubin is stable at 2-8C for 4 days and 2 months at 20C. PROCEDURE 1. Assay conditions: Wavelength: . . . . . . . . . . . . . .. 590 nm (570-610) Cuvette: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm light path Temperature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15-25C 2. Adjust the instrument to zero with distilled water. 3. Pipette into a cuvette: WR (mL) Distilled water (L) Sample (Note 1) / Standard (L)
BSDTT43 Ed.2003

Blank 1.0 100 --

Direct B. 1.0 -100

PACKAGING

Ref: 1001047

Cont.

10 x 20 mL

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