CONCLUSION

La sensibilidad de un mtodo representa la cantidad mnima de protena necesaria para dar una respuesta detectable.

En vista de los objetivos propuestos en este practico de laboratorio se concluye que: Respecto a la cuntificacion de protenas, se pudo cometer errores desde el momento de toma de muestras hasta la cuantificacin propiamente dicha, tanto analtica como grficamente:
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Analticamente, en lamaproximacin del valor promedio de la pendiente k. Grficamente: errores de extrapolacin al aproximar.

Los resultados obtenidos de ambos mtodos son similares por lo que se puede atribuir las diferencias a los errores mencionados. Los volmenes de siembra para la electroforesis se estiman a partir del calculo mediante mtodo analtico ya que se considera menor el error introducido respecto al mtodo grafico. Por otro lado, Siempre se debe tratar de obtener valores de protena por el centro de la zona proporcional de la curva, ya que representa el valor mas certero; ni muy cerca de la zona saturada, ni muy cerca del 0.. En este caso, los valores de protena dieron por la mitad de la curva aproximadamente, excepto el 327 del suero, y el 312 del plasma, que fueron descartados por estar en la zona saturada.

En cuanto al calculo de los pesos moleculares de las protenas marcadas en el gel, se puede haber cometido errores en el redondeo del valor de frente de corrida y en la extrapolacin grafica. Como observacin se puede agregar que se debe tener cuidado en la preparacin del gel (utilizar guantes y material adecuado) ya que se manipulan neurotxicos.

De los datos , se obtiene que el valor promedio de la pendiente en la zona de proporcionalidad es k= .Tambien se aprecia que la zona de proporcionalidad llega hasta 60 ug de protena, por lo tanto por encima de este valor, se presenta la zona de saturacin. A continuacin, Se prepararon muestras de hgado, cerebro, suero y plasma; uno con 5ul y otro con 10ul de muestra y se llevo a 100 ul de solucin agregando agua destilada. Luego se mide la absorbancia de las muestras en el espectrofotmetro y se puede determinar grafica o analticamente la concentracin de protena en las mismas.

OBJETIVOS 1. Estimar cantidad de protenas en la muestra para calcular el volumen de muestra que se debe sembrar para el segundo objetivo. ACTIVIDAD N2 La electroforesis Permite el clculo de parmetros moleculares (al contrario que el resto de los tipos de electroforesis), pues los complejos SDSprotena se separan estrictamente segn su tamao molecular. El SDS interacciona con las protenas formando complejos de caractersticas independientemente de las de cada protena. Las protenas unen una molcula de SDS por cada dos aminocidos, lo que implica que las cargas propias de las protenas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la molcula de SDS proporciona una carga negativa, por lo que los complejos SDS-protena estn cargados negativamente de forma uniforme (la carga por unidad de masa es prcticamente constante para todos los complejos). la movilidad electrofortica en una PAGE es funcin del tamao y de la carga por unidad de masa; como sta es constante para todos los complejos SDS-protena (que, adems, tienen la misma forma

elipsoide), esta movilidad es solamente funcin de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la masa molecular de la protena, mayor ser la movilidad de la misma y viceversa. En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de protenas debido a: 8 La gran mayora de las protenas son solubles en SDS. 8 Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo sentido. 8 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas. 8 La separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa molecular, que se puede calcular. 8 Los complejos SDS-protena se tien fcilmente.

Una vez teido el gel de poliacrilamida, la imagen que se obtiene es un conjunto de bandas coloreadas sobre un soporte transparente. Su anlisis permite identificar el nmero mnimo de componentes (bandas) de cada muestra. Cada banda se caracteriza por su movilidad electrofortica relativa (Ur) En las condiciones de la SDS-PAGE, si se representan los valores de logaritmo del peso molecular (logM) frente a la movilidad electrofortica (Ur) de un conjunto de protenas, se obtiene una relacin lineal . Normalmente, se utiliza un conjunto de protenas de peso molecular conocido (marcadores de peso molecular) que se someten a SDS-PAGE en el mismo gel que se analizan las protenas cuyos peso molecular se desea conocer.

Preparacion del gel:30% acrilamida

El Buffer utilizado es TRIS con pH 8,8 (se asegura con pHmetro). Se agrega acrilamida y la bisacrilamida y el catalizador lento (persulfato de amonio) que cataliza la unin de los compuestos Se agrega butanol (baja solubilidad en agua) para sellar el gel por arriba de las placas ya que el oxigeno es inhibidor de la polimerizacin. Adems sirve para que no se genere un menisco en la parte superior, sino que sea plano; y para eliminar burbujas que puedan formarse. Se agrega el catalizador rpido que contiene mucho N. el catalizador acelera la reaccin de polimerizacin y homogeiniza el gel. Se llevara a cabo la polimerizacin de todas formas si no se agregara catalizador pero seria un gel con aglomeracin de acrilamida, es decir, heterogneo. Se agita la mezcla. El gel es bifsico. El superior es de apilamiento; tiene poro de mayor tamao( concentracin 4% acrilamida) para que toda la muestra pueda atravesarlo. Tiene pH 6,8 (el mismo pH que tienen las muestras) por lo tanto las muestras no van a tener carga neta (o muy poca), entonces la nica fuerza que va a estar actuando es una fuerza ionica que genera que la muestra tienda a moverse hacia abajo y entren todas las muestras al mismo tiempo al gel resolutivo. Se coloca buffer arriba y abajo para que haya conductividad de electrolitos de arriba hacia abajo. Una de las placas de vidrio tiene una ranura o escotadura para que el buffer pueda entrar en contacto con las muestras y hace generar la conductividad elctrica. Luego de agregar el buffer se siembran las muestras. Los carriles tambin contienen glicerol que juega el papel de espesante. El colorante se pone para poder observar el frente de corrida. Este corre mas rpido que la muestra, por lo tanto va delante de las

protenas. Si no se ve mas el colorante significa que ya llego al fondo y podra haber perdido cierta cantidad de protenas. Una vez terminada la corrida, se separa el stacking del resolutivo y se tie este ultimo con coomassie blue. Para observar las bandas se usa decolorante de coomassie ya que todo el gel esta teido; este fija las protenas entre si y al gel, para que no sigan corriendo ni difundiendo.

ELECTROFORESIS: las protenas se separan dependiendo del PM; la corrida de las mismas tambin se basa en esto. Se toma como referencia donde comienza el gel resolutivo hasta el frente de corrida: distancia del frente de corrida. La distancia recorrida por la protena es directamente proporcional al log PM. Patron: se conocen sus PM. Se calculan los log PM y se le asigna la distancia recorrida. Luego se grafican. Muestras: se observa la distancia recorrida, y se extrapola la distancia para obtener el PM de la protena en cuestin. GRAFICA: log PM vs. Rf (relacin del frente de corrida= distancia recorrida/distancia total). Se le puede asignar en el eje el valor del PM aunque sea log PM. Se trabaja con duplicado para obtener promedio de los valores y reducir error. Las muestras estan diluidas porque tienen alta concentracin de protenas; entonces a la concentracin obtenida de la extrapolacin se la multiplica por 10 (dilucin 1:5) y se divide entre el volumen de muestra (5uL o 10uL). Las muestras de suero humano, hgado y Calculo mediante formula: factor k para la curva patrn de albumina; es la pendiente que se obtiene de la grafica (delta y/delta x). para cada

punto se obtiene dividiendo masa de protena entre absorbancia. Donde k empieza a variar se entiende que ya se esta en la zona de saturacin. Se observa hasta donde es similar el valor de k y se promedian para obtener uno. Se hacen las graficas y tambin los cuadros con los datos. Se hacen los clculos con la formula de k. En el caso del suero cuyo segundo valor es uno saturado, se descarta, y el valor final es el primero (no se promedian) CALCULO DE VOLUMEN DE MUESTRA PARA SEMBRAR: Se deben sembrar 25 ug de muestra. Muestra de hgado tiene 14,9 ug en 1 uL; 25 ug cuanto uL se debe agregar x. El sample buffer es 2X. para correr se necesita 1X; por lo tanto se agrega un volumen de buffer en un volumen de muestra, luego el buffer queda con la concentracion 1X. Volumen de siembra (hgado): 1,67 uL de muestra + 1,67uL de sample buffer 2X. Esto se calienta durante 5-10 minutos para aumentar la desnaturalizacin de las protenas, y luego se siembra. Se la muestra estuviera muy diluida, y tuviera que agregar 25 ug de muestra, debera poner mucho volumen lo cual esta impedido por el volumen del carril (30-40 uL). Entonces se utiliza un sample buffer 6X. Conclusion de la curva de albumina: a 60 ug de albumina se satura la curva. EJERCICIO: segn la marca en el patrn, se calcula el PM y se averigua el nombre de la protena. ABSORBANCIA METODO DE LOWRY: esta basado en el poder reductor de la protena. Analizando las reacciones que se llevan a cabo se puede describir el mtodo en dos fases: la primer reaccin se da al agregar solucin alcalina a la muestra de prtoeina; luego se forma un complejo

entre el nitrgeno peptidico y el Cu2+ de la solucin alcalina. Segundo, se agrega reactivo de Folin- Ciocalteus al complejo; este reactivo es reducido por lod grupos fenol presentes en la protena (de los residuos de tirosilos, triptfano y cistena en menor medida). El reactivo de Folin reducido torna de un color azulado la solucin, dando un pico de absorcin a los 650nm. Por lo tanto, se puede utilizar un espectrofotmetro para medir la absorbancia de las muestras, que ser proporcional a la concentracin de Folin reducido, y esta ultima proporcional a la concentracin de protenas con ciertos Aa que reducen a folin. Para calibrar el metodo se debe utilizar una protena conocida y construir una curva patron; en este caso se utiliza albumina bovina. Se pesa una cierta cantidad de albumina en una balanza, en este caso 1ug, y se diluye en un volumen de 1uL. Luego las muestras de albumina de 5uL, 10uL, etc, sern de 5ug, 10ug, etc, debido a la relacin 1:1 de masa y volumen. A la muestra patrn se le agrega agua para completar 100mL; de esta forma se considera concentracin absoluta, se puede comparar las muestras porque todas tienen el mismo volumen.

Absorbancia vs concentracin de albumina (ug) Este mtodo falla luego de una cierta cantidad de albumina, ya que se satura, y grficamente se observa una meseta. Por lo tanto si se tiene una muestra en la zona de meseta de la curva, quiere decir que esta muy concentrada, y por ello se debera diluir para obtener un valor en la zona de proporcionalidad. EXPERIMENTAL: la absorbancia del blanco da como resultado -0,102. Este se toma como base.