Practica # 6 - Fosfatasa Alcalina

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICA PRACTICA
# 6 _ FOSFATASA ALCALINA ELABORADO POR: Andrs Felipe Zapata Betancur REVISADO POR: Jaime Andrs Pereaez - Francisco Pea APROBADO POR: Gloria Ins Jaramillo
FOSFATASA ALCALINA
Objetivo
Aplicar las diferentes metodologas para la determinacin de los parmetros cinticos de la enzimologa, de acuerdo con las propiedades fsicas y queimicas de la estructura de la Fosfatasa alcalina.
Aspectos Tericos Generalidades y principio del mtodo

La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) hidroliza los fosfosteres, liberando el fosfato inorgnico. RCOOP + H2O RCOO- + Pi
Ejerce su accin a pH elevado, del orden de 10. La presencia de iones Zn 2+ es necesaria para su actividad, mientras que el fosfato la inhibe. La especificidad de la enzima por R es dbil (estructuralmente es posible variar R conservando la actividad enzimtica) y R puede ser un radical alqulico o fenlico. R-OH puede ser un alcohol primario o secundario, un fenol o un alcohol cclico. El sustrato que usaremos en este ensayo ser el p-Nitrofenilfosfato. (PNPP).
OPO3-H2O Enz HPO3

--
OH
NO2
NO2
Fecha Elab: 15/08/2011
Feche Rev: 15/08/2012
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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA 5-324 MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICA PRACTICA # 6 _ FOSFATASA ALCALINA ELABORADO POR: Andrs Felipe Zapata Betancur REVISADO POR: Jaime Andrs Pereaez - Francisco Pea APROBADO POR: Gloria Ins Jaramillo
PNPP
PNP
Este sustrato es incoloro pero por hidrlisis se libera el p-Nitrofenol (PNP), que es amarillo y absorbe a = 410 nm, lo cual posibilita seguirlo espectrofotometricamente. Este es el principio fundamental de esta prctica. En resumen: Si por accin de la enzima se produce el p-nitrofenol, precisamos de un mtodo que nos permite cuantificar sta sustancia para as calcular la velocidad de la reaccin medida por la enzima. Para ello debemos hacer una curva de calibracin:
Reactivos
Buffer de glicina 0.05 M, pH 10.4 Solucin fosfato disdico 0.5 M Solucin de p-Nitrofenol (PNP) 10-4M. (Para esta solucin y las disoluciones sucesivas, utilice el buffer de Glicina como solvente). Solucin acuosa de ZnCl2 610-4M Solucin enzimtica: Suero sanguneo diluido 1/2 con buffer de glicina Solucin acuosa de p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 510-3M Solucin acuosa de Na2HPO4 0.510-2M.
Preparacin de Reactivos
Solucin buffer glicina 0.05 M pH 10.4 o Calculo para la preparacin de 1 litro mg Glicina =
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o Diluir con agua en un beaker, llevar a un pH 10.4 con NaOH concentrado, luego se debe pasar a un baln volumtrico de 1000 ml y aforar con H 2O destilada. Nota: Se debe repetir este procedimiento 3 veces para ajustar los 4 litros necesarios para las prcticas. Solucin fosfato disdico 0.5 M o m K2HPO4 = 0.5 mol x 174.1810 g x 1 L = 87.0905 g L 1 mol o Llevar a un baln volumtrico de 1000.0 ml y aforar con H2O destilada. Solucin de p-Nitrofenol (PNP) 10-4M o Tomar 0.1391 g PNP y llevarlo a 100.0 ml con Buffer Glicina. o Luego se debe tomar una alcuota de la solucin anterior de 10.0 ml y llevarla a un baln de 1000.0 ml o Aforar con Buffer Glicina. Solucin acuosa de ZnCl2 610-4M o m ZnCl2 = 6 x 10-4 mol x 136.276 g x 0.5 L = 0.0409 g L 1 mol o Llevar a un baln volumtrico de 500.0 ml y aforar con H2O destilada. Solucin enzimtica: Suero sanguneo diluido 1/2 con buffer de glicina o Tomar 1 ml de suero fetal bovino y diluir con 1 ml de buffer glicina. o Conservar la proporcin para elaborar volmenes finales mayores Solucin acuosa de p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 510-3M o m PNPP= 5 x 10-3 mol x 263.049 g x 0.05 L = 0.0658 g L 1 mol o Llevar a un baln volumtrico de 250.0 ml y aforar con H2O destilada. o Si la solucin se pone de color amarillo se debe preparar una nueva solucin y se utiliza un frasco mbar. Fosfato (HPO-24) 0.5 x 10-1 M (Calculo dependiente de la sal a utilizar, Na o K) o Solucin Inhibidora, Realmente se preparara una solucin 0.5 x 10 -1 M, y en caso de ser necesario se debe diluir 7/10, ya que la concentracin 0.5 x 10-2 M, no presento efectos inhibitorios significativos.
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o m K2HPO4 = 0.5 x 10-1 mol x 174.1810 g x 0.25 L = 2.1773 g L 1 mol o Llevar a un baln volumtrico de 250.0 ml y aforar con H2O destilada.
Seccin experimental
Construccin de una curva de calibracin Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNP. Utilicen como solucin diluyente el buffer de Glicina. Luego de haber realizado las diluciones adicione 1 ml de la solucin de Fosfato 0.5 M y 0.5 ml de la solucin de ZnCl2 610-4 M a cada uno de los tubos. Prepare un blanco para este experimento. Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice las lecturas. Registre las absorbancias obtenidas
Tubo Dilucin PNP 10-4M Buffer de Glicina Fosfato de sodio 0.5M Sln de ZnCl2 610-4M Absorbancia Concentracin PNP
1 4 mL 0 1 0.5
2 1/2 2 1 0.5
3 1/4 2 1 0.5
4 1/8 2 1 0.5
5 1/16 2 1 0.5
Blanco 0 3 0 0.5
Calcule la concentracin de PNP en cada una de las diluciones Realice el grfico de A en funcin de la concentracin de PNP Exprese la concentracin en mol/L.
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Influencia de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica: Determinacin de parmetros cinticos Km y Vm Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNPP. Utilicen como solucin diluyente el buffer de Glicina. Luego de haber realizado las diluciones adicione 0.5 ml de la solucin de ZnCl2 610-4 M a cada uno de los tubos. Tubo PNPP
Sln. ZnCl2 610-4M
1 4 ml 0.5
2 1/2 0.5
3 1/4 0.5
4 1/8 0.5
5 1/16 0.5
Blanco 0 0.5
Absorbancia Prepare un blanco para este experimento. Deje en reposo durante 5 minutos Luego poner los tubos a 37C por 5 minutos, el suero fetal 1/2 tambin de de calentarse bajo las mismas condiciones. Luego adicionar 0.5 mL de la solucin enzimtica (Suero Fetal Bovino). Garantizar que cada tubo reaccione con la solucin enzimtica exactamente 15 minutos a 37 C. Detener la reaccin con 1 mL Na2HPO4 0.5 M. Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice las lecturas. Registre las absorbancias obtenidas Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la curva de calibracin obtenida en la prctica anterior. Construya y complete la siguiente tabla [PNPP] Absorbancia [PNP] V0 = [PNP]/min 1/[PNPP] 1/V0
Grafique los inversos y determine Km y Vm
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Determinacin del tipo de inhibicin Preparar en 5.0 tubos numerados del 1 al 5 y un blanco, las siguientes mezclas: Tubo 0.5 mL PNPP Inhib.0.510-2M Sln. ZnCl2 1 4 ml 0.5 0.5 2 1/2 0.5 0.5 3 1/4 0.5 0.5 4 1/8 0.5 0.5 5 1/16 0.5 0.5 Blanco 0 0.5 0.5
Dejar en reposo durante 15 minutos. Luego poner los tubos a 37C por 5 minutos, el suero fetal tambin de de calentarse bajo las mismas condiciones. Luego adicionar 0.5 mL de la solucin enzimtica. Garantizar que cada tubo reaccione exactamente 15 minutos a 37 C. Detener la reaccin adicionando 1 ml de a cada tubo Na2HPO4 0.5 M. Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice las lecturas. Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la curva de calibracin obtenida en la prctica anterior. Construir la misma tabla que utiliz para determinar los parmetros enzimticos, Km y Vm, y ahora calclelos en presencia del inhibidor. Determinar el tipo de inhibicin.
Preguntas
Cul es la importancia clnica de la fosfatasa alcalina? En este caso, se puede considerar el fosfato como un ihnibidor por producto? Sera posible revertir la inhibicin provocada por el fosfato aumentando la concentracin de PNPP?
Nota: En todos los ensayos enzimticos, es fundamental que el material de vidrio este limpio. Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.
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Todas las mediciones de volmenes deben ser exactas.
Bibliografa
Salamanca R. Notas del curso. Laboratorio de Bioqumica. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia. Cardona W. Notas del curso. Laboratorio de Bioqumica. Universidad de Antioquia: Medelln, Colombia.
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Grafique los inversos y determine Km y Vm

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Todas las mediciones de volmenes deben ser exactas.

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