Sei sulla pagina 1di 90

GENETICA

Date de contact:

GENERALA

Coordonator curs: Lector Dr. Mirela Mihaela Cimpeanu e-mail: mypanda64@yahoo.com Tutore: Lector Dr. Mirela Mihaela Cimpeanu e-mail: mypanda64@yahoo.com Obligatii minimale ale studentilor in vederea promovarii examenului la disciplina GENETICA GENERALA
Parcurgerea intregii materii incluse in suportul de curs; Definirea principalelor notiuni de genetic si caracterizarea ultastructural functionala a materialului genetic si a proceselelor si fenomenelor prezentate in suportul de curs; Comunicarea permanenta cu tutorele disciplinei in vederea elucidarii unor aspecte particulare si a intelegerii generale a materiei de curs; Prezenta directa la toate orele de lucrari practice de laborator; Definirea principiilor de baza si a scopului metodelor de laborator parcurse in cadrul orelor de lucrari practice; Insusirea etapelor de lucru ale metodelor de laborator parcurse; Dobandirea unei experiente generale practice de laborator; Corelarea cunostintelor dobandite din suportul de curs cu aplicatiile practice de laborator.

Modul de stabilire a notei finale


Nota finala la disciplina Genetica generala va fi acordata astfel: evaluarea activitatii desfasurate in cadrul orelor de lucrari practice: 50% examenul final la disciplina: 50%

Teme de licen ce pot fi abordate la disciplina GENETICA GENERALA


1. Caracterizarea complementului cromosomial la diferite specii din flora spontana 2. Intocmirea de cariotipuri la diverite specii vegetale de interes alimentar, medical etc. 3. Caracterizarea complementului cromosomial la diferite specii din fauna piscicola 4. Studii comparative asupra efectelor unor mutageni fizici si/sau chimici asupra materialului genetic, la diferite organisme model 5. Studiul efectelor poluarii asupra materialului genetic la diferite organisme model

GENETICA GENERALA
Suport de curs Unitatea de invatare 1 1. Din istoricul cercetarilor de genetica
Termenul "genetic" a fost propus, la cel de-al III-lea Congres Internaional de Hibridare i Ameliorare a Plantelor (Londra), de ctre W. Bateson, cel ce avea s devin titularul primei catedre de profil din lume (catedra de Genetic de la Cambridge - Anglia, nfiinat n 1909). Civilizaia Greciei antice ne-a lsat mrturii, de o deosebit profunzime i corectitudine, relative la fenomenul ereditii. n privina omului, de pild, grecii au reluat idei ale filosofiei indiene, idei de sorginte eugenic, n conformitate cu care omul poate fi mbuntit dac generaiile succesive sunt asigurate de indivizi sntoi, inteligeni, frumoi etc. Un punct de reper n orice analiz a antichitii greceti l constituie momentul Aristotel (384322 .e.n.). Aristotel a pus bazele embriologiei, urmrind ontogenia puiului de gin - proces n care se pot face magistrale demostraii relative la fenomenul ereditii. In Roma antic i-a etalat i dezvoltat concepiile Galenos Claudios (129-199). Renumitul medic a efectuat experimente i observaii, a adunat i prelucrat date referitoare la procese de ncruciare la animale i a ajuns la concluzia c cele dou sexe au rol egal n transmiterea caracterelor ereditare. Dupa Evul Mediu, toate acumulrile de pn atunci, combinate cu noile date furnizate de dezvoltarea fr precedent a agriculturii (producia vegetal i animal), a industriei (solicitant a noi cantiti i a noi materii i materiale) i a relaiilor interumane, au fundamentat noua concepie tiinific, noua poziie a omului n cadrul naturii. n anul 1651, W. Harwey, cel ce a descoperit i a descris circulaia sngelui, stabilete un adevr incontestabil i incomensurabil ca valoare - toate vieuitoarele provin din ou fecundate. In 1665, n premier mondial, R. Hooke (1635-1703) descrie celula. Simultan, Antony van Leeuwenhoeck (1632-1723) descoper (cu microscopul perfecionat de el nsui) i descrie multe microorganisme i spermatozoizii de om, cine i iepure. La mai puin de 50 de ani, adic n 1735, apare opera suedezului Carol Linn (1707-1778), Systema nature, oper fundamental pentru teoreticieni i practicieni ntruct, n numai 12 pagini, oferea criterii clare de delimitare i caracterizare a speciilor, obiectul concret de lucru pentru cei ce investigau anatomia, fiziologia, reproducerea i comportamentul organismelor vegetale i animale. Un punct nodal n demersurile pentru o concepie biologic modern l reprezint descrierea nucleului celular de ctre Schneider, Schwann, Schleiden, Virchow. Mai precizm c dac diviziunea celulei animale fusese observat n 1827, iar cea a celulei vegetale (la o alg) n 1832, meioza a fost descris abia n 1870. Dar, pentru o istorie a geneticii, este obligatorie prezentarea descoperirilor efectuate de Ch. Naudin care, n anul 1859, a publicat lucrarea Nouvelles recherches sur l'hibridit dans les vegetaux. n respectiva lucrare, Naudin sublinia aspecte importante ale transmiterii caracterelor ereditare, i anume: uniformitatea hibrizilor din prima generaie, diversitatea lor n generaiile urmtoare, segregarea "esenelor" (aa numete Naudin factorii ereditari), revenirea la formele parentale etc. Naudin a lucrat cu specii ale genurilor Papaver, Primula, Datura, Nicotiana. Din pcate, el nu a reuit s surprind i s enune legitile transmiterii caracterelor, legitile ereditii. Acest merit i va reveni lui Mendel.

2. Legile ereditatii
2.1. Johann Gregor Mendel (1822-1884) - fondatorul geneticii
Pregtit de o multitudine de descoperiri, observaii i experimente, diseminate pe ntregul parcurs al istoriei umane, momentul naterii geneticii ca tiin este momentul Mendel, mai precis, anul 1865, an n care opera sa Versuche ber Pflanzenhybriden (Experiene asupra

hibrizilor la plante, tradus i la noi, abia n 1945, de A. Piescu, n Buletinul Cultivrii i Fermentrii Tutunului) a primit bun de tipar i a fost publicat ntr-o modest revist provincial - "Revista Naturalitilor din Brnn. Pentru a nu exista neclariti, precizm: n 1900 copilul minune al biologiei a fost regsit i nscris n actele oficiale. Naterea lui, ns, avusese loc n 1865.

Johann Gregor Mendel (1822-1884)

2.2. Experimentele efectuate de Johann Gregor Mendel


Mendel a experimentat pe diverse specii de plante aparinnd genurilor Hieracium, Phaseolus i Pisum, atenie deosebit acordnd ns mazrii (Pisum sativum). n primul rnd, Mendel a ales ca obiect de studiu o specie autogam - Pisum sativum. A avut, astfel, posibilitatea de a urmri, n descenden, comportarea hibrizilor pe care i-a obinut, n ritm i n proporii strict determinate. n cel de al doilea rnd, Mendel a fcut ceea ce nu au gndit predecesorii si - a verificat puritatea genotipic a plantelor luate n studiu. Pentru a fi sigur, Mendel a verificat descendena fiecrui individ, timp de 3-4 generaii. Se impune, cu aceast ocazie, nc o remarc. Alegerea mazrii ca obiect pentru investigaii a fost benefic deoarece: specia este autogam, alterarea rezultatelor prin polenizri necontrolate fiind exclus; perioada de vegetaie este scurt; trsturile fenotipice contrastante (dominante-recesive) sunt distincte; castrarea plantelor este relativ uoar; sunt multe soiuri n cadrul speciei, hibrizii dintre diferitele soiuri sunt fertili;

2.2.1. Monohibridarea
n multe manuale de biologie se afirm c monohibridarea presupune ncruciarea ntre dou organisme deosebite ntr-o singur pereche de caractere. ntruct se pot nate confuzii, grave uneori, supunem ateniei urmtoarele aspecte ale problemei. Este vorba de manifestri diferite ale aceluiai caracter, nu de caractere diferite. Culoarea verde sau galben nu reprezint caractere diferite, ci manifestri diferite (fenotipic) ale aceluiai caracter (caracterul culoare, n cazul de fa). Prin urmare, monohibridarea reprezint procesul de ncruciare (hibridare) a doi indivizi aparinnd aceleiai specii, genotipic puri (adic homozigoi), deosebii ntre ei prin manifestarea fenotipic a unui singur caracter. Mendel a utilizat, pentru monohibridare, dou soiuri de mazre: unul cu boabe de culoare galben i altul cu boabe de culoare verde. Reamintim c, nainte de a efectua hibridarea, Mendel a perpetuat timp de 3-4 ani fiecare soi, spre a se convinge c este stabil (c ester genotipic pur, n terminologia genetic actual). Recurgnd la castrare i fecundare artificial, n prima generaie hibrid, notat cu F1 (adic prima generaie filial - n latin filius, filia = fiu, fiic), a obinut numai plante cu boabe de o singur culoare - galben, n experimentul de acest tip. ntruct i n privina acestui aspect apar, deseori, confuzii, recomandm revederea noiunilor de botanic i precizm: plantele ce au fost supuse castrrii i polenizrii artificiale reprezint generaia parental (desemnat n tabele i grafice cu simbolul P), iar boabele aprute

pe ele, n urma dublei fecundri prin care a luat natere embrionul (diploid) i endospermul (triploid), reprezint generaia filial, hibrid (desemnat prin F1). Prima constatare a lui Mendel a fost: toi hibrizii din prima generaie aveau o singur culoare a boabelor. Experimentnd cu alt caracter (pe aceeai specie), de pild forma boabelor netede i zbrcite, a constatat c n F 1 toi indivizii aveau boabe netede. Pe baza acestui experiment, Mendel a enunat principiul uniformitii hibrizilor n F1. Perpetund respectivii hibrizi, prin autofecundare, n cea de-a doua generaie Mendel a constatat reapariia fenotipurilor parentale (reapariia expresiilor fenotipice etalate de cei doi prini), n raport de aproximativ 3:1. n consecin, a fost enunat cel de-al doilea principiu segregarea hibrizilor n F2. Deci, Mendel a admis i precizat c n F1 se manifest fenomenul de dominan i recesivitate, n sensul c este etalat doar una dintre posibilitile de exprimare a caracterului (cea dominant), cealalt rmnnd ascuns (recesiv). Prin simboluri, experimentul efectuat de Mendel poate fi reprezentat astfel:
Prinii Gameii F1 Gameii Galben() () x Verde() Hibridare x () Galben() Autofecundare () i () () i () 1 galben ()+2 galben ()+1 verde() 3:1 1:2:1

F2 Segregare fenotipic Segregare genotipic

ntruct, la acea vreme, nu se cunotea nimic despre cromosomi i gene (substratul material al informaiei ereditare), Mendel a folosit termenul de factori ereditari i a presupus, cu o extraordinar intuiie, c n fiecare celul a organismului factorul ereditar determinant al unui caracter se afl n doz dubl, n timp ce n celulele sexuale se afl n doz simpl. Schematic, situaia poate fi redat i astfel:
Prinii Gameii F1 Gamei Produi n F1 F2 Segregare genotipic Segregare fenotipic AA A Aa AA 1 X aa X a Autofecundare sau hibridare de tipul frate x sor A i a A i a 2Aa 2 3:1 Aa 1

Evident, prin A se desemneaz factorul ereditar dominant i prin a factorul ereditar recesiv. Apoi Mendel a precizat c, dup fecundare i formarea zigotului, factorii ereditari nu se contopesc, ci doar se altur. n consecin, cnd se formeaz din nou gameii, ei se vor despri, fiecare trecnd ntr-un gamet. Astfel, conchide Mendel, gameii sunt puri din punct de vedere genetic. Aceasta este considerat prima lege elaborat de Mendel, supranumit: LEGEA PURITII GAMEILOR.

2.2.2. Dihibridarea
n a doua etap a experimentului, Mendel a recurs la ncruciarea de indivizi care se deosebeau prin expresia fenotipic a dou caractere - culoarea i forma boabelor. El a luat soiul de mazre cu boabe netede i galbene, pe care l-a ncruciat cu soiul caracterizat prin boabe zbrcite i verzi. n F1, ca i la monohibridare, toi indivizii au fost uniformi - boabe netede i galbene. Deci, s-au manifestat fenomenele de dominan i recesivitate. n F 2 s-a manifestat segregarea, dar s-a constatat un lucru interesant: fiecare caracter segreg independent i, n consecin, ester posibil recombinarea caracterelor i apariia de noi fenotipuri. Forma boabelor a segregat n raport de 3:1. La fel i culoarea boabelor. n plus, au aprut i noi tipuri de plante - cu

boabe netede i verzi, pe de o parte, i cu boabe zbrcite i galbene, pe de alt parte. Iat cum poate fi redat, schematic, procesul: Prin A i B, s-au redat factorii ereditari dominani (determinani ai culorii galbene i ai formei netede a bobului), iar prin a i b, s-au redat factorii ereditari recesivi (determinani ai culorii verzi i ai formei zbrcite a bobului) Examinnd tabelul redat n continuare constatm c pe diagonala stnga sus - dreapta jos sunt plasai numai indivizi homozigoi (dominani n ambele caractere, recesivi n ambele caractere sau dominani ntr-un caracter i recesivi n cellalt).
Prinii Gameii F1 Gameii hibrizilor din F1 AB Ab aB ab AB AABB AABb AaBB AaBb AABB AB X X aabb ab

AaBb Autofecundare sau hibridare de tipul frate x sor Ab AABb AAbb AaBb Aabb aB AaBB AaBb aaBB aaBb ab AaBb Aabb aaBb aabb

Hibrizii din F2 care segreg, fenotipic, n raportul 9:3:3:1 i genotipic n raportul 1:1:2:2:4:2:2:1:1

Pe diagonala stnga jos - dreapta sus sunt plasai numai indivizi heterozigoi (n ambele caractere), pe diagonalele mici avem heterozigoi ntr-un singur caracter (de fiecare dat altul fiind homozigotul dominant i altul homozigotul recesiv) etc. Prin urmare, din punct de vedere al constituiei ereditare, n hibridare, prin autofecundarea hibrizilor din generaia F 1, ntlnirea probabilistic a celor patru categorii (tipuri) diferite de gamei, asigur formarea a 16 descendeni, a cror constituie genetic este de 9 tipuri i anume: 1/16 dublu homozigot dominant, 1/16 dublu homozigot recesiv, 2/16 homozigoi dominani pentru caracterul culoare i heterozigoi pentru form, 2/16 cu acelai raport de homozigoie/heterozigoie dar pentru cellalt caracter, 4/16 indivizi heterozigoi n ambele caractere, 1/16 homozigoi n ambele caractere dar unul recesiv, cellalt dominant, 1/16 cu cellalt caracter dominant (ambele homozigote), 2/16 indivizi heterozigoi pentru culoare i homozigoi recesivi pentru form i 2/16 indivizi homozigoi recesivi pentru culoare i heterozigoi pentru form. Sub aspect fenotipic, situaia se prezint astfel: 9/16 indivizi dominani (cu boabe galbene i netede), 3/16 dominani ntr-un caracter (boabe galbene i zbrcite), 3/16 dominani n cellalt caracter (boabe netede i verzi) i 1/16 indivizi recesivi n ambele caractere (boabe verzi i zbrcite). Se impune, deci, o concluzie: n dihibridare, caracterele segreg independent unul de altul. Aceasta este, de fapt, cea de-a doua legitate stabilit de Mendel - LEGEA SEGREGRII INDEPENDENTE A CARACTERELOR.. Se mai impun cteva precizri. Una dintre ele se refer la categoriile de gamei ce pot aprea n cazul monohibridrii, dihibridrii, trihibridrii etc. i, implicit, la tipurile de descendeni ce pot lua natere. Trebuie specificat c tipurile parentale de gamei sunt dependente de numrul de factori ereditari implicai n hibridare. n principiu, fiind vorba de o relaie strict matematic, vom avea 2n tipuri de gamei, n fiind 1/2 din numrul de factori ereditari aflai n stare heterozigot. Spre exemplu, dac avem un factor ereditar pentru culoarea galben i unul pentru cea verde, n=2/2=1. Prin urmare, 21=2, vom avea 2 tipuri de gamei. Recurgnd la o simbolistic universal, n care notm determinantul unui caracter cu A pentru expresia dominant i a pentru cea recesiv, cellalt determinant cu B i b etc., conform relaiei matematice precizate situaia se va prezenta astfel: - n cazul monohibridrii, prinii vor fi AA i aa, cu gameii A i respectiv, a. Hibridul va fi Aa, cu gameii A i a.

- n cazul dihibridrii, prinii AABB i aabb vor avea gamei de tipul AB i ab, hibridul fiind AaBb. De data aceasta ns, avnd n vedere legea segregrii independente a caracterelor, gameii vor fi AB, ab, Ab i aB (deci, 2n=22=4 tipuri de gamei).

2.3. Universalitatea legitilor descoperite de Mendel


Evident, se pune problema dac legitile sesizate i formulate de Mendel sunt universale, adic dac sunt aplicabile totalitii speciilor existente. n consecin, cercetri similare celor efectuate de Mendel au vizat i alte specii, inclusiv omul. Un exemplu n acest sens l constituie ncrucirile dintre cobai de culoare diferit: tipul slbatic, de culoare gri i tipul albinos (aprut prin mutaie). n hibridarea dintre o femel de tip albinos (cu blana de culoare alb), cu un mascul slbatic (cu blana de culoare gri), indivizii din generaia F 1 (puii din prima generaie) aveau n totalitate blana de culoare gri. Indivizii din F 1, ncruciai ntre ei, au dat generaia F2, n care s-a produs segregarea celor dou fenotipuri n raportul de 3 gri: 1 alb, adic 3: 1. n F1 s-a manifestat dominana fenotipului unui printe (i recesivitatea celuilalt), fenotipizarea genei estompnd fenotipizarea alelei. n consecin hibrizii erau uniformi (sub aspect fenotipic). n F2 s-a produs segregarea, fenotipic, n raportul de 3 dominant la unu recesiv Evident, ca i la mazre, fenomenul a fost explicat pe baza legii puritii gameilor. Fr a intra n alte detalii care converg spre aceeai interpretare, n concluzie, se impune precizarea: legile descoperite de Mendel au caracter de universalitate, fiind aplicabile i, deci, valabile pentru plante i animale, inclusiv pentru om.

2.4. Abateri de la principiul dominanei i recesivitii din F1 i de la raportul de segregare de tip mendelian din F 2
Aa cum am precizat i demonstrat n paginile anterioare, pe baza experimentelor de hibridare ntre diferite soiuri ale speciei Pisum sativum L., Mendel a legiferat segregarea caracterelor n descendena hibrizilor de F 1 (perpetuai prin autofecundare sau reproducere de tipul frate x sor, n cazul speciilor alogame) i, n plus, segregarea independent a caracterelor n cazul hibrizilor pentru mai mult dect un caracter. Ulterior, prin experimente i observaii efectuate n hibridri la alte specii de plante sau animale, s-a ajuns la concluzia c exist abateri de la principiul dominanei i recesivitii fenotipurilor parentale n F1 i de la raportul de segregare din F 2 sau, altfel spus, c exist alte tipuri de segregare (fa de tipul mendelian). Este evident c abaterile de la tipul mendelian de segregare se datoreaz manifestrii altor tipuri i raporturi de dominan/recesivitate. n mod normal, determinismul profund al unui caracter se datoreaz activitii unei gene. Dar, sub impactul factorilor de mediu, o gen se poate transforma ntr-o alel (prin mutaie). De obicei, genele domin asupra alelelor, n sensul c la heterozigoi se manifest fenotipul datorat genei, i numai la homozigoii recesivi, la haploizi i n cazul hemizigoiei se manifest fenotipul determinat de alela recesiv. Abaterile de la aceste reguli induc modificri ale fenomenului dominan/recesivitate i schimbri n raporturile de segregare.

2.4.1. Dominana incomplet (semidominana)


Recurgnd la o simbolistic general i unificatoare, putem nota o gen oarecare cu A i alela ei, rezultat prin mutaie, cu a. n cazul hibridrii AA x aa va rezulta individul Aa, heterozigot. Aa cum precizam, de obicei A domin pe a, fenotipul heterozigotului Aa fiind identic celui al homozigotului AA. Sunt ns i cazuri n care AA Aa. Un exemplu, devenit clasic de acum, este cel al hibrizilor dintre varieti de Mirabilis jalapa, observat n experimentele efectuate de C. Correns (n 1912). ncrucind varietatea cu floare de culoare roie, cu varietatea avnd flori de culoare alb, n F1 s-au obinut indivizi uniformi dar toi cu flori roz. ncrucind aceti indivizi ntre ei, n F2 s-au obinut indivizi cu flori roii (25%), cu flori roz (50%) i cu flori albe (25%) (deci un raport de segregare de 1:2:1, heterozigoii fiind fenotipic diferii de ambii homozigoi). n F 3 indivizii

din F2 care aveau flori roii, interncruciai, au dat doar descendeni cu flori roii, cei cu flori albe, doar descendeni cu flori albe, iar descendena celor cu florile roz a segregat n continuare, n raportul de 1:2:1.
RxA rxr R + r + A 25% 50% 25% R = rou r = roz A = alb

n acest caz (al motenirii culorii florii), absena dominanei este explicat prin mecanismele metabolice ale formrii pigmentului rou. Pigmentul se formeaz printr-o succesiune de reacii enzimatice. Gena, notat cu I n cazul de fa (de la ivory = ivoriu, alb), determin producerea pigmentului rou, iar alela i determin absena pigmentului (nu determin producerea lui). n heterozigotul Ii se asigur o concentraie redus a enzimei ce determin sinteza pigmentului. La o concentraie redus a enzimei (probabil 1/2 din concentraia normal ntlnit la homozigotul II), sinteza pigmentului este, de asemenea, redus n timpul dezvoltrii florii, deoarece pigmentul este produs n cantiti fixe i limitate per gena I.
Prinii II x ii Gameii I x i F1 Ii Gameii I i i F2 II + Ii + ii 25%+50%+25%

Un asemenea efect nu apare ns n toate sistemele, deoarece 1/2 din cantitatea de enzim este suficient pentru a asigura sinteza unei cantiti adecvate de pigment, determinnd manifestarea fenotipului dominant, n cazul heterozigoilor. Exemple de manifestare a semidominanei pot fi date pentru multe alte specii de plante sau animale. De pild, n ncruciri ntre soiuri de Zea mays cu bob albastru i cu bob galben, n F 1 rezult indivizi cu bob violaceu. n F 2 segregarea este de 1 albastru: 2 violet: 1 galben. n literatura de specialitate, pentru segregarea de acest fel se folosete expresia "segregare de tip Zea" (1:2:1), tocmai spre a o deosebi de segregarea tipic (tip Pisum, 3:1). n lumea animal, un exemplu bine cunoscut de semidominan este cel referitor la rezultatul hibridrii ntre o ras de gini cu penajul negru i o ras cu penajul alb, hibridare n urma creia rezult tipul Andaluzia, cu penajul de culoare albstruie. n F 2, din ncruciarea ntre indivizi ai tipului Andaluzia, iau natere indivizi cu penaj negru (25%), indivizi tip Andaluzia (50%) i indivizi cu penaj alb (25%). Evident, tipul Andaluzia nefiind constant, nu se poate vorbi de rasa Andaluzia (rasele la animale i soiurile la plante trebuie s fie stabile ereditar).

2.4.2. Codominana
Codominana reprezint un fenomen genetic complex datorat n esen, polialeliei. Cel mai elocvent exemplu este furnizat de situaia grupelor sanguine umane, mai ales cele din sistemele ABO i MN. n codominan se constat un comportament difereniat al alelelor, n sensul c unele dintre ele se afl n raport de dominan i recesivitate, n timp ce altele sunt codominante, n sensul c au "trie" egal i contribuie n mod egal la fenotipizarea unui nou caracter. n 1900, K. Landsteiner a remarcat c prin amestecul globulelor roii prelevate de la o persoan cu serul sanguin prelevat de la o alt persoan, se produc dou fenomene diferite - n unele cazuri, amestecul nu are repercusiuni, iar n altele se soldeaz cu aglutinarea globulelor roii. Prin aprofundarea cercetrilor s-a constatat c n serul sanguin uman exist dou tipuri de anticorpi (notai cu anti A i anti B, sau i ) i dou tipuri de antigeni (notai cu A i B) pe

globulele roii. Pe criteriul prezenei sau lipsei celor dou categorii de molecule s-a ajuns la concluzia c oamenii aparin la patru grupe sanguine, notate cu A, B, AB i 0 (zero). De fapt alelele determinante ale grupelor sanguine, notate n unele nomenclaturi cu IA, IB i I0, n altele cu LA, LB i l (n onoarea lui Landsteiner), determin sau nu sinteza unor mucopolizaharide (protein identic + grup terminal de zahr, care difer) localizate pe suprafaa globulelor roii. Alela IA determin sinteza polizaharidului A, alela IB determin sinteza polizaharidului B, iar alela I0 recesiv nu determin sinteza nici unui polizaharid. n consecin, indivizii IAIA i IAI0 produc antigenul A, indivizii IBIB i IBI0 produc antigenul B, n timp ce indivizii I0I0 nu produc antigeni (globulele lor roii sunt fr polizaharide). Interesant este faptul c descendena cuplului IAIA x IBIB (care va fi IAIB) produce ambele tipuri de polizaharide, adic ambii antigeni (A i B). Acesta este tocmai fenomenul de codominan, adic alelele IA i IB sunt dominante (fiecare) asupra alelei I0, dar sunt codominante una fa de cealalt, adic ambele contribuie n mod egal i plenar la determinarea unui nou fenotip (AB, n cazul de fa). n consecin, grupele de snge din sistemul AB0 pot fi redate schematic, ca n tabelul de mai jos. Cunoaterea grupei sanguine a unui individ este extrem de important, din dou considerente - medical i juridic. Sub aspect medical, cunoaterea grupelor sanguine este obligatorie n cazul transfuziilor. n situaia n care antigenul A vine n contact cu anticorpul (adic, globulele roii de la un individ din grupa A cu serul sanguin al unui individ din grupa B), anticorpul (proteina) se leag la antigen (polizaharid) i l inactiveaz. Concomitent, se produce agregarea (aglutinarea) globulelor roii. n consecin, transfuziile de snge pot fi efectuate doar n sensul redat n schema care urmeaz.
Antigen (polizaharid de pe globulele roii) A B A+B Anticorp (proteina din serul sanguin) Anti B () Anti A () anti A()+anti B()

Fenotip A B AB 0

Genotip IAIA i IAI0 sau LALA i LAl B B I I i IBI0 sau LBLB i LBl A B I I sau LALB I I sau ll
0 0

00 / \ AA BB \ / AB AB

Grupa 0 este donator universal, iar grupa AB este primitor universal. Grupa A poate dona grupei A i AB i poate primi de la A i 0. Grupa B poate primi de la B i 0 i poate dona grupei B i AB. Fiind genic determinate, evident, grupele sanguine sunt ereditare. Cele trei alele LA, LB i l ocup acelai locus pe cromosomii omologi. Alela LA prezint mai multe mutaii, dou dintre ele fiind mai frecvente - LA1 i LA2, ntre ele fiind un raport de dominan (LA1 domin pe LA2). n consecin, fenotipic, grupele sanguine din sistemul AB0 sunt A1, A2, B, A1B, A2B i 0, conform tabelului:
Fenotip A1 A2 B A1B A2B 0 Genotip L L ,L L ,L l L L ,L l L L ,L l A1 B L L LA2LB Ll
B B B A2 A2 A2 A1 A1 A1 A2 A1

Fr ndoial, innd cont de raportul de dominan, codominan i recesivitate dintre alelele precizate, este simplu s se prevad grupele de snge posibile ale descendenilor. n cazul n care se cunosc grupele sanguine ale prinilor (i invers), se pot stabili relaiile de paternitate i filiaie, cu repercusiuni pentru demersuri medico-legale i juridice. De pild, doi prini cu fenotipul

0 nu vor putea da natere dect la copii cu acelai fenotip (ll x ll = ll). Doi prini din grupa B, dac vor fi heterozigoi, vor putea da natere la copii din grupele B sau 0 (LBl x LBl = LBLB, LBl i ll) etc.

2.4.3. Supradominana
Reprezint fenomenul datorit cruia heterozigoii depesc ambii prini n fenotipizarea unor caractere (mai ales cantitative, cum ar fi habitusul, productivitatea etc., inclusiv viabilitatea), ca o component a capacitii de a da rspunsuri adecvate la presiunea seleciei. Schematic, supradominana poate fi redat astfel:
AA < Aa > aa

Se apreciaz c n supradominan sunt implicate mai multe gene cu caliti aditive. n mod frecvent, supradominana reprezint rezultanta interaciunii a dou alele, rezultant ce face ca heterozigoii s se situeze n afara amplitudinii de variabilitate a fiecruia dintre cei doi homozigoi. Selecia favoriznd heterozigoii, asigur frecvena constant a unei gene. ntr-o populaie care nu este consangvinizat, cel mult 50% dintre indivizi pot fi heterozigoi pentru un anumit locus. Numai atunci cnd exist supradominan pentru un anumit caracter (pentru o anumit pereche genalel), consangvinizarea i ncruciarea pot realiza ceea ce selecia fr consangvinzare nu poate. n condiii normale de dominan i recesivitate, cel mai bun genotip este homozigotul dominant, toi indivizii unei populaii putnd fi adui, prin selecie, n stare homozigot.

2.4.4. Gene letale


O alt cauz a modificrii raportului mendelian de segregare n descendena hibrizilor din F1 o constituie prezena genelor letale. Noiunea de gen letal a fost introdus de L. Cunot (1911). El a observat c ncrucind oareci de culoare galben, ntotdeauna n descenden rezult un amestec de indivizi de culoare galben i de alt culoare, n raport de 2: 1. Rezultatele au impus dou concluzii. n primul rnd, faptul c descendena segreg nseamn c oarecii galbeni sunt heterozigoi. n al doilea rnd, segregarea fiind continuu n raport de 2: 1 i descendena indivizilor de culoare galben segregnd mereu, nseamn c o parte dintre descendenii indivizilor de culoare galben i anume cei homozigoi (a cror descenden ar trebui s nu segrege), nu iau natere. Prin urmare, gena dominant n stare homozigot este letal. Aceasta a fost presupunerea lui Cunot. Sacrificarea femelelor gestante a confirmat aceast presupunere, deoarece s-au identificat embrioni mori care corespundeau ca numr procentului indivizilor necesari pentru asigurarea raportului de segregare de 3 : 1. Dac notm gena pentru culoarea normal a blnii cu a i mutanta care determin apariia culorii galbene cu Ay (Y de la cuvntul englezesc yellow = galben), situaia se va prezenta astfel: - indivizii galbeni heterozigoi au genotipul Aya. Prin ncruciarea lor rezult: Aya x Aya = AyAy (25%) + 2Aya (50%) + aa (25%) nseamn c, n mod continuu, indivizii AyAy mor n stare embrionar.

2.4.5. Interaciunea genelor (epistazia)


Este un alt fenomen care determin modificarea raportului de segregare i chiar apariia de noi fenotipuri n descendena hibrizilor din F 1. Interaciunea genelor a fost constatat la ncruciarea dintre dou rase de gini, ambele albe: Leghorn i Wyandotte. Prin experimente i observaii multiple s-a demonstrat c la rasa Leghorn culoarea alb este dominant, n timp ce la rasa Wyandotte este recesiv. n consecin, dac rasa Leghorn este ncruciat cu o ras de culoare nchis, F 1 va fi de culoare alb. Dac se ncrucieaz indivizi ai rasei Wyandotte cu indivizii unei rase colorate, indivizii din F 1 vor fi, n totalitate, colorai. Prin urmare, la cele dou rase, Leghorn i Wyandotte, culoarea alb a penajului este determinat de gene diferite, nealele (Fig.1).

Se consider c Leghorn la origine avea penajul colorat (CC; C = simbolul pentru gena determinant a culorii, de la cuvntul englezesc colour = culoare). Exprimarea genelor determinante ale culorii este blocat ns de alt gen inhibitoare (II; I = simbolul pentru respectiva gen, de la cuvntul englezesc inhibitory = inhibitor). Deci, genotipic, rasa Leghorn este CCII. Rasa Wyandotte de culoare alb (ca i rasele White, Plymonth etc.) dar recesiv, are genotipul ccii. Prin ncruciarea dintre cele dou rase CCII x ccii, rezult hibrizii din F1, de culoare alb, cu genotipul CcIi. Acetia formeaz gameii CI, cI, Ci, ci i prin ncruciare dau hibrizii din F2, conform tabelului.
Gameii CI Ci cI ci CI CCII Alb CCIi Alb CcII Alb CcIi Alb Ci CCIi Alb CCii Colorat CcIi Alb Ccii Colorat cI CcII Alb CcIi Alb ccII Alb ccIi Alb ci CcIi Alb Ccii Colorat ccIi Alb ccii Alb

Prin urmare, raportul de apariie a indivizilor cu penaj colorat este de 3/16. Genotipul lor conine gena inhibitoare n stare recesiv homozigot, iar gena pentru culoare, n stare dominant, homozigot sau heterozigot. Fenomenul se numete epistazie, iar gena inhibitoare, a crei aciune mpiedic manifestarea aciunii genei pentru culoare, se numete epistatic. Gena inhibat se numete hipostatic. Un alt fenomen interesant de interaciune genic, n care nu se modific raportul mendelian de segregare i care determin apariia de noi fenotipuri, a fost constatat tot la gini de ctre W. Bateson i R.C. Punnett. Cei doi au efectuat ncruciri ntre gini caracterizate prin forme specifice ale crestei: rasa Leghorn cu creasta de form simpl, rasa Brahmas cu creasta de tip mazre i rasa Wyandotte cu creasta de tip trandafir (Fig.2).

Rasa neagr

Rasa Leghorn =

F1

Rasa neagr

Rasa Wyandotte =

F1

Rasa Leghorn

x Rasa Wyandotte =

F1

+
F2
Fig. 1. Rezultatele ncrucirilor dintre o ras cu penaj de culoare neagr i rasele Leghorn i Wyandotte, precum i ale ncrucirii dintre Leghorn i Wyandotte

Forma crestei este ereditar, fiind determinat de dou gene nealele, notate cu R i P. Forma crestei rasei Leghorn este recesiv. Prin urmare, genotipic rasa Leghorn se noteaz rrpp. Rasa Brahmas domin rasa Leghorn, avnd genotipul rrPP. La fel i rasa Wyandotte domin asupra rasei Leghorn, avnd genotipul RRpp. Prin urmare, dominana celor dou rase asupra rasei Leghorn este datorat altor gene. La aceast concluzie s-a ajuns deoarece, dac se ncrucieaz cele dou rase dominante ntre ele, rezult hibrizii de F 1 cu un nou tip de creast, tipul nuc, cu genotipul RrPp. n F2 segregarea se produce n raportul:
9/16 indivizi cu creasta n form de nuc; 3/16 indivizi cu creasta n form de trandafir; 3/16 indivizi cu creasta n form de mazre; 1/16 indivizi cu creasta de form simpl.

Tipul simplu

Tipul trandafir

Tipul nuc

Tipul mazre

Fig. 2. Tipuri de creast

Astfel, ca o concluzie final, din interaciunea ntre cele dou gene n stare dominant apare un nou tip de creast (tipul nuc), inexistent la genitori. Din interaciunea ntre alelele celor dou gene, recesive, apare creasta de tip simplu, tot inexistent la genitori.

2.4.6. Polialelia sau alelia multipl


Fr a intra n profunzimea problemei, amnuntele urmnd a fi analizate n capitolul de genetic molecular, precizm c gena, care este responsabil de determinarea unui caracter, ocup o poziie bine definit pe un cromosom (ocup un locus). Orice gen, pe parcursul existenei ei, a putut suferi una sau mai multe mutaii. n consecin, pentru o gen au putut aprea una sau mai multe alele (n limba greac, alelon = altul). Rezult deci, cu claritate, c o alel sau o serie de alele ale unei gene sunt implicate n determinismul aceluiai caracter (evident, asigurndu-i fenotipizri diferite) i ocup acelai locus n cromosomul omolog (adic poziia din cromosomul n care se gsete gena). Evident, din acest punct de vedere, o gen poate avea o alel sau mai multe (A poate avea alelele a1,a2,..,an), dar un individ nu poate avea dect una dintre strile posibile (AA, Aa sau aa, sau alte combinaii care s desemneze statutul de homozigot recesiv sau heterozigot). ntr-o populaie ns, genotipic i, bineneles, fenotipic, poate exista o multitudine de indivizi, cu o multitudine de combinaii, att ntre gena slbatic i alelele ei, ct i ntre alele.

Concomitent deci, exist o multitudine de izoalele sau alele izomorfe, a cror activitate determin diferene fenotipice minore, aproape insesizabile prin metode normale. Un exemplu n acest sens l furnizeaz variabilitatea culorii ochilor la Drosophila melanogaster. n unele cazuri, nuanele culorii ochilor nu pot fi determinate dect prin analiza spectrofotometric a cantitii de pigment. Prin urmare, relund i analiznd n detaliu problema, rezult c ntr-o populaie, pentru o anumit gen, pot exista mai multe alele. Aa cum am precizat, acestea provin prin mutaii succesive, fie ale genei normale, fie ale uneia sau unora dintre alele. ntruct notaia alelelor poate duce la confuzii, este bine s redm cteva dintre modalitile de desemnare (notare) a lor. La modul general, gena slbatic se noteaz cu A, iar alelele cu a1, a2, a3...an. Dar gena normal (slbatic) se mai poate nota i cu prima, primele sau un grup de litere din denumirea n englez a primei mutante (care a fost descoperit i descris) pentru caracterul respectiv, nsoit de indicele +, alelele fiind notate cu aceleai indicative, dar fr indicele +. O alt notaie prevede folosirea unei singure abrevieri, rezultat de la denumirea primei mutante, cu indicele + pentru gena slbatic i a aceleiai abrevieri, avnd mereu alt indice format din literele ce desemneaz mutantele decelate ulterior, pentru restul alelelor. S exemplificm. Culoarea normal a ochiului la Drosophila melanogaster este roie. Mutanta cu ochi albi se noteaz cu w (de la cuvntul englezesc white = alb). Gena slbatic, n acest caz, se noteaz cu w+. Alelele mutante, altele dect white, se noteaz cu we (eosin), wa (apricot), wch (cherry), wco (corai). Prin urmare, culoarea ochilor la drosofila cuprinde o gam larg de mutante ntre alb i rou. Fiecare nuan se datoreaz unei alele, fapt pentru care se consider c, la aceast musculi, exist un sistem polialelic, o serie alelomorf. n aceast serie alelomorf fenotipul slbatic este dominant, toate fenotipurile mutante fiind recesive. i ntre alelele mutante exist raporturi de dominan i recesivitate. Ordinea dominanei este determinat de intensitatea culorii ochilor, pe care o confer o alel. Prin urmare, alela w, care determin culoarea alb a ochilor (deci, lipsa complet a pigmentului) este recesiv, n raport cu toate celelalte alele. Demn de remarcat este faptul c numrul mutantelor depistate a crescut, concomitent cu punerea la punct a unor metode de laborator pentru determinarea exact a coninutului de pigment i, mai ales, faptul c exist mai multe fenotipuri normale (slbatic tip Steillenbusch w+sw+s, slbatic tip Couton, w+cw+c, slbatic tip Graaf-Reinet, w+Gw+G etc.). Valoarea coninutului n pigmeni, spectrofotometric determinat, la ochii mutantelor, variaz ntre 0,0044 i 0,1636, iar la ochii indivizilor normali ntre 0,6854 i 1,2548. Iat de ce heterozigoii prezint cantiti intermediare de pigmeni i se poate aprecia c, de fapt, exist un fenomen de dominan incomplet i nu de dominan/recesivitate de tip mendelian. ntruct cantitatea de pigment este variabil, inducnd o variabilitate chiar n cadrul tipului normal, n funcie de gena concret pe care o deine individul, alelele pentru fenotipul normal s-au numit izoalele normale, iar alelele pentru fenotipurile mutante s-au denumit izoalele mutante. n final, referitor la polialelie putem sublinia cteva particulariti, i anume: - polialelele ocup acelai locus n cadrul unui cromosom (grup de linkage); - polialelele fiind, de fapt, mutante ale unei singure gene, afecteaz ntotdeauna acelai caracter. n ncruciare ntotdeauna domin gena slbatic. Concomitent, unele alele sunt dominante fa de altele. De aceea, cnd se ncrucieaz doi indivizi alelici, n F 1 nu apare tipul slbatic, ci domin unul dintre genitori. Sunt i situaii n care una dintre alele domin asupra tipului slbatic. Este cazul animalelor agouti i al unor culori sau forme de ochi la Drosophila melanogaster. Evident, fiind plasate n acelai locus, ntre polialele nu poate avea loc fenomenul de crossing-over.

2.4.7. Poligenia sau polimeria


Vizeaz mai ales expresia fenotipic a caracterelor cantitative (nlime, greutate, producie de fructe sau semine, producie de alcaloizi, vitamine, uleiuri etc.). nc din secolul XVIII, prin experimentele sale de hibridare, J. Klreuter a constatat c hibrizii din F 1 rezultai din ncruciarea ntre Nicotiana tabacum pitic i Nicotiana tabacum nalt, aveau nlimea intermediar. n F 2

aprea o segregare gradual, n sensul c se identific o adevrat scar a indivizilor, de la cel pitic, pn la cel nalt. Cercetrile efectuate de suedezul H. Nilson Ehle pe gru i americanul E. M. East pe porumb, ntre anii 1910-1913, au permis descoperirea fenomenului poligeniei. n urma acestor cercetri s-a conchis c determinismul caracterelor cantitative este poligenic, n sensul c ele sunt determinate de mai multe gene nealele. Segregarea genelor nealele este independent (ca i caracterele independente), doar efectul lor fiind cumulativ. Un exemplu tipic de efect cumulativ ni-l furnizeaz manifestarea culorii pielii la om. Culoarea pielii n cazul omului este determinat de coninutul de melanin, care variaz ntre 0 11% pentru rasa alb, 12 - 25% la mulatrii deschii, 25 - 40% la mulatrii adevrai, 41 - 55% la mulatrii de culoare nchis, 56 - 78% la rasa negroid. Prin cstoria ntre un individ din rasa alb (europoid) i unul din rasa neagr (african), n F1 rezult indivizi de tip mulatru (relativ uniformitate). Prin cstoria ntre mulatri, n F 2 se obine o segregare de 1 alb: 4 mulatri deschis: 6 mulatri propriu-zis: 4 mulatri nchis: 1 negru. Pentru a explica acest raport, C.B. Davenport, care a studiat problema (mai ales, n Jamaica i insulele Bermude), a considerat c n apariia culorii pielii sunt implicate dou perechi de gene cu alelele lor - P1p1 i P2p2. Negrii au genotipul P1P1P2P2, iar albii p1p1p2p2. Din cstoria alb x negru, rezult:
P1P1P2P2 x p1p1p2p2 F1 P1p1P2p2

Cstoria ntre mulatri induce apariia a mai multe tipuri de indivizi n F2, i anume:
Gameii P1P2 P1p2 p1P2 p1p2 P1P2 P1P1P2P2 Negru P1P1P2p2 Mulatru nchis P1p1P2P2 Mulatru nchis P1p1P2p2 Mulatru P1p2 P1P1P2p2 Mulatru nchis P1P1p2p2 Mulatru P1p1P2p2 Mulatru P1p1p2p2 Mulatru deschis p1P2 P1p1P2P2 Mulatru nchis P1p1P2p2 Mulatru p1p1P2P2 Mulatru p1p1P2p2 Mulatru deschis p1p2 P1p1P2p2 Mulatru P1p1p2p2 Mulatru deschis p1p1P2p2 Mulatru deschis p1p1p2p2 Alb

Dac se face un back-cross ntre un alb p1p1p2p2 i un mulatru P1p1P2p2, descendenii vor fi: 25% P1p1P2p2; 25% p1p1p2p2 i 50% mulatri, intermediari ntre prini (adic P1p1p2p2 i p1p1P2p2). Retroncruciarea unui negru P1P1P2P2 cu un mulatru P1p1P2p2 induce apariia a 25% negri, 50% mulatri nchii, intermediari ntre cei doi prini i 25% mulatri. Davenport a conchis c acumularea cantitativ a pigmentului n piele este determinat de efectul cumulat al genelor P1 i P2 i al alelelor. Astfel, negrii au genele n stare homozigot, mulatrii nchii au o gen homozigot i celelalte n stare heterozigot (P1p1P2P2, P1P1p2P2), mulatrii propriu-zii sunt heterozigoi pentru ambele gene sau homozigoi pentru ambele, dar una n stare dominant i cealalt n stare recesiv (P1p1P2p2; P1P1p2p2; p1p1P2P2), mulatrii deschii au o singur gen dominant n stare heterozigot (P1p1p2p2 sau p1p1p2P2). Ulterior, au fost elaborate i alte ipoteze n care s-a presupus existena a mai mult de 2 perechi de gene - ntre 3 (R.R.Gotes, 1953) i 20 (C. Stern, 1960). INTREBARI DE VERIFICARE 1. Definiti termenii: hibridare, caracter, factor ereditar 2. Enuntati legile mendeliene ale ereditatii 3. Intocmiti schema monohibridarii 4. Intocmiti schema dihibridarii 5. Care sunt cauzele aparitiei si a altor raporturi de segregare decat cele precizate de catre Mendel 6. Ce reprezinta semidominanta si supradominanta

7. Care este importanta grupelor de sange la om si care este determinismul lor genetic 8. Cum se defineste fenomenul de poligenie 9. Ce reprezinta epistazia 9. Intocmiti schema unei hibridari intre doua persoane apartinand tipului mulatru propriu-zis TEME PENTRU EXAMINAREA FINALA 1. Dobandirea si operarea corecta a notiunilor fundamentale de genetica 2. Intelegerea legitatilor mendeliene si prezentarea schemelor de hibridare in mono- si dihibridare 3. Argumentarea caracterului universal al legilor mendeliene 4. Caracterizarea fenomenelor care produc abateri de la legitatile mendeliene de transmitere a caracterelor

Unitatea de invatare 2 3. Structura si functiile suportului material al ereditatii, variabilitatii si determinismului caracterelor
3.1. Cromosomii seiful informaiei ereditare
3.5.1. Materialul genetic al virusurilor, viroizilor si plasmidelor Primele forme de via aprute pe Terra erau, probabil, de tip acelular fiind reprezentate de macromolecule de ARN si apoi de ADN i aveau capacitatea de autoreplicare, autoreglare i autodezvoltare. Apariia primelor gene, alctuitela nceput din ARN i apoi din ADN, a insemnat trecerea de la evoluia chimic la cea biologic. Desigur c primele forme de via cuprindeau in programul lor genetic un numr foarte redus de gene. n care era codificat informaia necesar realizrii structurilor i funciilor caracteristice acestor organisme primitive. Apariia codului genetic, prin care informaia ereditar stocat n macromoleculele de acizi nucleici putea fi decodificat i transformat intr-o secven de aminoacizi, a fcut posibil asamblarea nucleoproteinelor, mai stabile i cu o capacitate de evoluie mai rapid. Studiul organismelor procariote acelulare actuale, cum sunt virusurile, viroizii i plasmidele a facut posibil cunoaterea mai aprofundat a proceselor care au dus la apariia vieii, deoarece ele sunt extrem de simple ca organizare structural si ca funcii, fiind oarecum similare cu protobionii aprui in negura timpurilor. Materialul genetic al virusurilor este reprezentat de un singur molecul de acid nucleic n care sunt dispuse, in ordine liniar, un numr variabil de gene. Virusurile cu genom ADN, numite si dezoxiribovirusuri, prezint apte tipuri principale de structur i anume: cu genom ADN mono-catenar. liniar, ntlnit la Parvovirus, fagul M13; cu genom ADN mono-catenar circular, ca la fagul X174, la fagul filamentos fd i la unele virusuri ale plantelor; cu genom ADN dublu-catenar liniar repetitiv (redundant), datorit secvenelor terminale repetate, identic situate la fiecare extremitate a moleculei; ca la fagul T7; cu genom ADN dublu-catenar liniar repetitiv (redundant) terminal (ca la Adenovirusuri), fapt care-i confer proprietatea ca dup denaturare, moleculele monocatenare s se poat circulariza prin unirea extremitilor repetate invers; cu genom ADN dublu-catenar liniar redundant terminal, permutat circular, caracteristic fagilor din seria T - pari, care au la fiecare extremitate secvene terminale provenite ins din regiuni diferite ale genomului. Genomul liniar al fagilor T - pari se poate circulariza in vivo datorit structurii extremitilor, care au o secven terminal repetat; cu genom ADN dublu-catenar liniar, cu extremiti monocatenare complementare (adezive), caracteristic fagului . n particula fagic ADN-ul rmne totdeauna liniar, dar in interiorul bacteriei gazd (Escherichia coli) cele dou extremiti adezive complementare

se leag i formeaz o molecul circular de ADN dublu-catenar, care prezint cte o singur bre pe fiecare caten; cu genom ADN dublu-catenar circular inchis covalent, prezentnd aproximativ 20 de rsuciri superhelicale suplimentare sau rsuciri teriare, care dau natere unei molecule suprarsucite. Acest cromosom care nu are nici o extremitate liber, deoarece toate legturile dintre nucleotide sunt covalente, este caracteristic pentru virusurile polioma si SV 40. Virusurile ARN, care au genomul reprezentat de o macromolecul de ARN, sunt numite ribovirusuri i prezint patru tipuri principale de structuri: cu genom ARN mono-catenar liniar, dispus helical, corespunztor structurii proteice a capsidei, ca n cazul virusului mozaicului tutunului (VMT); cu genom ARN mono-catenar intens pliat, care se impacheteaz uor i se intlnete la fagii ARN mici - R17 , MS2, f2; cu genom ARN mono-catenar circular, intlnit la virusul encefalomiocarditei de la oareci; cu genom ARN dublu-catenar divizat, format dintr-un anumit numr de segmente, ca la Reovirus (10 segmente) sau Myxovirus (8 segmente). Cromosomul viral, constituit din ADN sau ARN, conine toat informaia ereditar necesar pentru formarea particulei virale. Dar, informaia ereditar a virusurilor devine activ numai atunci cnd ADN-ul sau ARN-ul lor se afl in sistemul celulei gazd. Cnd se afl n particula viral, toate genele cantonate pe cromosom tac, sunt nefuncionale, inactive. i in spermatozoizii animalelor, genele sunt inactive. i n diferite esuturi vegetale sau animale, unele gene tac (sunt inactive), n timp ce altele funcioneaza intens. Infeciozitatea acizilor nucleici virali a fost demonstrat, pentru ADN-ul fagic, de ctre Hershey si Chase in 1952 i, ulterior, pentru ARN-ul VMT de ctre Gierer i Schramm, n 1956. In cazul virusurilor animale sunt infectioi toi acizii nucleici care sunt transmii n ARNm de ARN polimerazele celulei gazd sau care acioneaz ei inii ca ARNm (ca de ex. Picorna-, Toga-, Papova-, Adeno si Herpesvirus). Acizii nucleici virali care sunt transcrii in ARNm de polimeraze codificate de virus (de exemplu ARN provenii de la Myxo-, Rhabdovirus si ADN dublu-catenar de la Reovirus, nu sunt infecioi). Acizii nucleici virali izolai au o infeciozitate de 10 3 - 106 ori mai mic dect aceea a virusurilor din care sunt extrai, datorit degradrii lor rapide de ctre nucleazele prezente n lichidele extracelulare, ca i n membranele celulare, precum i datorit faptului c sunt slab fixai de celule (n absorbia i fixarea virusurilor pe celule un rol important l are capsida). Spectrul de gazde ale acizilor nucleici virali izolai este ns mult mrit n comparaie cu cel al particulei virale mature, la care intervine specificitatea interactiunii dintre capsid i receptorii specifici celulari. Teoretic, acizii nucleici virali, dac nu sunt degradai de nucleaze se pot replica in orice celul n care au ptruns. De exemplu, n timp ce virionii de Poliovirus infecteaz numai celulele umane sau de primate, ARN-ul izolat se replic in celulele de pui de gin sau oarece, care in mod normal nu sunt permisive pentru acest virus. O form acelular de organizare, mai simpl dect virusurile i de dimensiuni incomparabil mai mici, este reprezentat de viroizi. Denumirea lor le arat inrudirea cu virusurile, ei fiind in esen molecule mici de acid nucleic neprotejat de inveli proteic (de capsid) i nici de inveliul exterior ce conine lipide i proteine, asa cum este cazul la unele virusuri. In anul 1971 au fost evideniate, pentru prima dat, nite boli ale plantelor provocate de un tip special de ageni patogeni subvirali, denumii viroizi. Printre aceste maladii ale plantelor pot fi citate: boala stelrii tuberculilor de cartof, cloroza castraveilor, nanismul i ptarea clorotic a crizantemelor, boala cadang-cadang a palmierilor de cocos etc. Primul viroid a fost descoperit de Dienner, din USA, pe baza cercetrilor efectuate la cartof. Viroizii sunt un tip special de ageni patogeni, similari virusurilor, dar cu o organizare mai simpl i de dimensiuni mult mai mici. Viroizii sunt alctuii din molecule mici de ARN. neprotejate de proteine. Viroidul cartofului, care provoac deformarea tuberculilor, are un genom reprezentat printr-o molecul circular de ARN, cu regiuni mono- i dublu- catenare, alcatuit dintr-o secven de 359 de nucleotide. A fost pentru prima dat cnd s-a identificat o astfel de structur circular, format din ARN monocatenar.

S-a constatat c viroizii sunt localizai n nucleul celulelor, unde se replic cu ajutorul unei enzime de tipul replicazelor din celula-gazd. La plante s-au identificat secvene de nucleotide din ADN-ul nuclear complementare cu ARN-ul viroizilor, dar se pare c replicaia viroizilor nu se realizeaz prin intermediul ADN. Date experimentale de ultim or arat c n celulele vegetale exist o multitudine de enzime care pot asigura replicarea moleculelor de ARN, folosind ca matri chiar moleculele de ARN ale viroidului. Originea viroizilor nu este prea bine cunoscut. Pornindu-se de la observaia c genele plantelor si animalelor sunt alctuite din regiuni informaionale, denumite exoni si regiuni noninformaionale, denumite introni, care sunt eliminai in procesul de activare a genelor, s-a emis ipoteza c viroizii ar fi introni nedegradai. Caracterul patogen al viroizilor se datoreaz interreaciei lor cu genomul celulei-gazd, probabil prin perturbarea mecanismelor de reglaj genetic al acesteia. Ca urmare, se consider c viroizii sunt la limita inferioar a vieii, fiind sisteme autoreplicative, care posed un program genetic puternic redus. In anul 1952, J. Lederberg, laureat al premiului Nobel, a descoperit plasmidele din celulele bacteriene. Acestea sunt nite minicromosomi de form circular sau linear, alcatuii din ADN bicatenar care se replic independent de cromosomul bacteriei gazd i posed un mic numr de gene. In celula bacterian se gsesc ntre 10 i 200 de copii ale unei anumite plasmide, regula fiind urmtoarea: plasmidele de dimensiuni mici se pot gsi intr-un numr mai mare de copii, iar cele mari intr-un numr mic de copii. Ulterior s-au descoperit plasmide i in celulele eucariote, asociate cu nucleul sau cu organitele celulare (mitocondrii i cloroplaste). Plasmidele sunt mai simple ca organizare dect virusurile, fiind alctuite dintr-o molecul de ADN cu capacitate autoreplicativ. Ele se gsesc la toate speciile de bacterii dar prezena lor nu este obligatorie. Pn n prezent au fost identificate peste 1000 de tipuri , dintre care 269 numai la bacteria Escherichia coli. De regul, ADN-ul plasmidial reprezint 1-3% din cantitatea total de material genetic vbacterian. Plasmidele au un rol foarte important n celula bacterian. Unele dintre ele sunt capabile s determine conjugarea bacteriilor. Astfel plasmidul denumit factor de fertilitate (F), se poate gsi n celula bacterian sub form liber i atunci celula este notat F+, sau poate fi integrat n cromosomul bacterian, celula respectiv fiind notat Hfr (high frequency of recombination), sau poate fi absent, situaie n care celula se noteaz F- . Bacteriile de tip Hfr sunt capabile s realizeze recombinarea genetic, adic transferul unui segment cromosomial de la celula mascul (F +) la cea femel (F-), cu o mare frecven. Exist i plasmide F care au inclus un segment din cromosomul bacterian, fapt pentru care acest tip de factor de fertilitate este considerat recombinat genetic. Plasmida F este reprezentat de o macromolecul de ADN alcatuit din cca. 100.000 perechi de nucleotide. Un alt tip de plasmide bacteriene este constituit de plasmidele pentru rezisten (R). Ele sunt alctuite dintr-o macromolecul circular de ADN, pe care se gsesc gene ce determin rezistena la compuii toxici ai unor metale grele (mercurul, cadmiul, bismutul, antimoniul etc.), rezistena la unele insecticide i la unele produse petroliere etc. Plasmidele R pot trece de la o bacterie la alta, cu ajutorul virusurilor bacteriene, printr-un fenomen denumit transducie. Plasmidele F si R fac parte din grupa plasmidelor conjugative: favorizeaz transferul de material genetic, posednd capacitatea de a induce n celulele bacteriene formarea de structuri necesare conjugrii (pili de sex). Plasmidele Col (factorii colicinogenici) sunt un alt tip de plasmide, care posed gene ce determin sinteza unei clase de proteine ce se numesc colinice sau bacteriocine. Acestea, secretate n mediu, au aciune bactericid asupra altor bacterii, care sunt lipsite de astfel de plasmide. Astfel, bacteria Escherichia coli produce colicine, Bacillus subtilis produce subtilizine, Pseudomonas aeruginosa produce pyocine. Fiecare tip de bacteriocin este codificat intr-un anumit segment de ADN din plasmidul respectiv. Plasmidele sunt cromosomi in miniatur, alctuii din ADN dublu-catenar, circular nchis. Circularitatea este o condiie esenial pentru supravieuirea plasmidei in celula gazd deoarece altfel ADN-ul plasmidial ar fi cu usurin atacat de nucleaze. Plasmidele au cteva proprieti distincte: - dimensiunea mic a moleculei: reprezinta 1-2% din mrimea cromosomului bacterian; - secvena de baze azotate difer de cea a ADN-ului cromosomului bacterian; - prezint proprieti structurale aparte;

- reprezint informaie ereditar accesorie, fr importan vital pentru bacterie; bacteriile pot s piard plasmidele; - reprezint repliconi - structuri capabile de replicare independent dar, in general, corelat i controlat de cromosomul bacterian. ADN-ul plasmidial poate exista sub mai multe forme: a. covalent nchis, circular i superrsucit. Aceast stare faciliteaz izolarea plasmidelor prin centrifugare in gradient de densitate; b. circular deschis; c. ADN multimer. Diferite date experimentale au permis stabilirea hrilor genetice ale plasmidelor, demonstrndu-se existena, n ADN-ul plasmidial, a mai multor categorii de determinani (gene): - gene necesare pentru replicare; - secvene de inserie (poriuni de ADN ce au funcia de a se cupla cu ADN-ul cromosomului bacterian, n cazul n care plasmida se inser n acesta); - gene implicate in corelarea replicrii plasmidei concomitent cu diviziunea celulei i repartizarea plasmidelor n celulele rezultate dup diviziune; - n unele cazuri exist un operon de transfer, reprezentat de un grup de gene pentru sinteza pililor de sex si a antigenelor celulare de recunoatere, obligatoriu prezente n conjugare; - gene structurale ce determin funcii noi, manifestate n fenotipul gazdei: rezisten la antibiotice, rezisten la metale grele (mercur, plumb, cadmiu etc), producerea de bacteriocine, inducerea de tumori la plante, capacitatea de a face fermentaie lactic, capacitatea de a produce anumite antibiotice (cloramfenicol i metilenomicina), etc. In ultima vreme au fost identificate plasmide i n celulele eucariotelor, unele asociate cu nucleul i altele cu mitocondriile i cloroplastele. Prima plasmid asociat cu genomul celular a fost identificat la Saccha-romyces cerevisiae. Aceasta este alcatuit dintr-o secven de 6300 perechi de nucleotide, este de tip circular i se gsete n aproximativ 50-100 copii per celul. Plasmida, cunoscut sub numele 2m ADN, posed 3 gene, din care dou sunt necesare pentru replicarea sa i una este implicat n procesul de recombinare genetic intramolecular, precum i dou secvene inversate de nucleotide, cu ajutorul crora se poate integra n cromosomii celulei gazd. O alt plasmid circular, asociat nucleului celular, a fost identificat la ciuperca Cephalosporium acramonium, i are mrimea de 21 Kb. Un al doilea tip de plasmide, n celula eucariot, este asociat cu mitocondriile i cloroplastele. La ciuperca Podospora anserina a fost identificat o plasmid cu o mrime de 2,4 Kb, care prezint analogie cu genomul mitocondrial. Aceast plasmid se consider c a provenit prin amplificarea unui segment din genomul mitocondrial. La plantele superioare au fost identificate unele plasmide mitocondriale. La Vicia faba indivizii normali conin 5 tipuri de plasmide mitocondriale mici (1-2 Kb.). La liniile androsterile, unul din aceste tipuri de plasmide este absent. Plasmidele din celula eucariot, asociate cu nucleul sau mitocondriile i cloroplastele, sunt componente normale ale genomului celular i sunt foarte variate ca structur i greutate molecular. Ele contribuie la mrirea variabilitaii genotipice i flexibilitii acestor sisteme genetice. Se sper c va fi posibil utilizarea lor ca vectori n programele de ameliorare a plantelor, prin transfer de gene. 3.5.2. Structura cromosomului bacterian Celula bacterian, spre deosebire de celulele organismelor eucariote, nu are un nucleu adevrat ci un nucleu cu o organizare primitiv, fiind lipsit de membran i inclus direct in citoplasm, n partea central a celulei. Acest nucleu nu parcurge procesele de tip mitotic, de aceea el este numit nucleoid sau pur si simplu cromosom bacterian. Genomul bacterian este alctuit din dou categorii de gene: gene eseniale eucromosomale, localizate n cromosomul bacterian si gene accesorii, prezente in plasmide, elemente genetice transpozabile (SI si TN) si n unii fagi (Campbell, 1981) Cromosomul bacterian are form circular i este alctuit dintr-o singur molecula de ADN bicatenar, cu o lungime de 1400 m i un diametru de 2,5 nanometri (nm), corespunznd diametrului moleculei de ADN dublu catenar, o lungime de cca. 1360 m si o mas molecular de

cca. 2,5 0,3x109 Daltoni. La Escherichia coli i la majoritatea celorlalte bacterii, cromosomul este format dintr-o unic molecul de ADN dublu-catenar, circular nchis i superhelical. Respectiva molecul const din aproximativ 4 milioane pb (perechi de baze nucleotidice) care alctuiesc aproximativ 3000 de gene, dispuse liniar pe cromosomul circular, alctuind un singur grup de linkage. Lungimea total a cromosomului bacterian este de cca 1300, in condiiile in care o bacterie are forma cilindric cu un diametru de 1 si o lungime de maximum 3. Este normal ca, n condiiile dimensionale menionate, acest cromosom s fie superrsucit pentru a putea incpea n celul. A.Worcel i E.Burgi, n 1972 i Pettijohn in 1974, au reuit s studieze structura cromosomului la Escherichia coli. S-a demonstrat c el const din 40-50 bucle care i pstreaz structura cu ajutorul ARN. Fiecare bucl este bogat n ARN i poate funciona relativ independent de altele. Cele 40-50 de bucle mari au superrsuciri secundare alctuite din cca. 400 perechi de nucleotide. Meninerea acestor bucle de mrimi diferite, se pare c se face nu numai cu ajutorul ARN, ci i cu ajutorul unor proteine i enzime de tipul endonucleazelor. Aceste enzime sunt capabile s determine rupturi n una dintre catenele ADN-ului, fapt care impiedic (blocheaz) dersucirea buclelor superrsucite. In acest fel structura cromosomial este stabil, iar cromosomul bacterian si pstreaz continuitatea. Enzimele de tipul ribonucleazelor pot hidroliza unele molecule de ARN, fapt care duce la ruperea legturilor dintre dou bucle succesive. Una dintre enzimele care joac un rol esenial n replicarea ADN bacterian i este responsabil de suprarsucirea sa, este aa-numita ADN-giraza. Dac ntr-o cultur de E. coli se adaug, n mediu, coumeromicina, un antibiotic cu rol de inhibitor al funciei ADN-girazei, cromosomul celulei respective i va pierde constituia superhelical. Din motive inc necunoscute, E. coli posed mecanisme de reglaj al gradului de superrsucire a cromosomului. Alturi de ADN-giraz exist i o a II-a enzim implicat n rsucirea cromosomului - topoizomeraza I. Aceast enzim produce relexarea regiunilor superhelicale. Au fost izolate i mutante lipsite de topoizomeraz sau care produc o form inactiv a topoizomerazei. Nucleoidul izolat de la astfel de mutante prezint un grad nalt de superrsucire, cu cca 32% mai mult dect normalul. Paradoxal ns, aceste mutante nu sufer defecte de cretere i, n plus, sufer frecvent mutaii ale genei pentru ADN-giraza, care conduc la producerea unei giraze mai puin eficiente. n consecin cromosomul prezint un grad normal de superspiralizare. n mod normal, bacteriile aflate n faza de repaus, n culturi staionare i vechi, au un singur cromosom, fiind uninucleate. n faza de cretere activ, n culturi tinere meninute pe medii optime, ele apar ca multinucleate, avnd 2-4 cromosomi, care sunt ns identici, deoarece provin prin replicare dintr-un singur cromosom parental. De aceea, indiferent de aspectul morfologic al materialului nuclear, din punct de vedere genetic, bacteriile sunt organisme haploide, cu n cromosomi. Atunci cnd, prin recombinare, o celul bacterian primete un aport de material nuclear exogen, diploidia nu este dect parial i tranzitorie. Aceast stare se numete merozigot. Deci, cromosomul bacterian poart n structura sa toat informaia ereditar necesar pentru existena unei celule, adic poart toate genele (genomul) necesare pentru desfurarea metabolismului i pentru reglarea activitii celulare. Cromosomul bacterian determin i arhitectura celulei care-l conine, ereditatea i capacitatea ei de evoluie. n prezent nu se cunoaste exact mecanismul molecular prin care cromosomul bacterian, mai lung de 100-400 de ori dect lungimea celulei bacteriene, este mpachetat ntr-un volum att de mic, cum este cel al nucleoidului n care se afl. Dac mpachetarea s-ar face la ntmplare, s-ar produce inevitabil ncurcarea moleculei de ADN, o parte din informaia ereditar ar fi prins n zonele mai ascunse i ar deveni inaccesibil pentru transcripie. nc din anul 1966, Maale i Kjeldgaard, bazndu-se pe structura constant limitat la un volum mic din celul, fr s se rspndeasc n citoplasm, a ADN bacterian i pe faptul c informaia genetic este totdeauna accesibil sistemelor de transcripie i translaie, au emis ipoteza meninerii fibrilelor de ADN nvecinate ntr-o structur organizat, prin intermediul poliaminelor, care ar forma legturi tranzitorii cu ADN. Problema modului de mpachetare a cromosomului bacterian este deosebit de important pentru biologia bacterian deoarece este strns corelat cu unele funcii eseniale ale materialului genetic (ca replicarea, transcrierea si recombinarea). Fong (1967) a propus un mecanism de mpachetare prin suprarsucire. Dup ipoteza sa modificrile proprietilor dielectrice ale mediului nuclear afecteaz forele de atracie

intermolecular dintre perechile de baze i, ca urmare, molecula circular dublu elical se rsucete intr-o superelice de gradul I (o dubl helice n care fiecare helice este o dubl helice, provenit din molecula iniial). n felul acesta, molecula circular, s-ar transforma intr-o structur liniar a crei lungime este jumtate din circumferina iniial. Procesul ar continua prin formarea de superhelixuri de gradul 2,3,4, s.a.m.d. O superhelice de gradul 10 ar avea o dimensiune liniar de 210 ori mai mic dect lungimea originar a ADN (respectiv de 1024 ori mai mic), ceea ce corespunde aproximativ dimensiunilor nucleoidului de E.coli. Dup Fong, acest proces ar necesita introducerea a ~ 1000 ture de suprarsucire n ADN, schimbare teoretic posibil, deoarece ar corespunde o tur supraelical, la fiecare 300-400 ture ale ADN originar. Ulterior, Pettijhon i Hecht (1974) au elaborat un model de mpachetare a ADN cromosomial, bazat pe un proces dublu de pliere i formare de superelice, n care structura condensat a ADN ar fi meninut prin aciunea asociat a ARN i a proteinelor din nucleoid. Modelul este susinut de urmtoarele observaii: a. Nucleoidul se deruleaz daca este tratat cu ageni care degradeaz sau denatureaz proteinele, ceea ce arat c acestea sunt eseniale pentru meninerea stabilitii cromosomului izolat in stare compact (Pettijohn 1973, 1979, Drilica si Worcel, 1975); b. In mod similar, tratarea cu RN-az sau suprimarea sintezei ARN prin cultivarea n medii cu rifampicin duc la apariia unor molecule cromosomiale mai mult sau mai puin depliate i aproape lipsite de structuri superelicale detectabile (Hecht i colaboratorii, 1977). Deplierea total are loc cnd fie ARN, fie proteinele nucleoidale sunt complet disociate de ADN; c. Din cercetarile lui Vinograd (1965) este cunoscut faptul c producerea unei incizii monocatenare cu ajutorul ADN-azei, n structura AND, suprim constrngerile rotaionale i, ca urmare, catena sectionat se rotete liber n jurul celei intacte, determinnd suprimarea suprarsucirilor. Ori, n cazul nucleoidului de E. coli incizia monocatenar elimin brusc constrngerile i structura supraelical numai ntr-un segment localizat al ADN, ca i cum anumite restricii ar mpiedica propagarea rotaiei catenei secionate n regiunile adiacente. Aceasta demonstreaz c ADN cromosomial este imprit ntr-o serie de domenii de suprarsucire, fiecare supus unor constrngeri topologice separate. In conformitate cu aceste fapte de observaie, modelul propus de Pettijohn i Hecht (1973) consider c moleculele de ARN n curs de formare se leag de dou situsuri separate de pe molecula de ADN cromosomial, mprind-o intr-o serie de domenii de pliere (folding) i suprarasucire (supercoiling). Un domeniu de suprarsucire este deci reprezentat de o regiune a ADN dublu elicoidal delimitat de cele dou situsuri de legare ale ARN. Datorit lor, producerea unei incizii monocatenare cu DN-aza desface superelicea numai n bucla respectiv, fr a afecta structura superhelical a altor domenii. Degradarea a dou molecule de ARN, aparinnd unor domenii adiacente, cu RN-aza, unete cele dou domenii, fr pierderea structurii lor superelicale. Fiecare molecul de ARN leag ntre ele dou regiuni indeprtate ale dublei elici cromosomiale n aa fel inct o serie de interaciuni de acest gen separ ntregul cromosom ntr-o serie de domenii succesive de-a lungul lui. ARN n curs de sintez este legat de extremitatea 3 a ADN prin intermediul unei molecule de ARN - polimeraz, cellalt situs de legare putnd fi un hibrid ARNADN, o legtur triplu elical sau mediat de o protein specific (Lydersen si Pettejohn, 1977). Numrul de domenii estimat prin tehnica mai exact de producere de incizii monocatenare cu ajutorul radiatiilor gama este de 100 30 per echivalent genomic. Deoarece nucleoizii conin n medie 2,2 echivaleni genomici, Pettijohn si Carlton (1979) apreciau c n medie ar exista ~200 domenii per nucleoid. Ca o consecin a legrii ARN, cromosomul bacterian circular avnd de ~ 350 m, este pliat, formnd un numr de ~ 80 bucle care sufer formarea de superelici rsucite spre stnga, dup modelul Worcel si Burgi (1972). 3.5.3. Cromosomii la eucariote Studiul diviziunii celulare indirecte (Francis, Dudith & Inz, 1997) a evideniat att existena ct i comportamentul cromosomilor. Cromosomii au fost denumii astfel, n 1888, de ctre W. Waldeyer i, apoi, au fost identificai ca purttori (substrat) ai informaiei ereditare. Morfologia cromosomilor este variabil, att n funcie de faza din ciclul diviziunii celulare, ct i n funcie de specia la care aparin indivizii (plante sau animale) analizai. nc o precizare,

extrem de important, este aceea n conformitate cu care cromosomii eucariotelor sunt cu totul altfel structurai n comparaie cu cei ai procariotelor. n interfaz, cromosomii celulelor somatice normale sunt invizibili la microscopul optic, deoarece au o extensie maxim, care le confer un aspect filiform. Sunt alctuii din dou filamente paralele, alipite, numite cromatide. Examinate la microscopul optic, cromatidele etaleaz o structur helicoidal. O rotaie a helixului alctuiete un gir. Girii determin o suprapunere, n spaiu, a spirelor i, ca o consecin, o suprapunere de material cromatic. De aceea, cnd sunt privite dintr-o anumit direcie, cromatidele dau impresia c sunt alctuite dintr-o succesiune de granule, numite cromomere. De aici a pornit o mare confuzie i anume: un timp s-a considerat c cromomerele reprezint o materializare a genelor. n consecin, cromatidele erau considerate ca fiind alctuite din uniti discrete - cromomerele numite (la acea dat) i gene - avnd, deci, o structur discontinu. Probe de ordin electronografic i genetic au dovedit c structura cromatidelor este continu. Cele dou cromatide ce alctuiesc cromosomul se numesc cromatide surori. Ele se unesc ntr-un singur punct al cromosomului, n zona centromerului - formaiune cu diametrul mai mic dect al cromosomului. Din cauza diametrului inferior celui al cromosomului, centromerul realizeaz constricia cromosomial primar. 3.5.3.1. Morfologia cromosomilor eucariotelor Centromerul nu se coloreaz cu colorani bazici. Poziia acestuia n cromosom este variabil, mprind cromosomul n dou brae. n funcie de lungimea real a braelor i, apoi, a raportului dintre ele, se stabilete tipul cromosomului. Dac centromerul este situat exact n centrul cromosomului, delimitnd dou brae perfect egale (raportul dintre brae - r - fiind 1), cromosomul este metacentric (prescurtat se noteaz cu M). Cnd centromerul mparte cromosomul n dou brae inegale, cu r avnd valori cuprinse ntre 1 i 1,7 , cromosomul este median (m), iar cnd r are valori cuprinse ntre 1,7 i 3, cromosomul este submedian (sm). Cnd raportul braelor este cuprins ntre 3 i 7 cromosomul este subtelocentric (st), iar cnd raportul este mai mare dect 7 (r > 7) cromosomul este telocentric (T) (Fig.3). n ceea ce privete poziia terminal a centromerului (adic n ceea ce privete posibilitatea existenei cromosomilor telocentrici) prerile sunt contradictorii. Unii autori afirm c centromerul nu se poate gsi niciodat n poziie terminal, n timp ce ali autori admit aceast posibilitate. Se cunosc, de asemenea, mai multe ipoteze explicative i de modelare a structurii moleculare a cromatidei. Orice ipotez, orice model molecular, trebuie s satisfac urmtoarele cerine: - cromatida s fie format din dou subuniti, care s-i asigure posibilitatea de a se replica semiconservativ, - cromatida s acioneze ca o singur unitate, n schimburile reciproce de material genetic. Cromosomii reprezint un caracter de diagnoz, de delimitare a speciei asemenea oricrui alt caracter de natur morfo-anatomic, fiziologo-biochimic, fenologic sau reproductiv. n acest sens, trebuie precizat c cromosomii fiecrei specii eucariote, de plante sau de animale, au particulariti morfologice i numerice caracteristice speciei. Pe lng constricia primar, determinant a poziiei centromerului, cromosomii au i constricii secundare, cu rol n formarea nucleolului, fapt pentru care au primit i denumirea de organizatori nucleolari. Uneori, cromosomii au la unul din capete o constricie secundar prin care se delimiteaz un segment numit satelit (trabant). Asemenea cromosomi se ntlnesc la speciile Secale cereale (2n=14 - cromosomii perechii a VII-a), i Zea mays (cromosomii perechii a VI-a). Numrul nucleolilor dintr-un nucleu este egal cu numrul cromosomilor cu satelit. Cele dou specii menionate mai sus au, deci, cte doi nucleoli n nucleu. Centromerul are rolul de a fixa cromosomul pe fibra fusului acromatic, n timpul diviziunii celulare. Prin diviziunea sa, care precede diviziunea cromosomului i separarea cromatidelor, n mitoz sau n cea de-a doua diviziune meiotic, se asigur partiia cromosomului n cele dou cromatide surori. n cazurile n care, din diverse motive, cromosomul se rupe, fragmentele fr centromer (numite acentrice) nu se pot reface i se resorb.

Fig. 3. Tipurile de cromosomi. 1 - cromosom M (metacentric); 2 - cromosom m (median); 3 - cromosom sm (submedian); 4 - cromosom st (subterminal = subtelocentric); 5 - cromosom T (telocentric). Prin culoarea gri a coloanei se red zona n care se poate gsi centromerul. Desigur, braul de sus se scurteaz cu poriunea cu care se alungete cel de jos, n aa fel nct raportul dintre ele s se situeze ntre limitele precizate anterior (dup Bra, 1999)

Un fragment acentric se pstreaz doar atunci cnd se ataeaz de un cromosom cu centromer. Sunt ns i cazuri (coccidii, scorpioni, specii de Luzula) n care unii cromosomi, extrem de scuri, ndeplinesc funcii centromerice n totalitate sau pe mare parte din lungimea lor. De fapt aceti cromosomi au centromerul difuz i poart denumirea de cromosomi policentrici. Ei sunt api, ns, de a se fixa pe toat lungimea lor de fibrele fusului acromatic. La capetele cromosomilor exist o zon (o poriune) care le mpiedic unirea. Respectiva poriune poart numele de telomer (telomere). Dincolo de rolul de a mpiedica unirea cromosomilor prin capetele lor, telomerele au i un rol, din ce n ce mai bine definit, n determinismul longevitii organismelor. Fiind zone heterocromatice ale cromosomilor, telomerele au acidul dezoxiribonucleic super condensat (super rsucit). S-a constatat c, la diverse specii, lungimea telomerelor este foarte diferit i c numrul de diviziuni succesive ale unei celule este n relaie de direct proporionalitate cu lungimea telomerelor. Cnd, n succesiunea de diviziuni, telomerul dispare, cromosomul se autolizeaz iar celulele se distrug. Schematic (Fig.4), deci, un cromosom apare astfel: telomer, satelit, constricie secundar, bra scurt, centromer (constricie primar), bra lung, telomer (vezi schema anterioar). Fiecare bra este alctuit din dou cromatide, fiecare cromatid coninnd dou cromoneme. Regiunea cromosomial din vecintatea centromerului poart numele de regiune proximal, iar cea de la capetele braelor poart numele de regiune distal. Aa cum am precizat anterior, cromomerele sunt, de fapt, nite artefacte. n ultimul timp (detaliile vor fi date n paginile urmtoare) este contestat i realitatea cromonemei. Precizam anterior c tipul cromosomilor reprezint un caracter de diagnoz, o caracteristic a speciei. Fr a contrazice aceast afirmaie, se cuvine precizat c tipul (forma) cromosomilor poate varia ntre anumite limite, n funcie de specializarea i starea fiziologic a celulei. Uneori, n cadrul aceluiai individ, se constat i o variabilitate numeric a cromosomilor, tot n corelaie cu structura i funciile anumitor esuturi. De regul, cel mai propice stadiu pentru investigarea numrului i tipului cromosomilor l reprezint metafaza diviziunii mitotice. Puternic spiralizai, ataai de fibrele fusului n zona ecuatorial, n aceast faz cromosomii etaleaz conformaia lor specific, form caracteristic speciei creia i aparine individul (pot avea form de bastona sau forma literelor V, J ,I ,O etc.)

Fig. 4. Reprezentarea schematic a morfologiei i organizriii cromosomului la eucariote (prelucrare dup Tudose, 1992)

3.5.3.2. Mrimea cromosomilor eucariotelor Este o caracteristic de specie, dei poate varia destul de mult n cadrul unei populaii, n cadrul unui individ i chiar n aceeai celul, n funcie de faza de diviziune n care se afl aceasta din urm. Lungimea cromosomilor variaz i n funcie de biotopul pe care-l ocup o populaie n cadrul arealului speciei, fiind influenat de temperatur, anumite substane chimice etc.. n general, mrimea cromosomilor variaz ntre 1 i 50 microni pentru lungime i ntre 0,1 i 2 microni pentru diametru. n principiu se admite c lungimea cromosomilor este direct proporional cu numrul de gene pe care le conin. Realitatea este, ns, mult mai complicat. 3.5.3.3. Numrul cromosomilor la eucariote Este un alt caracter de diagnoz, dei cunoate i el o amplitudine de variabilitate suficient de larg. n lumea vie numrul de cromosomi variaz ntre 2, la Ascaris megalocephala i cteva sute, la Amoeba proteus. Pentru caracterizarea unei specii, sub aspectul numrului de cromosomi, se folosesc simbolurile: x, n, 2n i NF. - 2n reprezint numrul de cromosomi din celulele somatice ale indivizilor oricrei specii eucariote; - prin n se desemneaz numrul haploid de cromosomi, caracteristic celulelor gametice (sexuale) ale indivizilor speciilor eucariote; De regul, n cadrul unui gen, totalitatea speciilor provine dintr-o specie ancestral, prin evoluie divergent. Procesul a implicat, printre altele i modificarea numrului de cromosomi, prin autopoliploidizare, pseudopoliploidizare, aneuploidizare, amfipoliploidizare etc.. Numrul cromosomial de la care s-a plecat, n cazul unei serii poliploide de pild, reprezint numrul cromosomial de baz, notat cu x. La diploidul de origine, numrul de baz coincide cu numrul haploid (x = n). Evident, x rmne acelai pentru triploid, tetraploid etc., n modificndu-se n concordan cu 2n. Spre exemplu, n genul Papaver, secia Oxytona exist speciile Papaver

bracteatum (2n = 14, n = 7, x = 7), Papaver orientale (2n = 28, n = 14, x = 7) i Papaver pseodoorientale (2n = 42, n = 21, x = 7). Este clar c n variaz n funcie de 2n, n timp ce x (numrul fundamental de cromosomi) rmne acelai, cele trei specii fiind 2x, 4x i 6x. Alteori, o serie poliploid nu provine printr-o poliploidizare real, ci prin pseudopoliploidie. De exemplu, dac o specie are 2n = 8 cromosomi metacentrici, mediani, submediani sau subterminali, prin fisionarea cromosomilor dintr-o pereche, dou, trei sau toate perechile, vor rezulta 2n = 10, 2n = 12, 2n = 14, sau 2n = 16 cromosomi. Dac, ns, se va determina cantitatea de ADN per nucleu, se va constata c rmne constant, la toate aceste numere de cromosomi. Pe de alt parte, dac se vor numra braele cromosomiale, din cariotipurile efectuate pe baza numerelor menionate, se va constata c cifra este aceeai 16. Prin urmare NF (numrul fundamental de brae) a rmas constant, sugernd c speciile din respectiva serie nu sunt aneuploizi sau poliploizi adevrai ci pseudoaneuploizi sau pseudopoliploizi. 3.5.3.4. Structura intern a cromosomilor la eucariote Un real progres n studiul cromosomilor mamiferelor s-a nregistrat concomitent cu punerea la punct a metodei Giemsa de colorare i examinare a cromosomilor. Apoi, definitivarea metodelor de bandare a cromosomilor, de ctre Arrighi i Hsu, n 1971, urmat de unele modificri aduse metodei Giemsa, au permis stabilirea existenei diferitelor tipuri de cromosomi, n cadrul unuia i aceluiai genom. Mileniul 3 a debutat cu cea mai mare realizare n domeniu descifrarea genomului uman. S-a stabilit, cu aceast ocazie, c omul nu deine peste 100.000 de gene, cum se afirma frecvent, ci aproximativ 35.000. Prin urmare, extraordinara complexitate a organismului uman nu poate fi pus pe seama unui numr mare de gene ci pe interaciuni multiple i complexe ntre un numr de gene aproape egal cu numrul genelor deinute de o musc. n ceea ce privete compoziia chimic a cromosomilor eucariotelor, nc din anul 1920 s-a stabilit c principala component o constituie substana cromatic, denumit cromatin, alctuit, la rndul ei, din aciizi nucleici i proteine, n proporii egale (cte 50% pentru fiecare dintre ele). Organizarea structural intim a acestor dou componente a fost descifrat abia n jurul anilor 1960. Un progres considerabil l-a reprezentat identificarea componentelor proteice majore ale cromatinei. S-a constatat c acestea sunt proteine histonice, de cinci tipuri, notate cu H1, H2A, H2B, H3 i H4. Aceste cinci histone sunt prezente n cromosomii tuturor eucariotelor. Interesant este faptul c aceste proteine au secven aminoacidic asemntoare la majoritatea plantelor i animalelor, ceea ce poate sugera c gena care este responsabil de biosinteza lor are o origine foarte ndeprtat (este foarte veche) i nu a suferit prea multe mutaii, pe ntregul parcurs al procesului filogenezei. Un alt progres important a fost constatarea c patru dintre histonele menionate (H 2A, H2B, H3 i H4) formeaz octameri, particule n jurul crora se nfoar ADN-ul. Rezult o formaiune care, mpreun cu H1 alctuiete nucleosomul. Nucleosomul este considerat, deocamdat, structura de baz a cromosomului. Analizele cu raze X au dovedit c nucleosomii sunt legai ntre ei prin ADN neasociat cu histone (n unele manuale de specialitate sunt i alt tip de afirmaii), fiind sub forma unei fibrile de cca 10 nm grosime. Aceast fibril se continu de la un capt la altul al cromosomului, pliat (mpachetat) foarte compact. Cromosomii sunt, deci, cromatin suprastructurat. Cromatina este numele conferit substanei totale din care sunt alctuii cromosomii. n ciclul mitotic sau meiotic, cromatina se coloreaz rapid i este uor vizualizat. n interfaz este vizibil doar heterocromatina, partea vizibil n timpul diviziunii primind numele de eucromatin (ambele noiuni vor fi analizate, pe larg, ulterior). Regiunile heterocromatice ale cromosomilor sunt considerate ca fiind heteropicnotice (n limba greac pycnosis =dens). Intensitatea colorrii lor poate varia de la o etap a ciclului celular la alta. Fiecare cromosom dintr-o celul eucariot, conine o macromolecul lung de ADN, care se ntinde de la un capt al cromosomului la cellalt, prin centromer. Aceast macromolecul gigantic este supermpachetat, n cromosom, n numai civa microni. La om de exemplu, cel mai mare cromosom conine o macromolecul de ADN de aproximativ 85 mm (85.000 m sau 8,5 x 107 nm). Aceast macromolecul gigantic este mpachetat ntr-un spaiu care atinge, n metafaz, 0,5 m n diametru i 10 m n lungime, adic o mpachetare de aproxomativ 10 4 ori. Realizri remarcabile n descifrarea infrastructurii cromosomilor se datoresc cercetrilor efectuate de Hewish & Brugoyne (1973) care au constatat c prin tratarea cromatinei cu

endonucleaze activate cu Ca ++ i prin supunerea produselor rezultate la electroforez, se obineau repetiii de fragmente de ADN de aproximativ 200 pb (perechi de baze), repetiii ce s-au dovedit a fi un constituient permanent i ubiquitar al cromosomilor, cunoscut sub numele de nucleosom. Pe de alt parte, prin microscopie electronic s-au identificat bobie elipsoidale de aproximativ 11 nm n diametru i 6 nm n nlime, legate ntre ele prin fire subiri de acid dezoxiribonucleic. Aceste bobie nu sunt altceva dect nucleosomii. Pe de alt parte, digestia cromatinei cu nucleaze a evideniat existena unor formaiuni de aproximativ 146 pb care nu sunt disociate prin digestie. Mai mult dect att, uneori, un set de asemenea formaiuni rmne intact. Conform datelor de microscopie electronic, aceste seturi sunt asociaii de nucleosomi. Nucleosomii reprezint peste 95% din greutatea cromatinei i sunt considerai a fi unitile structurale de baz ale cromatinei. Structura lor poate fi redat schematic (Fig.5). n celulele eucariotelor cu organizare superioar, nucleosomii conin aproximativ 195 - 200 pb de ADN, un octamer histonic alctuit din cte dou molecule de H2A, H2B, H3 i H4 i o molecul de H1. Acesta nu este ns un nucleosom complet deoarece n figur nu este precizat i un fragment de 27 pb, fragment care nu este direct asociat cu octamerul histonic. Acest fragment conecteaz, ntre ei, doi nucleosomi consecutivi. n majoritatea cazurilor ns, octamerul histonic are n jurul lui aproximativ 1,7 ture de ADN (adic 146 pb). Octamerul histonic mpreun cu cele 146 perechi de nucleotide alctuiesc miezul, smburele, particula central a nucleosomului, cunoscut sub numele de nucleosomal sau histone core particle (Richmond et al., 1984). Acesta este modelul nucleosomal propus pe baza determinrilor efectuate n soluie cu dispersie de neutroni, dar i pe baza analizelor efectuate prin difracia razelor X (Bradbury & Baldwin, 1966; Klug et al., 1985; Burlingame et al,1985). Astfel, n conformitate cu acest model, exist un disc de 11,0 nm n diametru i 5,5 - 6,0 nm nlime, care are 1,7 ture de acid dezoxiribonucleic, cu o grosime de 3,0 nm, nfurat n jurul lui. Cele 146 de pb ale acidului dezoxiribonucleic nu sunt repartizate uniform n jurul octamerului histonic. Tetramerii 2H 3 i 2H4 interacioneaz cu ADN-ul i-l rsucesc n jurul lor. n acest fel se completeaz structura nucleosomal. S-a demonstrat c partea central a octamerului are histonele H 3 i H4, celelalte dou histone fiind la exteriorul lor (pe feele discului) aa cum este redat n modelul structurii discului octameric (Fig.6).

Fig.5 Diagrama unui nucleosom n jurul cruia se nfoar ADN pe aproximativ dou ture (model propus de Brandbury, 1992)

Rezumnd, putem preciza c exist trei etape n structurarea unui nucleosom i anume: 1. inima nucleosomului, alctuit din 146 pb i octamerul histonic (cte 2 molecule de H 2A, H2B, H3 i H4); 2. inima plus nc 22 pb, dnd un total de 168 pb, plus histona H 1, alctuiete cromatosomul; 3. cromatosomul plus nc aproximativ 32 pb (ajungndu-se la un total de aproximativ 200 pb.), formeaz nucleosomul. Trebuie precizat c, deocamdat, nu este precis stabilit dac exist o singur molecul H1 per nucleosom. Lungimea linkerilor dintre cromatosomi variaz att de la specie la specie, ct i de la un tip celular la altul. S-au descris linkeri n lungime de numai 8 pb,dar i linkeri de 114 pb. Nucleosomul complet conine, spre deosebire de inima nucleosomului, dou ture complete de ADN. Se mai afirm c structura i rolul nucleosomilor difer n regiunile genetic active de cele din

regiunile inactive. Interaciunile dintre ADN i histone, n cadrul nucleosomului, sunt de natur electrostatic, implicnd prile aminice, cu bazicitate crescut, din lanurile de arginin i lizin, precum i unele legturi slabe ale histonelor bazice, cu prile fosfat ale ADN-ului (Nieto & Palacian, 1988).

Fig.6 Modelul structurii miezului octameric, cu aranjarea probabil a histonelor. a - ADN-ul reacioneaz cu tetramerii H3, H4 i formeaz smburele discului nucleosomal, b - discul cu histonele H2A i H2B, asociate n exteriorul discului nucleosomal (dup Wagner, Maguire & Stallings, 1993)

Nucleosomii mpreun cu acidul dezoxiribonucleic linker alctuiesc o fibr cromatic de 11 nm grosime care se spiralizeaz, la rndul ei, dnd un solenoid de 30 nm grosime. Cercetrile nu au dat nc un rspuns clar i definitiv relativ la structurarea solenoidului de 30 nm grosime (Fig.7). Cnd concentraia ionic a mediului crete, apare aa numita form nalt a cromatinei (Thoma & Koller, 1977). La concentraia de 2 mM de electrolit de MgCl 2 i n prezena histonei H1 se poate pune n eviden aceast fibr de 25 - 30 nm grosime. n literatura de specialitate sunt meniuni privitoare la aceste fibre (McGhee & co., 1983; Felsenfield & McGhee, 1986). Analiza acestor fibre, prin microscopie electronic, cu raze X i cu neutroni, a relevat o structur prezent la toate metazoarele i la toate embriofitele, structur existent n cromosomi - att n cei interfazici, ct i n cei metafazici. Se admite c aceast structur reprezint un element de baz n cromosomii tuturor eucariotelor, cu eventuale excepii pentru unele protiste i pentru unele talofite.

Fig. 7. Diagrama solenoidului. Sunt 6 nucleosomi per tur. Nucleosomii au o nlime de 5,7 nm i un diametru de 11 nm. ADN-ul se continu de la un nucleosom la altul (linia ntrerupt) (dup Widom & Klug, 1985)

ADN-ul din componena solenoidului este, la rndul lui, constituit din dou pri - o parte ataat la miezul histonic i o alt parte cu rol spaiator (ali autori consider, dimpotriv, c are rol de linker), care asambleaz nucleosomii n solenoid. Aa cum precizam mai sus, segmentele spaiatoare (sau linkeri) sunt de lungimi variabile. Se pune doar o problem - cum sunt organizate aceste segmente? Unii autori (McGhee et al., 1983) apreciaz c ADN-ul spaiator este superrsucit. Linia AB, care trece prin centrul cromatosomilor adiaceni, este nclinat cu peste 10 0 fa de linia CD, care este perpendicular pe axa solenoidului. Aceasta determin deschiderea unghiului ADN-ului spaiator supercondensat care, la rndu-i, determin distana dintre nucleosomii vecini (unghiul ). Pe de alt parte, se cuvine menionat faptul c structurile aparente la acest nivel de rezoluie microscopic, reprezint implicit i un rezultat al metodei de analiz folosite, metod care presupune tratamente specifice (metode specifice de preparare a materialului). Prin urmare, se pot atepta rezultate ntructva diferite, de la un laborator (grup de cercetare) la altul. Toate rezultatele, ns, converg spre concluzia c fibra de 30 nm este o realitate (exist n realitate), rmnnd deschis doar problema structurii sale. La data prezent, structura solenoidului pus n eviden cu raze X, neutroni, microscopie electronic etc., pare a avea un suport faptic suficient de solid. Structurarea ulterioar a cromatinei (organizarea solenoidului), pentru a forma cromosomii vizibili n metafaz (sau regiunile cromosomiale heteropicnotice vizibile i n interfaz) (Fig.8), este suficient de bine cunoscut i explicat. Prerile, ca i argumentele, celor mai muli cercettori converg ctre concluzia n conformitate cu care fibra cromatic de 30 nm grosime se pliaz i formeaz bucle (lauri), asigurnd astrfel structurarea cromosomilor. Pentru a avea o reprezentare ct mai real a ratei de compactare a fibrei cromatice n cadrul unui cromosom, recurgem la exemplul dat de Wagner, Maguire & Stallings (1993) i anume. Cromosomul 16 din genomul uman conine aproximativ 1,1 x 10 8 pb, ceea ce reprezint aproximativ 3,7 x 10 4 m lungime (pentru respectiva fibr de cromatin). Dar, n metafaz, cnd condensarea este maxim, lungimea atinge doar 3 m. Se asigur, deci, o scurtare (datorat compactrii) de peste 12.000 de ori (adic 3,7 x 104 m / 3 m = 12.000). n prometafaza timpurie, acelai cromosom (cromosomul 16) este de 4 m lungime (adic s-a scurtat, prin compactare, de 9250 de ori). Pe baza acestui tip de calcule s-a conchis (Manuelidis & Chen, 1990) c diferena ntre rata scderii lungimii fibrei cromatice de 30 nm, prin compactarea n interiorul cromosomului i rata scderii lungimii cromosomului de la interfaz la metafaz este de 7,5. De aceea cromosomul 16, n interfaz, are o lungime de aproximativ 23 m (corespunznd unei rate de condensare de aproximativ 1600).

Fig.48. a. Cromosomi metafazici de cine, vzui la microscopul electronic cu baleiaj (SEM); b. Cromosom metafazic de hamster chinezesc (dup Wagner et al., 1993)

Prin urmare, ntrebarea care se pune este urmtoarea: cum se ajunge de la o lungime de 3,7 x 104 m la una de 23 m? Cele mai multe imagini, obinute la microscopul electronic cu scanare, relev situaia compactrii fibrei de ADN. Se observ plieri i contorsionri ale fibrei de cromatin, care explic acceptabil scurtarea cromosomilor. Dinamica spiralizrii, de la solenoid la cromosomul metafazic, este conform cu concepia relativ la structura intern a cromosomului. De aceea, o etap n compactarea cromosomului este asigurat prin nfurarea ADN-ului n jurul miezului nucleosomal i, apoi, prin spiralizri care duc la formarea solenoidului. Se asigur, astfel, o rat a mpachetrii de aproximativ 40. Deseori, restul compactrii se asigur prin alte procese. Cromosomii metafazici reprezint condensarea cromatic maxim (observat la cromosomii eucariotelor). Rolul acestor formaiuni este acela de a organiza i mpacheta macromolecula gigantic de ADN, permind segregarea ctre nuclei celulelor fiice. Cromosomii metafazici, care sunt eliberai de aproximativ 99% din coninutul lor histonic, i pstreaz ADN-ul n form aproximativ constant (asemenea cromosomilor iniiali, intaci), probabil tocmai din cauz c ADN-ul este ataat, n numeroase puncte, la scheletul proteic nonhistonic intern (Paulson & Laemmli, 1977). Acest schelet const, n primul rnd, din dou proteine, desemnate prin Sc1 i Sc2, cu greuti moleculare de 170 kD i, respectiv, de 135 kD (Lewis & Laemmli, 1982). Sc1 este, n fapt, Topoizomeraza II (Earnshaw et al., 1985), buclele radiale ale ADN-ului fiind ataate la aceast protein, n punctele numite SAR (n englez scaffolding attaching regions - regiuni de ataare la schelet) (Earnshaw & Heck, 1985; Gasser & Laemmli, 1986). 3.5.3.5. Eucromatina i heterocromatina Examinnd cu atenie cromosomii, pe lungimea lor, constatm c nu sunt uniformi sub aspectele chimice, fizice i genetice. n primul rnd, difer reacia lor la tratamentul cu colorani bazici, n sensul c unele segmente se coloreaz slab, cunoscute fiind sub numele de eucromatice, iar altele se coloreaz mult mai intens i au fost desemnate cu numele de heterocromatice. Interesant i important de consemnat este faptul c zonele heterocromatice nu conin gene n stare funcional, fiind considerate genetic inerte. n mod artificial, segmentele eucromatice pot fi introduse n segmentele heterocromatice, operaiune prin care se obin schimbri comportamentale ale ambelor categorii de segmente.

Eucromatina reprezint materialul normal, izopicnotic, deintorul informaiei genetice, cu comportament tipic n cazul diviziunii celulare (se spiralizeaz, se condenseaz, se decondenseaz i se coloreaz). La rndul ei, eucromatina este de dou tipuri: eucromatina activ i eucromatina permisiv. Eucromatina activ conine genele ce vor fi transcrise n ARNm. Eucromatina permisiv este reprezentat de acea poriune din eucromatin care devine activ doar dup ce accept (permite) semnale declanatoare (din categoria hormonilor, enzimelor etc.). Procesul autoreplicrii semiconservative a ADN-ului, n faza S din ciclul diviziunii celulare, ncepe la nivelul eucromatinei. n consecin, replicarea eucromatinei este mult mai timpurie, n comparaie cu cea a heterocromatinei. Heterocromatina reprezint materialul unor regiuni (uneori al unor ntregi cromosomi) heteropicnotice, caracterizate prin structur dens i compact, inclusiv n telofaz, interfaz i profaza timpurie. Din aceste cauze, heterocromatina se coloreaz intens i este vizibil i n interfaza ciclului celular (n nucleii celulelor n interfaz). Zonele heterocromatice sunt rspndite pe ntreaga lungime a cromosomului, dar mai ales n jurul centromerului, unde formeaz heterocromatina centromeric. Destul de frecvent este localizat i n apropierea organizatorilor nucleolari i spre capetele cromosomilor. Cu aceast ocazie se poate meniona faptul c n aceste zone cromosomiale (heterocromatice) au loc cele mai frecvente ruperi ale cromosomilor. Heterocromatina este componenta preferenial a cromosomilor sexuali i a celor suplimentari (cromosomii B). Sunt unele specii (broatele estoase, unii viermi) la care ntregul set cromosomial este heterocromatic. Replicarea ADN-ului, n zonele eucromatice i heterocromatice, se desfoar asincron. n ceea ce privete heterocromatina, ns, apar i unele aspecte deosebit de interesante. De pild, n stadiile timpurii de dezvoltare embrionar, heterocromatina lipsete. Deci, ca o concluzie fireasc, se poate accepta c ea nu se transmite de la o generaie la alta, ci se formeaz ntr-un anumit stadiu al ontogeniei. Dup ultimele observaii i experimente, se pare c orice regiune a cromosomului poate deveni, la un moment dat, heterocromatic. n consecin, heterocromatina i eucromatina trebuiesc privite nu ca uniti distincte i discontinue ale cromosomilor, ci stri ale cromatinei, dinamice att n timp ct i n spaiu. Sunt i autori care consider c exist o heterocromatin nativ, reprezentat prin segmente cromosomiale heterocromatinizate, nc de la naterea organismului i o heterocromatin funcional, care se individualizeaz temporar. O alt clasificare a tipurilor de heterocromatin a fost propus de Brown, n 1965. n conformitate cu aceast clasificare, heterocromatina poate fi constitutiv i facultativ. Heterocromatina constitutiv este identificat n cromosomul Y de la Drosophila melanogaster sau de la alte specii i are ca trstur definitorie faptul c se constituie nc de la nceputul vieii individului i rmne n aceast stare (genetic inactiv) pe tot parcursul dezvoltrii individuale. Heterocromatina constitutiv poate fi prezent i n ali cromosomi, fiind localizat (de obicei) de ambele pri ale centromerului. Heterocromatina facultativ este considerat cea din unul dintre cei doi cromosomi X, de la femelele de mamifere de pild, care devine genetic inactiv i se evideniaz n nucleul interfazic sub forma unui corpuscul intens colorat, cunoscut sub numele de cromatin sexual sau corpuscul Bar, bastonaul de tob (drum-stick) etc. n acest context, unul dintre cromosomii X devine nefuncional, asigurndu-se astfel egalitatea ntre cele dou sexe. Fenomenul este cunoscut sub numele de compensaie de doz. Important este faptul c heterocromatina facultativ are capaciti reversibile, astfel nct, n momentul n care cromosomul X inactivat de la femel ajunge s fie unicul cromosom X de la mascul, el devine funcional. Dar el devine activ i n ovulul n care, din ntmplare, nimerete. Apoi, dac prin fecundarea respectivului ovul se ajunge din nou la un zigot femel, iniial, acesta va avea ambii cromosomi X funcionali. n stadiul de blastocist, unul dintre ei devine nefuncional - capt statutul de cromatin sexual pentru ntreg ciclul ontogenetic. Iniial se considera c zonele heterocromatice nu conin gene funcionale. Dar, prin studii efectuate pe tomate, n 1961, s-a demonstrat c n heterocromatin exist gene funcionale - n heterocromatina centromeric. Heterocromatina poate aprea supercondensat, n unele regiuni cromosomiale, cum este cazul la Zea mays. Aici apar un fel de noduli, denumii knobi, n care activitatea genic este complet blocat. Numrul i topografia knobilor sunt constante pentru anumii cromosomi.

Deocamdat nu se cunoate rolul concret al knobilor i nici dac au sau nu gene cantonate pe ei. Sunt doar, presupuneri cu privire la rolul lor n procesele de gametogenez. 3.5.3.6. Categorii de cromosomi a. Cromosomii principali. Sunt cromosomii cu cea mai larg rspndire, altfel spus, cromosomii a cror prezen este considerat normal pentru celulele somatice i pentru cele sexuale normale i sunt grupai n dou clase: cromosomii A i cromosomii B. I. Cromosomii A sunt cromosomii tipici, normali ai complementului cromosomial ce definete o specie. Ei se comport constant (de obicei) att sub aspect tipologic (M, m, sm, st i T), ct i sub aspect numeric. II. Cromosomii B, supranumii i cromosomi accesorii sau suplimentari, sunt cromosomii aflai n exces, putnd fi n numr variabil, att la plante, ct i la animale. Un exemplu tipic de plant cu cromosomi B este Zea mays. Numrul cromosomilor B este extrem de variabil, nu numai de la individ la individ, ci i ntre esuturile aceluiai individ. Cromosomii B nu manifest fenomenul de omologie, nici ntre ei i nici cu cromosomii A. Sunt, de obicei, heterocromatici, mici i ineri din punct de vedere informaional. n diviziunea celular, distribuia lor nu este egal ctre celulele fiice.Nu li se cunoate originea, ci se presupune doar c au aprut din regiunile centrale ale unor cromosomi A, prin pierderea de ctre acetia a extremitilor (extremiti ce s-au putut ataa la ali cromosomi A, modificndu-le constituia i, deci, coninutul informaional). n context, trebuie menionat c nu li se cunoate nici rolul, deoarece lipsa lor (parial sau total) nu perturb existena individului purttor. Dimpotriv, uneori, prezena lor este duntoare. b. Cromosomii secundari, adic acei cromosomi care coexist cu cromosomii A i B, numai n anumite celule. n aceast categorie intr cromosomii uriai sau politenici din glandele salivare de la Drosophila melanogaster, Chironomidae i alte insecte, cromosomii lampbrush (perie de sticl de lamp) prezeni n oocitele vertebratelor, n profaza meiozei etc. 1. Politenicii sau cromosomii uriai au fost descoperii de ctre E. Balbiani (citolog italian), n 1881, n glandele salivare de Chironomus. Ca dimensiune, ei depesc de 100-200 ori lungimea cromosomilor normali, coninnd de peste 1000 de ori mai multe cromoneme. Cromosomii politenici au fost depistai i n unele celule somatice ale larvelor de diptere - cum ar fi tubul digestiv, tubulii lui Malpighi etc., fiind prezeni chiar i la unele plante (n sinergide) i la alte specii de nevertebrate. Evident, din considerente didactice, cromosomii politenici tipici sunt exemplificai prin cei din glandele salivare de Drosophilla melanogaster. Cauza apariiei acestor cromosomi este relativ simpl - celula n care ei se gsesc, nu se divide, ci doar i mrete dimensiunile. Nucleul respectivelor celule se gsete ntr-o perpetu stare de interfaz (pe ntreaga durat a stadiului larvar). Pe de alt parte, fenomenul are i o alt cauz. Cromosomii perechi se apropie i se unesc. Este fenomenul cunoscut sub numele de conjugare somatic. Concomitent cu creterea larvei, fiecare cromosom se mrete, prin replicarea cromatidelor i, implicit, a cromonemelor, fr migrarea lor la polii celulari. n final, fiecare cromosom ia aspectul unui fascicul de filamente (filamentele reprezentnd cromonemele), de unde i numele lor de politenici. n esen, avem un fenomen tipic de endomitoz - adic reduplicarea cromosomilor fr separarea i migrarea lor. De obicei, fiecare cromosom uria conine mai mult de 1000 cromoneme (subcromatide), care sunt vizibile ca filamente separate. Spiralizarea lor, pe lungimea cromosomului, este inegal. n plus, au i o structur chimic diferit de la o pereche la alta, ceea ce confer filamentului un aspect specific. Spiralizarea inegal, local mai compact, a cromonemelor, induce apariia unor formaiuni caracteristice, cunoscute sub numele de discuri. Discurile pot avea dimensiuni i structuri diferite. Unele discuri conin mai mult ADN i, n consecin, au o culoare mai intens, altele conin mai mult protein i, deci, au o culoare mai deschis. Sunt i preri n conformitate cu care toate discurile au aceeai compoziie, doar c reprezint poriuni mai puternic sau mai slab condensate (spiralate), de unde i coloraia lor diferit (Fig.9).

Fig.9 Cromosomul uria din glanda salivar de Drosophila melanogaster. Prin X, 2R, 2L, 3R, 3L i 4 sunt desemnai cromosomii X, braele drept (R, de la englezescul right) i stng (L, de la englezescul left) ale perechilor 2 i 3 i perechea 4 (desemnat prin 4) (dup Tamarin, 1991)

Cromosomii uriai de la Drosophila melanogaster formeaz o figur tipic, fiind constituii din cinci brae lungi i unul mai scurt. La punctul de ntretiere formeaz cromocentrul. Unul dintre braele lungi se noteaz cu X i reprezint cromosomii X, altele dou sunt notate cu 2S i 2D, celelalte cu 3S i 3D, iar braul scurt cu 4. Lungimea braelor, nsumate, ajunge la 2000 , adic de peste 266 ori mai mare dect lungimea nsumat a celor opt cromosomi somatici normali (7,5 n total). n cromosomii uriai (politenici), numrul cromonemelor dintr-un bra este de aproximativ 256, deci cu mult mai mare dect normalul (2 cromoneme / cromatid). Altfel spus, dac prin C redm numrul catenelor de acid dezoxiribonucleic dintr-un cromosom normal, ntr-un cromosom uria acest numr este dublat de 9 ori succesiv, ajungnd la 1024 C. Pe de alt parte numrul de dublri succesive difer de la un esut la altul, att la larvele de drosofila ct i la alte diptere. 2. Cromosomii lampbrush sunt tot cromosomi uriai. Forma lor se datoreaz conjugrii cromosomilor omologi ntr-un singur complex. n plus, cromosomii sunt puternic despiralizai i formeaz bucle simetrice cu orientare perpendicular pe axul complexului. Cromosomii de tip lampbrush sunt prezeni n oocitele amfibienilor, molutelor, echimodermelor, petilor, reptilelor, la unele mamifere i chiar la ceap. O asemenea conformaie se gsete i la cromosomul Y de la Drosophila melanogaster. La unele specii, aceti cromosomi ating lungimea de peste 1000, fiind considerai cei mai lungi cromosomi. Diametrul lor ns este foarte mic, uneori fiind att de subiri nct se situeaz la limita de rezoluie a microscopului optic. Avnd n vedere despiralizarea lor puternic, s-a emis prerea c respectivii cromosomi sunt deosebit de activi n procesul dezvoltrii oocitelor. nvestigaiile efectuate cu administrare de uridin marcat (3H), o precondiie a autoradiografiei, au argumentat aceast supoziie. n buclele cromosomilor perie de lamp are loc o intens transcriere a informaiei materializat n sinteza intens de ARNm. Deci, ca o concluzie final a problemelor analizate pn aici, se poate afirma c buclele din cromosomii lampbrush, ca structur i funcii, sunt similare pufelor din cromosomii uriai. 3.5.3.7. Cariotipul i idiograma Cnd am prezentat categoriile de cromosomi, am precizat c se are n vedere existena unei categorii de cromosomi principali, grupai n clasa A, reprezentnd cromosomii cu cea mai frecvent i normal prezen n celulele somatice i sexuale ale tuturor speciilor. Detaliind, precizm c la speciile care posed un determinism cromosomial al sexelor, cromosomii pot fi sbmprii n dou grupe - autosomi i heterosomi (sau alosomi, gonosomi, cromosomi ai sexului etc.). Evident, majoritatea membrilor complementului cromosomial sunt autosomi. De obicei exist doi heterosomi, excepie fcnd speciile al cror determinism cromosomial al sexelor este asigurat de heterosomi multipli i cele cu determinism sexual numeric cromosomial.

Cariotipul, n concordan cu raportul Conferinei Internaionale de la Denver (din 1960), ntrunit pentru standardizarea cromosomilor umani, poate fi definit astfel: ordonarea perechilor de cromosomi omologi, provenind dintr-o singur metafaz mitotic, n ordinea descrescnd a lungimii lor, cu centromerul plasat pe o linie imaginar (Fig.10, 11). Idiograma reprezint redarea grafic a lungimilor medii ale cromosomilor fiecrei perechi de omologi, obinute pe baza a cel puin 10 metafaze, din celule diferite provenite de la indivizi diferii (Fig.12). Se nelege c idiograma este mult mai reprezentativ pentru caracterizarea cromosomologic a unei specii. Modalitile practice de alctuire a cariotipului i idiogramei au fost precizate de lucrrile de laborator (se gsesc n orice manual de lucrri practice), fapt pentru care nu insistm. Se impun doar, cu aceast ocazie, cteva precizri. n stabilirea corect a perechilor de cromosomi omologi, constriciile secundare pot juca un rol definitoriu. De obicei, constriciile secundare nu afecteaz aceleai regiuni la diverii cromosomi. n plus, s-a constatat c aceste constricii secundare sunt mult mai uor observabile dac se administreaz cromosomilor unele tratamente speciale (cu ageni chimici, fizici sau biologici, cum ar fi: hidrazida maleic, 5-bromdezoxiuridina, virusul SV40sau al herpesului, dac se cultiv celulele pe mediu fr calciu, dac se asigur temperaturi sczute etc.). Mai recent s-au elaborat i alte metode de identificare exact a cromosomilor. Una dintre acestea este cea a bandrii. Prin bandare, fiecare regiune a unui anumit cromosom etaleaz un model caracteristic de benzi transversale, ceea ce permite identificarea cu mare siguran a cromosomilor, facilitnd observarea i cuantificarea diferitelor aberaii structurale sau numerice. O alt tehnic, extrem de modern, presupune determinarea coninutului de ADN n lungul unui cromosom. n acest sens, se recurge la microspectrofotometrie.

Fig. 10. Metafaz la Salmo gairdneri Rich (dup Minciu i Bra, 1986)

Fig.11. Cariotipul speciei Salmo gairdneri Rich., efectuat pe baza metafazei anterioare (dup Minciu i Bra, 1986)

Fig.12. Idiograma speciei Salmo gairdneri Rich (dup Minciu i Bra, 1986)

INTREBARI DE VERIFICARE 1. Definirea notiunea de cromosom 2. Precizarea caracteristicilor materialului genetic al virusurilor si viroizilor 3. Caracterizarea cromosomului bacterian si a modului sau de impachetare 4. Cromosomul la eucariote structura 5. Nucleosomul 6. Tipuri de cromosomi 7. Cariotipul si idiograma

TEME PENTRU EXAMINAREA FINALA 1. Intelegerea notiunii de cromosom 2. Prezentarea diferentelor in privinta materialului genetic intre procariote si eucariote 3. Aprofundarea aspectelor legate de structura, ultrastructura si functiile cromosomilor la eucariote 4. Nucleosomii, eucromatina si heterocromatina 5. Tipuri de cromosomi, cariotipul si idiograma

Unitatea de invatare 3

4. Teoria cromosomiala a ereditatii (morganismul)


4.1. Teoria cromosomial 4.1.1. Momentul Morgan
Profesor la Universitatea Columbia, din New York, Thomas Hunt Morgan (1866-1945) a sintetizat ntr-o teorie unitar multitudinea cercetrilor din domeniul geneticii, elabornd ceea ce a rmas n tiin sub denumirea de "TEORIA CROMOSOMIAL A EREDITII". Rsplata imediat pentru demersul su a fost conferirea premiului Nobel (1935), rsplata peren fiind nscrierea sa n galeria somitilor tiinei mondiale. Druit cu geniu, dar i cu intuiie, a tiut s-i aleag obiectul de studiu (Drosophila melanogaster) i colaboratorii (C.B. Bridges, A.H. Sturtevant i H. Muller), cu care a creat o

adevrat coal i un autentic sistem de cercetare, viabil, att ca profunzime ct i ca perspectiv.

Thomas Hunt Morgan (1866-1945), n laboratorul su din Universitatea Columbia

4.1.2. Obiectul studiului


Fr a intra n prea multe detalii, unele dintre ele fiind pe larg analizate n cadrul lucrrilor de laborator, reamintim cteva trsturi ale musculiei de oet, care au "recomandat-o" ca material optim pentru investigaiile de citogenetic. Aceast specie a fost descris la mijlocul secolului al XIX-lea sub numele de Drosophila ampelophila, ceea ce nseamn iubitoare de vi de vie (grecescul ampelos = vi de vie, philos = iubitor). Ulterior i s-a dat numele de Drosophila melanogaster, adic iubitoare de rou, cu abdomenul negru (grecescul drosos = rou, ap, lichid; philos = iubitor; melas = negru; gastris = stomac). Conform lucrrii An introduction to the Study of Insects ediia din 1964 revizuit de D. J. Borror i de D. M. De Long, specia Drosophila melanogaster aparine genului Drosophila din Familia Drosophilidae, Grupul Acalyptratae, Seciunea Schizophora, Subordinul Cyclorrhapha; Ordinul Diptera, Diviziunea Endopterigota (Holometabola), Subclasa Pterygota, Clasa Insecta (Hexapoda), ncrengtura Artropoda. Drosophila melanogaster are aproximativ 2 mm lungime, corpul de culoare gri-glbuie i doi ochi compui mari, de culoare roie-crmizie (la tipul slbatic). n regiunea capului mai prezint trei ochi simpli numii oceli i dou antene mici, aristate, formate din cte trei segmente; pe cel deal treilea segment antenal aflndu-se arista. Aparatul bucal este adaptat pentru lins i supt, Drosophila consum hran lichid sau lichefiat, n prealabil, cu ajutorul secreie glandelor salivare. Ca toate Dipterele, musculia de oet prezint dou aripi mari, mezotoracice, aripile de pe metatorace fiind transformate n haltere (organe de echilibru). Pe fiecare segment toracic se afl cte o pereche de picioare adaptate la mers. Numrul segmentelor abdominale vizibile este diferit la cele dou sexe apte la femel i cinci-ase la mascul. Acest numr mic de segmente la masculi este consecina fenomenului de telescopare a ultimelor segmente abdominale. Adulii de Drosophila melanogaster prezint dimorfism sexual, manifestat att prin diferene dimensionale, ct i morfologice. Femelele sunt mai mari dect masculii. Au abdomenul oval cu extremitatea posterioar puin ascuit. La masculi vrful abdomenului este rotunjit i colorat n maron-negru (Fig.13). Numrul de omatidii ce intr n alctuirea ochiului complex este diferit le cele dou sexe, i anume: 780 la femel, respectiv, 740 la mascul. Masculii prezint aa numitul pieptene sexual care servete la imobilizarea femelei n timpul acuplrii. Acesta este format din zece periori negri, rigizi, ce se gsesc pe primul articol tarsal al picioarelor anterioare (perechea I), mai precis n apropierea articulaiei dintre tibie i tars. Evident c diferenele cele mai nsemnate dintre mascul i femel in de organizarea intern, mai ales de anatomia sistemului reproductor.

Fig.13. Mascul i femel de Drosophila melanogaster de tip slbatic (Wild type)

Sexul larvelor se determin innd cont de poziia i mrimea gonadelor. Acestea sunt localizate n partea postero-lateral a larvei, n corpii grai. Testiculele sunt mult mai mari dect ovarele (de trei ori mai mari) i au o form oval. Ele pot fi observate cu ochiul liber datorit transparenei tegumentului larvei. Ca toate dipterele, Drosophila melanogaster prezint metamorfoz complet (este o insect holometabolic), ciclul su vital parcurgnd stadiile de ou, larv, pup i adult. Durata ontogeniei variaz n funcie de temperatur, umiditate, compoziia mediului nutritiv etc. Stadiul de ou. Este cuprins ntre momentul depunerii oului de ctre femela adult i cel al apariiei larvei corespunztoare. n partea anterioar, dorsal, oul prezint o pereche de filamente (apofize) cu rolul de a mpiedica scufundarea sa n mediul lichid. Stadiile larvare la Drosophila melanogaster sunt n numr de trei, fiind separate ntre ele prin dou nprliri. Larva de stadiul I prsete oul prin micropil, este mic, foarte mobil i se hrnete cu mare repeziciune. Este o larv de tip apod (fr apendici), acefal (capsula cefalic este nfundat complet n torace). Aparatul bucal de tip primitiv (adaptat pentru rupt i mestecat) prezint mandibule puternice, ca nite crlige, cu ajutorul crora larva ptrunde n materialul nutitiv. Acest prim stadiu larval dureaz aproximativ 24 ore. Pe msur ce larva crete, cuticula sa chitinoas devine nencptoare, astfel, c larva o prsete i i sintetizeaz o nou cuticul (nprlete). Larva de stadiul II apare n urma primei nprliri. Aceasta este mai mare i continu s se hrneasc timp de aproximativ 24 ore, dup care sufer nc o nprlire. Larva de stadiul III apare dup cea de-a doua nprlire (dup aproximativ ase zile de la fertilizare). Aceasta pote atinge 4,5 5 mm lungime i se dezvolt pe parcursul a 48 ore. Stadiul de pup are o durat variabil, fiind profund influenat de temperatur. La Drosophila melanogaster pupa este de tip coarctat pup butoia, o variant a pupei adectice (cu mandibule nesclerificate) de tip liber, caracterizat prin aceea c larva din stadiul III mpupeaz n interiorul ultimei exuvii larvare. La nceput nveliul pupal chitinos este alb i moale. Odat cu scurtarea corpului larvei el se ntrete i se nchide la culoare, fiind numit i puparium. Are form oval, msoar 2,5 3 mm i prezint n partea anterioar dou prelungiri ce corespund spiraculelor evaginate ale fostei larve. Stadiul de imago. n urma transformrilor ce au loc n interiorul nveliului pupal, se formeaz adultul care eclozeaz printr-o deschidere circular din regiunea anterioar a pupariumului. La nceput insecta este foarte lung, cu aripile nedesfcute, lipite de corp i are o culoare deschis. Aceste caracteristici ale adulilor nou eclozai constituie criteriile care i deosebesc de insectele btrne. Indivizii speciei Drosophila melanogaster sun frecvent ntlnii n natur, pe fructe care au nceput s fermenteze (mere, pere, prune, struguri etc.). Vara o ntlnim n vii, grdini, livezi sau n magazii, beciuri cu fructe i legume (mai ales dac acestea sunt alterate), n depozite, pe tescovina rmas de la prelucrarea vinului i, n general, n locuri insalubre. Aceast specie nu prezint diapauz, iernnd n magazii, depozite, beciuri etc. n laborator, musculia de oet poate fi cultivat pe medii artificiale care conin zahr i drojdie componente ce mijlocesc procesul de fermentaie. Compoziia mediului are influene asupra ciclulului vital, viabilitii i prolificitii insectei.

Temperatura, ca i compoziia mediului de cultur, influeneaz desfurarea ciclului vital la Drosophila melanogaster. La temperaturi mai mari de +31 0C femela devine parial sau chiar total steril. n regiunile cu umiditate sporit, musculia de oet poate tolera temperaturi mai ridicate ale aerului. Temperatura optim pentru dezvoltarea indivizilor de Drosophila melanogaster este de +24 - +250C. La aceast temperatur ciclul vital dureaz 10 zile (stadiului de ou i revin 24 ore, celui de larv 4 zile i pupei tot 4 zile). Astfel, ntr-un an se pot obine 40 de generaii. La temperaturi mai mici, ciclul de dezvolatre al insectei se lungete. Astfel, la +20 oC, ciclul vital se prelungete pn la 16 zile (larva 8 zile, pupa 6-7 zile), pe cnd la +100C durata ontogeniei ajunge la 75 de zile (larva 57 zile, pupa 13-14 zile). Umiditatea optim necesar dezvoltrii normale pentru Drosophila este de 75-85%. n unele cazuri acest parametru poate deveni o problem serioas. Un nivel al umiditii sub 70% afecteaz profund fertilitatea i viabilitatea insectelor. Musculia de oet prezint o prolificitate ridicat. n cursul vieii, o femel depune cteva sute de ou. In majoritatea cazurilor numrul oulor depuse este de 200-300. Bridges precizeaz c ameliorarea condiiilor de via determin o cretere a numrului de ou depuse, uneori acesta ajungnd pn la 2000. In medie o pereche de insecte d natere la aproximativ la 170 descendeni. Adulii de Drosophila melanogaster, n condiii de laborator, triesc aproximativ 3-4 saptamni. Longevitatea depinde de condiiile n care sunt crescute insectele i anume: temperatura, umiditatea, compoziia mediului nutritiv, densitatea populaiei, prezena n mediu a paraziilor etc. n condiii optime indivizii de Drosophila pot supravieui chiar 22 de sptmni (153 de zile). Exista unele mutante care au o viabilitate mult mai mare dect a tipului slbatic ns, de obicei, mutantele sunt mai puin viabile. n concluzie, putem afirma c sunt argumente care recomand aceast specie pentru studii de genetic i anume: a. Rapiditatea succesiunii generaiilor (circa 10-15 zile pentru un ciclu ontogenetic complet, o la 24 C). b. Prolificitate crescut (circa 200 ou/femel). c. Pretenii sczute fa de condiiile de cretere (se dezvolt bine n condiii artificiale). d. Numr mic de cromosomi (2n=8) uor identificabili. Astfel, perechea I este alctuit din cromosomi n form de bastonae drepte la femel i unul n form de bastona drept i altul ndoit la un capt, n cazul masculului. A se reine acest aspect, ca argument pentru fundamentarea ipotezei plasrii genelor pe cromosomi i pentru considerarea respectivei perechi ca reprezentnd cromosomii sexului (pentru femel, sunt notai cu XX, iar pentru mascul, cu XY). Cromosomii din perechile II i III sunt de forma literei "V". iar cei ai perechii IV sunt punctiformi. Dac cromosomii sexului mai poart i numele de heterosomi, restul sunt denumii autosomi. Principala caracteristic a drosofilei care, pe lng calitile amintite anterior, o recomand drept un material extrem de adecvat pentru investigaii genetice, o constituie mutabilitatea ei ridicat (rata relativ nalt de apariie a mutaiilor, att n mod spontan, ct i sub impactul anumitor tratamente). Practic, pentru fiecare dintre caracterele morfo-anatomice s-au identificat i descris mutaii. Sunt stabilite i caracterizate, pn n prezent, peste 500 mutaii, viznd culoarea ochilor, forma ochilor i a aripilor, culoarea corpului, pilozitatea i forma periorilor etc. Pentru Morgan, mutaiile au constituit un excelent mijloc de a studia legitile transmiterii ereditare a caracterelor i de a stabili mecanismele cromosomiale ale procesului. n principiu, s-a pstrat metodologia mendelian a notrii genelor (factorii ereditari, n concepia lui Mendel), dar s-a introdus o inovaie. n loc s se foloseasc, n mod aleatoriu, literele alfabetului latin pentru desemnarea fiecrei gene, se folosete prima liter, primele litere sau un grup de litere din cuvntul englezesc ce denumete prima mutant descoperit pentru caracterul respectiv. Cel mai utilizat exemplu este acela referitor la culoarea ochilor. n mod normal, drosofila are ochii de culoare roie. Prima mutant identificat, pentru acest caracter a fost cea cu ochi albi. n consecin, ea a primit numele white, notarea ei convenional fiind w. Evident, pentru forma cu ochi normali, dominant n ncrucirile cu mutantele, se putea recurge la desemnarea prin W. S-a preferat, ns, utilizarea simbolului w+, ntruct exist i cazuri de mutante dominante, a cror desemnare se face prin liter mare. Dar, a aprut o nou complicaie. n cazul unor gene (vezi tabelul 4.2) exist o serie alelic (polialelia). Referindu-ne tot

la culoarea ochilor, menionm mutantele: sepia, eosin, ivory, vermillon, apricot etc. Desemnarea lor ar putea fi fcut prin litere de la respectivele cuvinte (sp, e, i, v, a), dar, n acest caz, desemnarea tipului slbatic ar avea mai multe simboluri (sp+, e+, i+, v+, a+ etc.) i ar putea duce la confuzii. n consecin, s-a recurs la un alt sistem, n care la prima mutaie se adaug indicativele celor ulterior descoperite (wsp, we, wi, wv, wa), situaie n care, pentru desemnarea tipului slbatic, se recurge constant la o singur notaie - w+(Fig.14).
Cromosomii din perechea I y, yellow (0,0) mutant ce prezint corp de culoare galben intens, perii fiind cafenii cu vrful galben; pn, prune (0,8) mutant cu ochi de culoarea prunei; w, white (1-1,5) mutant cu ochi de culoare alb, ocelii fiind incolori, ca i tuburile lui Malpighi. A fost prima mutant descoperit (n 1910, de Lilian Morgan). Prezint numeroase alele; a w , apricot (1-1,5) prezint ochi de culoare trandafirie-glbuie la masculi i ceva mai galbeni la femele. Combinaia wa/wa;bw/bw are ochii mai deschii la culoare dect a a + + mutanta apricot (w /w ;bw /bw ); N, Notch (3,1) mutant cu aripile zimate; cx, curlex (13,6) mutant cu aripile ndoite n sus; ct, cut (20,0) mutant cu aripile reduse (tiate); ras, raspberry (32,8) mutant cu ochi de culoarea zmeurei; v, vermilion (33,0) mutant ce prezint ochi de culoare roie foarte vie, ocelii fiind incolori. Combinaia v/v;bw/bw prezint ochi albi. Viabilitatea este satisfctoare; m, miniature (36,1) aripile sunt mici, depind cu puin abdomenul; f, forked (56,6) prezint peri scuri i ndoii, bifurcai la vrf; B, Bar (57,0) mutant dominant, ce prezint ochi redui la un segment; Bx, Beadex (59,4) mutant cu aripi zimate; car, carnation (62,5) mutant cu ochi de culoare rubinie-nchis. Cromosomii din perechea II-a al, aristaless (0,0) mutant fr ariste; S, Star (1,3) mutant cu ochi n form de stea; Cy, Curly (8,5) prezint aripile ndoite n sus. n stare homozigot (Cy/Cy), aceast gen este letal; dp, dumpy (13,0) mutant cu aripile tiate i reduse la aproximativ 2 3 din lungimea aripilor de latipulul slbatic; b, black (48,5) prezint corp de culoare neagr; pr, purple (54,5) mutant cu ochi purpurii; ap, apterous (55,4) nu prezint aripi; cn, cinnabar (57,5) mutant cu ochi de culoare roie aprins, ce se nchide odat cu vrsta; vg, vestigial (67) prezint aripile sub forma unor rudimente (vestigii), de unde a primit i denumirea; sf, safranin (71,5) prezint ochi de culoarea ciocolatei; L, Lobe (72,0) prezint ochi redui ca mrime. n stare homozigot (L/L) determin o reducere accentuat a ochilor i scderea viabilitii, poate fi letal; c, curved (75,5) mutant cu aripi subiri, deprtate i rsucite; bw, brown (104,5) culoarea ochilor este cafenie deschis la natere i se nchide dup mai multe zile. Este afectat i culoarea organelor interne. Vasele i testiculele sunt incolore, iar tuburile lui Malpighi sunt mai deschise la culoare dect la tipul slbatic; Cromosomii din perechea III-a dv, divergent (20,0) mutant cu aripile ndeprtate; se, sepia (26,0) prezint ochi de culoare roie-cafenie, transpareni la natere, nchizndu-se, cu timpul, pn la sepia (pot deveni chiar negri); rs, rose (35,0) mutant cu ochi de culoare roz; D, Dichaete (40,4) prezint cte doi periori mpreun; p, pink (48,0) mutant cu ochi de culoare rubinie; ma, maroon (49,7) prezint ochi de culoare castanie; dw, dwarf (50,0) mutant pitic; ss, scinelles (58,0) mutant caracterizat prin absena periorilor; bx, bithorax (58,5) mutant cu mezotoracele dublat; e, ebony (70,7) prezint corp de culoare neagr strlucitoare, mult mai nchis dect la Wild type. Viabilitatea acestei mutante este 80% din cea a tipului slbatic; det, detachet (72,5) mutant cu ochi sticloi; ro, rough (91,1) prezint ochi micorai, cu suprafa neregulat. Cromosomii din perechea IV-a M4, Minute 4 (0,0) mutant cu periori subiri; bt, bent (0,0) mutant cu aripile ndoite n jos;

sv, shaven (0,1) prezint peri abdominali rari, mai puini dect la tipul slbatic; ey, eyeless (0,2) mutant cu ochi redui la jumtate sau la un sfert din mrimea celor de la tipul salbatic. Uneori ochii lipsesc complet; Cat, Cataract (6,7) prezint ochi cu suprafaa neregulat; spa, sparkling (93,0) mutant cu ochi proemineni, ce au suprafaa neregulat.

Fig. 14. Mutante de Drosophila melanogaster

4.2. Argumente pentru plasarea genelor (factorilor ereditari) pe cromosomi


Argumentul, imbatabil, pentru considerarea cromosomului drept suport material al factorilor ereditari (pentru plasarea genelor pe cromosomi) l-au furnizat experimentele efectuate cu drosofila. S prezentm doar unul dintre ele. n experimentele efectuate de Mendel, utiliznd mazrea cu bobul galben i cea cu bobul verde, segregarea n F2 era aceeai, indiferent de culoarea printelui ales ca mascul i a celui ales ca femel. Nu acelai lucru se constat, ns, cnd se fac ncruciri reciproce ntre indivizii w+ i w de drosofila. Situaia a condus la concluzia c gena responsabil de manifestarea respectivului caracter este cantonat pe unul dintre cromosomii sexuali. Iat care sunt rezultatele n cele dou tipuri de ncruciare:
P F1 w+w+ ww 50%
+ + +

x x

wy w+y 50%

+ cu ochi de culoare roie F2 ww 25% 100% cu ochi roii; w+y w+w 25% 25% 50% ochi roii;50% ochi albi wy 25%

n ncruciarea reciproc:
P F1 ww ww+ 50% cu ochi roii; ww 25% x x w+y wy 50% w+y 25%

F2

cu ochi albi w+w wy 25% 25% 50% cu ochi roii;50% cu ochi albi 50% cu ochi roii;50% cu ochi albi

ntruct att masculii ct i femelele au trei perechi identice de autosomi, diferenele constnd n prezena heterosomilor pereche (XX) la femele sau nepereche (XY) la masculi, rezult c respectiva gen este plasat pe unul dintre cromosomii sexului i anume pe cromosomul X, deoarece femelele heterozigote se comport (fenotipic) asemenea celor homozigote dominante, n timp ce masculii (fiind hemizigoi) se manifest recesiv sau dominant, n funcie de tipul cromosomului X pe care l-au primit (cu gena slbatic sau cu alela mutant plasat pe el). Fenomenul, cunoscut i sub numele de sex linkage, se constituie n cauz pentru abaterea de la tipul mendelian de segregare. Un alt exemplu, care confirm ipoteza plasrii genelor pe cromosomi, l constituie asocierea dintre lipsa unui cromosom din perechea IV i lipsa ochilor, la aceeai insect. Prin urmare, pe un cromosom, ntr-un anumit loc, numit locus, se afl plasat o gen. Pe cromosomul omolog, n aceeai poziie, adic n acelai locus, se afl plasat aceeai gen sau una dintre alelele ei. ntruct, n orice celul somatic avem cel puin dou seturi cromosomiale, unul provenind pe linie matern i cellalt pe linie patern, se poate considera c un individ, diploid, se poate afla n trei ipostaze i anume: AA (homozigot dominant), Aa (heterozigot) i aa (homozigot recesiv). Prin urmare, altfel spus, n cadrul diploidului genele se pot afla n doz simpl (gena A i alela a), n doz dubl (AA), sau lipsesc fiind prezente doar alelele, n doz dubl (aa).

n aceast ordine de idei, se cuvine reamintit faptul c, prin mutaie, una i aceeai gen sau alela (alele) ei, poate suferi o succesiune de mutaii, irul de alele fiind mult mai mare. Fenomenul, cunoscut sub numele de polialelism, contribuie la mbogirea substanial a variabilitii intrapopulaionale, n sensul c genofondul se mbogete. Evident, starea probabil a unui individ poate mbrca doar una dintre ipostazele menionate anterior, cu deosebirea c numai homozigoii dominani vor fi de un singur tip (AA), n timp ce heterozigoii i homozogoii recesivi pot fi de mai multe tipuri: Aa, Aa1...Aan, aa1...aan etc. (pentru heterozigoi) i aa, a1a1...anan (pentru homozigoii recesivi). Prin urmare, alelele sunt mutante ale genei de origine, plasate n cromosomii omologi, n acelai locus, la indivizi diferii i au rol n determinismul aceluiai caracter. n cazul experienelor lui Mendel, de pild, alele erau doar A i a, responsabile de determinismul culorii bobului, sau B i b, responsabile de determinismul formei bobului. ntre A i B nu se poate vorbi despre raport de alelism. ntr-o tentativ de definire a genei, nu putem omite calitile ei de unitate ereditar, mutaional i recombinaional. n timp, noiunii de gen i s-au atribuit mai multe sensuri. Dintre acestea, le amintim pe urmtoarele: o gen este responsabil de determinismul unui caracter; o gen este responsabil de determinismul sintezei unei enzime, o gen este responsabil de determinismul sintezei unei proteine; o gen este responsabil de determinismul sintezei unei biomolecule. ntruct cercetrile n derulare au evideniat determinismul poligenic al unor caractere, apoi faptul c o molecul enzimatic este alctuit dintr-o protein i o grupare prostetic i implic activitatea a mai mult dect o gen, precum i faptul c prin activitate genic se sintetizeaz i molecule nonproteice (acizii ribonucleici etc.) singura accepiune valabil pentru noiunea de gen a rmas cea din urm, adic o gen reprezint secvena de codoni responsabil de determinismul sintezei unei biomolecule. n sens larg ns, considerm c atribuia esenial a unei gene rezid n determinarea unui caracter. Dar, aa cum precizam anterior, structura unei gene (calitatea informaiei pe care o deine) se poate schimba, prin mutaie. n consecin, o gen poate avea una sau mai multe alele. Evident, gena i alelele sale ocup acelai locus (aceeai poziie) pe un anumit cromosom (sau pe omologul su). Prin mutaie gena i schimb nu numai calitatea informaional, ci i "calitatea activitii", n sensul c, dei determin acelai caracter (i nu altul), amplitudinea fenotipizrii ei va fi alta. Prin intermediul fecundrii, ntr-un zigot (viitor organism) se pot ntlni i forma o pereche, conform teoriei probabilitilor, att genele dominante, ct i alelele sau o gen cu una din alele, ntruct un genom provine pe linie patern i cellalt, pe linie matern. Este vorba, evident, de perechea de gene sau alele situate n acelai locus. Cu aceast ocazie, mai precizm nc un aspect. n concepia noastr, gena este unic, adic cea care s-a constituit iniial, cunoscut i sub numele de gen slbatic. Tot ce a aprut ulterior, prin mutaie, reprezint familia de alele ale genei slbatice. n consecin, exprimarea corect este: o gen i alelele ei (n limba greac, allelon = altul). Pe de alt parte, meioza permite asortarea ntmpltoare (dansul aleatoriu al cromosomilor; de la latinescul aleatoriu = ntmpltor) a cromosomilor i, deci, a genelor, n gamei. n consecin, aa cum a rezultat din experimentele lui Mendel, indivizii unei descendene hibride pot etala o multitudine de recombinri ale caracterelor prezente la prini.

4.3. Plasarea liniar a genelor pe cromosomi


n paginile anterioare am demonstrat, fr dubii, c genele sunt plasate pe cromosomi. Dar, un calcul extrem de simplu ne arat c numrul de cromosomi este mult mai mic, fa de numrul caracterelor etalate de un individ. La Drosophila melanogaster, de pild, s-au identificat mai multe sute de caractere i numai 8 cromosomi. innd cont de omologia cromosomilor, n fapt exist patru perechi i, avnd n vedere raportul de alelism al genelor, putem vorbi doar de 4 grupe de linkage ca entiti diferite. Deci, ca o prim concluzie, se impune constatarea c genele responsabile pentru cele cteva sute de caractere sunt cantonate n patru cromosomi. Deci, ntr-un cromosom exist mai multe gene. Dar cum sunt ele plasate, n mod concret, ntr-un cromosom? i ce dovezi avem, totui, c mai multe gene sunt plasate n acelai cromosom? Argumentele pentru plasarea mai multor gene pe acelai cromosom aparin tot colii lui T.H. Morgan i au fost susinute de experimente extrem de simple i clare, totodat.

S-a efectuat o experien de hibridare (tip dihibridare), ntre indivizi de D. melanogaster ce difereau ntre ei prin culoarea ochilor i forma aripilor. Femela era fenotipic normal (pr+pr+vg+vg+), iar masculul dublu mutant - avea ochii purpurii (prpr) i aripile vestigiale (vgvg). n F1 s-au obinut doar indivizi fenotipic normali. Prin ncruciarea lor, n F 2, n loc s se obin segregarea de tip mendelian, de 9:3:3:1, s-au obinut doar dou categorii de fenotipuri - 75% de tip parental dominant i 25% de tip parental recesiv. Deci, un raport tipic monohibridrii (adic 3 : 1). Prin urmare, se impune o prim concluzie. Cele dou caractere nu segreg independent. De aici supoziia c ele sunt plasate (genele ce le determin) pe acelai cromosom. Adic, pentru individul normal vom avea pr+ vg+, i pr wg pentru cel mutant. pr+ vg+ pr wg Pentru a elimina confuziile, precizm c cele dou gene sunt cantonate pe cromosomii perechii a II-a. Indicativul "pr" red mutanta purple (purpuriu, n englez). Deci, nu este vorba de cromosomii sexului i, de aceea, nu am notat masculul mutant prin pr vg. ncruciarea se deruleaz dup urmtoarea schem:
P G F1 G F2 pr vg pr+vg+
+ +

pr vg + + pr vg + + pr vg + + pr vg pr vg pr+vg+ prvg pr vg pr vg
+ +

x x x x pr vg pr vg
+ +

pr vg pr vg pr vg + + pr vg pr vg pr+vg+ prvg pr vg pr vg

Segregare genotipic: 25% homozigot dominant + 50% heterozigot, + 25% homozigot, recesiv Segregare fenotipic: 75% dominant + 25% recesiv Prin urmare cele dou gene sunt localizate pe acelai cromosom i se transmit mpreun. Fenomenul este cunoscut, n genetic, sub numele de linkage (nlnuire, legare). Este, n fond, nu numai o abatere, ci o completare a legii segregrii independente a caracterelor, demonstrat de Mendel.

4.4. Transmiterea nlnuit a tuturor genelor plasate pe un cromosom (linkage)


Autenticitatea linkage-ului a fost confirmat i prin retroncruciarea de tipul Test-cross (FT). Adic, un individ din F1 (un mascul) se ncrucieaz cu unul dublu mutant (o femel). Se obin dou clase fenotipice i anume: 50% indivizi normali i 50% indivizi dublu mutani. Precizm c este obligatorie respectarea sexelor indicate, deoarece masculul nu prezint fenomenul de crossing-over i, n consecin, rezultatele experimentului sunt constante.
P(F1) G FT pr vg pr vg pr+ vg+, pr vg pr vg pr vg
+ + + +

x x

pr vg pr vg pr vg pr vg pr vg

Heterozigoi cu fenotip normal (dominant) 50%

Homozigoi cu fenotip recesiv(dublu mutant) 50%

Deci, att genotipic (Sg), ct i fenotipic (Sf), segregarea este de 1:1. n consecin, cele 500 de gene identificate la Drosophila melanogaster au fost repartizate n patru grupe de linkage, corespunztoare celor patru perechi de cromosomi omologi. Se cuvine menionat faptul c mrimea unei grupe de linkage sau, altfel spus, numrul genelor plasate ntr-o grup este n concordan cu mrimea cromosomului. Astfel, grupa a IV-a de linkage, fiind plasat pe cromosomii perechii a IV-a (punctiformi), conine doar 12 gene. Ca o concluzie, general, menionm c la fiecare specie, numrul grupelor de linkage este identic cu numrul cromosomilor unui set haploid (genom). Se ridic o singur problem doar,

aceea a autopoliploizilor. In mod normal, ntr-un autopoliploid, numrul grupelor autentice de linkage este acelai cu numrul existent n diploidul de origine. La alopoliploizi numrul grupelor de linkage reprezint suma grupelor diploizilor ce au contribuit la hibridare. In aceeai idee, precizm c la aneuploizi avem grupe de linkage supranumerare sau subnumerare, comparativ cu diploizii de origine. In conformitate cu teoria linkage-ului, atunci cnd dou gene segreg mpreun, nseamn c fac parte din aceeasi grup de linkage, iar cnd segreg independent (dup modelul mendelian) nseamn c fac parte din grupe diferite de linkage - adic sunt plasate pe cromosomi diferii.

4.4.1. Sex-linkage (transmiterea nlnuit a genelor plasate pe heterosomi)


Aa cum am precizat deja, specia Drosophila melanogaster are patru grupe de linkage, adic are patru perechi de cromosomi. Mai exact drosofila are trei perechi de autosomi i doi heterosomi identici la femele (notai XX) i diferii la masculi (notai XY). Prin experimente proiectate i efectuate cu deosebit grij, T.H.Morgan i grupul su de cercettori au reuit s demonstreze c una dintre genele responsabile pentru determinismul culorii ochilor este plasat pe heterosomul X (vezi harta genetic), rezultatele ncrucirilor ntre indivizi normali i indivizi mutani depinznd, ntotdeauna, de sexul mutantului. Aa cum reiese din imaginile redate anterior, rezultatele ncrucirilor sunt dependente de genotipurile masculilor i femelelor cu care s-a efectuat experimentul.

Figura 4.3. Motenirea culorii ochilor la Drosophila melanogaster, n descendena unei femele normale i a unui mascul cu ochii albi (Dup Snustad & co., 1997)

Figura 4.4 Transmiterea culorii ochilor, la D. melanogaster, prin hibridarea dintre o femel heterozigot i un mascul mutant (sus) i o femel mutant i un mascul normal (jos) (Dup Snustad & co., 1997)

Prin urmare, s-a reuit s se demonstreze c gena responsabil de determinismul culorii ochilor este cantonat pe heterosomul X. n fapt totul a nceput dup ce a fost sesizat prezena unui mascul cu ochii albi. Cnd respectivul mascul a fost ncruciat cu o femel normal (de tip slbatic), toi descendenii au avut ochii de culoare roie, demonstrnd recesivitatea culorii albe i dominana celei roii. Prin ncruciarea descendenilor ntre ei s-a constatat c situaia se schimb i se complic femelele apreau numai cu ochii roii n timp ce masculii apreau att cu ochi albi (50%) ct i cu ochi roii (50%). Este clar, deci, c respectivul caracter (mai exact spus gena care-l determin) este cantonat pe cromosomul X. Altfel spus transmiterea respectivei gene este sexlinkat. Gena pentru culoarea ochilor este plasat pe cromosomul X i nu pe Y i, prin mutaie, apar alele. Tipul slbatic (normal) este desemnat prin w+, iar alela pentru culoarea alb prin w. Recurgnd la o simbolistic general i unificatoare n acelai timp, n care notm genele cu litere latine i, presupunnd c vom avea un grup de linkage din cinci gene, dinamica genotipurilor i fenotipurilor n descendena hibridrii va arta astfel:
P G F1 G F2 Sg Sf ABCDE ABCDE ABCDE ABCDE abcde ABCDE, abcde ABCDE ABCDE ABCDE abcde 1 3 x x x x ABCDE abcde 2 abcde abcde abcde ABCDE abcde ABCDE, abcde abcde abcde 1 1

Genele care fac parte din aceeai grup de linkage, sunt gene linkate. Cromosomii reprezentnd substratul (suportul) material al genelor, rezult c n meioz asortarea ntmpltoare a cromosomilor n gamei este, n fapt, asortarea ntmpltoare a grupelor de linkage. Altfel spus, o gen i chiar o grup de linkage, au comportamente identice cromosomilor.

n cazul sex-linkage-ului, are importan sexul indivizilor pe care-i folosim n ncruciare. Evident, cnd genele sunt localizate pe autosomi, sexul indivizilor utilizai pentru ncruciare nu ar trebui s aib importan. Dar, aa cum precizam mai sus, la Drosophila melanogaster, ntre autosomii masculului nu are loc fenomenul de crossing-over. Prin urmare, cnd se ateapt o constan a rezultatelor, este bine s se in cont de acest lucru.

4.5. Crossing-over (schimbul reciproc de gene)


Aa cum precizam n rndurile anterioare, nu ntotdeauna genele aparinnd aceluiai grup de linkage, se transmit mpreun. S-au constatat nenumrate excepii. n tentativa de a da explicaii adecvate abaterilor de la regul, Morgan i echipa sa au constatat c ntre cromosomii omologi poate avea loc un schimb reciproc de gene. Fenomenul a primit numele de crossingover.

4.5.1. Crossing-over ntre cromosomii sexului


Prin ncruciarea unei femele de Drosophila melanogaster, dublu mutant (cu dou mutaii recesive, ale genelor localizate pe cromosomul X, determinnd culoarea galben a corpului i culoarea alb a ochilor), cu un mascul normal, n F 1 s-au obinut doar indivizi de dou tipuri - deci, o segregare de 1:1. Femelele erau cu fenotip normal, dar heterozigote i masculii cu fenotipizare mutant, dar hemizigoi genotipic. Fenomenul a primit denumirea de ereditate n cruci (crisscross), deoarece fenotipul mamei se manifest la fii, iar cel al tatlui la fiice. Prin ncruciarea indivizilor femeli i masculi din F 1, s-a constatat apariia, n F2, a patru clase de indivizi - dou clase conforme rezultatelor determinate de linkage i alte dou clase cu recombinare de caractere. Proporia era de 49,25% pentru fiecare dintre primele dou clase i de 0,75% pentru fiecare din clasele cu recombinare. Precizm c w reprezint mutanta pentru culoarea ochilor (ochi albi) i y reprezint mutanta pentru corp galben (de la cuvntul englezesc yellow), w+ i, respectiv, y+ reprezentnd genele normale. Deci, plecndu-se de la femele dublu mutante i masculi normali, n F 1 s-a obinut o segregare fenotipic (Sf) de 1:1 i una genotipic (Sg) tot de 1:1, femelele fiind heterozigote, cu fenotip normal (dominant) i masculii hemizigoi, cu fenotip recesiv (mutant). Schematic, ncruciarea este redat astfel:
Prini Gamei F1 Gamei nerecombinai recombinai F2 Xyw Xyw Xyw X y+w+ X Xyw, Xy+w+ X
y+w yw

x x X Y x
yw

Xy+w+ Y Xyw, Y

Xyw, Y

,X

yw+

Xyw Xyw yw X Y 49,75%

Xy+w+ Xyw+ yw X Y 49,75%

Xy+w Xy+w yw X Y 0,75%

Xyw+ Xyw+ yw+ X Y 0,75%

Teoretic, gameii indivizilor de F1 trebuiau s fie doar de dou tipuri: la femele Xyw i Xy+w+, iar la masculi Xyw i Y. Dar rezultatele ncrucirii indivizilor din F1, dnd un cu totul alt raport de segregare n F2 i, mai ales, dnd o categorie de indivizi cu recombinri de caractere, s-a ajuns la concluzia c a avut loc crossing-overul ntre cromosomii omologi i apariia a dou noi tipuri de gamei n cazul femelelor: Xy+w i Xyw+. Prezena acestor gamei explic apariia indivizilor cu fenotipuri recombinate, n F2. Acetia sunt att masculi, ct i femele, cu corp gri i ochi albi sau cu ochi roii i corp galben. Deci, ntre genele y+ i w+ i alelele lor, situate pe cromosomii X omologi, au avut loc schimburi, rezultnd noi grupe de linkage. Adic, din y+w+ i yw, au rezultat y+w i yw+, alturi de tipurile parentale care s-au meninut.

4.5.2. Crossing-over ntre autosomi


Un alt experiment, efectuat de Morgan i colaboratorii si, a demonstrat existena crossingoverului i ntre autosomi. ncrucind o femel de Drosophila melanogaster cu corpul negru (b - de la black) i aripi normale (vg+) cu un mascul cu corpul gri (b+) i aripi vestigiale (vg), n F1 s-au obinut indivizi heterozigoi b+bvg+vg, cu fenotipul normal. ncrucindu-se indivizii din F1 cu indivizi dublu mutani (ncruciare de analiz genetic), sa constatat c n FT, fenotipul indivizilor difer n funcie de sexul lor. Astfel, dac se efectueaz o retroncruciare ntre un mascul din F 1, heterozigot (b+bvg+vg) cu o femel mutant (bbvgvg), n FT se obine segregarea de 1:1, ca n experimentele pentru demonstrarea fenomenului linkage (adic reapar indivizii cu fenotip parental - corp negru i aripi normale i corp gri cu aripi vestigiale). Deci, linkage-ul este total.
P G F1 G FT Sf Sg b vg+ + b vg b vg
+ +

x x x x

b+ vg + b vg b vg b vg b vg b vg b+ vg b vg 1 1(b+bvgvg)
+

b vg b+ vg b vg b vg

b vg+, b+ vg
+

1 1(bbvg+vg)

Precizam anterior c, n acest caz, este vorba de autosomi - mai concret, de perechea a IIa de omologi. Atunci, cum se explic diferena de comportament dintre masculi i femele? S-a ajuns la concluzia c, n cazul masculilor de Drosophila melanogaster, cromosomii din perechea a II-a nu prezint fenomenul de crossing-over. Lipsa crossing-overului este valabil i pentru cromosomii sexului (la mascul), n sensul c ntre cromosomii X i Y nu se cunoate existena acestui fenomen. n ncruciarea reciproc (retroncruciare) dintre o femel hibrid de F 1 (b+bvg+vg) i un mascul dublu mutant (bbvgvg), n FT, pe lng tipurile parentale (corp negru i aripi normale; corp gri i aripi vestigiale), mai apar nc dou clase fenotipice (care, n mod normal, nu trebuiau s apar: corp gri i aripi normale; corp negru i aripi vestigiale). ntr-o populaie suficient de mare, proporia indivizilor este de 41,5% pentru fiecare dintre tipurile parentale i cte 8,5% pentru fiecare dintre tipurile recombinante. Deci, linkage-ul genelor b+ i vg+ se deregleaz i respectivele gene "segreg", datorit schimbului reciproc de material cromatic ntre cromosomii omologi. Rezult c femelele din F1 pot forma patru tipuri de gamei - dou normale i dou recombinate, primii fiind numii gamei crossing-overi, ceilali fiind gamei necrossing-overi.
P G F1 GF1 FT segregare b vg+ b vg+ b vg+ b vg+ b+ vg b vg , b vg + + i b vg , b vg b vg b vg 41,5%
+ + + +

x x x x b vg b vg 41,5% b vg b vg 8,5%
+ +

b+ b+ b+ b b

vg vg vg vg vg

b vg b vg b vg 8,5%

83,0 % indivizi necrossing-overi

17,0% indivizi crossing-overi

4.6. Crossing-over la plante 4.6.1. Crossing-over simplu la plante


n cel de-al doilea deceniu al secolului nostru, C. Hutchinson, lucrnd pe porumb, a pus n eviden prezena crossing-overului i n lumea plantelor. C. Hutchinson a utilizat dou linii homozigote de Zea mays - una cu boabe coninnd aleuron colorat i endosperm neted (c+c+sh+sh+), iar cealalt cu aleuron incolor i endosperm zbrcit (ccshsh). Hibridarea ntre cele dou linii a permis obinerea, n F 1, heterozigoilor c+csh+sh, cu expresie fenotipic normal. Prin retroncruciarea unui astfel de hibrid, din F 1, cu un printe dublu mutant, n FT nu s-a obinut o segregare de 1:1, cum ar fi fost normal n linkage, ci sau obinut patru clase fenotipice - dou asemntoare cu prinii (adic fr crossing-over) i dou recombinante (cu crossing-over), care nu erau ateptate n mod normal.
P G F1 c sh + + c sh c sh c+ sh+ c sh + + c sh , c sh, gamei necrossingover c+ sh, c sh+ gamei crossing-over c+ sh+ c sh 48,2%
+ + + +

x x x

c sh c sh c sh c sh c sh

c sh

FT

c sh c sh 48,2%

c+ sh c sh 1,8%

c sh+ c sh 1,8%

Indivizi necrossing-overi

Indivizi crossing-overi

n acest caz ne aflm n faa unui proces de crossing-over simplu, deoarece ntre cromosomii omologi a avut loc un singur schimb, ntre o singur pereche de gene (gena slbatic i alela sa mutant).

4.6.2. Crossing-over dublu la plante


Dac n crossing-overul simplu a avut loc o singur ruptur cromatidic, s-au constatat i cazuri n care se produc recombinri ntre mai multe gene i alelele lor - schimburile fiind duble, triple sau multiple. M.M. Rhoades a descoperit un crossing-over dublu, tot la Zea mays. ncrucind plante cu fenotip normal verde (v+), avnd nervura central a frunzei de culoare verde (bw+), boabele cu gruncioare de aleuron incolor (pr+) i plante mutante pentru cele trei caractere, adic avnd fenotipul verde deschis (v, de la virescent), nervura central de culoare brun (bw, de la brown) i aleurona purpurie (pr), n F1 a obinut plante heterozigote cu fenotipul normal. Precizm c cele trei gene sunt localizate pe cromosomii din perechea a V-a. Hibrizii din F1, retroncruciai cu indivizi triplu mutani, nu s-au comportat n FT conform legilor mendeliene ale segregrii, adic nu au dat 50% indivizi cu fenotip normal i 50% cu fenotip recesiv (mutant). Rezultatul a fost neateptat, obinndu-se opt tipuri de indivizi: dou tipuri parentale i ase tipuri recombinate.
P G bw+pr+v+ bw+pr+v+ bw pr v
+ + +

x x

bw pr v bw pr v bw pr v

F1

bw pr v bw pr v

+ +

bw pr v bw pr v

bw+pr+v+, bw pr v; G bwpr+v+, bw+prv; bw+pr+v, bwprv+;


+ + +

bwprv

bw pr v bw prv FT

bw prv ; bwpr v + + + bw prv bwpr v bw prv bw prv bw pr v bw prv 21,05% 7,25% 7,25%

bw pr v bw pr v 17,85%

bwprv bw prv

bw prv bw prv 3,85%

bwpr v bw prv 3,85%

21,05%

17,85%

42,10%

14,50%

35,70%

7,70%

Facem precizarea c procentele sunt ntructva ajustate, pentru a rezulta 100%, cele obinute n mod concret de Rhoades fiind 42,11%; 14,52%; 35,62% i 7,75%, reprezentnd cte 467, 161, 395 i 86 de plante din totalul celor ce au supravieuit n experiment. Ca o concluzie general, menionm c la fiecare specie, numrul grupelor de linkage este identic cu numrul cromosomilor unui set haploid (genom). Se ridic o singur problem doar aceea a autopoliploizilor. In mod normal, ntr-un autopoliploid, numrul grupelor de linkage autentic, diferite ntre ele, ar trebui s fie acelai cu numrul existent n diploidul de origine. In aceeai idee, precizm c la aneuploizii hipoploizi (la nulisomici) grupele de linkage sunt subnumerare. In conformitate cu teoria linkage-ului, atunci cnd dou gene segreg mpreun, nseamn c fac parte din aceeasi grup de linkage, iar cnd segreg independent (dup modelul mendelian) nseamn c fac parte din grupe diferite de linkage - adic sunt plasate pe cromosomi diferii. La Drosophilla melanogaster a fost posibil i localizarea concret a fiecrei gene ntr-un anumit cromosom. Evident, au fost necesare nenumrate experimente de hibridare, n care se luau, succesiv, tot alte perechi de caractere (gene) i se nota cu meticulozitate comportamentul lor (dac segregau independent sau nu). Recurgnd la o simbolistic general i unificatoare n acelai timp, n care notm genele cu litere latine i, presupunnd c vom avea un grup de linkage din cinci gene, dinamica genotipurilor i fenotipurilor n descendena hibridrii va arta astfel:
P G F1 G F2 Sg Sf ABCDE ABCDE ABCDE ABCDE abcde ABCDE, abcde ABCDE ABCDE ABCDE abcde 1 3 x x x x abcde abcde abcde ABCDE abcde ABCDE, abcde ABCDE abcde abcde abcde 1 1

Genele care fac parte din aceeai grup de linkage, sunt gene linkate. Cromosomii, reprezentnd substratul (suportul) material al genelor, rezult c n meioz asortarea ntmpltoare a cromosomilor n gamei este, n fapt, asortarea ntmpltoare a grupelor de linkage. Altfel spus, o gen i chiar o grup de linkage au comportamente identice cu ale cromosomilor. n cazul sex-linkage-ului, are importan sexul indivizilor pe care-i folosim n ncruciare. Evident, cnd genele sunt localizate pe autosomi, sexul indivizilor utilizai pentru ncruciare nu ar trebui s aib importan. Dar, aa cum precizam mai sus, la Drosophila melanogaster, ntre autosomii masculului nu are loc fenomenul de crossing-over. Prin urmare, cnd se ateapt o constan a rezultatelor, este bine s se in cont de acest lucru. Se cunosc i cazuri de nlnuire fals, supranumit i nlnuire intercro-mosomial. Aceasta apare datorit dereglrii ce intervine n procesul combinrii libere a cromosomilor neomologi n meioz. Fenomenul se ntlnete la ncruciarea ntre linii de oareci de laborator,

ntre tulpini de Saccharomyces etc. Fenomenul este explicat prin tendina cromosomilor neomologi de a se asorta nentmpltor n procesul diviziunii meiotice. Transmiterea linkat a genelor cantonate pe cromosomi neomologi se constat, de asemenea, n cazul hibridrilor interspecifice, mai ales atunci cnd combinaiile cromosomilor parentali sunt favorizate fiziologic (sunt fiziologic compatibile). Uneori este posibil ca toi cromosomii unui genom (set haploid) s migreze ctre un pol. Apreciem c aceste fapte, de observaie i experiment, se constituie n argumente pentru susinerea ipotezei organizrii supracromosomiale (pe care am prezentat-o la capitolul dedicat studiului cromosomilor).

4.7. Mecanismele crossing-overului


Pentru explicarea modalitilor concrete prin care se realizeaz crossing-overul s-au emis mai multe ipoteze, care pot fi grupate n dou mari categorii, i anume: I. Cele ce consider c fenomenul se datoreaz ruperii cromatidelor i schimbului reciproc de segmente (breakage theory) (Fig.14). II. Cele ce consider drept cauz a fenomenului replicaia selectiv a cromatidelor n timpul dublrii materialului cromosomial (copy-choise theory) (Fig.15). Schematic, situaia se red astfel:

I
Fig. 14 Schimb reciproc de segmente prin ruperea cromatidelor

II
Fig. 15 Schimb reciproc de segmente cromatidice prin copiere selectiv

Din cadrul primului grup de ipoteze, cea mai cunoscut este teoria chiasmatipiei (Fig.16). Ea a fost elaborat de ctre F.A. Jannsen (1909, 1924), reluat apoi i dezvoltat de C.D. Darlington i K. Mathei (1932), fiind ulterior verificat de ctre J.H. Taylor (1957, 1958, 1963) prin metoda izotopilor radioactivi. Conform acestei ipoteze, n profaza meiozei, ntre leptoten i pachiten, ntre cromosomii omologi (unul de provenien patern i cellalt, de provenien matern) se produc sinapse. ntre pachiten i diploten, fiecare cromosom apare format din dou cromatide. ntre cromatidele unei perechi de omologi se menin puncte de contact, numite chiasme. n ipoteza chiasmatipiei, anterior diplotenului, se produce un schimb de segmente cromatidice (egale) - fenomen cunoscut sub numele de chiasmata. Prin urmare, doi gamei rmn nerecombinai, iar ceilali doi vor avea cromosomii recombinai. O chiasm nu poate afecta dect dou dintre cele patru cromatide ale unei perechi de omologi. n principiu, deci, crossing-overul ntre doi cromosomi omologi nu poate depi 50%. Fr ndoial, mai ales ntre cromosomii lungi, se pot forma mai multe chiasme, explicndu-se astfel, crossing-overul dublu, triplu, multiplu. n explicaia crossing-overului, pe baza acestor ipoteze, intervin i unele precizri. Una dintre ele privete repartiia chiasmelor. Astfel, prima chiasm apare la o anumit distan de centromer, denumit distan diferenial, care este mai mic la cromosomii mai scuri. Distanele dintre chiasme, pe aceeai cromatid, se numesc distane de interferen i reprezint caracter de specie.

Fig. 16 Formarea chiasmelor i producerea gameilor recombinai (50%) i de tip parental (50%)

Pentru a explica mecanismul ruperii i schimbului de material cromatidic, C.D. Darlington a propus o ipotez conform creia ruperea cromatidelor se datorete rsucirii foarte strnse a cromosomilor, unul n jurul celuilalt, n zigoten. Prin aceasta, s-ar crea o tensiune mare asupra cromatidelor externe. Ca urmare, acestea se rup, se deruleaz parial i, apoi, se resudeaz, fie n cadrul aceleiai cromatide, fie n cromatidele surori. Evident, n primul caz nu se poate vorbi de crossing-over, n cele de-al doilea, da. De aceea se apreciaz c probabilitatea maxim de a se manifesta crossing-overul este de 50%. Teoria copierii selective (replicaiei selective) consider c fenomenul de crossing-over se realizeaz n stadiul S din interfaza ciclului celular. Plecnd de la faptul c sinteza ADN i, deci, a materialului cromosomial n ansamblu, se realizeaz dup modelul semiconservativ, s-a presupus c replicaia cromosomului nu are loc dup propria matri, ci dup cea a cromosomului pereche i vice-versa. n consecin, cromatidele nou formate ar copia o parte a materialului genetic de pe un cromosom i o parte de pe cellalt cromosom. Aa ar rezulta recombinrile cromatidiene. Verificarea experimental a acestor ipoteze s-a efectuat prin marcarea unor bacteriofagi cu 15 N. S-au infectat bacterii cu un astfel de virus, dup care s-au cultivat pe un mediu cu 14N. Ipoteza copierii selective s-a dovedit neviabil.

4.8. Chiasmata i crossing-overul


Dovezile citologice ale crossing-overului pot fi obinute pe parcursul profazei trzii a primei diviziuni meiotice, cnd chiasmata devine vizibil. Este timpul n care cromosomii omologi menin contacte strnse, att n zona centromerului ct i la chiasme. Este situaia n care se pot numra, foarte exact, toate chiasmele. Cromosomii lungi, aa cum am precizat cu alt ocazie, au mai multe chiasme dect cei scuri. Altfel spus, cromosomii lungi au mai multe posibiliti de crossing-over dect cei scuri. Apariia chiasmelor n profaza primei diviziuni meiotice poate induce concluzia c atunci se produce crossing-overul. Sunt, ns, numeroase experimente care demonstreaz c fenomenul crossing-over apare mult mai devreme. n unele dintre aceste experimente s-au utilizat ocuri de temperatur i s-a constatat o modificare a frecvenei recombinrilor. Cnd ocurile de temperatur erau administrate n profaza trzie, efectele erau mai mici dect atunci cnd au fost administrate mai devreme. De aceea s-a concluzionat c fenomenul crossing-over apare n profaza timpurie. Dovezi suplimentare pentru aceast concluzie au fost furnizate de studiile la nivel molecular, studii efectuate n timpul autoreplicrii semiconservative a ADN-ului. Dei aproape toat cantitatea de ADN se sintetizeaz n timpul etapei S din interfaz, se apreciaz c o mic parte din ADN se sintetizeaz n timpul primei profaze meiotice. Acest proces ntrziat de sintez a fost interpretat ca avnd rolul de a repara rupturile ce apar n cromatide, n timpul crossing-over-ului. Analize de mare finee au stabilit c acest proces de sintez apare anterior trecerii n cea de a doua jumtate a profazei i nu mai trzziu. Prin urmare, crossing-over-ul apare, la rndul su, tot n prima jumtate a profazei, cu mult nainte de a fi vizibil chiasmata. Ce este, atunci, chiasmata i ce nseamn ea? Unii specialiti consider c chiasmata reprezint un vestigiu al procesului de schimb ntre cromosomii omologi. Cromatidele ntre care s-a produs schimbul de material cromatic rmn, probabil, ataate una de alta n timpul profazei.

Ulteerior punctele de contact ntre cromatide se desfac i cromatidele se ndeprteaz ndreptndu-se, fiecare, pe fibrele fusului acromatic, spre cte unul dintre polii celulei. De aceea, probabil, fiecare chiasm reprezint un punct de sudur aprut printr-un crossing-over ce s-a derulat, probabil, n pachiten.

4.8. Crossing-over intragenic


Cunoscndu-se mecanismul crossing-overului i frecvena sa, mult vreme s-a considerat c el este mult mai uor de explicat pentru genele ce se afl plasate n loci ndeprtai. n cazul genelor apropiate, frecvena sa este mai mic i posibilitile de decelare scad. n experienele cu D. melanogaster de pild, nu se poate lucra cu mai mult de 50.000 indivizi deodat. ntr-un asemenea lot experimental ns, uneori, este imposibil de decelat un crossing-over. Pe de alt parte la bacterii i la virusuri se poate lucra simultan pe milioane de indivizi. Astfel, s-a constatat c fenomenul crossing-over poate aprea i n interiorul genei. INTREBARI DE VERIFICARE 1. Care au fost avantajele folosirii Drosophilei melanogaster in cercetarile de genetica 2. Ce reprezinta linkage-ul 3. Ce reprezinta si cand are loc crossing-overul 4. Intocmiti schemele hibridarilor care sa ilustreze fenomenele de linkage si crossing-over 5. Care sunt mecanismele moleculare care conduc la aparitia crossing-overului TEME PENTRU EXAMINAREA FINALA 1. Definirea si explicarea fenomenului de linkage. 2. Intelegerea si aprofundarea aspectelor citologice si moleculare in cadrul fenomenului de crossing-over

Unitatea de invatare 5 5. Mutatiile


5.1. Definire, clasificaie, generaliti
Noiunea de mutaie a fost introdus n tiin de ctre Hugo de Vries (unul dintre descoperitorii legitilor elaborate de Mendel) n anul 1901. Mutaia (de la latinescul mutatio = schimbare, modificare) reprezint o modificare a coninutului informaiei ereditare a unui individ, prin alterri produse la nivel molecular, cromosomial, genomic sau celular, sub impactul unor factori de natur fizic, chimic i biologic sau, pur i simplu, prin hazard. Mutaiile, alturi de recombinrile intra- i intercromosomiale, constituie principala surs de asigurare a variabilitii individuale - cmpul de aciune al seleciei naturale. Dar, n funcie de transmiterea sau nontransmiterea lor n descenden, variaiile produse n coninutul informaiei individuale, mai corect spus, variaiile fenotipizate de individul purttor, sunt de dou categorii: - modificaii; - mutaii propriu-zise. Spre a nelege ce reprezint fiecare dintre ele, reamintim schema general a circulaiei informaiei (inclusiv a informaiei ereditare) n i ntre sisteme:

Canal Surs Perturbaii Destinaie

Figura 6.1 Schema general a circulaiei unui flux informaional

n principiu, modificrile produse n coninutul informaiei se pot datora interveniei perturbaiilor direct n surs, pe canal sau la destinaie. n ceea ce privete circulaia informaiei ereditare n sistemele biologice, se impun unele precizri. Sursa informaiei ereditare este asimilat, n cea mai mare parte a cazurilor, cu ADN-ul. ARN-ul mesager nu reprezint altceva dect canalul pe care circul informaia ereditar, ulterior transcrierii sale din molecula ADN. Biomolecula sintetizat n final (prin procesul translaiei mesajului coninut n ARNm, n ordinea i numrul aminoacizilor din respectiva biomolecul), reprezint destinaia circulaiei informaiei. Conform cu dogma central a geneticii, sensul circulaiei informaiei este univoc: ADN ARN Protein (precizrile i coreciile necesare le vom aduce la capitolul de genetic molecular). Cu alte cuvinte, o perturbaie poate aciona, n cazul de fa, n ADN (echivalat cu sursa), n ARN (echivalat cu canalul) sau n protein (destinaie). Evident, modificrile produse n ARN sau protein, dei manifeste fenotipic, nu se transmit ereditar (dispar odat cu individul purttor). Acestea sunt modificaiile. Mutaiile propriu-zise vizeaz exclusiv macromolecula de ADN i, n msura n care permit supravieuirea individului purttor, se menin definitiv n zestrea ereditar a populaiei din care face parte acesta i se transmit ca atare n succesiunea de generaii. Ca orice alt fenomen sau proces biologic i mutaiile sunt clasificate n funcie de diverse criterii sau interese. Fr a intra n detalii (care pot fi gsite n orice tratat de genetic), reamintim cteva dintre clasificaii: a. Mutaii: - naturale; - artificiale. b. Mutaii produse de factori: - fizici; - chimici; - biologici. Apreciem c cea mai adecvat clasificare, din punctul de vedere al biologului, este cea n care se ine cont de mrimea substratului ereditar afectat, de cantitatea informaiei afectat n surs. n conformitate cu acest criteriu putem vorbi despre mutaii: - genice; - cromosomiale; - genomice. Calcule efectuate de H.J. Muller au precizat c rata mutaiilor (per locus) este de aproximativ 1/100.000. S-au constatat corelaii destul de evidente ntre rata mutaiilor i gradul de evoluie (poziia n arborele filogenetic) a speciilor. La om, de exemplu, mutaia care provoac retinoblastomul are o rat de 0,000023. Alte calcule estimeaz c rata mutaiilor, per gen, la om este de 4/100.000. Dac notm cu U rata mutaiei per genom, cu u rata mutaiei per gen i cu N numrul total de gene, atunci N=U/u. La drosofila, de pild, s-a ajuns la estimarea existenei a 5.000 gene (N = 0,05/0,00001 = 5.000). Estimri mult mai recente ridic la 10-15.000 numrul genelor la Drosophila melanogaster.

5.2. Mecanismele producerii mutaiilor


5.2.1. Mecanismele mutaiilor genice a) Deleia reprezint pierderea uneia sau mai multor perechi de nucleotide. b) Adiia (adugarea sau inseria) uneia sau mai multor perechi de nucleotide.

c) Substituia uneia sau mai multor perechi de nucleotide. d) Inversia unui fragment de ADN cuprinznd cel puin dou perechi de nucleotide. Pentru exemplificarea celor patru mecanisme menionate, imaginm o situaie ipotetic n care redm o succesiune aleatorie de perechi de nucleotide (din catena unei macromolecule de ADN), perechi pe care le numerotm cu cifre arabe. n funcie de tipul mutaiei (n funcie de mecanismul prin care se produce mutaia), vom dubla, vom anula sau vom nlocui cifrele respective.
numrul nucleotidelor 1 nucleotidele unei catene A puni de hidrogen II nucleotidele complementare Caten (secven) normal numrul nucleotidelor 1 nucleotidele unei catene A puni de hidrogen II nucleotidele complementare 3 4 C G III III T G 5 T II C 6 A II A 7 G III T 8 T II C 9 C III A 10 G III G C 2 G III T 3 C III C 4 G III G 5 6 7 8 TA G T II II III II C AT C 9 C III A 10 G III G C

Deleia perechii a II-a de nucleotide numrul nucleotidelor 1 nucleotidele unei catene A puni de hidrogen II nucleotidele complementare 2 2 C G III III T G 3 C III C 4 G III G 5 T II C 6 A II A 7 8 9 10 G T C G III II III III T C A G C

Adiia unei perechi (2) de nucleotide numrul nucleotidelor 1 nucleotidele unei catene A puni de hidrogen II nucleotidele complementare 2 3 C C III III T G 4 G III G 5 T II C 6 A II A 7 G III T 8 T II C 9 C III A 10 G III G C

Substituia perechii a 2-a de nucleotide numrul nucleotidelor 1 nucleotidele unei catene A puni de hidrogen II nucleotidele complementare Inversia secvenei 4 5 6 2 3 G C III III T C 6 A II G 5 T II T 4 G III A 7 G III C 8 9 10 T C G II III III C A G C

Deci, se schimb fie numrul, fie ordinea perechilor de nucleotide. n consecin se schimb numrul i tipul (sau ordinea) codonilor, ceea ce nseamn, n fapt, o schimbare a coninutului informaiei ereditare. Transcripia se efectuiaz dup o informaie modificat, translaia avnd ca rezultat sinteza unei biomolecule schimbate (alt numr i alt succesiune a aminoacizilor). e) Mutaiile moleculare (genice) mai pot avea drept cauz i unele erori n procesul de autoreplicare semiconservativ a moleculei de ADN. Respectivele erori se pot datora fenomenelor: e.1. Tranziie - nlocuirea unei baze purinice sau pirimidinice cu o alt baz, tot purinic sau pirimidinic.
A G i T C

e.2. Transversie - nlocuirea unei baze purinice cu una pirimidinic i invers.


A G T i A T i G C C

Schematic, transversiile i tranziiile se pot reda astfel:

Tranziie A Transversie T Tranziie A T G C T G G T II II III III II III III II T A C G A C C A A C G T T G G T II III III II II III III II T G C A A C C A A TG C A C T G II II III III II III II III T AC G T G A C C G Purinice Transversie Pirimidinice

catena iniial de ADN

tranziie

transversie

Judecate prin prisma schimbrilor ce le produc n final (la sfritul procesului de translaie), mutaiile genice pot fi considerate: Nonsens, acele care duc la degenerarea codului genetic i nu se reflect n schimbarea succesiunii aminoacizilor n molecula proteic. Spre exemplu, codonii UAU i UAC codific acelai aminoacid - tirozina. Pe de alt parte, mutaiile survenite n codonii stop (terminatori ai sintezei unei catene proteice) - UAA, UAG i UGA, nu au nici o semnificaie. Mutaii cu sens greit, care transform un codon funcional (din cei 61) ntr-un codon terminator. n acest caz, molecula polipeptidic sintetizat va fi mai scurt. 5.2.2. Mecanismele mutaiilor structural cromosomiale Mutaiile cromosomiale sunt, n fapt, de dou mari categorii - structurale i numerice. Mutaiile structural cromosomiale presupun alterri ale materialului cromosomial, determinate de rupturi i pierderi sau realipiri (n alt ordine i n alte poziii) de segmente cu lungimi variabile. n funcie de localizarea restructurrii, mutaia structural cromosomial poate fi: - intracromosomial; - intercromosomial. Cele intracromosomiale pot fi, la rndul lor, intraradiale i interradiale (adic n cadrul aceluiai bra sau ntre cele dou brae ale cromosomului. Indiferent dac afecteaz un singur bra sau ambele brae cromosomiale, mutaiile intracromosomiale sunt: deleii, duplicaii, inversii, translocaii. Deleiile reprezint o pierdere de material cromosomial. n funcie de zona cromosomial pe care o afecteaz, ele sunt: terminale i intercalare, acestea din urm fiind paracentrice i pericentrice. Deleiile terminale afecteaz captul cromosomului i presupun producerea unei singure rupturi. ntruct producerea unei deleii terminale presupune pierderea regiunii telomerice, repercusiunile ei sunt destul de grave. Deleia terminal determin scurtarea cromosomului i formarea unui segment acentric, care, de obicei, se pierde:
ABCDEFGHI AB CDEFGHI

segment acentric Deleiile intercalare paracentrice presupun producerea a dou rupturi, urmate de eliminarea unui segment cromosomial acentric (din braul scurt sau lung) i scurtarea cromosomului:
ABCDEFGHI GH ABC D E F I

Deleiile intercalare pericentrice sunt datorate formrii unui segment cromosomial centric prin producerea a dou rupturi n imediata vecintate a centromerului i a dou (sau unul, n cazul reunirii lor) fragmente acentrice.

ABCDEFGHI

ABC

DE

FGHI

Deci, ca rezultat direct al producerii deleiilor, putem avea: - fragmente acentrice; - inele acentrice; - cromosomi inelari; - discontinuiti cromatice pe lungimea cromosomului; - isocromosomi; - micronuclee. Duplicaiile reprezint adugarea (dublarea) uneia sau mai multor gene, la cele existente deja n locusul (locii) respectiv. n funcie de modul concret n care are loc dublarea, duplicaiile pot fi: n tandem direct sau n tandem invers. i unele i celelalte, n funcie de zona cromosomial n care se produc, sunt: terminale i intercalare, acestea din urm fiind: paracentrice i pericentrice. Duplicaiile n tandem direct pot fi reprezentate schematic astfel:
ABCDEFGHI ABABCDEFGHI ABCBCDEFGHI ABCDDEEFGHI ABCDEFGHI ABBACDEFGHI ABCCBDEFGHI ABCEEDDFGHI cromosomul iniial terminal intercalar paracentric intercalar pericentric cromosomul iniial terminal intercalar paracentric intercalar pericentric

Duplicaiile n tandem invers pot fi redate schematic astfel

De obicei, frecvena duplicaiilor este mai mare dect cea a deleiilor i pentru motivul c duplicaiile nu au efecte nocive. Inversiile se datoresc ruperii unui fragment cromosomial, paracentric sau pericentric, rotirii sale cu 180o n planul longitudinal i resudrii capetelor n noua poziie. Evident, avnd n vedere existena telomerului la fiecare capt cromosomial, inversiile terminale sunt imposibile. Pe de alt parte, dac inversiile paracentrice nu produc modificri n morfologia (adic n tipul) cromosomului, inversiile pericentrice pot determina schimbri consistente n lungimea braelor, dac cele dou poriuni, rupte de o parte i de alta a centromerului, nu sunt egale. De aceea, inversiile pericentrice pot fi egale sau inegale. Schematic, situaiile menionate pot fi redate astfel:
ABCDEFGHI ACBDEFGHI ABCEDFGHI A E DCB F G H I cromosomul iniial paracentric pericentric egal pericentric inegal

Translocatiile reprezint fenomenul prin care o poriune (un fragment), dintr-un cromosom se rupe i se realipete, fie n acelai cromosom (n acelai bra sau n braul cellalt), fie n cromosomul omolog, fie ntr-un cromosom neomolog. Translocaiile (cunoscute i sub numele de transpoziii) pot fi, deci i intracromosomiale (intraradiale i interradiale) i intercromosomiale. Evident i la translocaii se pun aceleai probleme vis vis de captul cromosomului - prezena telomerilor mpiedic producerea de translocaii terminale. Translocaiile intracromosomiale pot fi schematizate dup cum urmeaz:
ABCDEFGHI ABCDEG HFI ABFCDEG HI cromosom iniial intraradial interradial

n ceea ce privete translocaiile intercromosomiale se cuvin menionate cteva aspecte deosebite implicate de producerea lor. Aa cum aminteam anterior, ele pot viza cromosomii omologi sau neomologi. Evident, dac modalitile concrete de producere (rupere i apoi alipire) sunt identice, rezultatele lor sunt diferite. n cazul n care cei doi cromosomi omologi sunt izogenici (adic nu se afl n raport de alelism), translocaia presupune o duplicaie (dac vizeaz izolocii de pe cei doi cromosomi):
ABCDEFGHI ABCDEFGHI ABCDEFGHI abcdefghi ADEFGHI ABCBCDEFGHI ADEFGHI aBCbcdefghi

Dac cei doi cromosomi sunt n raport de alelism, situaia se prezint astfel:

Dac translocaia va viza schimbul ntre cele dou brae neomoloage ale cromosomilor omologi, evident c nu vom mai avea duplicaie. n esen (ca mecanism vorbind), fenomenul este similar cu cel al translocaiei ntre doi cromosomi neomologi, cnd vom avea:
ABCDEFGHI M NO PRSTUV ADEFG HI M NBCO PRSTUV

n cazul translocaiilor intercromosomiale, dac poriunile translocate vor fi intercalare (acetrice), unul dintre cromosomi se scurteaz (donatorul) i cellalt se alungete (primitorul). n situaia n care poriunea translocat este pericentric (adic segmentul translocat conine i centromerul), rezultatul va fi apariia unui cromosom dicentric i a unor fragmente acentrice care se vor resorbi.
ABCDEFGHI M NO PRSTUV ABC EGHI MNDEO PRSTUV

Procesul se complic i mai mult n cazul n care schimburile de segmente cromosomiale sunt bidirecionale (reciproce). De aceast dat, putem vorbi i despre translocaii terminale. Evident, translocaiile reciproce, fie c sunt terminale sau intercalare (paracentrice sau pericentrice), pot fi simetrice sau asimetrice (adic vizeaz un schimb de segmente egale sau inegale):
ABCDEFGHI M NO PRSTUV ABCDEFGHI M NO PRSTUV ABCDEFGHI M NO PRSTUV ABCDEFGUV M NO PRSTHI ABCDESTI M NO PRFGHUV ABCPRFGHI M NO DESTUV

Rezumnd, putem conchide c translocaiile sunt: A. Intracromosomiale: - intraradiale; - interradiale. B. Intercromosomiale: - ntre cromosomii omologi: - ntre braele omoloage (duplicaii); - ntre brae neomoloage. - ntre cromosomi neomologi: - extraradiale directe (unidirecionale): - paracentrice; - pericentrice. - extraradiale reciproce (bidirecionale): - terminale simetrice sau asimetrice; - intercalare paracentrice simetrice sau asimetrice; - intercalare pericentrice simetrice sau asimetrice. Fenomenul de fuzionare a cromosomilor telocentrici presupune existena a cel puin doi cromosomi telocentrici. Acetia pot fuziona (prin fuzionarea centromerilor) dnd, astfel, natere unui cromosom cu centromer median (metacentric sau submetacentric, n funcie de lungimea celor doi cromosomi). 5.2.3. Mecanismele mutaiilor genomice Mutaiile genomice presupun o modificare a numrului seturilor cromosomiale fundamentale (de baz), notate n mod convenional cu x. Reamintim ceea ce am descris i elucidat pe deplin n capitolul dedicat structurii i funciilor cromosomilor i anume: x = n numai n cazul speciilor diploide i, mai mult dect att, ntr-un anumit gen, unde avem mai multe numere cromosomiale de baz (adic mai multe valori pentru x), unul a provenit din altul, concomitent cu diversificarea speciilor. Deci, nu ntotdeauna exist echivalen ntre genom (notat cu n) i numrul fundamental de cromosomi (x). Altfel spus, ntre evoluia pe orizontal (diversificarea specific) i variabilitatea numrului fundamental de cromosomi din cadrul unui gen, se pot stabili interrelaii precise.

Muli autori plaseaz aneuploidia n cadrul mutaiilor genomice. Din punctul nostru de vedere, aneuploidia reprezint o mutaie cromosomial i anume, o mutaie numeric cromosomial, ntruct ea afecteaz unul sau doi cromosomi (rareori trei sau patru, aa cum vom preciza la momentul potrivit) dintr-un genom i nu multiplicarea numrului genomurilor sau a numrului fundamental de cromosomi. n consecin, mutaiile genomice includ: haplodia, poliploidiile i pseudopoliploidiile. Haploidia starea fireasc n care se gsete un individ eucariot este starea diploid. Aceast stare se reconstituie n urma fiecrui act de fecundare, act n urma cruia, din fuziunea a doi gamei de sex opus, ia natere un zigot ce ntrunete suma cromosomilor existeni n fiecare din cei doi gamei. Tot prin definiie, gameii sunt haploizi, adic au jumtate din numrul de cromosomi caracteristic prinilor. Deci, n + n = 2n sau . Rezult, cu claritate, c dac (din anumite motive), un viitor individ se va dezvolta avnd ca surs un singur gamet (androgenez sau ginogenez, pseudogamie, embrionie adventiv etc.), n celulele sale se vor gsi n cromosomi i nu 2n. Fenomenul poart numele de haploidie. Prin fuziunea unui gamet cu unul rezult un zigot (punctul de start al noului organism) care poate fi homozigot dominant, recesiv sau heterozigot (AA, aa sau Aa). Fenomenul este imposibil la haploizi, ntruct acetia au un singur set din cromosomii omologi (un singur genom), deci au toate genele ntr-o singur doz (A sau a). Prin urmare, fiind exclus fenomenul de alelism, implicit dominana i recesivitatea, un haploid fenotipizeaz totalitatea genelor pe care le conine. Evident, lipsind dominana i recesivitatea, alelele profund duntoare, mai ales alelele letale, induc moartea indivizilor haploizi. De aceea, la acest nivel, selecia este mult mai dur i mult mai eficient. n acest context, se cuvin menionate i unele avantaje, din punctul de vedere al practicii, oferite de haploidie. Prin dublarea setului haploid de cromosomi (diploidizarea unui haploid) se obin indivizi izogenici (izocromosomici), sau aa zisele linii pure (genetic pure), a cror producere necesit multe eforturi i mult timp pe cile convenionale. Fiind parial sterili, haploizii au o mic inciden n mod natural. Se ntlnesc, pe anumite perioade i n anumite condiii, la grupe de insecte (albine, viespi, afide), reprezint o stare quasinormal la ciupercile cu spori, algele unicelulare, briofite i sunt starea normal a procariotelor. Pe de alt parte, diploidia poate reprezenta o stare normal a unui individ sau poate fi rezultanta unei autopoliplodizri sau alopoliploidizri. Evident, haploizii provenii din cele trei categorii de "diploizi" nu vor avea comportamente similare. De aici i posibilitatea clasificrii haploizilor n: a. monoploizi; b. polihaploizi. a. Monoploizii provin prin dezvoltarea autonom a unei celule sexuale (androgenez sau ginogenez) de la indivizi aflai ntr-o stare de diploidie adevrat. n cazul plantelor, un monoploid se poate obine i n urma dezvoltrii unei alte celule dect cea gametic, dar aparinnd tot fazei haploide (gametofitului), cum ar fi antipodele i sinergidele. Printre modalitile practice de obinere a haploizilor (indiferent de sorgintea i tipul lor) putem meniona: ndeprtarea staminelor (la florile hermafrodite) anterior maturizrii lor, polenizarea cu polen distrus prin iradiere, polenizarea cu polen strin etc. La animale, pentru inducerea partenogenezei ovulelor nefecundate, se utilizeaz spermatozoizi iradiai, tratamente cu ocuri termice, soluii hipotonice i hipertonice etc. b. Polihaploizii provin. prin mecanisme identice celor ce determin apariia monohaploizilor, din poliploizi. Poliploidia, evideniat pentru prima dat de ctre G. Winkler (1916), reprezint mutaia genomic datorat multiplicrii numrului de genomuri (numrului fundamental de cromosomi). Poliploidia reprezint un fenomen cu o inciden destul de mare n natur - 47% dintre angiosperme i 4,6% dintre gimnosperme sunt poliploide. Poliploizii se dovedesc a fi competitori redutabili n condiii aspre de mediu, proporia lor crescnd n biocenoze concomitent cu latitudinea i altitudinea, precum i n paralel cu deteriorarea drastic a condiiilor de habitat (deerturi, soluri srturate etc.). n funcie de numrul par sau impar al genomurilor ntrunite n noul organism, poliploizii pot fi clasificai n: A. Artioploizi - cu numr par de genomuri (2x, 4x, 6x, 8x, 10x).

B. Perisoploizi - cu numr impar de genomuri (3x, 5x, 7x, 9x). n ceea ce privete poliploizii, se cuvin menionate cteva aspecte. Crescnd numrul de seturi cromosomiale per nucleu, evident c va crete i cantitatea de AND per nucleu. Poliploidia este un fenomen larg rspndit la plante, animalele etalnd cu o frecven mult mai mic aceast stare. n acest regn poliploidia este mai frecvent la nevertebrate (protozoare, crustacei, lepidoptere, ortoptere), dar i la unele vertebrate, din clasele petilor i amfibienilor. Menionm n acest sens iparul (Misgurnus fossilis), care este tetraploid n apele noastre (2n=100), n timp ce n apele din Extremul Orient triete o specie diploid (Misgurnus anquillicaudatus)(2n=50). Prezena poliploizilor a fost semnalat i la reptile, psri i chiar mamifere. Desigur poliploizii sunt prezeni i la om dar, n mod firesc, nu sunt viabili. Conform originii lor (modului n care au aprut), poliplozii au fost grupai n: I Autopoliploizi i II Alopoliploizi. I. Autopoliploidia reprezint fenomenul multiplicrii numrului de genomuri (numere cromosomiale de baz) proprii. Autotetraploizii se ntlnesc frecvent la Solanusm tuberosum, Medicago sativa, Arachis hypogea, Coffea arabica, Vitis vinifera etc. n practic sunt deosebit de frecvent utilizai triploizii care, pe lng faptul c manifest heterozis, prezint i avantajul de a nu produce semine. Cei mai des ntlnii i mai frecvent utilizai sunt triploizii bananului, viei de vie, mrului, pepenelui verde, ananasului, plopului etc. II. Alopoliploizii (amfiploizii) reprezint poliploizii a cror apariie presupune, cu necesitate, prezena unui proces anterior de hibridare interspecific. n consecin, la un amfiploid nu putem vorbi de o multiplicare a numrului de genomuri proprii, ci de o multiplicare a unui numr de genomuri aditive. Spre exemplu, dac avem specia A, la care notm genomul cu x1 i specia B, la care notm genomul cu x2, hibridul interspecific AB va vea genotipul x 1+x2. Dar acest hibrid nu se va putea reproduce, meioza nefiind posibil. Prin poliploidizarea sa la faza de tetraploid vom avea hibridul AABB, cu genotipul 2x1+2x2, ceea ce nu este tot una cu 4x. Se apreciaz c n natur incidena amfiploizilor este destul de mare. Dintre acetia, menionm: Triticum aestivum (2n=42), Gossipium hirsutum (2n=52), Nicotiana tabacum (2n=48), Medicago sativa (2n=32), Prunus domestica (2n=48), Spartina townsendii (2n=126), Brassica napus (2n=38) etc. Unul din cele mai bine studiate cazuri este acela al speciei Triticum aestivum. Aici avem, n esen, rezultanta a dou hibridri interspecifice, urmate de poliploidizare. Astfel, Triticum monococcum (2n=14) s-a hibridat cu Aegilops speltoides (2n=14). A rezultat Triticum dicoccoides (2n=28). Acesta, ncruciat cu Aegilops squarrosa (2n=14), a dat specia Triticum aestivum (2n=42). Iat, schematic, procesul:
Triticum monococcum 2n = 14 (2xm), genomurile AA x Aegilops speltoides 2n = 14 (2xsp), genomurile BB

Rezult un hibrid steril, 2n = 14, cu genomurile AB (xm + xsp).

Prin alopoliploidizare hibridul devine


Triticum dicoccoides, 2n = 28, cu genomurile AABB (2xm + 2xsp)

Aegilops squarrosa x 2n=14(2xsq), genomurile DD

Triticum dicoccoides 2n=28(2xm +2xsp=4x),genomurile AABB

Rezult un hibrid steril, 2n = 21, cu genomurile ABD (xm + xsp +xsq). Prin alopoliploidizare hibridul devine Triticum aestivum, 2n=42(2xm+2xsp+2xsq=6x), cu genomurile AABBDD

Evident, Triticum aestivum este o specie nou, sintetic, fertil i foarte productiv. Se mai cuvine de menionat faptul c, tot la gru, japonezul H. Kihara a reuit s resintetizeze unele specii existente n natur, refcnd astfel drumuri parcurse de procesul speciaiei n genul Triticum. Pe de alt parte, s-a reuit sinteza de novo a unor specii complet necunoscute n natur. Astfel, G.D. Karpecenko, n 1927, a reuit s hibrideze Raphanus sativus (2n=18) cu Brassica oleracea (2n=18) i s obin Raphanobrassica (2n=36). Iniial, hibridul era steril. Dar, dup un timp de vegetaie, pe una din ramuri s-au format cteva semine. Se admite deci c, n mod natural, s-au produs gamei diploizi care au asigurat fertilitatea i perpetuarea hibridului. Noua specie (sintetic) are caractere intermediare celor dou specii genitoare - forma pstilor, de pild, este cea de la ridiche la partea superioar i cea de la varz la partea inferioar. Pseudopoliploidia sau poliploidia fals reprezint fenomenul n care multiplicarea numrului de genomuri se datoreaz unei fisionri a cromosomilor (perpendicular, la nivelul centromerilor) i nu unor dereglri n procesul diviziunii celulare. n consecin, la un pseudopoliploid, mrirea numrului de genomuri nu se regsete n mrirea adecvat a cantitii de ADN. n alt ordine de idei, precizm faptul c, n cadrul cariotipului unei specii, pe lng numrul i tipul cromosomilor, o caracteristic specific o constituie numrul fundamental de brae (NF). De pild, la o specie cu 2n=10, toi cromosomii fiind metacebtrici, NF=20. n cazul n care o pereche de cromosomi din cei 10 (una din cele cinci perechi) sunt telocentrici, restul fiind metacentrici, NF=18 etc. Evident, n cazurile de pseudopoliploidie, indiferent de numrul de genomuri, NF rmne constant (ca i cantitatea de ADN per celul). De pild, n cazul menionat, diploidul are 2n=10, adic 2x, deci NF=20 (toi cromosomii sunt metacentrici), Prin fisionare la nivelul centromerului, toi cromosomii devin telocentrici. Prin urmare 2n=20, ceea ce ar reprezenta 4x. Dar NF=20, deci este vorba de un 4x fals. Endopoliploidia reprezint fenomenul aa-zisei poliploidii somatice, adic o poliploidizare prin cicluri endomitotice repetate (replicarea cromosomilor n interiorul membranei nucleare). Endopoliploidia nu afecteaz ntregul organism ci, de obicei, anumite celule sau esuturi ale acestuia. Fenomenul a fost constatat i descris, pentru prima oar, de ctre citologul austriac L. Geitler, la insectele acvatice Gerris lateralis i Gerris lacustris, la care s-au identificat celule 512-, 1024- i chiar 2048 ploide, n esutul ovarian. Sunt date n conformitate cu care la specia Chironomus tentans, n glandele salivare, celulele conin 32.768 n. Fenomenul de endopoliploidie a fost observat i la organisme mult mai evoluate, cum ar fi obolanul (Rattus rattus). La angiosperme, endopoliploidia este un fenomen comun. La sfecla de zahr spre exemplu, n endospermul seminelor se ntlnesc celule cu 24.756 n. Aneuploidia (heteropoliploidia) reprezint fenomenul datorat prezenei n plus a 1-2 cromosomi sau lipsei a 1-2 cromosomi dintr-un genotip. Evident, prezena unor cromosomi supranumerari sau lipsa lor, se regsete n augmentarea sau diminuarea coninutului de ADN i n modificarea corespunztoare a numrului fundamental de brae. Dac un individ diploid normal mai poart i numele de disomic (n sensul c fiecare pereche de cromosomi conine doi omologi - unul de origine matern i altul de origine patern), heteroploizii pot fi de dou categorii: hipoploizi i hiperploizi. Hipoploidia se caracterizeaz prin lipsa unuia sau a doi cromosomi din setul diploid. a. Nulisomia (2n 2). n acest caz lipsete una dintre perechile de cromosomi. De exemplu, dac o specie are 2n=10, nulisomicii vor avea 2n=8. n consecin, vom avea o serie de 5 nulisomici diferii (cte unul pentru fiecare pereche: I, II, III, IV i V). b. Monosomia (2n 1). n acest caz, dintr-o pereche de cromosomi lipsete unul. Deci, rmnnd la acelai exemplu, vom avea 10 monosomici diferii (n ideea c cei doi cromosomi ai unei perechi, unul provenit de la mam i unul de la tat, nu sunt identici - unul poate avea genele dominante i cellalt, alelele recesive). c. Dublumonosomia [2n (1+1)]. Semnific lipsa a 2 cromosomi aparinnd la dou perechi diferite. n exemplul nostru, vom avea 40 de dublumonosomici diferii. Hiperploidia reprezint fenomenul datorat unui proces oarecum invers, adic prezena a unul sau doi cromosomi n plus.

a. Trisomia (2n+1). La una (n fiecare caz alta) dintre perechile de omologi, n loc de 2 cromosomi vor fi 3. n consecin, vom putea identifica 10 trisomici diferii n cazul n care meninem exemplul speciei cu 2n=10 cromosomi. b. Tetrasomia (2n+2). Presupune dublarea unei perechi de cromosomi (figurat vorbind, reprezint un caz de tetraploidie pentru o pereche de cromosomi). Prin urmare, la 2n=10 vom avea 5 tetrasomici diferii. c. Dublutrisomia [2n+(1+1)]. Reprezint fenomenul invers dublumonosomiei, rezultnd 40 de dublutrisomici diferii, posibili. n contextul acestei problematici precizm faptul c geneticianul E.R. Sears, n anul 1959, a efectuat studii complete i complexe asupra tetrasomiei n cazul speciei Triticum aestivum (2n=42), ocazie cu care a identificat i a descris seria complet de 21 tetrasomici (2n=44). Hipo-hiperploidia (2n ? + ?) reprezint fenomenul rezultat prin combinarea aleatorie a procesului de hipoploidie cu cel de hiperploidie. Adic simultan, la acelai individ, pentru aceeai pereche putem sesiza prezena unui cromosom n plus, n timp ce la o alt pereche un cromosom lipsete etc. Se apreciaz c principala cauz a apariiei aneuploizilor o constituie perturbarea meiozei. n consecin iau natere gamei cu 1-2 cromosomi n plus sau n minus, fenomen ce duce la apariia de indivizi modificai (cu 1-2 cromosomi n plus sau cu 1-2 cromosomi n minus). Dac la multe vieuitoare, n special la plante, aneuploidia se constituie ntr-o surs important de variabilitate, fiind i unul dintre mecanismele asigurrii apariiei de noi numere cromosomiale de baz (x), la animalele superior organizate, mai precis la om, aneuploidia reprezint o aberaie incompatibil cu viaa normal a individului. Indiferent dac afecteaz autosomii sau heterosomii, aneuploidia reprezint sindroame (boli genetice) deosebit de grave. Spre exemplu, trisomia 21 reprezint sindromul (maladia) Down (cunoscut i sub numele de idioie), indivizii monosomici pentru heterosomi (X0=viabili i Y0=letali) ca i trisomicii (XXX sau XXY) reprezintnd, de asemenea, boli grave (sindromul Turner i, respectiv, Klinefelter). n acest caz, aneuploidia este destul de rspndit n lumea plantelor. Este cunoscut cazul zambilei (Hyacinthus orientalis, 2n=16), introdus n cultur n anul 1560 n Olanda. Pe parcursul timpului, n urma seleciei empirice s-au obinut forme triploide, tetraploide i aneuploide foarte diferite ntre ele din punct de vedere estetic. Cele din urm (cele aneuploide) se multiplic mai ales pe cale vegetativ. 5.2.5. Pseudoaneuploidia Dac la poliploidie sau aneuploidie variabilitatea numeric a genomurilor sau a cromosomilor se regsea ntr-o variabilitate a cantitii de ADN, n pseudoaneuploidie (ca i n pseudopoliploidie) nu se regsete. n consecin, pseudoaneuploidia reprezint un fenomen de fals aneuploidie, datorat fuzionrii sau fisionrii cromosomilor. Spre exemplu, un "monosomic" poate reprezenta, n realitate, rezultanta fuzionrii cromosomilor unei perechi, iar un "nulisomic" poate reflecta rezultanta fuzionrii cromosomilor din dou perechi. n replic, un "trisomic" poate reprezenta, n fond, rezultanta fisionrii unui cromosom, iar un "tetrasomic" poate reflecta rezultanta fisionrii ambilor cromosomi dintr-o pereche sau a 2 cromosomi din dou perechi diferite etc. Desigur, pentru ca cele dou procese antagonice (fisiune i fuziune) s aib o inciden crescut, este important prezena cromosomilor telocentrici (pentru fuziune) sau metacentrici, submediani i subtelocentrici (pentru fisiune). Un element important n stabilirea existenei unei aneuploidii veridice sau a pseudoaneuploidiei, l constituie NF (numrul fundamental de brae). Evident, dac dou specii nrudite au numere diferite de cromosomi dar totalizeaz, n fiecare dintre celule, acelai numr de brae cromosomiale, rezult c ele au luat natere printr-o fals aneuploidie (pseudoaneuploidie). Un exemplu de aneuploidie natural, n cadrul regnului animal, ni-l ofer genul Drosophila. Specia iniial, D. virilis, avea 2n=12. Prin fuziuni cromosomiale succesive, din ea au luat natere speciile: D. pseudoobscura (2n=10), D. melanogaster (2n=8) i D. willistoni (2n=6).

INTREBARI DE VERIFICARE 1. Ce reprezinta mutatiile si care este rolul acestora 2. Care este mecanismul molecular de aparitie al mutatiilor 3. Ce reprezinta mutatiile cromosomiale 4. Care sunt mecanismele de producere a mutatiilor genomice TEME PENTRU EXAMINAREA FINALA 1. Precizarea rolului si mecanismelor de producere a mutatiilor 2. Clasificarea mutatiilor in functie de cantitatea de material genetic afectata

Unitatea de invatare 6 6. Acizii nucleici suport material al informatiei genetice


6.1. Acizii nucleici sunt macromolecule semantice
Dupa 1940, cercetri efectuate pe ciuperca Neurospora au oferit noi argumente (concomitent cu noi ntrebri), pentru o ipotez formulat cu ani n urm de Garrod, n conformitate cu care genele controleaz producerea enzimelor specifice. Aceasta a fost prima concepie relativ la gen, cunoscut n genetic sub forma o gen - o enzim, concepie n conformitate cu care, o anumit gen este responsabil de determinismul sintezei unei anumite enzime. Iniial, s-a emis o ipotez simpl: gena determin ordonarea a 20 de aminoacizi diferii ntrun lan polipeptidic. O asemenea ipotez presupunea acceptarea prezenei unui mare numr de enzime, cte una pentru fiecare aminoacid diferit, ce va fi asamblat n proteina ce urma a fi sintetizat. Dar, fiecare enzim avnd i o parte proteic, ar fi fost necesare alte enzime (enzime suplimentare) pentru sinteza enzimelor ordonatoare de aminoacizi i aa mai departe. Astfel, o problem ar genera o alta, la infinit. n consecin, concepia genei de natur proteic a trebuit s fie abandonat. A fost, deci, necesar elaborarea unei alte ipoteze. Aceasta a fost "ipoteza matriei", adic ipoteza existenei unei suprafee ablon. In conformitate cu aceast ipotez, ar exista unele con-formaii cu calitate de matri, pe suprafaa crora s-ar asigura selectarea unui anumit aminoacid pentru o anumit poziie (locus) i, ulterior, asamblarea aminoacizilor ntre ei. Astfel s-ar fi putut explica o a doua aseriune i anume: o enzim specific pentru un anumit aminoacid, dar comun pentru sinteza tuturor proteinelor, poate asigura asamblarea aminoacizilor. Apare, totui, o dificultate i aici. Conform acestei ipoteze, ar fi fost necesar s se accepte c o astfel de matri ar trebui s aib capacitatea de a fi suport pentru propria-i asamblare (adic o matri trebuie s fie capabil s dea na-tere la noi matrie). Practic, impasul n care a intrat prima ipotez s-ar menine - o enzim ar trebui s dea natere unei alte enzime i, aa cum s-a demonstrat, enzimele nu pot produce enzime. Mergnd n continuare cu logica, se mai impune o rezolvare i anume : matriele trebuie s fie macromolecule cel puin la fel de mari ca moleculele crora le dau natere. Analiza gruprilor aminoacizilor din proteine nu a adus, ns, confirmri pentru ipoteza enunat anterior, ntruct nu exist, din punct de vedere chimic, nici o posibilitate de a explica de ce inserarea valinei pe o matri ar atrage, preferenial, o alt molecul de valin pe matria complementar. In realitate, nici o grupare de aminoacizi nu are afiniti pentru una similar. Dimpotriv, este mult mai uor s se imagineze molecule cu trsturi opuse sau complementare, care s se atrag reciproc. Spre exemplu, atomii electropozitivi de hidrogen, leag numai atomi electronegativi, cum ar fi cei de oxigen sau azot. In acelai fel, moleculele pot fi atrase, n mod specific, prin fore van der Waals, numai cnd posed forme complementare. In context, se poate imagina c o adncitur ntr-o molecul poate fi complementar unei protuberane din molecula

complementar. Aa stnd lucrurile, s-a constatat c nu este posibil gruparea celor 20 de aminoacizi n 10 perechi constituite din aminoacizi cu forme comple-mentare. Se poate admite, ns, c exist 20 de molecule specifice diferite, pe care le putem numi conectori. Fiecare conector ar trebui s posede dou suprafee identice, dar complementare, unui anumit aminoacid. Respectivele molecule (conectoare) ar putea determina ncorporarea unor aminoacizi ntr-un lan, ntr-o secven identic celei a lanului polipeptidic ce servete ca matri. Ins, nu s-au gsit dovezi pentru demonstrarea prezenei unor asemenea matrie. Infirmarea ipotezei matriei de natur proteic a fost argumentat i chimic. Principalul suport al ipotezei respective este acela c matria are, n structura sa, acizi aminici. In acest context, se impune precizarea c o matri a crei specificitate depinde de aminoacizi ca valina i/sau alanina (aminoacizi extrem de apropiai conformaional - ca structur spaial), nu poate fi copiat cu suficient acuratee. Exist riscul de a se asambla alanina n loc de valin sau invers. Un alt exemplu l constituie valina i izoleucina care difer doar prin prezena unui grup metil adiional la izoleucin (Fig.17). De asemenea, glicina i alanina difer ntre ele printr-o grupare metil etc. Similitudinile structurilor spaiale pun o problem simpl - poate exista sigurana c un proces de copiere este suficient de sigur (ca acuratee), adic poate s asigure diferena ntre dou structuri aa de asemntoare ? Calculele au demonstrat c ansele de copiere nu implic mai mult de o eroare n 10 8 cazuri. Pe de alt parte, un argument de ordin chimic, nu prea riguros, este acela c o reacie chimic, nu poate face distincie ntre dou molecule care difer printr-o grupare metil, cu o acuratee care s permit mai puin de o greeal n 10 6 cazuri. Apoi, cnd sau realizat experimentele propriu-zise, s-a constatat c leucina, de exemplu, era inserat ntr-un polipeptid cu o siguran de cel mult 99,9%, ceea ce admitea o greeal la 10 3 cazuri. Din aceste motive, ipoteza c proteinele ar putea juca rolul de "molecule ereditare" nu a putut fi acceptat. n consecin, atenia cercettorilor a fost, astfel, canalizat spre o alt component celular - acizii nucleici.

Fig.17 Structura chimic a moleculelor de valin (a), alanin (b) i izoleucin (c)

Asemenea proteinelor, macromoleculele de acizi nucleici sunt alctuite dintr-un numr mare de subuniti, denumite nucleotide. Acestea stau la baza a dou categorii de acizi nucleici ADN-ul (prin-cipalul constituient al cromosomilor) i ARN-ul (mai exact acizii ribonucleici). Iniial se credea c acizii ribonucleici sunt specifici plantelor i cel dezoxiribonucleic animalelor. Ulterior, prin modernizarea metodelor de extracie i de caracterizare a acizilor nucleici, s-a constatat c toate celulele (bacteriene, vegetale i animale) i conin pe ambii. Aa cum am precizat, ambele tipuri de acizi nucleici au drept constituieni de baz nucleotidele. Fiecare nucleotid este alctuit dintr-un radical fosfat (radical al acidului ortofosforic) legat la C 5 al moleculei de zahr (pen-toz), legat, la rndu-i, de molecula unei baze azotate (purinic sau pirimidinic). Purina are structur dublu inelar, iar pirimidina are un singur inel (un singur ciclu) (Fig. 18). Deoarece conin dezoxiriboz, nucleotidele din ADN sunt denumite dezoxiribonucleotide, iar cele din ARN sunt denumite ribonucleotide. Att moleculele ADN, ct i cele de ARN au cte dou nucleotide purinice i cte dou nucleotide pirimidinice, n proporii variabile. Purinele sunt aceleai, att pentru ADN ct i pentru ARN (Adenin i Guanin). In ceea ce privete pirimidinele, se cuvin precizate urmtoarele: Citozina se gsete n ambii acizi nucleici, n

timp ce Timina se gsete doar n ADN, fiind nlocuit n ARN prin Uracil (foarte asemntor, ca structur) (Fig. 19).

Fig. 18 Structura purinei i pirimidinei

In ambii acizi nucleici, nucleotidele sunt asamblate prin legturi covalente - se leag grupele fosfat ale unei nucleotide, la gruparea hidroxil a zahrului de la nucleotida adiacent. Aceste legturi, numite legturi fosfodiester, erau cunoscute ca existnd, dar detaliile (atomii care au legat mpreun nucleotidele pentru a forma catena de acid nucleic) au rmas mult vreme necunoscute. De asemenea, iniial, era confuzie cu privire la adevrata mrime a ADN-ului i a ARN-ului n celule.

Fig. 19 Structura chimic a adeninei, guaninei, citozinei, timinei i uracilului

Tehnicile utilizate pentru separarea acizilor nucleici degradau puternic macromoleculele, fapt pentru care doar pe la mijlocul anului 1930 s-a demonstrat c ambii acizi pot aprea ntr-o multitudine de forme. Cruciale au fost i experimentele efectuate de Signer i Casperson, care au constatat c ADNul separat cu atenie, are greuti moleculare mai mari dect multe proteine (mai mare de 500.000 daltoni). Cei doi cercettori au dedus, de asemenea, c ADN-ul este o molecul foarte alungit - aseriune complet confirmat prin 1950, cu ajutorul microscopiei electronice, care a relevat faptul c ADN-ul este o molecul extraordinar de subire, cu un diametru de numai 20 . Lungimea unei molecule de ADN este de multe mii de angstromi, confirmndu-se, astfel, c este alctuit din multe mii de nu-cleotide (Fig. 20).

Fig. 20 Aspectul electronomicroscopic al unei molecule ADN

n 1928, microbiologul englez Frederick Griffith a efectuat un experiment crucial pentru genetica molecular de mai trziu. In linii mari, experimentul a decurs astfel. Griffith a omort pneumococii viruleni, de tip S, prin ocuri de temperatur iar resturile acestora, mpreun cu pneumococi neviruleni de tip R, au fost injectate la un lot de oareci. Cu surprindere, Griffith a constatat c oarecii s-au mbolnvit de pneumonie i au murit. Din oarecii mori, cercettorul a izolat pneumococi viruleni de tip S. Deci, dintr-o anumit cauz, cauz ce se gsea n resturile pneumococilor viruleni distrui prin temperaturi ridicate, o parte dintre pneumococii neviruleni s-au transformat n pneumococi viruleni. Altfel spus, componente genetice ale pneumococilor S au trecut n pneumococii de tip R i i-au transformat. In plus, respectivele componente genetice trebuiau s fie rezistente la temperatur i s nu fie foarte mari, pentru a putea penetra prin membranele celulare ale pneumococilor vii, neviruleni, unde puteau s ia parte la procese recombinaionale. Acestea erau, logic, presupunerile. Evident, la acea dat, innd cont de stadiul cunotinelor, nu se putea da o explicaie adecvat fenomenului (Fig. 21). Cercetrile ulterioare au confirmat interpretarea dat acestui fenomen. Patogenitatea reflect aciunea genelor S (smooth, n limba englez nseamn neted) care determin sinteza unei enzime implicate n elaborarea capsulei (coninnd carbohidrai) ce nconjoar bacteriile virulente. Cnd este prezent alela R (rough, n limba englez nseamn rugos, aspru) a acestei gene, nu se formeaz capsul i respectivele bacterii nu sunt patogene. Civa ani dup ce Griffith i-a fcut publice observaiile, extractele pe baz de bacterii omorte s-au dovedit a fi capabile de a induce (determina) transformri ereditare. S-au putut iniia cercetri pentru identificarea chimic a agentului transformant. Dar, la acea dat, marea majoritate a biochi-mitilor, nc mai credea c genele sunt de natur proteic. De aceea, surpriza a fost extraordinar, n 1944, cnd s-a anunat de ctre Oswald T. Avery, Colin M. McLeod i Maclyn McCarty (de la Rockefeller Institute, New York) c agentul genetic activ este ADN-ul. Cei trei au fcut aceast precizare dup o cercetare asidu de peste 10 ani. Punctul central al cercetrilor lor, a fost acela c au reuit s se demonstreze c activitatea transformant a principiului activ, purificat, este anihilat de ctre dezoxiribonucleaza pancreatic. Aceasta este, de fapt, o enzim ce degradeaz, cu nalt specificitate, moleculele de ADN, pn la nucleotide i nu are nici un fel de aciune asupra integritii moleculelor proteice, sau chiar asu-pra celor de ARN. Pe de alt parte, adugarea de ribonucleaz pancreatic sau de enzime proteolitice, nu a avut influen asupra principiului activ, transformant. Muli s-au ndoit de valabilitatea universal a descoperirii lui Avery, fapt pentru care rezultatele sale au fost acceptate i apreciate corespunztor, mai trziu.

Fig. 21 Schema experimentului realizat de Griffith

6.1.2. Acizii nucleici component ubiquitar i permanent a cromosomilor O confirmare, deosebit de important, a acestei descoperiri a survenit dup ce s-a stabilit compoziia chimic a cromosomilor. S-a constatat, iniial, c ADN-ul este localizat cu prioritate n nucleul celular, apreciindu-se c este absent acolo unde lipsesc cromosomii. Apoi s-au derulat cercetrile efec-tuate, tot la Institutul Rockefeller, de ctre Mirsky i Ris, precum i cele realizate, n Frana, de ctre Vendrelys, cercetri prin care s-a demonstrat constana cantitii de ADN (per nucleu celular). Pentru indivizii din cadrul unei specii, cantitatea de ADN este dubl n celulele somatice i simpl n celulele haploide. 6.1. 3. Stabilitatea metabolic a ADNului Un alt argument forte, pentru considerarea ADN-ului ca macromolecul cu rol informaional, a fost furnizat de descoperirea stabilitii sale metabolice. El nici nu se asambleaz, dar nici nu se distruge rapid, asemenea multor altor molecule din celulele animale i vegetale. Atomii odat ncorporai n ADN nu sunt scoi dect atunci cnd celula se degradeaz, cnd nceteaz de a mai fi o entitate vie. Confirmri indubitabile ale celor precizate anterior sunt furnizate i de analizele efectuate pe material viral dar, mai ales, de experimentele prin care s-a elucidat cauzalitatea infeciilor virale. ncepnd cu 1950, a fost posibil separarea virusurilor n cele dou componente - capsida proteic i miezul nucleic. Apoi, injectnd separat cte unul dintre cele dou componente n diverse organisme vii, s-a constatat c doar componenta nucleic (acidul nucleic viral) este apt de a declana infecia tipic, n timp ce capsida proteic (fantoma fagic) nu are caliti infectante. Concluzia a fost clar - purttorul informaiei ereditare este acidul nucleic. Cu aceast ocazie, prin analizele efectuate, s-a ajuns i la o alt concluzie foarte important i anume: toi viruii conin acizi nucleici. S-a studiat, prin metoda izotopilor marcai, multiplicarea bacteriofagului T 2 - un fag bacterian care conine un miez din ADN i un nveli alctuit prin agregarea mai multor molecule proteice diferite. Experimentele au fost efectuate de ctre Hershey i Chase, la Cold Spring Harbor, din Long Island (Fig. 22).

Fig. 22 Schema experimentului efectuat de Hershey i Chase

Proteinele au fost marcate cu 35S i ADN - ul cu 32P. Virusul marcat a fost utilizat pentru infecie i lsat s se multiplice n celulele gazd. Analizele efectuate ulterior nu au detectat, n progeni, protein marcat ci numai ADN marcat. n plus s-a constatat c nveliul proteic, marcat radioactiv, rmnea ataat de suprafaa celulei gazd. Dac, prin agitare puternic, fantomele fagice (nveliul proteic) ataate la suprafaa celulei gazd erau ndeprtate, procesul de infecie nu era afectat cu nimic. Prin aceasta s-a demonstrat, fr echivoc, rolul determinant al acidului nucleic n procesul infeciei. Ulterior, prin perfecionarea tehnicilor de purificare a ADN-ului, a fost posibil extragerea i caracterizarea acidului dezoxiribonucleic pur, din virusul polioma prelevat din oareci. Injectnduse doar acest acid dezoxiribonucleic, la oareci sntoi, s-a determinat apariia bolii. Din oarecii astfel mbolnvii s-au putut, apoi, extrage mii de exemplare de virui polioma (neoformai). Pe baza tuturor acestor observaii (completate, n timp, cu numeroase altele) s-a conchis c rolul nveliului proteic viral este acela de a proteja miezul nucleic, deintor al informaiei virale specifice (concomitent confirmndu-se lipsa oricrei ncrcturi semantice a nveliului proteic ). 6.1.4. Principiile lui Chargraff Utiliznd cromatografia pe hrtie, biochimistul Erwin Chargraff (de la Universitatea Columbia din New York), a analizat componena nucleotidic a macromoleculelor de ADN. Investigaiile sale au acreditat ideea c cele patru nucleotide (Adenin, Guanin, Citozin i Timin) nu sunt prezente n cantiti egale (n celulele prelevate de la indivizi aparinnd la specii diferite) i c procentul lor variaz de la o specie la alta. Aceste constatri au sugerat (idee demonstrat, ulterior, ca valabil) c aranjarea (ordinea, succesiunea) nucleotidelor n macromoleculele acidului dezoxiribonucleic, determin specificitatea informaional a acestuia. Prin urmare, proporia celor patru nucleotide (n fond, a celor patru baze azotate) n macromolecula acidului dezoxiribonucleic, nu are caracter aleatoriu. n toate probele analizate, numrul de resturi adeninice a fost egal cu numrul de resturi timidinice, numrul de resturi guanidinice fiind egal cu numrul de resturi citozinice. Schematic, aceste constatri pot fi redate astfe:l
A=T i G=C, de unde A+G = T + C, deci A + G / T + C = 1

Aceast axiom este cunoscut, n genetic, sub numele de REGULA CHARGRAFF. Investigaii atente au fost efectuate prin difracia razelor X pe acidul dezoxiribonucleic. Cercetrile au debutat n 1938 i i-au aparinut lui Astbury, care a analizat eantioane de acid dezoxiribonucleic care i-au fost puse la dispoziie de ctre Hammarsten i Casperson. Peste aproximativ 15 ani, Wilkins i Franklin, care lucrau la Kings College din Londra, au obinut fotografii de bun calitate. Wilkins i Franklin au confirmat structura elicoidal a acidului dezoxiribonucleic i c molecula sa este alctuit din mai mult dect un lan polinucleotidic. Nu s-a putut stabili, la acea vreme, dac este vorba de asamblarea a dou sau a trei lanuri polinucleotidice. Aproximativ n aceeai perioad (mai precis n 1952), un alt grup de cercettori, din laboratorul lui Todd (Cambridge Anglia) a stabilit c nucleotidele dintr-un lan sunt legate ntre ele prin puni fosfodiesterice formate ntre C5 al pentozei dintr-o nucleotid i C3 al pentozei din nucleotida adiacent (Fig. 23).

Fig. 23 Structura nucleotidic a ADN-ului monocatenar

6.1.5. Argumente pentru conformaia dublu elicoidal a ADN-ului ntre timp, Linus Pauling a propus ipoteza unei conformaii -elicoidale, care a strnit un imens interes. n consecin, Cochran, Crick i Vand au elaborat teoria conformaiei elicoidale (pe baza rezultatelor obinute prin difracia razelor X). Teoria final, n conformitate cu care macromolecula acidului dezoxiribonucleic are o conformaie dublu elicoidal, cu dou catene care se rsucesc elicoidal n jurul unui ax comun (ax ipotetic) a fost elaborat n 1953 de ctre Watson i Crick (care lucrau n laboratorul condus de Perutz i Kendrew, din Londra). Watson i Crick au reuit s dea vigoare i elegan teoriei conformaiei dublu elicoidale , folosind ca argument configuraia stereochimic stabilit de grupul de cercettori de la Kings College, pe baza difraciei razelor X. n ansamblu, s-a precizat c cele dou catene ale ADN-ului sunt meninute mpreun, n dubla elice, prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate complementare (puni duble ntre A i T i puni triple ntre G i C) (Fig. 24).

Fig. 24 Macromolecula de ADN dublu-catenar

De aceea, aa cum am precizat n rndurile anterioare, n macromolecula dublu elicoidal numrul de nucleotide cu A (purin) este egal cu numrul de nucleotide cu T (pirimidin) i numrul de nucleotide cu G (purin) va fi egal cu numrul de nucleotide cu C (pirimidin), conform principiului stabilit de Chargraff. n consecin secvenele bazelor azotate din cele dou catene ale unei macromolecule dublu elicoidale sunt perfect complementare. Altfel spus, ordinea bazelor de pe o caten impune (determin) ordinea bazelor de pe catena complementar. Concomitent cu definitivarea concepiei structurii dublu elicoidale s-a produs i o restructurare de profunzime n modul de abordare i analiz a datelor obinute de cei mai muli geneticieni. Gena a ncetat s mai reprezinte o entitate misterioas, analizabil doar prin experimente de dihibridare. Destul de rapid gena a devenit o entitate molecular real, ce poate fi investigat de chimiti, geneticieni i evoluioniti. De acum ncolo se punea problema cunoaterii mecanismelor concrete prin care genele se pot reproduce, se transmit i funcioneaz. S-au nregistrat progrese i n ceea ce privete procesul autoreproducerii acidului dezoxiribonucleic. Era tot mai evident c o caten servete ca suprafa specific (matri) pentru procesul de formare (asamblare) a catenei complementare, precondiie pentru a nelege cum se autoreplic o gen (Fig. 25). Dar, pentru a accepta i, apoi, explica ipoteza catenei matri necesar pentru asamblarea catenei complementare, s-a impus efectuarea de experimente cruciale, prin care s se realizeze sinteza de acid dezoxiribonucleic in vitro. Merite deosebite n acest domeniu i revin colii create de Arthur Kornberg care, nc din 1956, a demonstrat c este posibil neoformarea de acid dezoxiribonucleic n extracte (amestecuri acelulare) din bacterii. Ulterior, Kornberg a demonstrat c, pentru asamblarea precursorilor ADN-ului ntr-o caten unitar, este necesar o enzim polimerizatoare specific. Nucleotidele utilizate n respectivele experimente au fost : dATP, dGTP, dCTP i dTTP (adic nucleotide cu bogat coninut energetic). Enzima utilizat a fost ADN-polimeraza I, prima enzim care s-a dovedit a fiimplicat n sinteza polinucleotidelor. Enzima este capabil s lege nucleotidele prin puni fosfodiesterice ntre C5 i C3 (cei doi atomi de carbon din dou pentoze aparinnd la dou nucleotide adiacente) (Fig. 26). Se impune precizarea c aceast enzim este funcional i eficient numai n prezena acidului dezoxiribonucleic. Numai n prezena unei macromolecule de ADN se poate asigura ordonarea celor patru nucleotide ntr-o anumit succesiune. De aici i concluzia c ADNpolimeraza I recunoate numai poriunea regulat zahr-radical fosforic din cadrul unei nucleotide, fapt pentru care nu poate determina i specificitatea secvenei pe care o asambleaz (diferenele dintre nucleotide sunt date de bazele azotate din compoziia lor). Demonstrarea acestei afirmaii este relativ simpl. n orice sintez de novo a ADN-ului, in vitro, proporia perechilor de baze (A = T i G = C) este similar cu cea din acidul dezoxiribonucleic care a servit ca matri.

Fig. 25 Autoreplicarea ADN-ului

Pe de alt parte se impune meniunea c n orice experiment de inducere a sintezei in vitro, n mediu acelular, nu s-a reuit obinerea de molecule proteice sau a altor tipuri de molecule. Prin urmare, concluzia este clar : nu exist un alt compus, n afar de ADN, care s conin informaie genetic. Capacitatea polimerazei I a ADN de a produce copii complementare matriei acidului dezoxiribo-nucleic din mediul de cultur, sugereaz c ea poate fi enzima major la Escherichia coli, implicat n asamblarea nucleotidelor pe parcursul replicrii ADN. Desigur, autoreplicarea semiconservativ a ADN-ului este un proces mult mai complex.

Fig. 26 Biosinteza enzimatic a ADN-ului, catalizat de ADN polimeraza I

6.1.6. ADN-ul se autoreplic semiconservativ O alt problem, este aceea a comportamentului celor dou catene complementare n procesul autoreplicrii acidului dezoxiribonucleic. Se separ ele sau nu? Rspunsul a fost dat, aproape simultan (n 1958) de Kornberg, Meselson i Stahl. Cei trei au reuit s pun la punct metoda de separare a macromoleculelor de ADN, n funcie de greutatea lor, ntr-un gradient de densitate. S-a recurs la marcarea macromoleculelor acidului dezoxiribonucleic, cu izotopi grei de

15

N i 13C. S-a reuit s se obin macromolecule hibride i s se demonstreze c, n timpul replicrii, cele dou catene de ADN se separ. Iat, pe scurt, cum a fost conceput experimentul. S-a preparat un mediu de cultur, pentru bacterii, n care se gsea (n compusul azotat specific) izotopul greu 15N. Bacteriile, provenind din aceeai surs, cultivate simultan pe mediul normal i pe mediul cu 15N, vor produce acizi dezoxiribo-nucleici cu greuti moleculare diferite (cele crescute pe mediul normal vor produce acid dezoxiribo-nucleic cu greutate mai mic, adic normal, dect cele crescute pe mediul cu izotopul greu). Dar, n acest context, se pune ntrebarea cele ce produc acid dezoxiribonucleic greu au molecule grele i molecule uoare sau molecule cu o caten grea i una uoar? De rspunsul obinut la aceast ntrebare depindea un alt rspuns n timpul autoreplicrii ADN cele dou catene se separ, sau nu? Adic autoreplicarea este conservativ sau semiconservativ? Pentru a rspunde la aceste ntrebri s-a procedat astfel : extractul de ADN s-a introdus ntr-o soluie de CsCl2 i s-a supus ultracentrifugrii. n timpul centrifugrii, n lungul tubului de centrifug, se realizeaz densiti diferite mai mare spre captul superior i mai mic spre captul inferior. Metoda despre care vorbim are rolul de a ordona moleculele de acid dezoxireibonucleic ntr-un gradient de densitate, conform gradientului de densitate al clorurii de cesiu, din timpul centrifugrii. Prin transferarea bacteriilor de pe un mediu pe cellalt (de pe mediul cu 15N pe mediul cu 14 N va fi posibil obinerea unui ADN hibrid (cu o caten grea i una uoar), n situaia n care admitem c biosinteza de noi macromolecule se realizeaz prin separarea celor dou catene ale macromoleculei de start. Admind ipoteza precizat, putem estima densitatea macromoleculelor rezultate dup anumite intervale de timp, intervale n care s-au realizat una sau mai multe autoreplicri pe mediul uor,ale ma-cromoleculelor de ADN ce fuseser sintetizate pe mediul greu. Dup prima autoreplicare, fiecare ma-cromolecul va avea o caten grea i una uoar dar toate macromoleculele vor fi la fel. Dup nc o autoreplicare, vor rezulta macromolecule n totalitate uoare i macromolecule hibride etc. (Fig. 27).

Fig. 27 Redarea schematic a experimentului prin care s-a demonstrat replicarea semiconservativ a ADN-ului

Prin urmare, aa cum reiese din schia de mai sus, dup prima autoreplicare cele dou macromo-lecule rezultate sunt hibride (cu o caten grea i una uoar), dup a doua autoreplicare rezultnd dou macromolecule hibride (cea de sus i cea de jos) i dou macromolecule normale (numai cu catene uoare cele din mijloc, n schia prezentat mai sus). Este, n fapt, ceea ce au observat Kornberg, Meselson i Stahl. Astfel s-a demonstrat c replicarea macromoleculelor de ADN este semi-conservativ una dintre catene este conservat , rmne intact, n irul generaiilor succesive.

7.2.Transferul informaiei ereditare de la acizii nucleici la proteine


O alt dominant, n preocuparea geneticienilor, a fost aceea a demonstrrii modalitilor prin care informaia deinut n macromoleculele de acizi dezoxiribonucleici este determinant pentru compo-nena proteinelor n aminoacizi. Specificitatea macromoleculelor de ADN (diferenele dintre dou macro-molecule provenind din surse diferite) este datorat secvenei liniare a celor patru nucleotide : A, G, C i T, din care-i sunt alctuite catenele. Cele patru nucleotide (mai precis bazele azotate purinice i piri-midinice din alctuirea lor), prin repetri aleatorii, constituie un mesaj lung, cu semnificaie precis. Cele patru nucleotide pot fi considerate, n fond, patru litere, dintr-un alfabet. Chiar i numai cu aceste patru litere, numrul de secvene poteniale (de ADN) va fi 4 N, unde N reprezint numrul de litere (de baze, n cazul de fa) din cuvnt (din secvena de ADN). Prin urmare, se poate admite c exist un numr infinit de molecule de acid dezoxiribonucleic, diferite ntre ele prin mesajele ereditare pe care le conin. Multe gene bacteriene conin cam 1500 de baze azotate, ntro anumit succesiune. Numrul potenial de gene, de aceast mrime, este de 4 1500 o valoare mult mai mare dect numrul de gene ce au putut exista n cromosomii ce s-au putut constitui de la apariia vieii, pe Terra i pn astzi. Prin urmare, atunci cnd ne referim la determinismul profund al caracterelor, ne referim la con-trolul genic al sintezei proteice, la determinismul secvenei aminoacizilor de ctre secvena nucleotidic, dar i la determinismul ordinii i numrului componentelor altor biomolecule. Primele dovezi, n acest sens, au fost furnizate de studiul hemoglobinei umane, prelevat de la indivizi suferind de anemie falciform. La respectivii bolnavi, genele care afecteaz forma globulelor roii, gene notate cu s (de la cuvntul englezesc sickle = secer) se pot afla n stare homozigot (ss) sau n stare heterozigot (Ss). Evident, starea individului este diferit n cele dou cazuri. n cazul Ss individul este (fenotipic) aproape normal, anemia nefiind prea sever (globulele roii au form aproape normal). n cazul indivizilor ss (homozigoie recesiv) hemoglobina este anormal (fiind caracterizat prin solubilitate diferit de cea a hemoglobinei normale). Moleculele de hemoglobin de tip normal (tipul slbatic) sunt alctuite din dou tipuri de lanuri peptidice tipul alpha i tipul beta. Fiecare lan are o greutate molecular de aproximativ 16.100 daltoni. Fiecare molecul are dou lanuri alpha i dou lanuri beta, fapt pentru care greutatea ei molecular atinge 64.600 daltoni. Dar lanurile alpha1 i alpha2 sunt controlate de ctre gene distincte, fapt pentru care o singur mutaie va afecta fie lanul alpha1, fie lanul alpha2, dar niciodat ambele lanuri simultan. Prin cercetrile efectuate de Ingram (n 1957, la Cambridge), s-a constatat c hemoglobina s (din hematiile n form de secer) difer de hemoglobina normal prin schimbarea unui singur aminoacid n lanul alpha, la poziia 6 (acidul glutamic este nlocuit cu valina). n alte forme de anemie s-au con-statat alte nlocuiri specifice de aminoacizi. Dar ADN-ul nu poate asigura de unul singur integrarea aminoacizilor n proteine, dei deine n-treaga informaie necesar acestui proces. Altfel spus, acidul dezoxiribonucleic nu servete ca matri pentru sinteza proteinelor. Iat argumentele pentru aceast afirmaie. n primul rnd sinteza proteic are loc n zone celulare n care ADN-ul este absent. Locul n care s-a stabilit c se desfoar sinteza proteic l reprezint zona citoplasmatic cu mari aglomerri de ribosomi. Or, se tie, citoplasma este clar delimitat de carioplasm (dein-toarea cromosomilor seifurile ADN-ului) prin membrana nuclear. Prin urmare, este nevoie ca infor-maia ereditar, deinut de ADN -ul din cromosomi, s ajung, pe o cale sau alta, n citoplasm, la locul sintezei proteice. n aceast idee s-a sugerat i apoi s-a demonstrat, ca real, existena unei alte macromolecule, capabil s preia informaia de la ADN i s o transporte la locul sintezei proteice. Suedezul Casperson i belgianul Brachet au constatat c respectiva macromolecul este ARN-ul, prezent n cantiti foarte mari n citoplasma celular. Dar, pentru a admite acest lucru, se mai impune o condiie. ARN-ul, fiind monocatenar, nseamn c trebuie s aib posibilitatea de a prelua, din ADN, doar informaia ereditar deinut de una dintre catene. Altfel spus, atunci cnd nu servete pentru autoreplicare, una dintre catenele ADN-ului servete pentru asamblarea ARN-

ului. Prin urmare, trebuiau gsite anumite similitudini ntre compoziia nucleotidic a unei catene de ADN i cea a ARN-ului. ARN-ul, asemenea ADN-ului, este alctuit din nucleotide. Macromolecula sa este lung (de dimensiuni variabile), neramificat i se formeaz prin legturi fosfodiesterice de tipul 3 5 (Fig. 28). Exist, totui, dou diferene ntre moleculele de ADN i cele de ARN. Una dintre acestea se da-toreaz componentei glucidice reprezentat prin dezoxiriboz n cazul acidului dezoxiribonucleic i prin riboz n cazul acidului ribonucleic. O a doua deosebire, mult mai semnificativ, erste aceea c n ADN sunt prezente nucleotidele adenin, guanin, citozin i timin ( A, G, C i T ), n timp ce n ARN sunt prezente adenina, guanina, citozina i uracilul ( A, G, C i U ), adic timina este nlocuit cu uracil. Dar complementaritatea purin-pirimidin (A = U i G C) fiind asigurat, poliribonucleotidul (ARN) este complementar cu polidezoxiribonucleotidul i, n consecin, se formeaz structuri elicoidale complementare (caten ADN caten ARN) meninute mpreun prin punile de hidrogen menionate anterior. ARN-ul este, n mod normal, monocatenar. Tot ca o normalitate este i faptul c n macromoleculele de ARN nu se asigur o rat a bazelor complementare. Deseori, cantitatea de adenin nu este egal cu cea de uracil i cantitatea de guanin nu este egal cu cea de citozin. Prin urmare, moleculele de ARN nu au o structur regulat dat de punile de hidrogen.

Fig. 28 O poriune dintr-o molecul de ARNm, cu punctele de start i de oprire a translaiei, marcate

7.2.1.Sensul circulaiei informaiei ereditare La nceputul deceniului ase al secolului XX (mai exact n 1953), s-a ncetenit concepia n con-formitate cu care ADN-ul cromosomial servete drept matri pentru asamblare macromoleculelor de ARN, macromolecule care migreaz apoi spre aglomerarea de ribosomi din citoplasm, zon n care are loc o intens sintez proteic. n 1956, Crick a formulat dogma central a geneticii, dogm n conformitate cu care sensul curgerii informaiei ereditare este de la ADN spre protein, conform schemei (Fig. 29). Din aceast schem, care la ora actual nu mai este acceptat ca dogm, date fiind procesele de reverstranscripie descoperite ulterior, reiese cu claritate c acidul dezoxiribonucleic are capacitatea de autoreplicare i c pe catena sa se asambleaz macromoleculele de acizi ribonucleici care prsesc zona nuclear (totul se petrece n interfaza ciclului celular) i migreaz n citoplasm. De asemenea, schema sugereaz faptul c ARN-ul nu poate fi niciodat sintetizat pe o matri proteic i nici ADN-ul pe o matri de ARN. n ceea ce privete sinteza ADN-ului pe o matri de ARN, afirmaia a suferit unele amendamente, n sensul c uneori ARN-ul poate servi ca matri pentru sinteza ADN-ului (am menionat deja existena reverstranscripiei).

Fig. 29 Sensul de circulaie al informaiei genetice, de la AND la proteine

7.2.2. Fundamentarea ipotezei adaptorului Nimic nu prea mai simplu, la nceput, dect s se accepte cmatria de ARN asigur sinteza proteic pe baz de plieri care determin apariia de caviti specifice fiecruia dintre cei 20 de aminoacizi. Prin urmare, cavitile trebuie s fie n aa fel conformate nct s asigure potrivirea unui singur aminoacid (specificitatea cavitate aminoacid). Ulterior, ns, Crick a nceput s se ndoiasc de realismul acestei ipoteze. O astfel de matri nu-i putea dovedi funcionalitatea. n primul rnd, gruprile specifice de pe cele patru baze ale ARN-ului (A, U, G, C) au capacitatea de a interaciona cu gruprile solubile n ap. Mai mult, grupele laterale ale multor aminoacizi (cum ar fi leucina, valina, fenil-alanina) prefer mult mai mult interaciunea cu grupele insolubile n ap (cu grupele hidrofobe). Pe de alt parte, chiar dac unele molecule de ARN pot fi mpachetate pentru a expune suprafee hidrofobe, nu exist nici o cale pentru matria ARN-ului de a face deosebirea ntre aminoacizii foarte asemntori cum ar fi, de exemplu, glicina i alanina, sau valina i izoleucina (ambele cupluri difer doar prin prezen-a unui singur grup CH3). De aceea, Crick a precizat c , anterior ncorporrii n protein, aminoacizii trebuie ataai la un adaptor specific, adaptor care s posede o suprafa unic, care s se lege specific la bazele de pe matria ARN. 7.2.3. Sintez proteic fr componente celulare Sinteza proteinelor fiind descoperit i, parial, explicat, a fost necesar analiza unor extracte din care s fie eliminate toate componentele celulare (presupuse a fi implicate n sinteza proteic). Experimentul a fost imaginat i derulat, cu succes, n 1953, la Spitalul General Massachusetts din Boston, de ctre Zamecnick i colaboratorii si. Succesul a fost asigurat de folosirea aminoacizilor marcai radioactiv, aminoacizi care au permis marcarea proteinelor nou sintetizate. S-a presupus c organitele n care are loc sinteza proteinelor sunt ribosomii, organit care conin cantiti mici de ARN. S-a constatat, totodat, c ATP-ul este necesar ca surs de energie pentru formarea legturilor peptidice. La o scurt perioad dup aceea, Zamecnik i Hoagland, au precizat c, nainte de a fi ncorporai n proteine, aminoacizii sunt ataai la ARNt , cu ajutorul enzimelor aminoacil sintetaze (Fig. 30). ARNt reprezint aproximativ 10% din cantitatea de ARN celular. Aceasta a fost o descoperire neateptat, senzaional.

Crick fcuse deja speculaia c exist un adaptor care, probabil, este un lan de ARN care este capabil de a se mperechea cu moleculele de ARN care servesc drept matrie pentru sinteza proteic. Prin urmare, ARNt descoperit de Zamecnik i Hoagland, nu este altceva dect adaptorul lui Crick. Adaptorul conine baze complementare celor din ARNm adic aici (pe ARNt) se gsete anticodonul (nodoc ul ) i pe ARNm se gsete codonul.

Fig. 30 Molecula de ARNt

7.2.4. Ribosomii nu au specificitate Prin determinri de nalt finee, s-a demonstrat c peste 85% din ARN-ul celular se gsete n ribosomi. Pe de alt parte, cantitatea de ARN crete semnificativ n celulele cu o intens activitate pro-teosintetic. De exemplu, cantitile de ARN cresc semnificativ n celulele bacteriene, aflate n diviziune intens, n celulele pancreatice, hepatice etc. Din aceste considerente, iniial, ARNr a fost considerat ca fiind matria pe care se ordoneaz aminoacizii. Dar, analizndu-se ribosomii de la E. coli, precum i cei din alte organisme, s-a constatat c acetia sunt compui din dou subuniti inegale, fiecare coninnd ARN, care se unesc sau se despart (n mod reversibil), n funcie de concentraia ionic a mediului. Pe de alt parte, toate lanurile ARN r, din interiorul subunitilor mici, au lungime similar -cca 1.500 baze, cum dealtfel au i lanurile din subunitile mari cca 3.000 baze. n alt ordine de idei, compoziia ambelor categorii de lanuri (cele mici i cele mari) este aproximativ aceeai bogia n G i C, la bacterii, plante, animale, n pofida variabilitii ratei AT / GC din ADN-ul aceluiai organism. Acest lucru nu ar fi posibil dac moleculele de ARNr ar reprezenta, n fapt, o colecie de molecule de ARN care s serveasc drept matrie, molecule sintetizate de un mare numr de gene diferite. Dac situaia ar fi astfel, componenta bazic a ARNr ar trebui s fie puternic corelat cu aceea a genomului lor. Pe de alt parte, noi nu ne-am atepta ca lungimea lanurilor de ARN, care servesc drept matri, s fie diferit i corelat cu mrimea produilor polipeptidici. Rezult c nici moleculele mici, nici cele mari, de ARNr, nu pot juca rolul de matri.

7.2.5. Schimbrile conceptuale produse de descoperirea ARNm Studiile efectuate pe celule bacteriene infectate cu virusul T 4 s-au dovedit deosebit de utile pentru definitivarea conceptului de matri. Ulterior infeciei virale, sinteza ARN-ului specific gazdei n-ceteaz i se sintetizeaz doar ARN-ul n care este transcris ADN-ul specific virusului. Acest ARN, care este de fapt un ARNm, nu formeaz (nu se asambleaz n) ribosomi, ci se ataeaz la ribosomii exis-teni, ribosomi pe care gliseaz pn ce nucleotidele (bazele azotate) sale ajung n poziiile n care permit legarea complexelor ARNt AA, n vederea sintezei proteinelor. Deoarece acest ARN poart informaia de la ADN spre ribosomi (locul n care are loc sinteza pro-teic) a primit numele de ARNm (acid ribonucleic mesager). Aceast descoperire, fcut n 1960, a fost urmat de multe altele care au demonstrat c exist, n realitate, o important categorie de ARN i anume ARN-ul mesager. ARN-ul ribosomal, mpreun cu aproximativ 50 proteine diferite (proteine ribosomale, evident, legate de ARN-ul ribosomal), se comport asemenea unui complex de sintez a proteinelor, funcionnd pentru a pune n contact componentele complexului ARNt AA (aminoacizi), n poziiile n care pot descifra informaia deinut de ARNm. Determinri precise au stabilit c numai 4% din cantitatea de ARN dintr-o celul revine ARNm. Pe de alt parte, acest tip de ARN etaleaz o variabilitate suficient de mare n ceea ce privete lungimea moleculei, n strns dependen de gena pe care o copie i de molecula proteic a crei sintez o codific. ntruct numai un mic fragment din macromolecula de ARNm este ataat la un ribosom, care gliseaz pe lungimea sa, doar o singur molecul de ARN poate fi citit, la un moment dat, simultan de mai muli ribosomi. De obicei, ribosomii sunt asamblai n poliribosomi n numr destul de variabil ntre 6 i 50 de ribosomi. Molecula de ARNm este citit i tradus, ntotdeauna, n aceeai direcie ribosomii gliseaz de la captul 5, spre captul 3,. Prin urmare la ribosomi se ataeaz, la nceput, captul 5 , al macromoleculei de ARNm. 7.2.6. Sinteza enzimatic a ARN-ului pe baza matriei ADN-ului Dup ce a fost descoperit i caracterizat ARNm, a fost descoperit i descris i enzima responsabil cu formarea ARN-ului pe matria de ADN. Caracterizat i numit ARN-polimeraz, de ctre biochimitii americani Hurwitz, Stevens i Weiss, aceast enzim funcioneaz numai n prezena ADN-ului (care are rolul de matri), determinnd asamblarea nucleotideluo ATP, GTP, CTP i UTP n monocatena de ARN. n cazul bacteriilor, una i aceeai enzim asigur constituirea tuturor tipurilor de ARN (riboso-mal, transportor i mesager). Dovezi directe ale faptului c matria de ADN dirijeaz asamblarea corect a ribonucleotidelor, pentru a forma ARN-ul, sunt furnizate de variaia compoziiei nucleotidice a ARN-ului, n concordan cu rata AT / GC din macromolecula de ADN, care servete ca matri. Adic, rata AU / GC, din ARN, este similar ratei AT / GC din ADN. n timpul transcripiei, numai una dintre cele dou catene ale ADN-ului este transcris n ARN. Este normal s fie aa deoarece, dac ARN-ul ar transcrie ambele catene, care sunt complementare, prin translaie ar rezulta polipeptide extrem de diferite. Pe de alt parte, sinteza ARN-ului se deruleaz ntr-o direcie fix, mereu aceeai - 5 3. Prin urmare, transcripia i translaia se deruleaz, mereu, n acelai sens. ntre timp a fost evideniat procesul migrrii ARN-ului de la ADN (care a servit, prin una dintre catenele sale, ca matri), prin porii membranei nucleare, spre ribosomi (spre zona citoplasmatic bogat n ribosomi). ARN-ul nou sintetizat prsete nucleul cam ntr-o or.

7.3. Gena definitie, structura si functie


Gena, ca noiune, a fost introdus n tiin de ctre Johannsen (ca i conceptul de genotip i cel de fenotip), n 1909. Conceptul de gen (de la grecescul gennao = a nate) a cunoscut o evoluie, trecnd prin cteva etape, pe care vom ncerca s le redm, sintetic, n rndurile urmtoare. Iniial, gena era conceput ca unitatea structural responsabil de determinismul fenotipizrii unui caracter. Ulterior s-a constatat c sunt multe caractere, cantitative, n fenotipizarea crora i aduc aportul mai multe gene (caractere cu determinism poligenic). Atunci s-a restrns coninutul noiunii, apreciindu-se c gena este responsabil de sinteza unei

enzime. Era concepia o gen = o enzim. Dar o enzim are dou componente clar difereniate o protein la care este ataat o grupare prostetic. Cele dou entiti fiind destul de deosebite, ca structur i funcie, era greu s se accepte c una i aceeai gen este capabil s determine sinteza a dou entiti att de diferite. Atunci s-a recurs la restrngerea i mai accentuat a conceptului, considerndu-se c o gen este responsabil de determinismul sintezei unei proteine. Era conceptul o gen = o protein. Dar, n acest caz, nu se putea explica determinismul sintezei altor biomolecule, inclusiv a acizilor ribonucleici. n consecin, cea mai adecvat definiie este urmtoarea : gena reprezint o secven de codoni (o secven de nucleotide) responsabil de determinismul sintezei unei biomolecule. Adic, sintetic exprimndu-ne, conceptuzl actual este o gen = o biomolecul. Cam n aceeai perioad (n jurul anilor 1900) medicul englez Archibald Garrod, studiind unele maladii metabolice umane (alkaptonuria, albinismul, cistinuria, pentozuria i porfinuria), a emis ipoteza o gen recesiv = un blocaj metabolic. n anul 1935, Beadle i Ephrussi, prin cercetri efectuate pe Drosophila melanogaster au sugerat i, apoi, demonstrat c mutaiile suferite de dou gene implicate n determinismul culorii ochilor, duc la blocaje n dou etape diferite ale sintezei pigmentului. Ulterior Beadle a experimentat, mpreun cu Tatum, pe Neurospora crassa reuind s demonstreze, din nou, c genele exercit un control asupra proceselor enzimatice de sintez. Dealtfel, aceste cercetri au contribuit la fundamentarea conceptului o gen = o enzim. Dar gena este nu numai o unitate funcional ci i una structural. i concepia despre structura genei a cunoscut o evoluie, n timp. Iniial se considera c genele sunt repartizate n cromosomi ca mrgelele pe o a. De aici decurgea concluzia c recombinrile sunt posibile doar ntre gene, ca identiti i nu i ntre subuniti ale genelor. Concret, genele erau considerate ca uniti structurale, funcionale i mutaionale. Dar, n 1940, Oliver a adus prima dovad c recombinarea poate fi i intragenic, nu numai intergenic. Apoi, n 1942, Lewis a efectuat testul de complementaritate, prin care s-a demonstrat efectul de poziie al unor subuniti ale genei. Adic, s-a demonstrat c dac dou subuniti ale genei se afl n poziia cis (sunt una n continuarea celeilalte, pe acelai cromosom), au cu totul alt efect fenotipic dect atunci cnd se afl n poziie trans (sunt pe ambii cromosomi omologi, una pe unul i cealalt pe cellalt dintre omologi). Descoperirea lui Lewis poart i numele de alelism de funcie sau test de complementaritate. Cnd dou mutaii ale aceleiai gene nu sunt comple-mentare n poziia trans, concluzia este c ele afecteaz aceeai funcie. Perin urmare, cele dou subuniti sunt repartizate n acelai grup de complementare. Un grup de complementare reprezint o unitate genetic discontinu care mai este denumit cistron. Dac se manifest comple-mentaritatea i n poziie trans, nseamn c mutaiile s-au produs n cistroni diferii. O excepie de la aceast regul se ntlnete atunci cnd genele determin sinteza unor polipeptide ce constituie sub-uniti ale proteinelor heteromultimere. n celula de tip slbatic, proteina activ este format din cteva subuniti identice. ntr-o celulce conine dou alele mutante, produii acestora pot interreaciona, dnd natere la proteine multimere, constituite din ambele tipuri de subuniti. Uneori, cele dou mutaii se compenseaz, proteina format din subunitile respective fiind activ, n timp ce proteinele constituite dintr-un singur tip de subunitate mutant sunt inactive. Acest fenomen a primit denumirea de complementaritate interalelic sau intragenic. Un alt aspect important, care trebuie s fie elucidat cnd se analizeaz caracteristicile genei, este acela al colinearitii dintre gen i produsul pe care-l determin. La procariote, colinearitatea este total. La eucariote, de obicei, genele sunt mult mai complexe i colinearitatea nu se mai poate realiza. Este tiut faptul c, n procesul transcripie-translaie, molecula de ARNm, care se sintetizeaz pe matria unei gene, prezint o secbven nucleotidic diferit de cea a genei, dar corespondent secvenei aminoacidice a proteinei pe care o determin. Gena conine secvene adiionale care nu se reg-sesc n molecula de ARNm. Altfel spus, gena este ntrerupt. De aceea, secvenele de ADN ce alctuiesc o gen ntrerupt, aparin la dou categorii exoni i introni. Exonii sunt cei copiai n ARNm. Intronii lipsesc din ARNm, fapt pentru care au fost considerate ca regiuni noninformaionale. n realitate, procesul de transcripie vizeaz ntreaga gen. Astfel ia natere un ARNm precursor, care sufer procese de rupere, eliminare a intronilor i resudare a exonilor, procese ce duc la formarea de ARNm matur, care va fi translat. Mutaiile localizate n diferii exoni ai unei gene nu sunt complementare. Evidenierea fenomenului de alelism multiplu i de recombinare interalelic a favorizat concluzia c mutaia i recombinarea nu respect graniele ce delimiteaz o anumit funcie a genei.

Gena are, n fapt, trei proprieti distincte i anume: funcia din lanul metabolic celular, mutabilitatea i capacitatea de recombinare. Seymour Benzer a propus o serie de trei termeni, tocmai pentru a denumi i delimita cele trei caracteristici ale genei. Astfel el a propus denumirile: MUTONUL cel mai mic segment de material ereditar care poate suferi o mutaie; RECONUL cel mai mic segment genic apt de a participa la recombinare; CISTRONUL unitatea de funcie a materialului ereditar, definit pe baza testului de comple-mentaritate. Aa cum am precizat anterior, substratul material al informaiei ereditare, deci implicit al genelor, sunt acizii nucleici acidul dezoxiribonucleic pentru majoritatea vieuitoarelor i acidul ribonucleic pentru ribovirusuri i viroizi. La nivel molecular, deci, att mutonul ct i reconul coincid cu perechea comple-mentar de nucleotide din ADN-ul dublu catenar. Prin urmare gena este constituit din mai muli mutoni i, respectiv, din mai muli reconi. Unii autori consider cistronul sinonim cu gena, n timp ce alii nu le consider similare. De exemplu, Arnold Ravin folosete noiunea de gen pentru a desemna secvena din catena de acid nucleic care controleaz producerea unei macromolecule specifice, din celul. n a-ceast accepie o gen poate fi constituit din mai muli cistroni, fiecare dintre ei avnd rolul de a codifica o subunitate a proteinelor multimerice (de exemplu).

7.4. Codul genetic


n paginile anterioare s-a demonstrat, fr dubii, c informaia ereditar este stocat n acizii nucleici, acizi responsabili i de transmiterea ei, de la parentali la progeni, n succesiunea de generaii. Dealtfel, n lumea specialitilor, este stabilit faptul c informaia ereditar, deinut de un individ, poate circula (poate fi transmis) pe dou canale unul n cadrul individului, n procesul fenotipizrii informa-iei deinute de genotip i unul n cadrul sistemelor succedente (populaiespecie, biocenoz), de la un individ la altul. n primul caz este vorba despre procesele de transcripie i translaie, n cel de al doilea caz este vorba, n principal, despre procesul reproducerii. C informaia ereditar este stocat n ma-cromoleculele de acizi nucleici nu mai sunt dubii. Se pune, ns, o ntrebare. Cum anume este stocat? Nici vorb nu poate fi despre o stocare ca atare, sub form de caractere. Informaia ereditar reprezint, n ultim analiz, un mesaj (n conformitate cu preceptele teoriei informaiei). Mesajul, la rndul su, reprezint o succesiune de simboluri convenionale: litere, cuvinte, sunete, linii, puncte, cifre etc. Ca atare, mesajul informaional este stocat i transmis prin intermediul simbolurilor. Unitate de baz a unei simbolizri o reprezint simbolul. Totalitatea simbolurilor aferente unui mesaj informaional, alctuiete un alfabet. Cea mai simpl relaie dintre simbolurile unui alfabet i un anumit coninut informaional este aceea n care unui eveniment, dintr-o diversitate informaional, i corespunde un simbol. Aceasta este o coresponden biunivoc. Dar, acest sistem de coresponden este greoi, fr flexibilitate. Mult mai eficient este un sistem n care un eveniment, dintr-o mulime de evenimente, este redat printr-o com-binaie de simboluri. Este cazul alfabetelor oricreia dintre limbile comunitii planetare, alfabete care conin, n medie, 30 de litere (simboluri) prin combinaia crora se poate forma un numr imens de cuvinte. Combinaia de simboluri prin care se poate defini un eveniment, dintr-o diversitate de evenimente, poart numele de cuvnt de cod. Prin conbinaii de cuvinte se pot alctui pro-poziii, fraze i, apoi, texte, n numr nelimitat. Din cele redate mai sus reiese, cu claritate, c orice in-formaie este stocat i, apoi, vehiculat codificat, printr-o succesiune de simboluri. Simbolurile, alfa-betul cuvintele de cod, alctuiesc codul unui tip de informaie. Altfel spus, codul reprezint sistemul informaional prin care este posibil redarea elementelor unei anumite diversiti. Pentru a fi descifrat i neleas, informaia trebuie s fie nu numai transmis i i recepionat i tradus, ntr-un sistem accesibil receptorului. De aceea, teoria informaiei vizeaz i legitile care guverneaz posibilitatea traducerii unui sistem de informaii n altul. De obicei, n sistemele tehnice, se folosete alfabetul binar, alctuit din dou litere (simboluri) 0 i 1. 0 nu reprezint absena a ceva ci o alternativ la 1. De exemplu, prin 0 i 1 putem reda stnga-dreapta, sus-jos, pozitiv-negativ etc. Succesiunea (cuvntul) 00110110, de exemplu, poate reprezenta un element dintr-o diversitate, elementul fiind specificat att prin numrul, ct i prin ordinea simbo-lurilor. Mai profund analizat aceast chestiune, rezult c sunt posibile doar

dou cuvinte alctuite din cte un simbol fiecare, patru cuvinte alctuite din cte dou simboluri (01, 10, 00 i 11) etc. Sunt, deci, 2 n cuvinte, alctuite din n simboluri (fiecare). Un mesaj este alctuit, n fond, dintr-un numr de cuvinte de cod care reprezint pri variabile, organizate i specificate, din diversitatea informaiei. Dar cum se pot interpreta procesele genetice prin prisma teoriei informaiei? Prezentm doar cteva argumente, din numeroasa suit a celor existente. n fond, att n cadrul unui sistem de nivel in-dividual (n procesul ontogeniei) ct i ntre sisteme de nivel individual (ntre parentali i progeni,n pro-cesul perpeturii speciilor), este vorba de transmiterea, recepionarea i materializarea unui mesaj infor-maional ereditar. Experiene multiple i din ce n ce mai sofisticate au demonstrat c suportul material, purttorul informaiei ereditare este Acidul dezoxiribonucleic (sau Acidul ribonucleic n cazul ribovirusurilor i al viroizilor). Dar, aa cum am precizat deja, ADN-ul nu conine, n macromolecula sa, o succesiune de caractere, ci informaia care determin fenotipizarea acestora, stocat codificat. Diversitatea fenotipic a speciilor de pe Terra i, n ultim instan a indivizilor unei populaii (specii), se realizeaz pe baza diversitii proteinelor i a altor biomolecule. Proteinele, la rndul lor, sunt constituite din cei 20 de aminoacizi existeni n lumea vie, prin asamblarea lor n ordine i cantiti diferite de la o protein la alta. Dar numrul i ordinea aminoacizilor dintr-o protein sunt dictate, pe anumite ci, de mesajele informaionale deinute de macromolecula de ADN. Cum anume se realizeaz aceast determinare, nu era posibil s se elucideze dect prin cunoaterea i aplicarea principiilor teoriei informaiei. Pe aceste baze s-au nscut i au fost definite noiunile de codon i cod genetic. 7.4.1. Codonul Bazele azotate care intr n compoziia ADN-ului i anume A, G, T i C, constituind nucleotidele AMP, GMP, TMP i CMP, reprezint literele alfabetului pentru codul genetic. Diversitatea proteinelor, specificat de combinaii ale acestor patru baze. Era necesar, doar, gsirea corelaiilor dintre respec-tivele combinaii i combinaiile de aminoacizi din proteine. Altfel spus, trebuia s se demonstreze, cum patru litere ale alfabetului genetic determin o diversitate de compoziii proteice prin asamblarea a 20 de aminoacizi. Prin urmare, codul genetic ar trebui s conin cel puin 20 de cuvinte, fiecare alctuit pe baza celor patru litere i fiecare fiind specific pentru un anumit aminoacid. Dac examinm cu atenie situaia, constatm c, atunci cnd relaia ar fi biunivoc, adic o liter s reprezinte un cuvnt, ar rezulta doar patru cuvinte : A, G, T i C. n acest caz, fiind vorba de 20 aminoacizi, 16 dintre acetia ar rmne nespecificai. Urmtoarea ans ar fi aceea a cuvintelor alctuite din dou litere. Aa s-ar obine 16 cuvinte i anume : UU UC UA UG CC CU CA CG AA AU AC AG GG GU GC GA

n aceast situaie ar rmne patru, dintre cei 20, aminoacizi nespecificai. Urmtoarea ans este aceea n care, pentru un cuvnt de cod, sunt utilizate trei litere (simboluri). Astfel rezult 64 de cuvinte de cod i anume:

Prima nucleotid U

U UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC

A doua nucleotid C A UCU UAU UCC UAC UCA UAA UCG UAG CCU CAU CCC CAC CCA CAA CCG CAG ACU AAU ACC AAC

G UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC

A treia nucleotid U C A G U C A G U C

AUA AUG GUU GUC GUA GUG

ACA ACG GCU GCC GCA GCG

AAA AAG GAU GAC GAA GAG

AGA AGG GGU GGC GGA GGG

A G U C A G

Dar, reamintim, n lumea vie exist numai 20 de aminoacizi. Prin asocierea a trei litere ntrun cuvnt, rezult mult mai multe cuvinte, dect ar fi necesar. Mai exact sous rezult 64 de codoni. Aceast contradicie se rezolv, aa cum vom vedea n continuare, prin caracterul degenerat al codului genetic. Se mai impune, odat ajuni la acest punct, nc o precizare. n paginile anterioare am menionat, continuu, c la eucariote informaia ereditar este stocat pe macromolecula de ADN. De aceast dat, preciznd care sunt cei 64 de codoni, am inserat ntotdeauna U i nu T, adic am inserat o nucleotid specific ARN-ului i nu una specific ADN-ului. Atunci se nate, n mod firesc, ntrebarea genele se afl n ADN sau n ARN? Problema i va gsi rspunsul atunci cnd vor fi discutate procesele transcripiei i translaiei. 7.4.2. Caracteristicile codului genetic Am demonstrat, credem noi, c un codon nu poate fi alctuit din mai puin de trei litere de cod. Totodat am precizat c s-a ajuns la o dilem: prea muli codoni pentru cei 20 de aminoacizi. Aceast contradicie se rezolv prin caracteristica codului genetic de a fi degenerat. nainte de a discuta aceast calitate, menionm toate caracteristicile codului genetic i anume: triplet, nesuprapus, fr semne de punctuaie ntre codoni, degenerat i universal. C un cuvnt de cod este cu necesitate triplet, s-a demonstrat n rndurile anterioare. Ceea ce nu s-a discutat, ns, este faptul dac un simbol (o liter de cod) aparine la doi codoni adiaceni sau nu. Adic se pune problema dac codul genetic este cu acoperire sau nu. Acoperirea, la rndul ei, poate fi total sau parial. Dac doi codoni adiaceni ar avea dou nucleotide n comun, acoperirea ar fi total. Dac doi codoni adiaceni ar avea doar o nucleotid n comun, acoperirea ar fi parial. Dar, toate verificrile efectuate, prin diferite metode, au demonstrat c este vorba despre un cod genetic fr acoperire, adic doi codoni adiaceni nu au nucleotide n comun. Altfel spus, codul genetic este nesuprapus, adic doi codoni adiaceni nu se suprapun pe dou sau pe una dintre nucleotide. Mai mult dect att, ntre doi codoni adiaceni nu exist una sau mai multe nucleotide spaiatoare. Adic, codul genetic este fr semne de punctuaie. Dar s exemplificm. S presupunem c, ntr-o caten de acid nucleic exist urmtoarea secven de nucleotide : CUUCCUCAUCGUAUUACUAAUAGU. n cazul codului cu acoperire total, codonii ar fi: CUU, UUC, UCC, CCU, CUC, UCA.etc. n cazul codului cu acoperire parial codonii ar fi : CUU, UCC, CUC, CAU.etc. Dac ntre codoni ar exista semne de punctuaie, codonii ar fi : CUU, CUC, UCG, AUU etc. Dar, n realitate, codonii sunt : CUU, CCU,CAU, CGU, AUU, ACU, AAU, AGU. n concluzie, putem afirma : codul genetic este triplet, fr acoperire i fr semne de punctuaie ntre codoni. Argumente pentru codul genetic triplet, fr acoperire, au fost aduse prin experimente de mutagenez. Dac o nucleotid ar aparine la doi codoni adiaceni, o mutaie punctiform care ar afecta respectiva nucleotid, ar efecta doi codoni i, n consecin, ar semnifica schimbarea a doi aminoacizi n lanul polipeptidic. Dar, n experimentele efectuate, aa ceva nu s-a semnalat. Dar ce se nelege prin cod genetic degenerat? Codul genetic degenerat presupune existena a dou categorii de codoni. Unii dintre acetia, mai precis 3 dintre cei 64, sunt codoni nonsens sau codoni stop, codoni care stopeaz procesul de translaie al unei gene. Acetia sunt UAA (numit ochre), UAG (numit amber) i UGA (numit opal). Numele codonilor stop provin de la numele unor clase de mutani de la bacteriofagi. Astfel, din cei 64 de codoni, au mai rmas funcionali 61. Acetia se caracterizeaz prin aceea c, mai muli dintre ei, pot specifica unul i acelai aminoacid. Aa cum rezult din tabel, unii aminoacizi sunt specificai de ase codoni diferii, alii de cinci, patru sau trei, doi ssau numai de un codon (cum este metionina). Acesta este un subiect asupra cruia trebuie reflectat care este semnificaia repartiiei att de inegale a codonilor per aminoacid?

Degenerarea codului genetic este asigurat prin schimbarea nucleotidei din poziia II-a sau a III-a din codon. Se pare c nucleotida din poziia I este inamovibil, n cadrul unui codon Universalitatea codului genetic reprezint o alt caracteristic a sa. Prin universalitate se ne-lege c, indiferent de specie (microorganism, plant sau animal), un anumit aminoacid este specificat de aceeai codoni. Afirmaia se bazeaz pe experimente efectuate att in vivo ct i in vitro. De exemplu, in vitro, utilizndu-se un mediu acelular alctuit din ribosomi prelevai din reticulocite tinere de iepure i ARNs de Escherichia coli, a fost posibil sintetizarea de hemoglobin de iepure. Dac mediul acelular este alctuit din ribosomi extrai din ficat de obolan i ARNs de Escherichia coli i poli U, se sintetizeaz polifenilalanina. ntr-un mediu acelular de Escherichia coli, s-a reuit sinteza proteinei specifice capsidei virusului poliomelitei, dac s-a introdus un ARN purificat, din virusul poliomelitei. Dar cele mai elocvente argumente au fost furnizate de experimente n care s-a introdus ADN specific unei specii, n indivizi aparinnd altei specii, reuindu-se sinteza proteinelor specifice primei specii. Indiferent de sursa din care este extras ADN-ul i indiferent de gazda n care este introdus, el are capacitatea de a determina sinteze proteice specifice sursei i, n plus, are capacitatea de a se replica semiconservativ, n gazd. Prin urmare codul genetic este universal i macromoleculele de ADN dein informaia ereditar.

7.5. Transcriptia si translatia informatiei ereditare


Am demonstrat, deci, c informaia ereditar este stocat, codificat, n macromoleculele de ADN (cu excepia ribovirusurilor i a viroizilor). Dar indivizii au un fenotip n care-i etaleaz trsturile specifice. Cum se asigur transferul de informaie de la genotip la fenotip, prin ce mecanisme se materializeaz informaia ereditar stocat, codificat, n ADN? Procesul poart numele de translaie i presupune traducerea ordinii i numrului codonilor dintr-o gen, n ordinea i numrul aminoacizilor dintr-o protein. Procesul cunoate o succesiune de etape n care sunt implicate, pe lng enzime specifice, macromoleculele de ADN i macromoleculele de ARN (mai precis cele de ARNm, ARNs i ARNr adic acizii ribonucleici mesager, solubil sau de transfer i cel ribosomal). Pentru a nelege rolul fiecrei componente n acest complicat proces, este necesar elucidarea unor aspecte eseniale ale structurrii i funcionalitii lor. Reamintim c ADN-ul are structur bicatenar, fiecare caten fiind un polinucleotid. Cele dou catene, care se rsucesc elicoidal i jurul unui ax imaginar, sunt meninute mpreun, prin intermediul punilor de hidrogen, duble ntre adenin i timin i triple ntre guanin i citozin (A = T, G = C). Pe una dintre catene, numit convenional catena sens, sunt cantonate genele, alctuind grupele de linkage (o grup de linkage = un cromosom). Cealalt caten poart numele de caten antisens. Aa cum precizam anterior, n definiia pe care am dat-o pentru gen, gena asigur inclusiv sinteza macromoleculelor de ARN. Evident, n cazul acestor macromolecule, procesul se petrece pe principiul complementaritii bazelor. Intervine ns, aici, o modificare, n sensul c, n dreptul adeninei nu se mai inser timina, ci uracilul. O alt diferen, n constituia acizilor ribonucleici, fa de ce a acidului dezoxiribonucleic, const n aceea c, n loc de dezoxiriboz este riboza. Reamintim c acizii ribonucleici sunt de trei tipuri: acid ribonucleic mesager (ARNm), acid ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs sau ARNt) i acidul ribonucleic ribosomal (ARNr), cu structuri i funcii bine definite n procesele transcripiei i translaiei informaiei ereditare. 7.5.1. Acidul ribonucleic mesager (ARNm) Deine unul dintre principalele roluri n procesele transcripiei i translaiei informaiei ereditare. Menionam c n ADN exist o caten sens i una antisens i c pe catena sens se afl cantonate genele. n timpul autoreplicrii semiconservative a ADN-ului, anterior sintezei catenelor complementare, are loc sinteza macromoleculelor de ARN. Acidului ribonucleic mesager i revine rolul de a copia, de a transcrie informaia ereditar coninut n genele de pe ADN. De fapt nu este o simpl transcriere, o transcriere liter cu liter a respectivei informaii deoarece, aa cum am precizat anterior, are loc o nlo-cuire (n toate poziiile) a timinei cu uracilul.Prin urmare putem vorbi de o prim conversie, de o prim traducere, parial este drept, a secvenelor nucleotidice din ADN n secvenele nucleotidice din ARN. Se pune, firesc, o problem. Dac informaia ereditar este

stocat doar pe una dintre catenele ADN, for-marea ARN folosete ca matri ambele catene ale ADN, numai una dintre ele i pe care anume? Opiniile recente converg ctre concluzia c, pentru a deine informaia ereditar similar celei stocate pe catena sens a ADN, innd cont de faptul c ARNm se sintetizeaz pe principiul comple-mentaritii bazelor, este obligatoriu ca el s se formeze pe catena antisens. Dac s-ar forma pe catena sens, informaia pe care ar deine-o ar fi similar celei de pe catena antisens. Dovezi concludente n privina modului de asamblere a macromoleculei ARN, au fost furnizate de punerea n eviden a existenei hibrizilor ADN-ARN. Numele de mesager i-a fost dat de laureaii premiului Nobel, francezii Monod i Jacob, n 1961, datorit asemnrii lui puternice cu ADN-ul, datorit marii sale instabiliti i, mai ales, datorit rolului specific n procesul sintezei proteice. 7.5.2. Compoziia i organizarea ARNm Compoziia nucleotidic a catenei de ARN m este complementar celei a ADN pe baza creia s-a asamblat. n consecin, compoziia sa, ca ordine i cantitate a diferitelor nucleotide, este extrem de va-riabil, variabilitate legat de sursa din care se extrage, pe de o parte, ct i de poriunea din ADN pe care a copiat-o, pe de alt parte. ARN-ul mesager mai este cunoscut i sub numele de ARN informaional, sau ARN translocator, deoarece are rolul de a prelua informaia ereditar coninut n ADN i a o transfera n pro-teine. Aa cum am specificat anterior i cum reiese din tabelul 3, ARN-ul, indiferent c este mesager, transportor sau ribosomal, conine nucleotidele A, G, C i U, neavnd niciodat T. Acest fapt se datorea-z modalitii de constituire (sintetizare) a macromoleculelor de ARN, .pe matria ADN, respectnd prin-cipiul complementaritii bazelor, dar, complementara A fiind ntotdeauna U i nu T. Astfel, dac catena ADN-ului va fi AAATCGTTGGACAGCATA, catena complementar de ARN va fi UUUAGCAAC-CUGUCGUAU. Transcripia, n cazul formrii macromoleculei de ARNm, se petrece dup modelul: ADN 5 3 TGCAGCTCCGGACTCCAT.. ACGTCGAGGCCTGAGGTA. 3 5 Transcripie 5 3 UGCAGCUCCGGACUCCAU ARNm Aa cum am precizat anterior, catena de ADN pe care este stocat, codificat, informaia eredi-tar, este catena sens (cea de sus, n schia anterioar), iar ARN m se formeaz pe catena nonin-formaional (catena antisens sau nonsens, catena de jos, n schia anterioar). Reamintim c nucleo-tidele din care se constituie molecula ARN sunt ribonucleotide, adic au riboz n componena lor i nu dezoxiriboz, cum au nucleotidele din componena ADN. ARNm reprezint aproximativ 3% (ntre 2,5% i 5%) din totalul de ARN din celule. Greutatea molecular a ARNm este cuprins ntre 100.000 i 200.000 daltoni. Locul sintezei sale este, evident, nucleul celular. Asamblarea catenei de ARN, pe baza complementaritii cu catena ADN, se realizeaz sub aciunea enzimei polimeraza ARN dependent de ADN. Dei are o durat de via destul de scurt, pentru a-i menine stabilitatea structural i funcional, ARNm este asociat cu o protein protectoare, numit informozom (care-l protejeaz de activitatea enzimelor degradante). S-au constatat corelaii clare ntre prezena ARN m i procesul sintezei proteice, att n medii acelulare ct i n celule. Afirmaia se bazeaz pe experimente efectuate n mediu acelular, cu un ames-tec de ribosomi, ARNs i aminoacizi marcai, la care s-a adugat i ARNm (toate extrase din Escherichia coli). Dup adugarea ARNm, viteza ncorporrii de aminoacizi n lanul

polipeptidic, a crescut de peste 20 de ori. De exemplu, dac ntr-un sistem ribosomal se introduce acid poliuridilic, se induce sinteza unui lan de polifenilalanin. S-a demonstrat, apoi, c acidul poliuridilic este un ARNm care, la o greutate mo-lecular de 105, conine cca. 300 nucleotide i are o lungime de aproximativ 1.000 , cu distana dintre nucleotide de 3,4 . Concluzia a fost c ARNm servete ca matri pentru asamblarea lanului polipeptidic. Pe de alt parte s-a demonstrat c, n cazul ARNm, distana dintre nucleotide poate ajunge chiar la 6,8 . Printre caracteristicile definitorii ale ARNm menionm: metabolizarea rapid n cadrul celulei; compoziia nucleotidic complementar uneia dintre catenele ADN, dar similar celeilalte, n cazul n care ambii acizi nucleici provin din aceeai surs; greutate molecular extrem de heterogen; capacitate de a stimula sinteza de proteine, proces n care are rolul de matri pe care se ataeaz unitile ribosomale (formnd polisomii sau poliribosomii). Complexul poliribosomal rezist la dezintegrarea produs de scderea concentraiei de ioni de magneziu i sedimenteaz, la centrifugare, mult mai rapid dect ribosomii singulari. S-a constatat, de asemenea, o corelaie direct ntre mrimea complexului poliribosomal i viteza asamblrii lanului poli-peptidic. Prin marcare cu izotopi radioactivi s-a demonstrat, fr echivoc, c lanurile polipeptidice ns-cnde sunt legate de poliribosomi. Deoarece polisomii, reprezentnd sediul sintezei proteice intra-celulare, consum cantiti mari de energie (pe parcursul procesului de sintez proteic), au mai primit i numele de ergosomi. Bazele purinice i pirimidinice, din macromolecula de acid ribonucleic mesager, sunt dispuse pe o singur parte a axei glucido-fosforice, perpendicular pe aceasta. 7.5.3. Compoziia i structura macromoleculei de ARNs Acidul ribonucleic solubil (numit, n unele tratate, acid ribonucleic transportor - ARNt), este mult mai puin variabvil, att ca numr de nucleotide ct i, implicit, greutate molecular, prin comparaie cu ARNm. n medie, ARNs este alctuit din 67 de nucleotide (ntre 67 i 85 de nucleotide), i are o mas molecular de aproximativ 25.000 daltoni. Dar, ceea ce este mai important, acidul ribonucleic solubil poate prezenta i o structur secundar, n sensul c nu rmne tot timpul monocatenar. Una dintre explicaiile apariiei structurrii secundare este aceea c bazele azotate din lungul catenei poli-nucleotidice interacioneaz i dau natere la poriuni dublucatenare elicoidale, alternnde cu poriuni monocatenare. Pe de alt parte, poriunile monocatenare nu rmn liniare ci se bucleaz.. Aceast con-formaie explic proprietile aparte ale acestui acid ribonucleic. Uneori, moleculele de ARNs pot avea i structurare teriar. Spre exemplu, moleculele de ARNs de la Escherichia coli, precum i cele izolate din unele drojdii (Fig. 31), au conformaii reversibile, care se deosebesc ntre ele sub aspectul activitii biologice, comportamentului cromatografic, proprietile optice i hidrodinamice etc. Rolul ARNs, n procesul sintezei proteice, este acela de a transporta acizii aminai la poliribosomi. A fost descoperit n 1960, de ctre Allen i Shweet, fiind unul dintre acizii ribonucleici cel mai bine studiai. S-a stabilit, de pild, c au n compoziia lor o cantitate apreciabil de baze rare, cum ar fi deri-vaii metilai de substituie : pseudouridina, riboziltimina, N-6-metiladenozina etc. Se apreciaz c aceste baze rare contribuie decisiv la asigurarea conformaiei tridimensionale a ARNs, conferindu-i o mai mare rezisten la aciunea hidrolitic a nucleazelor celulare. Structura primar a acidului ribonucleic trans-portor extras din drojdii, care specific alanina, a fost stabilit de ctre Holley i colaboratorii si, n 1965. Ulterior, n 1968, s-au descris acizii ribonucleici transportori pentru valin i serin, de ctre Zachau i colaboratorii, precum i de Baev i colaboratorii (n mod independent). ARNs reprezint aproximativ 10-15% din totalul de ARN celular. Polimorfismul accentuat al aces-tui tip de acid ribonucleic se datoreaz faptului c, avnd rolul de transportor, pentru fiecare aminoacid (din cei 20 cunoscui) exist un ARN t specific. Diferenele dintre moleculele de ARN t rezid, n principal, n componena tripletei nucleotidice, plasat n situsul cunoscut sub numele de anticodon sau nodoc.

Fig. 31 Molecula de ARNt de la Saccharomyces cerevisiae (reconstituire)

Pe de alt parte, ca factor uniformizator, macromoleculele de ARN t au, fr excepie, gruprile terminale ale lanurilor polinucleotidice identice: la unul dintre capete au acid guanilic (G), cu hidroxilul de la C5 esterificat, iar la cellalt capt au adenozina, naintea ei fiind dou grupri citidilice (CCA). Sunt unele preri n conformitate cu care gruparea C-C-A este responsabil de activarea aminoacizilor implicai n procesul sintezei proteice, n ultima sa faz translaia informaiei ereditare. Aminoacizii sunt ataai, la macromolecula de acid ribonucleic transportor, prin legturi nalt energetice, care se stabilesc ntre gruparea carboxil a aminoacidului i hidroxilul terminal 3 al acidului ribonucleic. ARNt este activat i legat cu aminoacidul, n dou etape succesive, catalizate de aceeai enzim aminoacil-ARNt-sintetaza. Complexul AA~AMP nu este eliberat, de ctre enzim, nainte de a se derula i cea de a doua etap cea a legrii ARNt. Complexul AA~ARNt reprezint substratul pentru sinteza polipeptidic, n complexul poliribosomal. 7.5.4. Compoziia i structura ARNr ARNr este sintetizat pe secvenele moderat repetitive ale ADN-ului cunoscute i sub numele de ADNr. n celulele eucariotelor s-au identificat milioane de ribosomi, fiecare dintre acetia posednd c-teva molecule de ARNr, alturi de proteine ribosomale. n interfaza diviziunii celulare, clusterii de ADNr formeaz o structur neregulat, ca form, numit nucleol, a crei funcie este aceea de a produce ri-bosomi. Poriunea din cromosom car conine ADNr este cunoscut sub numele de organizator nucleolar. Pe parcursul diviziunii mitotice nucleolii dispar i reapar n nucleii celulelor fiice. La microscopul electronic, masa nucleolului apare format din particule cu diametrul de 15 20 nm, fapt pentru care nucleolul are aspect granulat. Examinndu-se nucleolii din oocitele amfibienilor, s-a evideniat existena unui miez fibrilar, prin a crui dispersie se relev prezena unor fibrile circulare. Examinarea acestora la microscopul electronic a dezvluit asemnarea lor cu un pom de Crciun (Christmas tree). Ribosomii eucariotelor conin patru tipuri de ARNr, trei dintre acestea fiind prezente n subunitile mari, cealalt fiind prezent n subunitatea mic. La om, de exemplu, subunitatea ribosomal mare conine trei molecule de ARNr cu constante de sedimentare de 28S, 5,8S i 5S, iar subunitatea ribosomal mic conine cea de a patra molecul de ARNr cu constanta de sedimentare de 18S. Tipurile de ARNr 28S, 18S i 5,8S deriv dintr-un transcript primar numit preARNr, n timp ce tipul 5S este sintetizat separat, n afara nucleolului. Nucleolul nu este doar sediul sintezei ARNr, ci i locul de asamblare a celor dou subunitpi ribo-somale. Pe parcursul procesului de producere a moleculelor de ARN, s-a identificat prezena

a dou tipuri de proteine care se asociaz cu ele i anume : un tip care va rmne ataat de moleculele ARNr, intrnd n structura subunitilor ribosomale i un tip aparinnd nucleolului, caracterizat prin relaii tem-porare cu intermediarii ARNr. Aceste proteine sunt indispensabile pentru prelucrarea precursorilor ARNr, deoarece, mpreun cu enzimele, asigur clivajul precursorilor ARNr. Genele care codific ARNr 5S sunt separate total de cele care codific celelalte tipuri de ARNr, fiind plasate n afara nucleolului. Aceste gene sunt organizate n tandemuri, n care poriunile ce sunt transcrise alterneaz cu poriuni netranscrise, poriuni spaiatoare, formnd uniti repetitive. 7.5.5. Translaia informaiei ereditare (sinteza proteinelor) 7.5.1.1. Rolul ARNt i procesul activrii aminoacizilor Am demonstrat, n paginile anterioare, c informaia ereditar este stocat i perpetuat, n irul generaiilor eucariote, codificat (n secvena nucleotidelor) la nivelul macromoleculelor de ADN. ntrebarea care se pune este urmtoarea: cum are loc transferul informaiei deinut n ADN, n informaia specific proteinelor (secvena aminoacidic a acrestora), pe parcursul ontogenezei indivi-duale? Adic se cere elucidarea proceselor prin care informaia codificat n secven nucleotidic se ma-terializeaz n informaie redat prin secven de aminoacizi. Rspunsul la aceast tulburtoare ntrebare a fost descifrat n deceniul ase al secolului 20, de Crick. Acesta a presupus c transferul de informaie are loc prin intermediul unei molecule adaptoare, capabil s traduc numrul i ordinea nucleotidelor, n numr i ordine a aminoacizilor. Crick era de prere c pentru fiecare aminoacid exist un adaptor i c, prin intermediul acestuia, o secven spe-cific de baze azotate poate fi translat ntr-o secven definit de acizi aminici. La scurt timp dup lan-sarea acestei prezumii, a fost descoperit un nou tip de ARN i anume ARNs (sau ARNt), n faza solubil a citoplasmei. Foarte repede a fost demonstrat rolul de adaptor al acestui tip de ARN. Apoi s-a demonstrat c ARNt are capacitatea de a recunoate dou tipuri diferite de molecule : att ARNm ct i aminoacizii. Rmnea, doar, s se explice cum au loc aceste recunoateri. Descifrarea structurii ARNt, nb primul rnd, a sugerat c aceasta face posibil existena celor dou funcii de recunoatere. n 1975, dup 7 ani de investigaii, Holley (de la Universitatea Cornell SUA), prezenta organizarea unei molecule de ARNt molecul responsabil de transferul aminoacidului alanin la locul sintezei proteice. Respectiva molecul are o secven de 77 nucleotide, 10 dintre acestea fiind baze azotate modificate. Dup aceast descoperire au urmat altele i a devenit evident faptul c toate macromoleculele de ARNt au cteva caracteristici comune i anume : dimensiuni mici, date de 73 93 nucleotide; proporie semnificativ de baze azotate neobinuite, rezultate prin modificarea enzimatic a celor patru baze azotate normale U, C, A, G, dup ncorporarea lor n caten; complementaritatea secvenei n anumite regiuni, complementaritate ce permite rea-lizarea unei structuri bicatenare ntre respectivele regiuni, asigurndu-se o conformaie monocatenar, alternant cu una bicatenar, care mbrac, n mare, aspectul unei frun-ze de trifoi; posibilitatea de a lega un aminoacid, ntotdeauna, la adenina situat la captul 3OH al catenei, regiune care poart denumirea de bra acceptor; prezena bazelor azotate modificate la nivelul buclelor monocatenare, servesc drept situ-suri de recunoatere pentru enzime; capacitatea de a adopta o structur teriar unic i foarte bine definit (ca i n cazul structurii teriare a proteinelor, prin formarea de legturi ntre diferite regiuni ale moleculei). Caracteristicile menionate, mai sus, reflect participarea moleculelor de ARNs n etapele complexe ale sintezei proteice. Pe de alt parte, moleculele de ARNs trebuie s poat fi difereniate de ctre enzimele care iau parte la sinteza proteinelor, astfel nct fiecare aminoacid

s fie legat la ARNs corespunztor. ARNs are deci responsabilitatea de a citi mesajul nucleotidic al moleculei de ARNm, asigurnd astfel translarea sa n secvena polipeptidic. Recunoaterea ntre molecula ARNs i un anumit codon din ARNm, este acompaniat de formarea legturilor de hidrogen ntre moleculele de baze azota-te complementare, existente n anticodonul din ARNs i codonul din ARNm. Prin urmare, n timpul sin-tezei proteinelor, unul dintre momentele de o importan major este ataarea corect a amino-acidului potrivit la molecula ARNs potrivit. Enzimele care cupleaz aminoacidul la captul 3-OH al moleculei de ARNs, prin legturi cova-lente, poart numele de aminoacil-ARNs-sintetaze. Fiecare aminoacid este recunoscut de ctre o aminoacil-ARNs-sintetaz specific, capabil s asambleze complexul AA-ARNs. Aminoacil-ARNs-sinte-tazele reprezint un exemplu de specificitate a interaciunii protein-acid nucleic. Aceste enzime consti-tuie o categorie extrem de heterogen de proteine, care par s fi evoluat din proteine ancestrale, extrem de diferite la rndul lor. Este posibil ca aceste enzime s fi aprut n stadiile timpurii ale evoluiei, nain-tea apariiei multor alte componente ale complexului de sintetizare a proteinelor. Aminoacil-ARNs-sintetazele catalizeaz o reacie n dou etape. n prima etap a acestui proces, desemnat prin denumirea activarea aminoacizilor, energia deinut de ATP este utilizat pentru formarea unui aminoacid adenilat, care va fi cuplat la enzim. Acesta este, dealtfel, primul proces care necesit energie, din complexitatea proceselor de sintez pro-teic. n etapa urmtoare, aminoacidul este transferat la molecula de ARNs. Pirofosfatul, PPi, care a fost format n prima etap, este hidrolizat la fosfat anorganic. Datorit mecanismelor de verificare posedate de enzim, n cazul n care se constituie un complex AAARNs greit, enzima se reactiveaz i hidro-lizeaz legtura format ntre AA i ARNs. Prerile referitoare la molecula care este recunoscut de ctre ARNm, adic dac este vorba de ARNs sau de aminoacid, au fost deosebit de contradictorii. Dovezile experimentale au fost furnizate de experimentele efectuate de ctre Lipmann i colaboratorii si, experimente n care a fost alterat (chimic) aminoacidul deja cuplat la ARNs specific (Fig. 32).

Fig. 32 Etapa recunoaterii ARNt cu aminoacidul activat

n experimentul redat n figura anterioar, a fost utilizat ARNt la care s-a cuplat cisteina (ARNt cistein). Cisteina a fost ulterior convertit la alanin i s-a urmrit eficiena cu care are loc ncorporarea aminoacidului n catena polipeptidic. Trecerea cisteinei n alanin, dup ataarea sa la ARNt specific pentru cistein, nu a avut nici un efect. Rezult c secvena de recunoatere a ARNt, reprezentat prin anticodonul su, a rmas nealterat i, n consecin, alanina (obinut din cistein) va fi inserat, n lanul polipeptidic, n locii indicai de anticodonul

pentru cistein, pe baza recunoaterii codonilor din ARNm. Se va obine, astfel, un lan polipeptidic modificat n consecin. S-a demonstrat, astfel, fr echivoc, faptul c molecula recunoscut la nivelul ARNm este ARNt (prin intermediul sec-venei sale anticodon) i nu aminoacidul. Sinteza proteinelor (procesul translaiei propriuzise) reprezint una dintre cele mai complexe acti-viti ale metabolismului celular. Complexitatea acestui proces este datorat i faptului c, n el, sunt im-plicate numeroase componente. Astfel, n context, reamintim : diferitele tipuri de ARNt, ncrcate cu aminoacizii specifici, ARNm, ARNr i ribosomii, proteine, enzime cu funcii specifice, cationi, GTP etc. ntruct procesul sintezei proteice, dei urmeaz n principiu aceleai etape, este mai complicat la euca-riotele superioare, vom prezenta principalele lui momente ntr-o celul bacterian. Cea mai important diferen, fa de ceea ce se petrece ntr-o celul eucariot superior organizat, const n faptul c translaia implic un numr mult mai mic de uniti proteice ribosomale cu funcii specifice. n esen, procesul sintezei unui lan polipeptidic, poate fi divizat n trei etape, delimitate n funcie de evenimentele specifice care au loc pe parcursul lor i anume : - iniierea sintezei catenei polipeptidice; - elongarea catenei polipeptidice; - terminarea sintezei. Procesul translaiei debuteaz de la codonul de start, de la codonul iniiator. Aa cum rezult din figurile urmtoare, este deosebit de important ca ribosomul s fie corect ataat la nivelul ARNm. Altfel translaia nu poate debuta de la nivelul codonului iniiator (Fig. 33). S-a constatat c interaciunea dintre ARNm i ribosom are loc cu mult nainte ca acesta din urm s fie complet format, aa nct cuplarea se realizeaz, n fapt, ntre ARNm i unitatea ribosomal mic. Legtura se realizeaz ntre ARNm i respectiva subunitate, la nivelul codonului iniiator de pe molecula ARNm, codonul AUG. Ar fi deosebit de interesant s se stabileasc modul n care unitatea ribosomal este capabil s deceleze poziia codonului iniiator, ntre multitudinea de codoni AUG existeni pe catena ARNm. Cercetrile ntreprinse n aceast direcie au stabilit faptul c ARNm de la procariote conine o secven specific de baze azotate, situat cu 5 pn la 10 nucleotide nainte de codonul iniiator AUG. Aceast secven a primit denumirea de secven Shine-Dalgarno (dup numele celor ce au descoperit-o) i este complementar unei secvene nucleotidice aflat la captul 3 al ARNr 16S, din subunitatea ribosomal mic: ARNr .ACCUCCUUUA3 ARNm GGAGGA5 Recunoaterea codonului iniiator se realizeaz prin interaciunile ce au loc ntre aceste secvene, complementare, de la nivelul ARNm i ARNr 16S, aa c subunitatea ribosomal mic se va putea cupla cu mesagerul. La eucariote, subunitatea ribosomal mic va recunoate mai nti captul 5 al ARNm, capt bonetat cu metilguanozin. Ulterior, aceast subunitate va scana ARNm, pn ce va ntlni o secven de nucleotide care va conine tripleta AUG, care funcioneaz drept codon iniiator. De obicei, secvena de nucleotide este 5CCACCAUGC3. n 90% din cazuri, moleculele de ARNm de la eu-cariote au codonul iniiator AUG, iar proteina sintetizat nu posed metionin, n catena sa primar. Codonul AUG nu este doar codon iniiator ci i unicul codon care specific metionina, n lanul polipeptidic. Din acest motiv metionina (formil-metionina la procariote) va fi ntotdeauna primul aminoacid de la captul N-terminal al unei catene polipeptidice. n cadrul proteinelor mature, n 50% dintre cazuri, prima metionin este ndeprtat enzimatic. n celule se ntlnesc dou tipuri de ARNt pentru metionin i anume : ARNtiMet, care va fi folosit la iniierea sintezei i ARNtMet, care va fi folosit ori de cte ori trebuie introdus metionina n catena polipeptidic. Un aspect foarte interesant este datorat faptului c, n mitocondrii i n cloroplaste, iniierea sintezei proteice are loc cu fMet, cu toate c acest aminoacid nu este folosit i pentru iniierea sintezei proteice la nivelul ribosomilor citoplasmatici ai eucariotelor. Aceast constatare se constituie ntr-un argu-ment forte al ipotezei privind originea procariot a acestor organite. Subetapele procesului de iniiere reclam prezena unor proteine ajuttoare solubile, numite factori de iniiere (notate IF la procariote i eIF la eucariote). De exemplu, la eucariote, eIF4E

este factorul de iniiere care se cupleaz cu captul 5 al ARNm, n vederea medierii interaciunii ntre mesager i subunitatea ribosomal mic.

Fig. 33 Formarea complexului de iniiere (A) i ribosomul complet asamblat (B)

Pe lng prezena factorilor de iniiere, debutul sintezei proteice este dependent i de prezena GTP-ului. O molecul de GTP este cuplat cu ARNt iMet nainte de cuplarea acestuia cu subunitatea ribosomal mic. Odat ce ARNt iniiator este ataat, subunitatea ribosomal mare se altur complexului, factorii de iniiere sunt eliberai, iar GTP-ul este hidrolizat. Hidroliza GTP-ului conduce, probabil, la modificarea conformaional a ribosomului, necesar pentru iniierea sintezei. Fiecare ribosom, complet asamblat, va prezenta dou situsuri pentru asocierea ARNt (aspect ce iese n eviden n figura anterioar). Aceste dou situsuri, denumite situsul A (aminoacil) i situsul P (peptidil), au roluri diferite n procesul de translaie. Se presupune c mai exist nc un situs, situsul E (exit). Situsul A este locul n care va fi ncrcat, de fiecare dat, un nou complex ARNt AA, specificat dde codonul cantonat pe ARNm, iar situsul P va dona aminoacidul cuplat la ARNt, situat la acest nivel, catenei polipeptidice n cretere. Singurul ARNt care poate fi plasat la nceput, n situsul P, este ARNtiMet. Din moment ce situsul P este ocupat de ARNt iniiator, ribosomul este apt i disponibil pentru a prelua un al doilea ARNt cuplat cu un aminoacid (al doilea aminoacil-ARNt), la situsul A, declanndu-se, astfel, primul pas n procesul de elongare (Fig. 34). nainte ca ansamblul aminoacil-ARNt s fie plasat n situsul A, acest complex va trebui s se combine cu una dintre proteinele din categoria factorilor de elongare (elongation factors, n limba englez), cum ar fi : EF-Tu la procariote, sau eEF1 la eucariote. Aceti factori de elongare sunt cuplai, la rndul lor, cu GTP-ul.

Dei, n principiu, oricare complex aminoacil-ARNt poate fi plasat n situsul A, ncrcarea stabil nu va putea avea loc dect pentru acel complex al crui anticodon este complementar codonului ARNm aflat n situsul A. Odat ce complexul aminoacil-ARNt-EF-Tu-GTP s-a legat la ARNm, la nivelul unui codon, GTP-ul este hidrolizat i complexul EF-Tu-GDP eliberat. De asemenea, complexul EF-Tu-GTP-aminoacil-ARNt, va fi regenerat. Cea de a doua faz, a procesului de elongare, const n formarea unei legturi peptidice. ntre aminoacizii cuplai la cele dou molecule ARNt, plasate la situsurile P i A. Reacia se realizeaz prin transferarea metioninei (sau N-formil metioninei, la procariote) de la ARNT iniiator, plasat n situsul P, la aminoacidul legat la ARNt din situsul A. Reacia este catalizat de o enzim numit peptidil-transferaz, care se gsete n subunitatea mare a ribosomului. Dei mult vreme a fost considerat o protein, peptidil transferaza s-a dovedit a fi una dintre moleculele de ARNr ce alctuiesc, mpreun cu proteinele, subunitile ribosomale. Aceast constatare este n acord cu evidenierea rolului catalitic al multor molecule de ARN. Prin urmare, peptidil transferaza este considerat, pe baza datelor experimentale obinute pn la data prezent, o ribozim (o molecul ARN cu proprieti catalitice). n urma formrii legturii peptidice, ARNt de la situsul A va avea anticodonul cuplat cu codonul din ARNm, iar la captul 3 al moleculei va purta o dipeptid. ARNt din situsul P va fi, n acest moment, eliberat de orice aminoacid. Aceast etap a elongrii presupune ejectarea ARNt descrcat din situsul P i deplasarea ribosomului cu trei nucleotide mai departe (cu un codon), n lungul moleculei ARNm, n direcia 3. Deplasarea ribosomului reprezint o subetap a elongrii i a primit numele de translocare, fiind caracterizat de deplasarea dipeptidei, cuplat cu ARNt, la situsul P. Aceast subetap a reaciei necesit intervenia EF-G la procariote, sau a eEF2 la eucariote i hidroliza GTP. Translocarea implic deplasarea ribosomului pe o distan de 1 nm. Pe parcursul fiecrui ciclu de elongare, se hidrolizeaz cel puin dou molecule de GTP una sau mai multe n procesul selectrii aminoacil-ARNt i una n timpul translocaiei. n momentul n care peptidil-ARNt s-a mutat n P, situsul A redevine operaional pentru ncrcarea unui nou complex aminoacil-ARNt, conform informaiei furnizate de cel de al treilea codon de pe molecula de ARNm care, prin deplasarea ribosomului, se afl n dreptul situsului A. n momentul formrii legturii peptidice, ARNt de la situsul A va deveni purttorul unei tripeptide, n timp ce ARNt de la situsul P va fi descrcat i, apoi, ejectat. Ciclul de elongare se va putea relua, prin deplasarea ribosomului, de cte ori va fi necesar, pn ce se va sintetiza ntregul lan polipeptidic. Cnd am prezentat codul genetic am precizat c trei dintre cei 64 de codoni, ndeplinesc funcia de codoni STOP (codonii ochre, amber i opal). Situaia este explicabil prin aceea c nu exist ARNt care s posede anticodoni complementari acestor codoni. Cnd ribosomul ajunge cu situsul A n dreptul unuia dintre cei trei codoni (UAA, UAG sau UGA), elongarea se ntrerupe i catena polipeptidic, cuplat la ultimul ARNt, este eliberat. Terminarea elongrii este dependent de intervenia factorilor de eliberare, care interacioneaz cu codonii stop. Bacteriile, de pild, posed doi factori de eliberare RF1 care recunoate codonii UAA i UAG i RF2 care recunoate codonul UGA. Celulele eucariote au un singur factor de elibe-rare eRF (n englez, RF =release factor). Factorii de eliberare sunt, n prealabil, cuplai cu GTP, care va fi hidrolizat.Cnd translaia este ntrerupt, catena polipeptidic va fi decuplat de la ARNt care, alturi de factorul de eliberare, va fi pus n libertate din ribosom.

Fig. 34 Iniierea translaiei cu formarea primei legturi peptidice (C), i elongarea (D i E)

Ribosomul, la rndul su, se decupleaz de la ARNm i se disociaz n cele dou subuniti, conform Fig. 35. Dac se examineaz la microscopul electronic ARNm ce urmeaz a fi translat, se poate observa prezena mai multor ribosomi, ataai de el. Complexul ARNm-ribosomi (vezi figura urmtoare) poart numele de poliribosom sau polisom. Fiecare ribosom se ataeaz la codonul de iniiere i, apoi, se va deplasa, pe parcursul procesului de translaie, codon dup codon, spre captul 3 al catenei de ARNm, pn la primul codon STOP (Fig. 36).

Fig. 35 Terminarea translaiei

Fig. 36 Schema (dreapta) i electrono-microfotografia (stnga) unui complex poliribosomal

Imediat ce primul ribosom ataat la macromolecula ARNm se gsete la o distan suficient de codonul de iniiere, un nou ribosom se va cupla la acest codon i va ncepe, la rndul su, deplasarea n vederea translaiei. Translaia simultan a ARNm are efecte benefice asupra sintezei proteice celulare. Spre deosebire de eucariote, la care transcripia ADN cu formarea de ARNm are loc n nucleu, iar translaia n citoplasm, la procariote cele dou procese sunt intim cuplate. De fapt, la bacterii, sinteza proteinelor debuteaz nainte ca ARNm s fi fost complet format. Sinteza ARNm se efectuiaz n direcia 5 3, direcie respectat i de deplasarea ribosomilor, n procesul translaiei. n momentul n care captul 5 al moleculei ARNm se elibereaz de la ADN, la acesta va ncepe ataarea ribosomilor, de la nivelul codonului iniiator, avnd ca efect final formarea poliribosomilor. Proteinele, n stare nscnd, vor avea lungimi diferite, fiind cu att mai mari cu ct ribosomul a fost legat mai de timpuriu la ARNm, deoarece a avut timp s transleze o poriune mai lung din mesaj. INTREBARI DE VERIFICARE 1. Care sunt componentele chimice ale acizilor nucleici 2. Modelul Watson-Crick de structura a ADN-ului 3. Structura si functiile genei 4. ARN-ul structura si functii 5. Exprimarea informatiei genetice transcriptia si translatia (sinteza) proteinelor

TEME PENTRU EXAMINAREA FINALA 1. Structura si functiile acizilor nucleici 2. Notiunea de gena 2. Exprimarea informariei genetice transcriptia si translatia

BIBLIOGRAFIE
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D., 1994. Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing Inc., New York, London. Bra, I.I., 1996. Vademecum in genetic. Editura CORSON, Iai. Bra, I.I., 1999. Genetica. Editura CORSON, Iai. Brown, D.D., David, I., 1968. Specific gene amplification in oocytes. Science, 160, 272. Buctaru, N., 1993. Genetic. Editura Universitas, Chiinu. Butnaru, G., Nicolae, I., Tma, E., 1999. Genetic molecular. Editura MIRTON, Timioara Callan, H.G., 1955. Recent work on the structure of cell nuclei. Symposium on the Fine Structure of Cells.IUBS Publ. Series B., 21, 89. Gavril, L., 1986. Genetica. I. Principii de ereditate. Editura Universitii Bucureti. Ghiorghi, G., 1999. Bazele geneticii. Editura Alma Mater Bacu. Klug, W.S., Cummings, M.R., 1986. Concepts of Genetics. Merill Publishing Company. A Bell & Howell Company, Columbus-Toronto-London-Sydney. Knippers, R., 1997. Molekulare Genetik. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Latchman, D.S., 1998.Eukaryotic Transcription Factors. Third Edition. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto. Lewin, B., 1997. Genes, VI. Oxford University Press, Inc., New York, USA. Miller, O.L., Hamkalo, B.A., 1972. Visualization of RNA synthesis on chromosomes. Int. Rev .Cytol., 33,1. Moraru, I., Antohi, t., 1966. Introducere n genetica molecular. Ediia II-a. Editura Medical, Bucureti. Raicu, P., 1997. Genetic general i uman. Editura Humanitas, Bucureti. Snustad, D.P., Simmons, M.J., Jenkins, J.B., 1997. Principles of Genetics. John Wiley & Sons, Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, Weinheim. Tamarin, R., 1991. Principles of Genetics. WCB (Wm. C. Brown) Publishers. Toma, O., Bra, I.I., 1996. La sorgintea vieii aminoacizi, proteine si acizi nucleici, Vol.1. Editura Corson, Iai. Tudose, I., 1992-1993. Genetic. Editura Universitii Al.I.Cuza, Iai. Voicule, N., Puiu, L., 1997. Biologia molecular a celulei. Grupul editorial ALL. Watson, J.D., Hopkins, N.H., Roberts, J.W., Steitz, J.A., Weiner, A.W., 1987. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. Menlo Park, California. Reading, Massachusetts. DonMills, Ontario Wokingham, U.K. Amsterdam. Sydney. Singapore. Tokyo. Madrid. Bogota. Santiago. San Juan. Bra, i.i., 1973. Studiu asupra biologiei populaiilor unor specii apomictice i sexuate nrudite.Tez de doctorat, Facultatea de Biologie, Universitatea Bucureti. Bra, I.I., Ghiorghi, g., 1980. Din enigmele evoluiei (Apomixia i rolul ei n evoluie). Editura tiinific i Enciclopedic, Bucureti. Bra I., Corneanu G.(sub redacia), Fraley l., Gottschalk W., Imreh St., Lazanyi A., Nedelcu C., Whicker W., 1989. Elemente de radiobiologie vegetal. Ed. Ceres, Bucureti. Bra, I.I., 1989. Reproducerea, factor al evoluiei plantelor. Editura Academiei, Bucureti Bra, I.I., 1999. Genetica. Editura Corson, Iai Beggs C., Schneider-Ziebert U., Wellmann E., 1986. UV-B Radiation and Adaptativ Mechanisms in Plants. Stratospheric Ozone Reduction, Solar Ultraviolet Radiation and Plant Life (Edited by R. C. Worrest and M..M. Caldwell), NATO ASI Series, Vol. G.8, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 235-251. Brookes P., Lawley P., 1961. The reaction of mono- and difunctional alchilating agents with nucleic acids. Biochem J, . 80, 496-502. Buican, D., 1997. Mendel i genetica de ieri i de astzi. Editura ALL, Bucureti. Butnaru, Gallia, Nicolae,I., Tma, Elena, 1999. Genetic molecular. Editura Mirton, Timioara. Cavalli-Sforza, l.l., Bodmer, W.F.,1971. The Genetics of Human Populations. Freeman, San Francisco. Charlesworth, B., 1996. The evolution of chromosomal sex determination and dosage compensation. Curr. Biol., 6, 149-162.

Ciobotari, Ghe. V., Bra, I.I., 2000. Frecvena crossing-overului ntre cromosomii X, la femelele hibride de Drosophila melanogaster obinute prin ncruciarea ntre mutanta Muller 5 i indivizi din trei populaii naturale. Genetic i Evoluionism (sub redacia Ion I. Bra, Csilla Iuliana Surugiu, Mirela Cmpeanu, Marilena Maniu), Editura Corson, Iai, 53-78 Ciobotari, G.V., Bra, I.I., 2000. Efecte ale tratamentului cu nicotin, n diferite concentraii, aplicate indivizilor de Drosophila melanogaster dintr-o populaie reversmutant. Genetic i Evoluionism (sub redacia Ion I. Bra, Csilla Iuliana Surugiu, Mirela Cmpeanu, Marilena Maniu), Editura Corson, Iai, 7984. Ciupercescu d. , 1986. Curs de Genetic si Eredopatologie, Tipo Agronomia, Cluj-Napoca. Ciupercescu, D.D., Vereskens, J., Mouras, A., Y, D., Briquet, M., Negruiu, I., 1990. Karyotyping Melandrium album, a dioecious plant with heteromorphic sex chromosomes. Genome, 33, 556-562. Cmpeanu, M.M., Cmpeanu, C.S., Bra,I.I., 2000. ADN recombinant. Editura Corson, Iai. Cmpeanu, Mirela M., Maniu, Marilena, Surugiu, Iuliana C., 2002. Genetica metode de studiu. Editura Corson, Iai. Coohill Th ., 1989. Ultraviolet Action Spectra (280 to 380 nm) and Solar Effectiveness Spectra for Higher Plants. Photochem. Photobiol., 50 ,4 , Printed in Great Britain, 451-457. Cook, l.M., 1976. Population Genetics. Chapman and Hall, A Halsted Press Book London, John Wiley & Sons, Inc., New York Corneanu, Mihaela, 2001. Genetica. Editura Sitech, Craiova. Creed, E.R., 1971. Ecological Genetics and Evolution. Essays in Honour of E.B. Ford.Blackwell, Oxford. Crow, J.F., Kimura, M., 1970. An Introduction to Population Genetic Theory. Harper and Row, New York. Crow, J.F., 1972. The dilemma of nearly neutral mutations :How important are they for evolution and human welfare ? J. Heredity, 63, 306-316 Darwin, Ch., Wallace, A.R., 1958. Evolution by natural selection. Cambridge University Press Deering R., 1962. Ultraviolet radiation and nucleic acid, in Organic chemistry of life. Editors: Calvin M., Pryor A., Freeman and Company, San Francisco, 377-382. Dellaporta, S.L., Calderon-Urrea, A, 1993. Sex determination in flowering plants. Planta Cell, 5, 1241-1251. Dobzhansky, T., 1970. Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press, New York. Drake J., 1970. The molecular basis of Mutation, Holden Day, San Francisco, Dumitru, I.F., 2001. Nouti n biotehnologie. Editura ILEX, Bucureti Dumitru, I.F., Toma, N. (coordonatori volum), 2001. Progrese n Biotehnologie. Universitatea Bucureti, Centrul de Cercetri n Enzimologie, Biotehnologii i Bioanaliz. Fairbanks, D.J., Andersen, R.W., 1999. Genetics. The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company. Wadsworth Publishing company. ITPR an International Thomson Publishing Company. New York, Scottsdale AZ, Singapore, Tokyo, Toronto Falconer, D.S., 1960. Introduction to quantitative Genetics. Oliver and Boyd, Edinburgh. Fernandez, J.M., Hoeffler, J.P., 1999. Gene expression Systems. Using Nature for the Art of Expression. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto. Floria F., 1979. Studiu comparativ asupra comportrii unor specii de plante superioare in tratamentul cu ageni mutagenici chimici alchilani, Teza de doctorat, Univ. Al.I.Cuza, Iai, 1974. Floria F., Gille E., Popescu T., 1984. Influence of the treatmens with alchilating agents and gamma rays on the cardenolides content of Digitalis lanata, Ehrn. Rev. Roum. Biochim. 21,3, 177-180. Flondor, P., Ionescu, C. (ediie ngrijit de), 1998. Introducere n algoritmi genetici. Editura ALL, Bucureti. Ford, E. B., 1964. Ecological Genetics. New York, John Wiley & Sons. Ford, E.B., 1975. Ecological Genetics, 4th Edition. Chapman and Hall, London. Friedberg, E.C.,Walker, G.C., Siede, W., 1995. DNA Repair and Mutagenesis. ASM Press, Washington D.C. Fristrom, J.W., Clegg, M.T., 1988. Principles of Genetics (Second edition). Freeman & co., New York. Gardner, E., Simmons, M., Snustad, D., 1991. Principles of Genetics. John Wiley & Sons, Inc., 288-308. Gavril, L., 1986. Genetica principii de ereditate, vol. I. Tipografia Universitii, Bucureti. Ghiorghi, G., Toth, E., Gille, E., 1984. Some cytogenetic physiological, and biochemical effect induced by single and combined treatments with gamma rays and ethylmethansulfonate in two-row barley and wheat. Rev. Rum. Biol., Biol. Veget., v. 29,2, 137-145. Ghiorghi, G.I., 1999. Bazele geneticii.Editura Alma Mater, Bacu. Ghiorghi, G.I., Corneanu, G., 2002. Radiobiologie. Editura ALMA MATER, Bacu. Glick, B.R., Pasternak, J.J., 1994. Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press, Washington D.C. Hartl, D., Freifelder, D., Snyder, L., 1988. Basic genetics. Johns and Bartlett Publishers, Boston. Jiang, J., Gill, B.S., 1994. Different species-specific chromosome translocations in Triticum timopheevii and T. turgidum support the diphyletic origin of polyploid wheats. Chromosome research, Oxford & New York, vol. 2, nr. 1, 59-64. Kihara, H., Ono, T., 1923. Cytological studies on Rumex L. Bot. Mag., 37, 84-90. Kimura, M., 1968. Evolutionary rate at the molecular level. Nature, 217, 624-626.

Kimura, M., 1968. Genetic variability maintained in a finite population due to mutational production of neutral and nearly neutral isoalleles. Genet. Res., 247, 11. Klug, W., Cummings, M., 1986. Concepts of genetics, Second edition. Merrill Publishing Company, 177, 1972000, 306-312. Lewin, B., 2001. Genes VII. Oxford University Press, Oxford Malling, H., de Serres, F., 1970. Genetic effects of N-methyl N-nitrosoguanidine in Neurospora Crassa.Molec. Gen. Genetics, v. 106, 165 Manna, G., 1971. Chromosome aberrations induced by living mutagens. Natl. Acad. Sci. Sect. Biol. Sci., 115. Morton, N.E., 1991. Parameters of the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 88, 7474-7476 Pelling, C., Allen, T.D., 1993. Scanning electron microscopy of polytene chromosomes (I). Chromosome research, Oxford & New York, vol. 1, nr. 4, 221-237. Raicu, P., Stoian, V., Nicolaescu, M., 1974. Mutaiile si evoluia. Editura Enciclopedic, Bucuresti. Raicu, P., Gorenflot, R., 1980. Cytogntique et volution. Editura Academiei Romne, Bucureti. Snustad, P.D., Simmons, M.J., Jenkins, J.B., 1997. Principles of Genetics.John Wiley & Sons, Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto,Singapor,Weinheim. Socaciu, C., 1996. Mutageneza chimic. Editura Genesis, Cluj-Napoca, p. 76-84. Soll, D., Rajbhandary, U.L.(edited by), 1995. tRNA Structure, Biosynthesis and Function. ASM Press, Washington D.C. Toma, N., Gavril, L., 2000. Ereditatea extranuclear. Editura Universitii din Bucureti. Trachsel, H. (edited by), 1991. Translation in Eukaryotes. CRC Press, Boca Raton, Ann. Arbor, Boston, London Tudose, I., 1992-1993. Genetica vol. I, II, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai.