Facultad de Ciencias Biolgicas BIO050 Enfermera

Metabolismo y Crecimiento Bacteriano

Prof. Liliana Berrocal

Metabolismo y Necesidades energticas...

Productos de desecho Nutrientes para la sntesis

Anabolismo (Biosntesis) Energa para biosntesis Energa para la movilidad, transporte de nutrientes Catabolismo

Macromolculas y otros componentes

Productos qumicos, luz (fuente de energa)

Metabolismo Bacteriano
Conjunto de reacciones bioqumicas que se realizan al interior del organismo
Biodegradacin

Biosntesis

Reacciones degradativas: Proporcionan energa (Rx. Catablicas) Reacciones sintticas: Proporcionan componentes estructurales (Rx. Anablicas)

Metabolismo Bacteriano. Enzimas

H2O2

H2O + O2

> aos

H2O2

H2O + O2

< seg.

Las enzimas son protenas catalticas (biocatalizadores) que disminuyen la energa de activacin requerida para que ocurra una reaccin qumica. Energa de activacin: energa necesaria para juntar las molculas reactantes (sustratos) de la manera adecuada de modo que alcancen el estado de transicin.

Metabolismo. Ciclo cataltico de las enzimas

Ciclo cataltico de la Aldolasa

Catalizador
Sustancia que aumenta la velocidad de una reaccin qumica sin ser el mismo alterado permanentemente. (se regenera al final del proceso o reaccin).

Metabolismo. Catabolismo

Catabolismo: Obtencin de Energa

Nutrientes Bacterianos:
Macronutrientes: Son requeridos en gran cantidad (Ej.: Carbono, Nitrgeno,Hidrgeno, Oxgeno, Fsforo, Azufre, Potasio, Magnesio, Calcio, Sodio y Fierro) Micronutrientes: Son requeridos en pequea cantidad (Ej.: Cromo, Cobalto, Cobre, Manganeso, Molibdeno, Nquel, Selenio, Tungsteno, Vanadio y Zinc.)

Metabolismo. Catabolismo. Obtencin de Energa

Gliclisis o gluclisis

Ciclo de Krebs o cidos tricarboxlicos (ATC)

Sistema de transporte de electrones

Gliclisis Glucosa

Piruvato 2 ATP
2 NADH = 5 ATP

7 ATP

Vas de Fermentacin

Gliclisis. Fermentacin del cido pirvico

Glucosa

Gliclisis

cido Pirvico (piruvato)

Fermentacin anaerbica

Respiracin aerbica
Ciclo de Krebs

F. Lctica
Piruvato
lactato deshidrogenasa

F. Alcohlica
Piruvato
piruvato descarboxilasa

Fosforilacin oxidativa

Lactato

Acetaldehido
Alcohol deshidrogenasa

CO2 + H2O

Etanol

Gliclisis. Fermentacin alcohlica

Alcohol deshidrogenasa

2 Etanol

Fermentacin anaerbica

La fermentacin alcohlica es ampliamente usada en la fabricacin de alimentos como vino, cerveza, pan

Gliclisis. Fermentacin lctica

Fermentacin anaerbica

Fermentacin usada por los lactobacilos (Bacillus lactis ): utilizan la lactosa (azcar de la leche). El lactato acumulado baja el pH, lo que hace que las protenas de la leche precipiten en el proceso de fabricacin del queso

Lactato deshidrogenasa 2 Lactato

Ciclo de Krebs o ciclo de los cidos tricarboxlicos...

Piruvato

Acetil- CoA

2 NADH = 5 ATP

GTP = 2 ATP 6 NADH = 15 ATP 2 FADH2 = 3 ATP

25 ATP

Cadena transportadora de electrones. Fosforilacin oxidativa...

1 Glucosa = 32 ATP
Gliclisis 2 ATP / 2 NADH (5 ATP) Piruvato a Acetil CoA 2 NADH (5 ATP) Ciclo de Krebs 2 GTP (2 ATP) / 6 NADH (15 ATP) / 2 FADH2 (3 ATP)

Rendimiento total

1NADH = 2,5 ATPs 1FADH2 = 1,5 ATPs

Respiracin. Aerbica y Anaerbica

Respiracin aerbica

Respiracin anaerbica

E. coli es capaz de realizar ambos tipos de respiracin, dependiendo si esta creciendo en presencia o ausencia de oxgeno.

Respiracin. Formas txicas del oxgeno

Estas molculas txicas se generan durante el metabolismo normal de las bacterias (Respiracin aerbica). Los radicales superxido (O2-) e hidroxilo (HO) reaccionan rpidamente oxidando diversas macromolculas orgnicas como lpidos, protenas y cidos nucleicos Esta oxidacin provoca la destruccin de estructuras biolgicas, como membranas, complejos multiproteicos, DNA, etc.

Enzimas que degradan formas txicas del oxgeno

La presencia de enzimas capaces de degradar los derivados txicos del O2 le permite a un determinado microorganismo utilizar esta molcula como aceptor final de electrones durante el proceso de la respiracin aerbica

Catalasa (-)

Catalasa (+)

Prueba de la presencia de catalasa: Colonia suspendida en agua oxigenada (30%) ( 2H2O2 2H2O + O2 )

Identificacin bacteriana

Cultivo puro

Morfologa de colonia y de tincin de Gram

Propiedades Bioqumicas
Fermentacin de glucosa Utilizacin de citrato Produccin de H2S etc.

Propiedades Antignicas
Reacciones serolgicas Anticuerpos especficos

Caractersticas de crecimiento
Temperatura Aerobiosis Anaerobiosis etc.

Clasificacin bacteriana. Segn tolerancia al oxgeno

Anaerobias estrictas: Carecen de SOD, catalasa y peroxidasa por lo que el O2 es muy txico para ellas. No soportan presiones de O2 > al 0,5%. Ej. Clostridium haemolyticum Anaerobias moderadas: Soportan presiones de O2 de 2 - 8%. Pueden estar expuestas al aire por 60-90 minutos sin perder viabilidad. Ej. Bacteroides fragilis Anaerobias aerotolerantes: Poseen algn nivel de enzimas detoxificantes. Ej. Lactobacillus spp., Leuconostoc spp.

Clasificacin bacteriana. Segn tolerancia al oxgeno

Microaerfilas: Sobreviven a presiones de O2 menores a la atmosfrica (<21%). Son capnoflicas (requieren CO2). Ej. Campylobacter spp. Anaerobias facultativas: Pueden realizar metabolismo anaerobio o aerobio dependiendo del ambiente. Ej. Escherichia coli y otras enterobacterias. Aerobias estrictas: Slo crecen en presencia de O2. Ej. Pseudomonas sp.

Clasificacin metablica segn la fuente de ENERGA

Todos los microorganismos

Quimitrofos (compuestos qumicos como fuente de energa)

Fottrofos (luz como fuente de energa)

Quimiolittrofo (compuestos inorgnicos)

Quimioorgantrofo (compuestos orgnicos)

Clasificacin bacteriana. Segn fuente de energa

Quimiotrficas o Quimiosintticas: Son aquellas que obtienen su energa a partir de reacciones qumicas

Fototrficas o Fotosintticas: Son aquellas que obtienen su energa captndola de la luz solar

E. coli (Enterobacteria)

Ocillatoria (Cianobacteria)

Clasificacin bacteriana. Segn fuente de energa Quimiotrficas o Quimiosintticas: a) Quimioorganotrficas

Quimioorgano...Sustancia qumica orgnica (trophos: alimento) Obtienen su energa a travs de la utilizacin de sustancias qumicas orgnicas

Clasificacin bacteriana. Segn fuente de energa Quimiotrficas o Quimiosintticas: a) Quimiolitotrficas

Quimiolito...Sustancia qumica inorgnica (lithos: piedra; trophos: alimento) Obtienen su energa a travs de la utilizacin de sustancias qumicas inorgnicas

Metabolismo Quimiolitotrfico

Oxidacin del Fe2+ por el acidfilo Acidothiobacillus ferrooxidans

Clasificacin bacteriana. Segn fuente de energa Fotosintticas o Fototrficas:

Membrana plasmtica de una cianobacteria fotosinttica La luz solar aporta la energa requerida para el proceso de transferencia de electrones en la membrana, generndose un gradiente de protones que se acopla a la sntesis de ATP

Clasificacin metablica segn la fuente de CARBONO

Todos los microorganismos

Hetertrofos (compuestos orgnicos como fuente de C)

Auttrofos (CO2 como fuente de carbono)

Resumen Catabolismo

Obtencin de Energa
Gliclisis Ciclo de Krebs Sistema de transporte de electrones. Fermentaciones:
lctica alcohlica

Tolerancia al O2
Anaerobios estrictas Anaerobios moderadas Anaerobios aerotolerantes Microaerfilos Anaerobios facultativas Aerobios estrictas

Fuente de Energa Quimiotrficos Fototrficos

Quimiotrficos:
Quimioorganotrficos Quniolitotrficos

Metabolismo. Anabolismo

Anabolismo: Sntesis de componentes estructurales Segn su fuente de carbono, las bacterias se clasifican en:
Hetertrofas: Obtienen el carbono a partir de molculas ms complejas. Ej.: hidratos de carbono, aminocidos, lpidos. Auttrofas: Obtienen el carbono a partir de molculas simples. Ej.: CO2 y CH4

La gran mayora de las bacterias de inters clnico son hetertrofas

Metabolismo. Anabolismo. Biosntesis de Macromolculas

Los microorganismos son la base de todas las cadenas alimenticias

Metabolismo. Anabolismo. Fijacin de molculas simples Fijacin de Carbono (CO2)

Ciclo de Calvin: Es realizado por todas las bacterias fototrficas.

Metabolismo. Anabolismo. Fijacin de molculas simples Fijacin de Fsforo (P)

Fotofosforilacin: Formacin de ATP desde ADP y Pi durante la fotosntesis. Fosforilacin Oxidativa: Formacin de ATP desde ADP y Pi durante la cadena transportadora de electrones. Fosforilacin a Nivel de Sustrato: Ej. Durante la gliclisis
Gliceraldehido-3-P + Pi + NAD+ 1,3-Bisfosfoglicerato + NADH + H+

Metabolismo. Anabolismo. Fijacin de molculas simples Fijacin de Azufre (S)

SO42H2S + Serina
ATP

H2S Cistena + H2O

Metabolismo. Anabolismo. Fijacin de molculas simples Fijacin de Nitrgeno (N)

NO3- + H+ + NADH NO2N2 NO2- + NAD+ + H2O NH3 NH3

NH3 + c. glutmico ATP Glutamina

Crecimiento y Medios de Cultivo

Divisin Bacteriana. Fisin Binaria

Se requiere coordinacin espacial y temporal (secuencial) en la sntesis de macromolculas: DNA Protenas Hidratos de Carbono Lpidos

Reflejado (poblacionalmente) por un aumento en el nmero de organismos presentes El tiempo requerido para la duplicacin bacteriana es variable para cada especie (Ej: 20 min para Escherichia coli; 24 horas para Mycobacterium tuberculosis)

Divisin Bacteriana. Fisin Binaria

1. La bacteria duplica su cromosoma

2. Luego la clula aumenta en tamao

3. Se inicia la divisin de la clula y la formacin del tabique que separa las clulas hijas

4.

Resultado: dos clulas idnticas o clonales

Definiciones

Crecimiento: Aumento del nmero de individuos (M.O.) en una poblacin.

(Implica un aumento de la biomasa del M.O.)

Velocidad de crecimiento: Crecimiento de un M.O. por unidad de tiempo. Tiempo de generacin (g): Tiempo requerido para que se formen dos clulas hijas a partir de una clula parental. Es el tiempo necesario para que la poblacin bacteriana se duplique.
(Implica la duplicacin de todos los componente estructurales de la clula)

Crecimiento Bacteriano. Exponencial...

Crecimiento Bacteriano. Exponencial...

Curva de Crecimiento Bacteriano

Etapas de la curva clsica de crecimiento bacteriano:

Fase lag: Crecimiento lento (etapa de acondicionamiento ambiental) Fase exponencial o logartmica: Crecimiento bacteriano a mxima capacidad Fase estacionaria: Detencin del crecimiento, no del metabolismo (estrs,

hambruna) Fase de decaimiento: Muerte celular (agotamiento del cultivo)

Medicin del Crecimiento Bacteriano

Medicin del Crecimiento Bacteriano 1.- Recuento total de clulas: Conteo directo bajo el microscopio usando una muestra (diluida) de cultivo bacteriano y una cmara de recuento calibrada (Petroff-Hausser).

Este mtodo no discrimina la viabilidad de las bacterias en la muestra.

Medicin del Crecimiento Bacteriano. Recuento total de clulas

Medicin del Crecimiento Bacteriano

1) Recuento total de clulas DESVENTAJAS 1) Las clulas muertas no se distinguen de las clulas vivas... 2) Las clulas pequeas son difciles de ver al microscopio y algunas de ellas probablemente no se cuenten... 3) Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisin por este mtodo... 4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no est teida... 5) No es un mtodo recomendable cuando la suspensin de clulas est muy diluida...

Crecimiento Bacteriano. Colonia Bacteriana...

S. aureus S. aureus

S. aureus

Colonias de S. aureus S. aureus

Crecimiento Bacteriano. Colonia Bacteriana...

Medicin del Crecimiento Bacteriano

2.- Recuento de clulas viables (o Recuento viable): Dilucin de la muestra y siembra (plaqueo) sobre medio slido o siembra de la muestra incluida en el medio slido.

Medicin del Crecimiento Bacteriano. Recuento viable

Medicin del Crecimiento Bacteriano

2.- Recuento de clulas viables: Dilucin seriada de la muestra en medio o buffer estril y plaqueo sobre medio slido.

Medicin del Crecimiento Bacteriano

2) Recuento de clulas viables (vivas) VENTAJAS 1) En condiciones adecuadas, es un mtodo sensible 2) Se pueden contar bacterias especficas gracias a la presencia de medio selectivos y diferenciales DESVENTAJAS 1) El nmero de colonias no depende slo del tamao del inculo. Tambin depende de: El medio de cultivo Las condiciones de incubacin Longitud de incubacin 2) No siempre las colonias son del mismo tamao: Las colonias pequeas pueden ser ignoradas

Medicin del Crecimiento Bacteriano 3.- Medicin espectrofotomtrica, fotomtrica o turbidimtrica de un cultivo bacteriano lquido

Medicin del Crecimiento Bacteriano

3) Medicin espectrofotomtrica

A turbidez muy alta se pierde precisin

Medicin del Crecimiento Bacteriano

3) Medicin espectrofotomtrica VENTAJAS 1) Esta tcnica no distorsiona a las muestras 2) Generalmente muy precisas 3) Fcil, rpido y barato

DESVENTAJAS 1) No discrimina entre clulas vivas y muertas 2) El crecimiento celular es una estimacin de la biomasa 3) A elevadas concentraciones celulares (alta turbidez) se pierde precisin

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano...

Temperatura pH Disponibilidad de agua y nutriente Disponibilidad de oxgeno

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. TEMPERATURA...

Las reacciones enzimticas van aumentando su velocidad de reaccin. Las reacciones enzimticas ocurren a la mxima velocidad posible.

Congelacin de la membrana; el transporte es tan lento que no hay crecimiento.

Desnaturacin de protenas; colapso de la membrana citoplasmtica; lisis trmica.

Consecuencias moleculares de la temperatura en el crecimiento bacteriano

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. TEMPERATURA...

Psicrfilos: Temperatura ptima baja (<1 a 15C)

Mesfilos: Temperatura ptima en rango medio (25 a 42C)

Termfilos: Temperatura ptima alta (50 a 70C) Hiper termfilos: Temperatura ptima muy alta (80 a >100C)

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. TEMPERATURA...

Hipertermfilos
Aguas termales del Parque Nacional Yellowstone

Thermus aquaticus Extremfilo, de la familia arquea T ptima de crecimiento 70C Fuente de la enzima Taq Polimerasa (PCR)

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. SALINIDAD...

No halfilos: No toleran ni siquiera concentraciones moderadas de sal. Halotolerantes: Toleran concentraciones moderadas de sal; crecen mejor sin ella. Halfilos: Leves (1 a 6% NaCl) y Moderados (6 a 15% NaCl). Halfilos extremos: 15 a 30% NaCl.

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. SALINIDAD...

Lago poblado por Halobacterium salinarum

Halobacterium salinarum Necesita 12 a 15% de NaCl en el medio para crecer.

Mar: 3% NaCl Sangre: 0,85% NaCl

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. ACIDEZ (pH)...

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. ACIDEZ (pH)...

Tiobacillus ferrooxidans En medio altamente cido (en H2SO4 concentrado, pH 1) es capaz de oxidar minerales de cobre insolubles como CuFeS2 (calcopirita), Cu2S (chalcocita), CuS (covelita) y Cu5FeS4 (bornita), produciendo CuSO4 (soluble)

Mina de cobre Bingham Canyon, Salt Lake City, Utah, USA

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. Oxgeno...

Grupo Aerobios Estrictos Facultativos

Relacin con el O2

Metabolismo

Ej.

Requerido

Respiracin aerbica Respiracin aerbica

M. luteus E. coli S. volutans

No requerido (Mejor con O2) Respiracin, fermentacin

Microaeroflicos Requerido (Bajos niveles) Anaerobios Aerotolerantes Estrictos No requerido (Peor con O2) Daina o Letal

Fermentacin

S. pyogenes

Respiracin, fermentacin M. formicicum

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. Oxgeno...

Resazurina (Indicador de presencia de oxgeno)

(a) Aerbica (b) Anaerbica (c) Facultativa (d) Microaeroflica (e) Anaerobio aerotolerante

Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano. Oxgeno...

Jarra Anaerbica (GasPack) Diseada para el crecimiento de bacterias anaerbicas. Mecanismo hermtico, que posee un catalizador qumico que consume todo el oxgeno presente dentro del recipiente.

Cmara Anaerbica

Medios de Cultivo Condiciones de los medios de cultivo Esterilidad Tener todos los nutrientes esenciales (agua, fuente de nitrgeno, fuente de carbono, sales minerales, micronutrientes, vitaminas, etc.) Cumplir con requisitos fsicos: temperatura (37C), pH neutro (7.0 - 7.2 ), condicin atmosfrica (10% CO2) Estar protegidos del medio ambiente (Evitar su contaminacin con microbiota ambiental y/o comensal)

Medios de Cultivo Cmo se observa desarrollo bacteriano en los medios de cultivo? En medio lquido Enturbiamiento Aparicin de grumos Formacin de un velo o pelcula en la superficie En medio slido formacin de colonias

Colonia: Multiplicacin de una bacteria que forma una masa visible a ojo desnudo

Medios de Cultivo Cul es la utilidad de los medios de cultivo? Aislamiento de bacterias a partir de una muestra (agua, secreciones, aire, alimentos, muestras clnicas) Obtencin de cultivos puros, para el estudio de propiedades fisiolgicas e identificacin Conservacin de cepas Evaluacin de antibiticos Pruebas de esterilidad Fabricacin de sueros, vacunas, etc.

Medios de Cultivo Segn su estado fsico...

Medio slido (agar 1,5%)

Medio semi slido (agar 0,8%)

Medio lquido

Medios de Cultivo Segn su presentacin...

En placa

En tubo

Medios de Cultivo Segn su contenido de nutrientes...

Medios definidos (qumicamente): Contienen cantidades precisas y bien formuladas de diversos componentes inorgnicos y orgnicos. Renen los requerimientos nutricionales para el desarrollo de un determinado microorganismo

Medios complejos (indefinidos): No poseen una formulacin precisa. Se preparan en base a infusiones de digeridos proteicos (carne, soya, casena, extracto de levadura). La mayora de estos medios se venden deshidratados, lo que facilita su preparacin

Medios de Cultivo Segn su utilidad...

1.- Corriente (bsicos): Contienen slo los elementos nutritivos esenciales. Ej.: caldo Luria (medio lquido) y agar corriente (medio slido) 2.- Especiales: Mejorados o enriquecidos: Son medios corrientes adicionados de sustancias de alto valor nutritivo (sangre, suero, vitaminas, extractos de levaduras), que permiten el desarrollo de bacterias ms exigentes. Ej.: Agar sangre (medio slido), agar chocolate (medio slido) Medios selectivos: Contienen sustancias inhibidoras para determinadas bacterias. Ej.: Agar SS para Salmonella y Shigella, Thayer Martin para N. gonorrhoeae y Agar MacConkey para Gram (-) Medios diferenciales: Permiten establecer si una bacteria desarrolla una determinada funcin metablica que la diferencia de otras bacterias. Ej.: Citrato de Simmons, TSI, MIO, LIA, Caldo urea Agar MacConkey Agar Chocolate

Agar Sangre

Medios de Cultivo Enriquecidos...

Streptococcus pyogenes

Bacillus subtilis

Medios de Cultivo Enriquecido y diferencial

-hemlisis: Parcial

-hemlisis: Total

-hemlisis: No produce hemlisis...

Medios de Cultivo Selectivo y diferencial

E. coli
Gram (-), lac+

S. typhimurium
Gram (-), lac-

S. aureus
Gram (+)