Prctica 1: TCNICA ASPTICA Y TCNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCIN: Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo. Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y esterilizacin para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfeccin es un proceso que elimina nicamente formas vegetativas de los microorganismos. La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procedimientos de mayor utilizacin en microbiologa. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180 C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican principalmente en la esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de material de vidrio y quirrgico. Los procesos con calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El ms recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presin para alcanzar temperaturas de 121 C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruccin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resistentes al calor. Para el caso de materiales plsticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos qumicos en forma lquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehdo, alcoholes, halgenos y detergentes. El tipo de microorganismo que ser utilizado en este laboratorio sern bacterias. Las bacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composicin qumica o nutricional de los medios es extremadamente variada (Prctica Medios de Cultivo). Los medios ms comunes son los caldos (medios lquidos), tubos con agar inclinado, tubos con agar y cajas de Petri con agar o placas de agar. El agar es una sustancia derivada de un alga marina que se solidifica como un semislido tipo gelatina. Cuando se aaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden cultivarse en l. A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. El proceso requiere cuidado y precisin, y se lleva a cabo siguiendo la tcnica asptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el rea de trabajo o a la persona que lleva a cabo la transferencia. OBJETIVO: Conocer los principios generales de las tcnicas de esterilizacin y entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones microbianas en el laboratorio.

MATERIAL POR EQUIPO: 1 caja de agar nutritivo (por alumno) Marcador indeleble 2 tubos con caldo nutritivo estril (por alumno) 2 tubos con agar nutritivo inclinado estril (por alumno) Gradilla Asa de siembra Encendedor 1 tubo con cultivo en caldo 1 tubo con cultivo en agar inclinado

(El material en letras cursivas ser proporcionado por el profesor)

PROCEDIMIENTO: a) Importancia de las condiciones de asepsia. 1. Marcar las cajas de la siguiente manera: Caja 1: Puntas de los dedos. Caja 2: Hablar frente a la placa. Caja 3: Abiertas. Caja 4: Caja control 2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos. Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite tres veces el trabalenguas de Tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. En tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigo tres tristes tigres. Tapa de nuevo las cajas. La caja 3 se dejar destapada durante toda la sesin de laboratorio. La caja 4 se conservar sin abrir. 3. Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora en posicin invertida. La siguiente sesin examina las placas y registra los resultados en la tabla. Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente. b) Transferencia tubo a tubo. Cada alumno sembrar 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia (Fig. 1): Caldo-Caldo Caldo-Agar inclinado Agar inclinado-Caldo Agar inclinado-Agar inclinado Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa de trabajo, ni en la bata. Al acabar la prctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora a 37 C hasta que te lo indique la profesora.

Figura 1. Procedimiento de transferencia de inculo de tubo a tubo.

Rotular el tubo con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del alumno.

Sostener los tubos con la mano no dominante. Si los tubos tienen un tapn en rosca, afljalo de manera que solo se necesite levantarlo para quitarlo. Si tiene un tapn de algodn, scalo un poco de manera que no est muy apretado.

Flamear el asa en el mechero Bunsen. El asa se sostiene con la mano dominante, como sosteniendo un lpiz o una pluma. Dejar que el alambre se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa unos breves segundos.

Retirar una tapa con el meique y la otra con el dedo anular, mientras sostienes el asa. Nunca poner las tapas sobre la mesa.

Flamear la boca de ambos tubos para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior del tubo durante las manipulaciones.

Insertar el asa dentro del tubo que contiene a la bacteria a ser sembrada. Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo.

Sembrar en el tubo estril un poco de inculo. En el caso de los caldos nicamente inserta el asa en el medio. En el caso del agar inclinado, dibuja con el asa un zig zag en la superficie del agar.

De nuevo flamea las bocas de los tubos y tpalos de nuevo. Asegrate de mezclar muy bien el inculo en los tubos que contienen caldo sembrado.

Flamea el asa hasta el rojo vivo antes de que la coloques en la mesa.

Si estas compartiendo el mechero con algn compaero, debes tener cuidado de no flamear dos asas al mismo tiempo, ya que existe un alto riesgo de que alguien sufra quemaduras.

RESULTADOS Realiza la descripcin morfolgica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas con los distintos tratamiento en relacin a la caja control. Cuadro 1. Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes tratamientos. MEDIO DE Puntas de los Hablar frente Abierta al aire Control CULTIVO dedos a la placa

RESULTADOS

Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. Registra la morfologa macroscpica del microorganismo sembrado en los tubos con agar inclinado y en los caldos de acuerdo a la gua de observacin. DISCUSIN En esta seccin se analizarn los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las siguiente preguntas (entre otras): Debes tocar las cajas de agar con tus manos? Puedes encontrar organismos en el aire? Qu resultados soportan tus conclusiones? Cuando trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar? Por qu s o por qu no? Contesta las siguientes preguntas relacionadas con la tcnica de transferencia: 1. Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen? 2. Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia? 3. Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia? 4. Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado. 5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es necesario tocar una parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de siembra? 7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?

GUA DE OBSERVACIN Tubos con agar inclinado. Observa la figura 2, la cual muestra varias formas de crecimiento que se observan en tubos con agar inclinado y compralas con el tipo de crecimiento que ves en los tubos que sembraste.

Ramificado

Puntiforme

Puntiaguda

Uniforme

Rizoide

Extendido

Figura 2. Tipos de crecimiento en tubos con agar inclinado. Caldos A menos que tengas un cultivo fresco de 24 hrs directo de la incubadora, no vers muchos tubos con turbidez. Esto es porque las bacterias tienden a depositarse o a precipitarse cuando se refrigeran por varios das. Despus de que te fijes si se form un anillo o una pelcula en la superficie del tubo (fig. 3), toma los tubos y observa si se presenta el fenmeno de precipitacin. Una vez que se complet este paso, mezcla las bacterias agitando, dando golpecitos, rodando el tubo en la palma de tu mano. No agites el tubo de manera que la tapa se contamine con el caldo. Una vez mezclado, puedes observar turbidez, floculacin, o una apariencia de hilo dentro del caldo.

No inoculado No inoculado

Turbio

Floculacin

Pelcula

Anillo

Precipitacin

Figura 3. Tipos de crecimiento en tubos con caldo.

CUESTIONARIO a) Glosario. Define los siguientes trminos. 1. Agar 2. Medio de cultivo 3. Caldo de cultivo 4. Incubacin 5. Colonia 6. Inoculacin 7. Contaminacin 8. Tcnica asptica 9. Estril 10. Desinfeccin b) Haz un diagrama de flujo del procedimiento de transferencia microbiana de tubo a tubo. c) Completa el siguiente cuadro: Cuadro 2. Equipo y material de laboratorio. Equipo y Material Caja de Petri Funcin Esquema (opcional)

Mechero de Bunsen

Asa bacteriolgica Pipetas Micopipetas Probeta Matraz Erlenmeyer Balanza analtica Potencimetro Vortex Tringulo Perlas de vidrio Incubadora Refrigerador Campana
Esparcir las bacterias en las placas de agar.