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La trascrizione nei procarioti

Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

Concetti base
Nucleoside
base purinica o pirimidinica legata alla posizione 1 dellanello pentoso

Nucleotide
base azotata-pentoso-fosfato

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Concetti base
La trascrizione comporta la sintesi di una catena di RNA che ha la stessa sequenza di un filamento di una doppia elica di DNA. Il filamento di DNA identico in sequenza allRNA chiamato filamento codificante
il filamento codificante ovviamente complementare allaltro filamento, che funge da stampo per la sintesi dellRNA, ed chiamato per questa ragione filamento stampo o filamento noncodificante.

La sintesi della catena di RNA catalizzata dallenzima RNA polimerasi. La trascrizione comincia quando la RNA polimerasi si lega ad una particolare regione di DNA, chiamata promotore, che si trova allinizio del gene.
fa parte della sequenza del promotore la prima coppia di basi trascritta in RNA, chiamata sito di inizio o punto di inizio della trascrizione.

Partendo dal sito di inizio, la polimerasi si muove lungo lo stampo sintetizzando lRNA, fino a che non raggiunge una sequenza chiamata terminatore
questazione definisce lunit di trascrizione, che si estende dal promotore al terminatore; lunit di trascrizione quindi una sequenza di DNA che viene espressa mediante la sintesi di una singola molecola di RNA
una unit di trascrizione pu codificare per pi di una proteina. Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

Concetti base
Le regioni pi vicine al promotore sono descritte come prossimali, mentre quelle pi lontane sono descritte come distali. Le sequenze precedenti al punto di inizio sono definite sequenze a monte; quelle dopo il punto di inizio (cio allinterno della sequenza trascritta) sono definite sequenze a valle. Per convenzione, le sequenze vengono scritte in modo che la trascrizione procede da sinistra (a monte) a destra (a valle). Ci equivale a scrivere lRNA nella solita direzione 53.

Spesso la sequenza di DNA scritta in modo da mostrare il filamento la cui sequenza la stessa dellRNA. Le posizioni delle basi sono numerate in entrambe le direzioni a partire dal punto di inizio, al quale assegnato il valore +1, e i numeri vanno poi aumentando verso valle. Procedendo verso la regione a monte, le posizioni sono numerate a partire da -1, ed aumentano allontanandosi dal punto di inizio. Il numero 0 non assegnato a nessuna base. Il prodotto della trascrizione chiamato trascritto primario: una molecola di RNA che si estende dal sito di inizio al terminatore, che inizia con lestremit 5 originale e che termina con lestremit 3 originale. Il trascritto primario sempre molto instabile. La trascrizione il primo stadio dellespressione genica. Le proteine regolatrici determinano se un particolare gene sar trascritto oppure no dalla RNA polimerasi. La prima (e spesso lunica) fase di regolazione dellespressione genica la decisione se trascrivere o no un gene. Come fa la polimerasi a trovare i promotori nel DNA?
questo un esempio particolare di una domanda pi generale: come fanno le proteine che legano specificamente il DNA (come gli enzimi di restrizizione) a distinguere il loro specifico sito di legame dalle altre sequenze?

Come interagiscono con la polimerasi le proteine regolatrici per attivare o reprimere la trascrizione? Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

I due filamenti di DNA si separano per formare la bolla di trascrizione


La trascrizione avviene mediante il normale processo di appaiamento di basi complementari. La sintesi dellRNA avviene allinterno di una bolla di trascrizione, una regione in cui i due filamenti di DNA sono separati in maniera transiente
un filamento usato come stampo per la sintesi della catena di RNA: filamento stampo o non-codificante; laltro filamento di DNA ha la sequenza identica a quella della catena di RNA: filamento codificante.

La catena di RNA sintetizzata dallestremit 5 allestremit 3. Il gruppo 3-OH dellultimo nucleotide aggiunto alla catena reagisce con il nucleoside 5 trifosfato entrante, che perde i due fosfati terminali ( e ). Per la RNA polimerasi batterica, la velocit di sintesi di circa 40 nucleotidi/sec.

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La bolla di trascrizione si muove assieme alla RNA polimerasi


La RNA polimerasi crea la bolla di trascrizione quando si lega al promotore. Allinterno della bolla, lRNA sintetizzato mediante appaiamento di basi con il filamento stampo del DNA. Quando la RNA polimerasi si sposta lungo il DNA, la bolla di trascrizione si sposta con lenzima, la doppia elica di DNA si riforma alle sue spalle, spiazzando la catena di RNA. Nel processo, la catena di RNA si allunga. I processi di
- appaiamento delle basi - aggiunta di nucleotidi alla catena nascente di RNA

sono supervisionati dalla RNA polimerasi.


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Le 4 fasi della trascrizione


Riconoscimento dello stampo
comincia con il legame della RNA polimerasi al DNA a doppio filamento, con formazione di un complesso chiuso; poi i filamenti di DNA vengono separati, formando un complesso aperto: la bolla di trascrizione creata grazie ad uno srotolamento locale che comincia nel sito legato dalla RNA polimerasi. sintesi del primo legame nucleotidico nellRNA; lenzima resta sul promotore mentre sintetizza i primi 9 legami nucleotidici. La fae di inizio resa pi lunga dal succedersi di eventi abortivi, nei quali lenzima sintetizza brevi trascritti (<9 basi) , li rilascia e ricomincia la sintesi. La fase di inizio termina quando lenzima riesce ad estendere la catena e lascia il promotore. La sequenza di DNA necessaria per il legame della polimerasi allo stampo e per leffettuazione della reazione di inizio definisce il promotore. lenzima si muove lungo il DNA ed estende la catena di RNA. Muovendosi, lenzima srotola la doppia elica esponendo esponendo una nuova porzione dello stampo a singolo filamento. I nucleotidi vengono aggiunti allestremit 3 della catena nascente di RNA, formando un ibrido DNA-RNA nella regione srotolata. Alle spalle della regione srotolata, il filamento stampo si riappaia con il filamento codificante, riformando la doppia elica e spiazzando la catena di RNA. riconoscimento di un punto nel quale lenzima cessa di aggiungere nucleotidi alla catena di RNA in crescita: dopo laggiunta dellultima base, librido DNA-RNA si dissocia, la bolla di trascrizione collassa riformando la doppa elica, lenzima e lRNA si dissociano dal DNA. La sequenza di DNA che innesca questa reazioni chiamata terminatore.
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Inizio della trascrizione

Elongazione

Terminazione

La RNA polimerasi batterica


Come pu un singolo enzima eseguire cos tanti compiti (legame al DNA, denaturazione dei filamenti, inizio, elongazione e terminazione)? La RNA polimerasi batterica ha dimensioni di 90x95x160 . La struttura mostra che nellenzima c un canale sulla superficie, largo circa 25 . Le dimensioni del canale permettono di contenere circa 16 paia di basi di DNA a doppia elica, ma questo rappresenta solo una parte della regione di DNA legata dallenzima durante la trascrizione. Il DNA viene srotolato nel sito attivo, dove viene sintetizzata la catena di RNA (appena iniziata nella struttura cristallografica).

Nei batteri, una singola RNA polimerasi sintetizza tutto il mRNA e tutti gli rRNA ed i tRNA. Ci sono circa 7000 molecole di RNA polimerasi in una cellula batterica di E. coli e, di queste, tra i 2000 e i 5000 enzimi sono in fase attiva di sintesi.
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Le subunit della RNA polimerasi batterica


Lenzima completo o oloenzima ha una composizione 2. Il nucleo enzimatico (enzima core) ha una composizione 2. La subunit necessaria per lassemblaggio del nucleo enzimatico, ha un ruolo secondario nel riconoscimento del promotore e partecipa nellinterazione della polimerasi con alcuni fattori di regolazione. La subunit (chiamato anche fattore ) ha un ruolo specifico nel riconoscimento delle sequenze del promotore. Le subunit e formano in centro catalitico. Il canale nel quale passa il DNA formato dallinterfaccia tra le due subunit. Sia il filamento stampo che il filamento codificante interagiscono con le due subunit nella regione della bolla di trascrizione: in questa maniera lenzima stabilizza i due filamenti separati. Anche la catena di RNA interagisce con le due subunit nella regione della bolla di trascrizione. Lantibiotico rifampicina (una delle cure principali contro la tubercolosi) blocca la trascrizione della RNA polimerasi batterica legandosi alla subunit a 12 di distanza dal sito attivo, impedendo luscita della catena di RNA in allungamento.
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Le funzioni del nucleo enzimatico e del fattore


Il nucleo enzimatico pu sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non pu iniziare la trascrizione al promotore. Il fattore fa si che la RNA polimeasi si leghi al promotore
il fattore pu essere o non essere rilasciato quando la catena di RNA raggiunge le 8-9 basi, eventualmente lasciando al nucleo enzimatico il compito di portare avanti lelongazione.

Solo loloenzima pu iniziare la trascrizione. Il nucleo enzimatico ha una certa capacit di legare il DNA in maniera non specifica, su quello che viene chiamato sito di legame debole; il DNA in questo caso resta a doppia elica
il complesso a un sito del genere stabile, con unemivita di dissociazione di circa 60 minuti

Il fattore riduce la capacit di legare i siti deboli di 10.000 volte, e lemivita di dissociazione diventa meno di 1 secondo. Il fattore conferisce anche la capacit di legare specificamente i promotori: loloenzima riconosce un promotore circa 107 volte meglio di una sequenza non specifica.
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Linizio della trascrizione


La reazione oloenzima promotore inizia con la formazione di un complesso chiuso binario
il DNA a doppia elica; la reazione reversibile e laffinit dettata dalla sequenza del promotore.

Il complesso chiuso trasformato in un complesso aperto dalla fusione di una breve regione di DNA allinterno della sequenza legata dallenzima (il fattore coinvolto nella reazione). La serie di eventi che conduce alla formazione di un complesso aperto chiamata legame stretto. Lo stadio successivo lincorporazione dei primi due nucleotidi, con la successiva formazione del legame fosfodiesterico. Questo genera un complesso ternario, che contiene DNA, RNA ed enzima. Altri nucleotidi possono essere aggiunti senza che lenzima si muova, fino a generare una catena di RNA di 9 basi. Dopo laggiunta di ogni base, c una certa probabilit che la catena di RNA venga rilasciata, determinando un inizio abortivo, dopo il quale lenzima ricomincia dalla prima base. Superata la fase di inizio, il fattore non pi necessario e lenzima supera la transizione a complesso di elongazione ternario (enzima-DNA-RNA). Il parametro critico il tempo necessario a lasciare il promotore, di modo che unaltra polimerasi possa iniziare: il tempo minimo 1-2 sec.
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La polimerasi cambia forma durante le varie fasi di inizio


Quando loloenzima lega il DNA, copre 75-80 paia di basi, estendendosi da -55 a +20
le dimensioni della RNA polimerasi (160 ) fanno si che essa possa coprire al massimo 50 paia di basi di DNA in forma estesa, quindi ci deve essere qualche forma di torsione in questa fase.

Nella trasnsizione da inizio ad elongazione, lenzima perde contatto con la regione da -55 a -35, quindi le paia di basi coperte dalla polimerasi diventano 60
la parte distale del promotore coinvolta nel legame iniziale della polimerasi, ma non negli stadi successivi

Quando la catena di RNA raggiunge i 15-20 nucleotidi, c una ulteriore transizione e lenzima copre a questo punto 30-40 paia di basi
non si sa se lenzima che cambia conformazione o se il DNA che assume una struttura pi estesa.

Si credeva che il fattore si staccasse dopo la fase di inizio:


in realt, il 70% delle polimerasi in elongazione sono ancora associate al fattore ma la natura dellassociazione deve essere cambiata, perch la polimerasi in elongazione non riconosce pi il promotore.

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Il fattore controlla il legame al DNA


La RNA polimerasi ha diverse necessit durante le fasi di inizio e di elongazione
durante linizio si deve legare solo ai promotori; durante lelongazione deve legare tutte le sequenze.

Il problema risolto grazie allassociazione reversibile tra il fattore e il nucleo enzimatico. Quando il fattore si associa al nucleo enzimatico, loloenzima lega il promotore. Terminata la fase di inizio, il fattore si dissocia (30% dei casi) o cambia la sua associazione (70% dei casi) con il nucleo enzimatico, che adesso mantiene la sua affinit non specifica per il DNA e pu effettuare lelongazione. Terminata lelongazione, il nucleo enzimatico viene rilasciato e pu riassociarsi con un altro il fattore per ricominciare un nuovo ciclo. Il fattore ha un dominio che riconosce il DNA al promotore. Di per se, non lega il DNA, ma quando loloenzima forma un legame stretto, lega il DNA a monte del sito di inizio: la regione N-terminale blocca la regione di legame al DNA nel fattore libero, ma quando lega il nucleo enzimatico, la regione di legame al DNA pu agire.

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Il promotore

Linformazione per la funzione del promotore fornita dalla sequenza del DNA: la sua struttura il segnale (min 12 bp)
il caso delle sequenze di DNA la cui funzione quella di essere riconosciute da proteine, i cosiddetti siti cis-agenti; al contrario le regioni che vengono espresse aquistano un significato solo dopo che linformazione stata trasferita in un altro acido nucleico o in una proteina.

Ogni sequenza essenziale dovrebbe essere presente in tutti i promotori: si dice che la sequenza conservata. Ci sono 4 caratteristiche conservate nei promotori batterici
il sito di inizio: una purina (>90% dei casi), spesso CAT; la sequenza -10: T80A95T45A60A50T96; la sequenza -35: T82T84G78A65C54A45; la distanza tra la sequenza -35 e la sequenza -10.

Mutazioni in gi (down) del promotore


diminuiscono lefficienza e la similitudine al consenso

Mutazioni in su (up) del promotore


aumentano lefficienza e la similitudine al consenso

Mutazioni in gi:
sequenza -35: riducono la formazione del complesso chiuso
ma non bloccano la conversione a complesso aperto

sequenza -10: riducono la conversione a complesso aperto


ma non bloccano la formazione del complesso chiuso

Sequenza -35: dominio di riconoscimento. Sequenza -10: dominio di srotolamento (ricco in A.T).
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La tecnica dellimpronta
La tecnica dellimpronta utilizzata per determinare quale parte di un acido nucleico coperta da una proteina ad esso legata. Una variante della tecnica della impronta consiste nel trattare il complesso DNA-proteina con reagenti che modifichino una base, di modo che successivamente il corrispondente legame venga rotto
si pu legare la proteina al DNA e poi vedere quali basi sono protette da modificazione
alcune bande possono aumentare in intensit, identificando siti in cui il legame della proteina ha creato una conformazione pi esposta

si pu modificare il DNA e poi legare la proteina; le molecole che (a causa della modificazione) non hanno legato la proteina vengono recuperate e analizzate.
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La RNA polimerasi contatta solo una faccia della doppia elica


Le sequenze -35 e -10 contengono la maggior parte dei punti di contatto con la RNA polimerasi La regione di DNA che viene srotolata pu essere identificata con il cambiamanto alla suscettibilit ad agenti chimici
quando i filamenti sono separati, le basi non appaiate divengono suscettibili ad agenti che non possono modificarle quando sono in forma di doppia elica.

Lo srotolamento iniziale avviene tra la posizione -9 e la +3.

I punti di contatto a monte della sequenza -10 si trovano tuti dallo stesso lato della doppia elica: allinizio la polimerasi contatta la doppia elica da un lato solo; poi lenzima comincia lo srotolamento e siti che originariamente si trovavano dallaltro lato (a valle della sequenza -10) entrano in contatto con lenzima.
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Le 4 fasi della trascrizione


Riconoscimento dello stampo
comincia con il legame della RNA polimerasi al DNA a doppio filamento, con formazione di un complesso chiuso; poi i filamenti di DNA vengono separati, formando un complesso aperto: la bolla di trascrizione creata grazie ad uno srotolamento locale che comincia nel sito legato dalla RNA polimerasi. sintesi del primo legame nucleotidico nellRNA;lenzima resta sul promotore mentre sintetizza i primi 9 legami nucleotidici. La fae di inizio resa pi lunga dal succedersi di eventi abortivi, nei quali lenzima sintetizza brevi trascritti (<9 basi) , li rilascia e ricomincia la sintesi. La fase di inizio termina quando lenzima riesce ad estendere la catena e lascia il promotore. La sequenza di DNA necessaria per il legame della polimerasi allo stampo e per leffettuazione della reazione di inizio definisce il promotore. lenzima si muove lungo il DNA ed estende la catena di RNA. Muovendosi, lenzima srotola la doppia elica esponendo esponendo una nuova porzione dello stampo a singolo filamento. I nucleotidi vengono aggiunti allestremit 3 della catena nascente di RNA, formando un ibrido DNA-RNA nella regione srotolata. Alle spalle della regione srotolata, il filamento stampo si riappaia con il filamento codificante, riformando la doppia elica e spiazzando la catena di RNA. riconoscimento di un punto nel quale lenzima cessa di aggiungere nucleotidi alla catena di RNA in crescita: dopo laggiunta dellultima base, librido DNA-RNA si dissocia, la bolla di trascrizione collassa riformando la doppa elica, lenzima e lRNA si dissociano dal DNA. La sequenza di DNA che innesca questa reazioni chiamata terminatore.
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Inizio della trascrizione

Elongazione

Terminazione

Si distinguono due tipi di terminatori:


terminatori intrinseci o rho-indipendenti
il nucleo enzimatico pu terminare a questi siti senza lausilio di altri fattori

La terminazione

terminatori rho-dipendenti
il nucleo enzimatico necessita del fattore rho () per terminare la trascrizione.

La struttura dei terminatori intrinseci presenta due caratteristiche peculiari (entrambe necessarie per la terminazione):
una struttura secondaria a forcina
contiene una regione ricca in G.C alla base

una serie di residui U (circa 6) a valle della forcina.

La polimerasi rallenta o si ferma (circa a 60 secondi) quando ha trascritto la sequenza che forma la forcina. La serie di U necessaria per la dissociazione della RNA polimerasi durante larresto alla forcina
se si accorcia le serie di U, la polimerasi si ferma, ma non termina la trascrizione.

Le sequenze ricche in A.T sono importanti sia nellinizio che nella terminazione rho-indipendente della trascrizione.
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La terminazione rho-dipendente
Rho una proteina essenziale di E. coli, che funziona solamente nella reazione di terminazione; agisce come un esamero di 6 subunit identiche (non un tetramero come scritto su alcuni testi pi vecchi). Circa le met dei terminatori di E. coli sono rho-dipendenti. La caratteristica di un terminatore rho-dipendente una sequenza lunga 50-90 basi, che si trova a monte del sito di terminazione. Caratteristica tipica di queste sequenze che i residui C sono molto frequenti mentre i residui G sono piuttosto rari. Lefficienza di un terminatore rho-dipendente aumenta con la lunghezza della regione ricca di C e povera di G.
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La terminazione rho-dipendente
Rho ha una attivit di ATPasi, dipendente dalla presenza di un poliribonucleotide lungo pi di 50 basi. Probabilmente rho lega la catena di RNA in elongazione o allestremit 5 o su alcune specifiche sequenze esposte. Successivamente, rho trasloca lungo la catena di RNA e, infine, raggiunge la RNA polimerasi. Rho ha una attivit di elicasi 5-3 (lenergia fornita dallidrolisi di ATP) e questo suggerisce che possa direttamente srotolare librido DNARNA nella bolla di trascrizione
alternativamente, rho potrebbe interagire con la RNA polimerasi causando indirettamente il rilascio della catena di RNA.

Il risultato finale la terminazione della trascrizione.


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