Protocolo de extraccin de ADN La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas.

En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol. MATERIALES: Papel para pesar Balanza analtica Bistur Palillos de dientes Tubos de microcentrfuga Microcentrfuga Bao a 55C Bao a 70C Etanol absoluto helado PROCEDIMIENTO: 1. A. Corte y pese 25 mg de tejido (hgado, timo) en pedazos pequeos, depositar en un tubo de centrifuga de 1.5 ml, y aadir 180 l Buffer ATL. O, en su lugar: B. Raspe el epitelio bucal con un palillo de dientes y deposite las clulas sobre papel para pesar y verifique el peso de la muestra. Eche en microtubo y aada 180 l de Buffer ATL. Asegurarse que la cantidad correcta de material se utilize. Para tejidos como el bazo, con un nmero alto de clulas para una masa determinada de tejido, no utilizar ms de 10 mg del material. 2. Aadir 20 l de proteinasa K, mezclar por vortex, e incunbar a 55 C hasta que el tejidoeste completamente lisado. Mezclar por vortex ocasionalmente durante el periodo de incubacin para dispersar la muestra. El tiempo de lisis varia dependiendo del tejido que se utilize. Lisis usualmente se completa de 1 a 3 hrs. Si es ms conveniente, las muestras pueden dejarse lisando hasta el otro da. Luego de la incubacin, el lisado puede parecer viscoso pero no debe estar gelationoso ya que puede tapar la columna "DNeasy spin". Si esto sucede hay que lisar de nuevo, usando esta vez menos material 3. Opcional: Tratamiento de la muestra con Rnasa. Aadir 4 l de RNasa A (100 mg/mL), mezclar por vortex e incubar por 2 minutos a temperatura ambiente. Tejidos que estan activos transcripcionalmete tal como el hgado y los riones continen niveles altos de RNA, que copurifican con el DNA genmico. Este paso es necesario si se requiere DNA libre de RNA . Este paso se puede omitir si el RNA residual no es de importancia.

4. Vortex por 15 s. Aadir 200 l de Buffer AL a la muestra, mezclar completamente por vortex e incubar a 70 por 10 min. Es esencial que la muestra y el Buffer AL sean mezclados inmediatamente y completamente por vortex o pipeteando para obtener una solucin homognea. Un precipitado blanco se puede formar cuando se le aada el buffer AL. En la mayora de los casos este se disuelve durante la incubacin a 70 C. El precipitado no interfiere con el procedimiento de Dneasy. Algunos tejidos ( baso, pulmones) podran formar un lisado gelationoso luego de aadir el Buffer AL. En estos casos, batir vigorosamente o hacer vortex antes de aadir el etanol en el prximo paso. 5. Aadir 200 l de etanol absoluto (96 - 100%) a la muestra, mezclar completamente con el vortex. Es muy importante que el Buffer AL, y el etanol sean mezclados hasta obtener una mezcla homognea. Un precipitado blanco se puede formar cuando se aada el etanol. Este contiene el DNA de la muestra. Es esencial que se aada todo el precipitado a la columna DNeasy spin. 6. Pipetear la mezcla del paso 5 dentro de la columna DNeasy spin que se encuentra en un tubo de recoleccin de 2 mL. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin. 7. Colocar la columna de DNeasy spin en otro tubo de recoleccin de 2 mL, aadir 500 l Buffer AW1, y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm) Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin. 8. Colocar la columna de DNeasy spin en otro tubo de recoleccin de 2 mL, aadir 500 l de Buffer AW2, y centrifugar por 3 minutos a velocidad mxima para secar la membrana del Dneasy. Descartar lo que pas por la columna y el tubo de recoleccin. Esta centrifagacin asegura que no quede nada de etanol residual. Luego del paso de centrifugacin, remover la columna de Dneasy spin, cuidadosamente para que esta no tenga contacto con el tubo de recoleccin, ya que esto causara que se contaminara con etanol. ( Si se contamina, vaciar el tubo de recoleccin y reusarlo en otro paso de centrifugacin por 1 min a velocidad mxima. 9. Colocar la columna de DNeasy spin en un tubo de microcentrfuga limpio de 1.5 - 2 mL y pipetear 200 l de Buffer AE directamente a la membrana de Dneasy. Incubar a temperatura ambiente por 1 min, y luego centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rmp) para eluir. Eluir con 100 l (en vez de 200 l) aumenta la concentracin final de DNA en el eludo, pero tambin disminuye la cantidad de DNA que se obtiene. 10. Repetir la elucin como descrita en el paso 9. Un nuevo tubo de microcentrfuga puede ser utilizado para el segundo paso de elucin para prevenir la dilucin del primer eluido. En la segunda elucin, el tubo de microcentrfuga del paso 9 puede ser utilizado para combinar los eluidos. Nota: No deben ser eluidos ms de 200 l a la vez a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL ya que la minicolumna de DNeasy puede tener contacto con el eluido.