Anlise Diagnstica de um

PESQUISA

Produto Transgnico
Institute of Agricultural Botany Rheinische Friedrich-Wilhelms-University of Bonn Physiology and Biotechnology of Plants Ulp50b@uni-bonn.de

Pedro C. Binsfeld

O CASO DO TOMATE FLAVR SAVR

Foto cedida pelo autor

biotecnologia rejuvenesceu com a revoluo da engenharia gentica. Durante a ltima dcada do sculo XX, inmeros produtos biotecnolgicos deixaram de ser uma promessa para se tornar uma realidade do

Figura 1. Representao esquemtica do vasto pool gnico e mtodos de melhoramento aplicados na transferncia de genes entre espcies em programas de melhoramento de plantas

nosso cotidiano. Entre esses, incluemse inmeros produtos usados na medicina, no processamento industrial, na produo de alimentos e na agricultura
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(Tabela 1). Entre os produtos da engenharia gentica consolidados encontramse quase que exclusivamente os controlados por genes nicos, isto , por monogenes. Porm, o grande desafio da nova era da engenharia gentica para o incio do prximo milnio ser o controle de processos ou rotas metablicas que envolvam genes mltiplos, abrindo-se, assim, uma nova pgina na evoluo dessa tecnologia, bem como a possibilidade de gerar produtos inovadores. O melhoramento de plantas agrcolas obtido por meio do acmulo de genes que conferem maior produtividade e qualidade aos produtos agrcolas, assim como conferem maior tolerncia a fatores de estresses biticos e abiticos. Para alcanar esse objetivo, os melhoristas lanam mo de complexos sistemas de cruzamentos e retrocruzamentos quando os genes de interesse localizam-se na mesma espcie. Porm, quando os genes de interesse encontram-se fora do pool gnico primrio da espcie, a engenharia gentica oferece as ferramentas bsicas para identificar, selecionar, isolar e transferir genes especficos escolhidos dentro de um vasto pool gnico englobando um amplo espectro de seres vivos como fonte de genes (Figura 1). Plantas transgnicas caracterizam-se

por possuir um ou mais genes provenientes de um pool gnico mais distante. Pelo uso dessa tecnologia espera-se produzir novos produtos ecologicamente sustentveis, mais produtivos, com superior qualidade e que sejam capazes de colaborar na soluo da falta nutricional dos mais de 1,5 bilho de pessoas no mundo, que sofrem de subnutrio (Malik, 1999), bem como, reduzir substancialmente a agresso ao meio ambiente (Sachse, 1998). Porm, antes que produtos de plantas transgnicas cheguem ao mercado consumidor, a legislao prev que esses sejam analisados sob diversos aspectos, garantindo seguridade para o homem, animais e meio ambiente. Tais anlises envolvem inmeros testes bioqumicos, fisiolgicos, alimentares, testes de impacto ambiental e, finalmente, testes de campo. Desde 1986, aps os primeiros testes de campo com plantas transgnicas, j foram realizados testes de campo com mais de 40 espcies de culturas agrcolas transformadas, em 31 pases (Bilang. & Potrikus, 1997). Desde que se iniciou o uso comercial de plantas transgnicas nos EUA, em meados da dcada de 90, tem-se tido um crescimento mdio de 20% ao ano na oferta de novos produtos provenientes da engenharia gentica (Kleinmann, 1998). Por meio da engenharia gentica de plantas, pode-se alterar importantes rotas metablicas e, com isso, promover a alterao no tipo e composio de amido, leos, protenas, vitaminas, etc. Com essas modificaes objetiva-se: 1) elevar o valor nutricional dos alimentos, 2) melhorar o processamento industrial e a comercializao dos produtos, 3) desenvolver plantas transgnicas que funcionem como bioreatores, onde seja possvel produzir polipeptdios de valor farmacutico, como, por exemplo, vacinas na forma de antgenos de vrus ou anticorpos, e 4) produzir inmeras enzimas (protenas) para fins industriais. A lista de reas de aplicao dessa tecnologia poderia ser significativamente estendida. Porm, para efeitos concretos, analisaremos a seguir um produto de engenharia gentica (Tomate-FLAVR SAVR) sob o aspecto da segurana alimentar. O caso do tomate FLAVR SAVR O tomate denominado de FLAVR SAVR, modificado pela engenharia gentica, produzida pela empresa Calgene, EUA, foi liberado pela USDA para ser comercializado desde 1994 (Schlter & Potrikus, 1997). O objetivo da empresa foi produzir um tomate que durante a maturao amolecesse vagarosamente. Assim, em vez de colher os frutos verdes,

Figura 2. Frutos de tomate convencional em avanado processo de maturao (esquerda), frutos do tomate FLAVR SAVR, com desacelerado processo de amolecimento (direita) esses poderiam permanecer na planta para maturar at ficarem vermelhos. Isso melhoraria a qualidade dos frutos sem que implicasse perdas na colheita, no transporte e no armazenamento, uma vez que os frutos vermelhos e firmes, em sua consistncia, assemelham-se aos que so colhidos verdes. Variedades de tomate que produzam frutos firmes podem ser obtidas tambm pelos mtodos tradicionais de melhoramento. Porm, at o momento, no foi possvel transferir o gene de plantas silvestres para a cultura sem que houvesse tambm a transferncia de inmeros caracteres indesejveis. A engenharia gentica tem sido usada como ferramenta auxiliar no melhoramento de espcies vegetais, por oferecer elevada preciso na transferncia de um ou mais genes, oriundos da prpria ou de outra espcie, sem que haja perda das caractersticas desejveis da espcie transformada, obtendo-se assim o somatrio de caracteres desejveis. O amolecimento do fruto do tomate na maturao causado pela presena e ao de uma enzima denominada poligalacturonase (PG). Essa enzima degrada a pectina, que um importante componente da parede celular de frutos imaturos. Durante a maturao, o amolecimento dos frutos diretamente proporcional presena e ao dessa enzima, assim o processo do amadurecimento pode ser retardado se essa enzima for freada (Figura 2). Para essa finalidade, isolou-se uma cpia da seqncia gnica do tomate que codifica para a PG e esta foi transferida novamente para a planta no sentido invertido (Antisenso). O gene antisenso da PG foi ligado a um promotor constitutivo, isto , um promotor que est ativo continuamente. Por esse processo, supe-se que a mRNA antisenso do gene da PG seja anelado ao mRNA do gene da PG normal

do tomate e, assim, freie a sntese da enzima PG (isto , o produto gnico). O mecanismo preciso desse processo no est completamente elucidado, porm, tem-se indicativos de que o mRNA seja afetado em diferentes nveis, como na estabilidade, na transcrio, no transporte e na traduo. Alm do gene antisenso da PG, transferiu-se tambm um gene marcador, que facilita a identificao e a seleo das plantas transgnicas. Como gene marcador usou-se o gene nptII associado a um promotor constitutivo. O gene nptII codifica para a enzima fosforiltransferase [APH(3)II], tambm conhecida como neomicina fosfotransferase II (NPT II), que, pela fosforilao, inativa os antibiticos do grupo aminoglicosdios (Neomicina, Canamicina e Gentamicina) (Schlter & Potrikus, 1997). A construo gnica compreendida pelo gene antisenso da PG e o gene marcador foi transferida mediante o vetor Agrobacterium tumefaciens. A caracterizao das plantas transgnicas foi realizada por de anlises moleculares e testes de segregao gnica. Os resultados mostraram que o nmero de cpias do gene antisenso da PG e nptII variava entre 2 a 6 cpias por planta transformada. Os genes distribuiam-se em diferentes regies do genoma. Foi observado tambm que os genes eram transferidos para a progenie e segregavam de acordo com as leis de Mendel (Bilang & Potrikus, 1997; Schlter & Potrikus, 1997). A segurana do tomate transgnico, bem como sua eqivalncia com as variedades produzidas por mtodos de melhoramento convencional, tem sido questionada. Na prtica, no tomate transgnico tem-se somente o gene nptII e o seu produto gnico, a enzima NPT II, como novo componente, pois o gene PG foi isolado do prprio tomate e, depois, inserido novamente em sentido contrrio. Mesmo assim, a transformao e a introduo de genes no genoma receptor podem provocar alteraes genotpicas e fenotpicas inesperadas, pois podem ocorrer mutaes pela integrao de novos genes, j que a integrao de genes pode ocorrer em regies codificadoras, podendo-se esperar que genes da planta receptora sejam desativados (silenciados) ou outros ativados pela inativao de genes supressores. Mutaes e efeitos pleiotrpicos, causados pela integrao gnica, podem ser esperados quando se usa o vetor Agrobacterium. Mutaes e efeitos pleiotrpicos, no entanto, no so exclusivamente causados pelo evento da transformao, mas tambm so verificados
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em plantas criadas pelos mtodos convencionais de melhoramento (Kleinmann, 1998). Um critrio de avaliao de plantas transgnicas a identificao de caractesticas atpicas (mutaes). Essas, podem originar-se da tcnica de cultura de tecidos ou serem resultantes da transformao gentica. Plantas com anomalias so eliminadas, mantendo-se somente plantas que no exibem alteraes fenotpicas, com exceo da caracterstica para a qual foi feita a transformao da planta. Avaliao Em geral, tomates frescos so analisados e testados para sabor, aroma, textura e cor, enquanto que produtos do tomate (sucos, molho, polpa concentrada, etc.) so avaliados para quantidade de carotenides (Pr-vitamina A e Licopeno), vitamina C, composio total de slidos solveis, teor de acar, teor de cidos (citrato e malato), assim como a viscosidade e a consistncia. A viscosidade , em grande parte, funo da concentrao de molculas de pectina, enquanto que a consistncia depende da quantidade e estruturao dos slidos solveis. No tomate transgnico, adicionalmente foram analisados os seguintes componentes: gordura, protenas, tiamina, riboflavina, vitamina B6, cido nicotnico, clcio, magnsio e fsforo, como tambm a presena de potenciais toxinas, como os glicoalcalides tomatina e solanina. De acordo com a anlise dos componentes do FLAVR SAVR, no ocorreram alteraes na composio nutricional (Tabela 2), exceto as j esperadas na degradao da pectina. Devido a ao do gene antisenso PG no tomate transgnico, tanto o mRNA quanto a atividade enzimtica da PG foram freados em 90-95%. Com essa reduo da atividade da PG, obtevese um processo desacelerado da degradao da pectina no fruto. Isso implicou numa maior conservabilidade (Figura 2), aumento do rendimento, melhorou o processamento industrial e aumentou a tolerncia a patgenos (Schlter & Potrikus, 1997). Comparando o sabor do tomate transgnico com o do tomate convencional, no foi constatada nunhuma alterao quando estes foram colhidos no mesmo estdio de maturao. Para os glicoalcalides (tomatina e solanina) no se constatou diferenas em relao ao tomate convencional. A variao constatada entre diferentes frutos de uma mesma planta foi devido a diferena no grau de maturao dos frutos. Em frutos verdes, o teor desses glicoalcalides chega a miligramas, enquanto que em frutos maduros, devido a presena da enzima tomatinase, o teor encontrado foi da ordem de microgramas
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(Redenbaugh et al. 1994). A toxicidade da enzima NPT II foi testada para verificar se esta no poderia representar um risco sade, mesmo que ela no tenha parentesco com protenas txicas. No cotidiano, estima-se que cada pessoa ingira juntamente com saladas e verduras cruas, at 1,2x106 bactrias resistentes canamicina que possuem essa enzima. A NPT II liberada pela morte e lise bacteriana no trato digestivo humano, assim como acontece pela ingesto de um tomate transgnico. Porm, para verificar o que acontece com a enzima NPT II, simulou-se uma digesto cida (estmago) e alcalina (intestino). Tomou-se a enzima NPT II purificada e submeteu-a ao suco estomacal. Neste, a NPT II foi destruda aps 2 minutos de incubao, enquanto que, no suco intestinal, a ao proteoltica foi um pouco mais lenta e a protelise da NPT II deuse em 5 minutos (Schlter & Potrikus, 1997). Na seqncia, testou-se a enzima ativa e purificada na alimentao de camundongos, onde ministrou-se uma dose nica de 150 mg da enzima NPT II. Essa dose representa o contedo enzimtico de mais de 1 milho de tomates transgnicos. Nos 7 dias subseqentes ao tratamento, no ocorreram mortes ou alteraes de comportamento dos camundongos. Igualmente, no puderam ser verificadas alteraes de peso ou indcios patolgicos nos rgos dos animais. Paralelamente ao experimento anterior, conduziu-se outro experimento, onde tratou-se ratos com tomate transgnico durante 28 dias. A dosagem de tomates ingerida pelos ratos representaria para o homem o consumo de, aproximadamente, 100 tomates por dia. Tambm nesse caso, no foram constatados efeitos negativos da enzima NPT II sobre os animais. Essa enzima no possui homologia com alergnicos conhecidos, alm disso, faltam NPT II as tpicas caractersticas dos alergnicos, tais como, estabilidade ao calor e estabilidade contra atividade proteoltica das enzimas digestivas. Freqentemente, questiona-se se a atividade antibitica seria reduzida ou inativada com o consumo de produtos transgnicos que contenham NPT II, no caso de um tratamento com canamicina e neomicina. Mesmo que o consumo do tomate fosse elevado, pela rpida atividade proteoltica no trato digestivo, a presena dessa enzima seria muito baixa, de modo que o risco nesse caso, pode ser descartado. Um eventual risco, porm reduzido, poderia ocorrer se o antibitico fosse consumido juntamente com o tomate transgnico. Porm, para isso se-

riam necessrias condies ideais como: 1) toda a enzima NPT II deveria estar livre no suco gstrico, 2) deveria ter disponibilidade suficiente de ATP no meio e 3) o suco gstrico deveria estar tamponado em pH 7,0, o que na prtica irreal (Schlter & Potrikus, 1997). Via de regra, administra-se, por via oral, os antibiticos do grupo aminoglicosdios a pacientes nos casos de encefalopatia sistmica e de cirurgia de intestino. Neste ltimo caso, improvvel que o paciente ingira alimentos slidos antes da interveno cirrgica, portanto, no haveria risco de inativao da canamicina. No caso da encefalopatia sistmica, a inativao da neomicina, segundo clculos, poderia ser, no mximo, de 1,5% se o paciente ingerisse tomate transgnico juntamente com o antibitico (Redenbaugh et al. 1994). Outra preocupao freqentemente mencionada se poderia haver a transferncia do gene nptII da planta transformada para bactrias do trato digestivo ou bactrias patognicas. Clculos de probabilidade mostraram que tal evento, por vrias razes, muito raro. Isso porque o local da provvel transformao seria na parte posterior do intestino delgado (leo) e do intestino grosso (clon), onde se encontra uma quantidade enorme de bactrias. Nesse ponto, os alimentos chegam digeridos e o DNA fragmentado. Porm, a concentrao de DNA que estaria disponvel nesse local mnima, uma vez que, 10 minutos no suco estomacal e mais 10 minutos no suco intestinal as extensas molculas de DNA so degradadas em pequenos fragmentos, onde mais de 99,99% destes so menores que 1 kb, tamanho correspondente ao tamanho do gene nptII. Fragmentos menores poderiam ser integrados ao genoma, mas no resultariam em uma seqncia capaz de produzir uma enzima ativa. Isso mostra que a quase totalidade do DNA do tomate transgnico destrudo no trato digestivo, no havendo, portanto, risco de transferncia por essas vias. Especula-se tambm que o gene nptII possa ser integrado ao genoma de clulas humanas, como, por exemplo, em clulas epiteliais do intestino. Para esse aspecto, no h pesquisas acabadas. Porm, a probabilidade de que isso ocorra infinitamente reduzida. Primeiro, porque, habitualmente, clulas eucariticas no tendem a integrar genes estranhos e essas possuem nucleases prprias que destroem DNA estranho que venha a penetr-las. Segundo, a maior parte da alimentao que ingerimos composta por genes e no se tem conhecimento de que, por isso, tenham-se introgredido novos genes nas clulas epiteliais do intestino. Terceiro, a vida mdia

de clulas epiteliais do intestino relativamente curta. Se ocorresse o caso de uma eventual transferncia, a probabilidade de que esse gene se estabilizasse seria pouco provvel, porque a clula j estaria em processo de morte. Porm, supondo que houvesse transferncia e expresso do gene nptII na clula humana, isso no levaria a uma nova caracterstica, j que as clulas humanas, naturalmente, j possuem elevada resistncia canamicina e neomicina. Caso contrrio, no poderamos tomar esses antibiticos (Redenbaugh et al. 1994, Schlter & Potrikus, 1997). Concluso Conforme fica transparente para o produto transgnico aqui analisado, o risco pelo consumo humano ou animal no significante. Porm, essa no uma afirmativa que vale para todos os produtos da engenharia gentica. Assim, como se analisou o tomate FLAVR SAVR, necessrio que todos os produtos transgnicos sejam examinados, avaliados e julgados, caso a caso, tendo em vista a sua finalidade benfica e que, em concordncia com a legislao e baseados nos preceitos ticos, morais, scio-econmicos e de segurana ambiental, venham garantir vantagens ao consumidor e ao processo produtivo, sem que, no entanto, se ponha em risco a vida e sua evoluo como processo dinmico e multivarivel. Bibliografia Bilang, R. & Potrikus, I. Pflanzenzchtung. In: Gassen, H.G. & Hammes, W.P. Handbuch Gentechnologie Lebensmittell. 1Auflage. Hamburg - Behr Verlag, 1997. Kleinmann, K. Gentechnik im Lebensmittelbereich. In: Matissek & Reinhould (ed.) Lebensmitttelchemische Gesellschaft. 1 Auflage - Hamburg - Behr Verlag, 1998. Malik, V.D. Biotechnology: Multibilion Dollar Industry. In: Chopra, V.L., Malik, V.D. & Bhat S.R. Applied plant biotechnology. Science Publishers, Inc. USA, 1-69, 1999. Redenbaugh, K., Hiatt, W., Martineau, B., Lindemann, J. & Emlay, D. Aminoglycoside 3-prosphotransferase II (APH(3)II): review of ist safety and use in the production of genetically engenered plants. Food Biotechnology 8, 137-165, 1994. Sachse, L. Gentechnik im Lebensmittelbereich. In: Matissek & Reinhould (ed.) Lebensmitttelchemische Gesellschaft. 1 Auflage - Hamburg - Behr Verlag, 1998. Schlter K. & Potrikus I. Anwendungsbeispiele fr die Gentechnik bei Lebensmitteln, transgene Nutzpflanzen. In: Gassen, H.G. & Hammes, W.P. Handbuch Gentechnologie Lebensmittell. 1 Auflage, Hamburg - Behr Verlag, 1997.

Tabela 1. Alguns exemplos de produtos obtidos atravs da engenharia gentica que j so amplamente utilizados no cotidiano (Kleinmann, 1998; Sachse, 1998, Malik, 1999)

Tipo de produto Insulina humana Vacina anti-Hepatite B Alteplase Interferon- 2b Fator anti-hemoflico Hormnio do crescimento humano Interferon- Culturas agrcolas Tomate Canola Milho Batata Soja Algodo

Indicao de uso Diabetes Preveno da hepatite B Preveno de infarto do miocrdio Tratamento da leucemia Hemofilia A Deficincia de crescimento Tratamento de esclerose mltipla Fentipo verificado Maturao retardada Alterao da composio do leo Resistncia a insetos Resistncia a viroses Tolerncia a herbicidas Tolerncia a herbicidas Tipo de enzimas Com protease, lipase, celulase, amilase Lipases Pectinase Chimosina Amilase e amiloglicosidase

Aplicao industrial

Detergentes e sabo em p Produo de papel Produo de sucos e vinhos Produo de queijos Produo de lcool

Tabela 2. Comparao do tomate transgnico FLAVR SAVR e o tomate no transgnico (Schlter & Potrykus 1997)

Caractersticas Alteradas Caractersticas No Alteradas Sabor Colorao do fruto Caractersticas de processamento Viscosidade do suco Caractersticas de produo Resistncia a doenas fngicas Amolecimento do fruto Teor de toxina Teor de protenas Teor de Vitamina A Teor de Vitamina B1 (Tiamina) Teor de Vitamina B2 (Riboflavina) Teor de Vitamina C Teor de cido nicotnico Teor de clcio Teor de magnsio Teor de fosfato Teor de sdio Teor de ferro Componentes
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