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Universidade de So Paulo
Tpicos
Os nucleotdeos so formados por uma base nitrogenada ligada a um acar (ribose), o qual possui ao menos um grupo fosfato ligado.
Purina
Pirimidina
Bioqumica I 1 semestre de 2010
As mais comuns so a adenina (A) e a guanina (G) As purinas se ligam a um acar de 5 carbonos (uma pentose) por meio do tomo N9
As principais so a timina (T), a citosina (C) e a uracila (U) As pirimidinas se ligam a um acar de 5 carbonos (uma pentose) por meio do tomo N1
Nucleosdeo
Nucleotdeo
c. Nuclico
Desoxiadenosina
Guanina Guanosina Desoxiguanosina
Desoxiadenilato
Guanilato Desoxiguanilato
DNA
RNA DNA
Pirimidinas
Citosina Citidina Desoxicitidina Timina Timidina Citidilato Desoxicitidilato Timidilato RNA DNA RNA
Desoxitimidina
Uracila Uridina
Desoxitimidilato
Uridilato
DNA
RNA
Bioqumica I 1 semestre de 2010
Ribonucleosdeos e desoxirribonucleosdeos
Os ribo e desoxirribonucleotdeos
Os ribo e desoxirribonucleotdeos
Os ribonucleotdeos so encontrados no RNA (cido ribonuclico) Os desoxinucleotdeos so encontrados no DNA (cido desoxirribonuclico) A, G e C so encontrados nos ribonucleotdeos e nos desoxiribonucleotdeos U encontrada basicamente em ribonucleotdeos, e T somente em desoxiribonucleotdeos
Nas clulas, a maioria dos nucleotdeos encontram-se na sua forma polimrica (DNA ou RNA) Principal funo: armazenamento e a transferncia da informao Nucleotdeos livres e derivados desempenham uma grande variedade de funes metablicas norelacionadas informao gentica
Nucleotdeos livres
O ATP
O ATP um carreador ou transmissor de energia Difunde-se pela clula, fornecendo energia para as tarefas celulares, como reaes biossintticas, transporte inico e movimento celular A energia disponibilizada pela transferncia de 1 (ou 2) dos grupos fosfato a outra molcula
Apesar das variaes no metabolismo energtico dos diferentes organismos, diversos derivados de nucleotdeos destacam-se pela sua universalidade.
So eles:
FAD
Contm uma adenosina ligada riboflavina por meio de dois grupos fosfato
NAD
Participa de reaes de oxidao-reduo A adenosina est ligada por meio de dois grupos fosfato a uma ribose, e a nicotinamida
NADP
A adenosina est ligada por meio de dois grupos fosfato a uma ribose, e a nicotinamida Um terceiro grupo fosfato est ligado ribose da adenosina na posio 2. A poro nicotinamida, derivada da vitamina niacina o stio da reduo reversvel A base nicotinamida do NAD est ligada a uma base ribose fosforilada, formando um dos dois nucleotdeos desse dinucleotdeo
Coenzima A (CoA)
Os nucleotdeos podem ser unidos entre si e formar polmeros, o RNA e o DNA Os cidos nuclicos so cadeias de nucleotdeos ligados por pontes de grupo fosfato nas posies 3 e 5 de unidades de ribose vizinhas Os fosfatos so cidos, por isso os cidos nuclicos formam polinions em pH fisiolgico
Bioqumica I 1 semestre de 2010
O DNA possui um nmero de resduos de adenina igual ao de timina (A=T) e de citosina igual ao de guanina (C=G) Essas relaes so conhecidas como regra de Chargaff anos 40 Erwin Chargaff Sua composio difere bastante entre os diversos organismos Bactrias: contedo G+C varia de ~25 a 75% mais ou menos constante entre espcies relacionadas mamferos: G+C varia de 39 a 46%
Bioqumica I 1 semestre de 2010
A base estrutural para essa regra derivada da natureza da fita dupla do DNA
A dupla hlice
A estrutura do DNA foi determinada por James Watson e Francis Crick em 1953 marco do surgimento da biologia molecular moderna No apenas a molcula fundamental da vida, mas sua estrutura sugeriu o mecanismo molecular da hereditariedade As descobertas foram baseadas nas regras de Chargaff e nas formas tautomricas corretas das bases molcula helicoidal
Bioqumica I 1 semestre de 2010
As bases pricas e pirimdicas dos cidos nuclicos podem assumir diferentes formas tautomricas
Tautmeros so ismeros de converso fcil, diferindo entre si apenas nas posies dos hidrognios
2.
As duas fitas de DNA so antiparalelas, mas cada uma forma uma hlice para o lado direito
Cadeia de acar
4. Cada base est ligada a uma base da fita oposta por meio de ligaes de hidrognio, formando um par de base planar - pareamento de fitas complementares associao especfica das duas cadeias da fita dupla.
A guanina realiza trs ligaes de hidrognio com citosina, e a timina realiza duas ligaes de hidrognio com adenina
Genoma
O genoma de um organismo contedo especfico de DNA pode estar distribudo em diversos cromossomos, cada um contendo uma molcula de DNA separada. Vrios organismos so diplides dois conjuntos equivalentes de cromossomos. Devido ao seu comprimento, as molculas de DNA so descritas em termos do nmero de pares de bases (pb ou kb).
Bioqumica I 1 semestre de 2010
O caritipo humano
Foi em 1944 que Avery, Macleod e McCarty mostraram que o DNA, e no as protenas, era a substncia que transformava uma cepa no-patognica em patognica. A natureza da fita dupla do DNA facilita a replicao. Quando a clula se divide, cada fita de DNA atua como molde para a sntese da sua fita complementar
A replicao do DNA semiconservativa: Watson e Crick observaram que um dos filamentos de cada molcula filha de DNA sintetizado, enquanto o outro passado inalterado vindo da molcula original de DNA.
A replicao de DNA feita por uma interao complexa e coordenada de mais de 20 protenas, dentre elas, as DNA polimerases I, II e III so importantes na replicao do DNA, alm da primase, helicase, topoisomerase e DNA ligase.
fita.
Topoisomerase
Helicase
http://www.johnkyrk.com/DNAreplication.html
Replicao
RNA primase: sintetiza os iniciadores de RNA, pois a sntese de DNA inicia-se sempre na terminao 5 Helicase: enzima dependente de ATP com a funo de desenrolar a dupla hlice Topoisomerase: promove o desenrolamento contnuo na forquilha de replicao Single-stranded-binding (SSB): impede que as fitas de DNA se reanelem, mantendo a fita simples em estado no-pareado.
A replicao
DNA polimerase I
DNA polimerase I (DNA Pol I): uma enzima processiva, pois catalisa vrios passos sucessivos na polimerizao de nucleotdeos Funo essencial: sntese da fita descontnua, onde remove os iniciadores de RNA e substitui por DNA Possui atividade exonuclesica 5 3 e 3 5
A atividade 3 5 permite que a DNA Pol I corrija erros: esse mecanismo de correo de erros de leitura explica a alta fidelidade da replicao do DNA pela DNA Pol I
DNA Pol II participa no reparo do DNA, mas tambm pode replicar DNA quando o filamento molde danificado
DNA Pol III denominada de replicase. capaz de sintetizar uma fita de DNA complementar a um molde de fita simples e corrigir a reao de polimerizao para aumentar a fidelidade
A DNA polimerase
Replicao
A bolha de replicao
A replicao do DNA bidirecional: uma "bolha" de replicao com
duas forquilhas que se movimentam em sentidos opostos
Bioqumica I 1 semestre de 2010
A fita descontnua
A DNA Polimerase I com atividade exonuclesica 5 3 liga-se a fita dupla de DNA em locais de abertura na fita simples (quebras). A fita simples com quebras clivada em uma regio pareada alm da quebra liberando o DNA em mononucleotdeos
Bioqumica I 1 semestre de 2010
DNA ligase
Transcrio
A transcrio consiste na sntese de RNA. Ela realizada por um complexo enzimtico cuja enzima chave a RNA polimerase, composta de vrias subunidades e que realiza a polimerizao do RNA a partir de um molde de DNA.
Esse processo ocorre em trs etapas principais, a iniciao, o alongamento e o trmino, cada um contendo fatores especficos
Transcrio
Trs passos da transcrio: iniciao (stio de iniciao promotor), elongao e terminao (stio de terminao) Sentido da leitura: 3 5
RNA transcrito:
5 3
A transcrio
Enzima responsvel pela sntese de RNA dependente de DNA Acopla ribonucleosdeos trifosfatos (NTPs) em moldes de DNA em uma reao promovida pela liberao e subsequente hidrlise de PPi. (RNA)n resduos + NTP (RNA)n + 1 resduos + PPi 2Pi
H2O
Transcrio
Terminao da transcrio
Uma srie de 4 a 10 pares de bases AT consecutivos com as As na fita molde. O RNA transcrito terminado nessa sequncia ou logo aps;
Uma regio rica em G+C com uma seqncia palindrmica que imediatamente precede a srie de AT;
O RNA transcrito dessa regio pode ento formar uma estrutura de grampo auto complementar terminada por vrios resduos U.
Processamento ps-transcricional
Os produtos imediatos da transcrio os produtos primrios no so necessariamente funcionais. Para adquirir atividade biolgica, muitos deles devem ser especificamente alterados
O processamento inicial, que forma os produtos conhecidos como prRNAr, comea enquanto o transcrito primrio ainda est sendo sintetizado e consiste em clivagens endonucleolticas especficas pelas RNases III, P, E e F em locais de clivagem especficos
Bioqumica I 1 semestre de 2010
O RNA ocorre principalmente como fita simples, em geral formando estruturas compactas em vez de cadeias frouxas estendidas Uma fita de RNA idntica fita de DNA, exceto pela presena de grupos 2-OH e pela substituio da timina por uracila Pode parear com uma fita complementar de RNA ou DNA O pareamento das bases intramolecular, formando estruturas em grampo ou estruturas mais complexas.
Tipos de RNA
A traduo
O RNA que corresponde ao gene que codifica uma protena o RNA mensageiro (RNAm)
Este vai at o ribossomo organela composta em grande parte por RNA ribossmico (RNAr)
No ribossomo cada grupo de trs nucleotdeos no RNAm pareia com trs nucleotdeos complementares em uma pequena molcula de RNA o RNA transportador (RNAt) Cada molcula de RNAt est ligada a um aminocido correspondente
A traduo
A traduo
A reao qumica que une os aminocidos de modo covalente catalisada pelo RNAr (RNA + peptidil transferase) exemplo de RNA cataltico
Lembrar que: As protenas suplantaram o RNA como catalisadores celulares devido sua maior versatilidade qumica
A regio de DNA codificante para arginina 3-GCC-5, a qual transcrita, por pareamento de bases para o cdon do RNAm 5-CGG3, o qual liga-se a um RNAt com o anticdon 3-GCC-5
Os cdons
DNA e protenas so polmeros lineares de unidades repetitivas. A informao gentica estocada na seqncia de 4 tipos de nucleotdeos da fita de DNA codificada numa seqncia protica com 20 possveis aminocidos. O mecanismo molecular desta converso a traduo, em que uma trinca de nucleotdeos (cdon) traduzido num aminocido.
Mudana ps-traducional
Tcnicas de clonagem Bibliotecas genmicas Amplificao de DNA pela reao em cadeia da polimerase Aplicao da tecnologia do DNA recombinante
Tcnicas de clonagem
Refere-se a produo de mltiplos organismos idnticos derivados de um ancestral comum Fornece cidos nuclicos ou protenas para outros estudos, alm de representar um modo para o estudo da expresso gnica
Vetores de clonagem
Uma variedade de pequenas molculas de DNA com replicao autnoma so utilizadas como vetores de clonagem
Plasmdeos: Molculas de DNA circular encontradas em bactrias ou em clulas de leveduras
Endonucleases de restrio
Stio de reconhecimento da enzima que produz fragmentos de DNA com extremidades complementares
Stio de reconhecimento da enzima que produz fragmentos de DNA com extremidades cegas
O DNA recombinante
Vetor de clonagem
Endonucleases de restrio
A grande vantagem da utilizao de uma enzima de restrio para construir um recombinante que o DNA inserido pode ser, mais tarde, retirado precisamente do vetor de clonagem pela clivagem com a mesma enzima de restrio
DNA ligase
Na construo de um recombinante, as extremidades complementares das fitas de DNA pareiam suas bases (anelam-se) e o esqueleto de acar-fosfato ligado covalentemente pela ao de uma enzima denominada DNA-ligase
Para efetivar a clonagem, uma clula hospedeira pode incorporar um plasmdeo, mas o vetor permanentemente estabelecido na clula - transformao - com uma eficincia muito baixa (0,1%) Mas uma nica clula transformada pode multiplicar-se indefinidamente, produzindo grandes quantidades de DNA recombinante Clulas so plaqueadas em meio de cultura semi-slido Uso de antibiticos essencial
Bibliotecas genmicas
O genoma inteiro de um organismo pode ser clonado como fragmentos de DNA e ento os clones que contm as sequncias de interesse so identificados
Iniciadores (Primers)
Oligonucleotdeos cujas sequncias flanqueiam o segmento de DNA de interesse Dirigem a sntese de fitas complementares de DNA pela DNA polimerase
Bioqumica I 1 semestre de 2010
PCR
Sequncia-alvo: segmento de at 6kb DNA-polimerase dNTPs inicializadores (primers)
Produo de protenas
Gene clonado deve ser inserido em um vetor de expresso plasmdeo que controla a transcrio e a traduo corretamente posicionadas A produo da protena de interesse pode chegar a 30% da protena celular total do hospedeiro superprodutores Pode haver o isolamento de protenas inteis ou txicas clula hospedeira
Expresso de protenas
Plasmdeo
Insulina humana para tratamento do diabete Fatores de coagulao IX e X para tratamento de distrbios de coagulao (hemofilia) Hormnio de crescimento para tratamento de distrbios endcrinos Eritropoietina estmulo da produo de clulas brancas do sangue
As tcnicas para a manipulao do DNA produziram avanos bastante significativos na bioqumica, biologia molecular e gentica
Tornou possvel o isolamento, a amplificao e a modificao de seqncias especficas de DNA
Sequenciamento de DNA
O seqenciamento a tcnica utilizada para determinar em que ordem as bases contidas no DNA se encontram. apenas a primeira etapa de um processo cujo resultado final poder resultar em novos mtodos de diagnstico, na formulao de novos medicamentos, vacinas, na preveno e tratamentos mais eficazes contra doenas ou pragas.
A estratgia global:
1.
2.
3.
Clivar o polmero em fragmentos especficos, pequenos o suficiente para serem completamente sequenciados Determinar a seqncia dos resduos em cada fragmento Determinar a ordem dos fragmentos no polmero original pela repetio das etapas precedentes
Utiliza DNA polimerase, dNTPs e iniciadores, e uma fita simples de DNA como molde reao em cadeia da polimerase A sntese de DNA termina aps bases especficas mtodo dideoxi (2,3-dideoxinucleosdeo-trifosfato ddNTP)
ddNTP
Bioqumica I 1 semestre de 2010
Sequenciamento automtico
uma variao do mtodo de terminao de cadeia so usados marcadores fluorescentes A base terminal de cada fragmento identificada pela fluorescncia caracterstica Esses detectores fluorescentes so controlados por computador Esse sistema automtico pode identificar ~10 mil bases por dia contra ~ 50 mil bases por ano obtidas pelo mtodo manual.
Bioqumica I 1 semestre de 2010
Sequenciamento automtico
Lista de exerccios
1. Desenhe a estrutura geral de um ribonucleosdeo-difosfato e de um desoxirribonucleotdeo. 2. Quais as diferenas qumicas e biolgicas entre DNA e RNA? 3. Resuma o Dogma Central da Biologia Molecular. 4. Descreva o modelo de DNA de Watson-Crick. 5. Quais as caractersticas funcionais e estruturais do RNAt, RNAm e RNAr? 6. Descreva os tipos de ligaes existentes nos cidos nuclicos. 7. A alga vermelha Polyides rotundus retm sua informao gentica numa fita dupla de DNA. Quando o DNA foi extrado de clulas de P. rotundus e analisado, 32% das bases foram resduos de guanina. Com esta informao, possvel determinar qual porcentagem de bases deste DNA era resduo de timina? Explique. 8. Considerando o seguinte fragmento de DNA: 5-CATATG-3 Desenhe a fita complementar respeitando as propriedades de complementaridade e antiparalelismo da molcula de DNA. O que pode ser observado, considerando apenas esse pequeno fragmento?
Bioqumica I 1 semestre de 2010