Biologia Super)

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR
J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera
UNIDAD 1 ADN COMO FUENTE DE INFORMACIN

1.1 DESCUBRIMIENTO DEL ADN El cido desoxiribunucleico fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, en los ncleos de las clulas del pus y en esperma de salmn. La llamo nuclena, observ la presencia de fsforo. Robert Feulgen, en 1914, describi un mtodo para revelar por tincin el ADN, basado en el colorante fucsina. Se encontr la presencia de ADN en el ncleo de todas las clulas eucariotas, especficamente en los cromosomas. El bioquimico P.A. Levene en los 20s analiz los componentes del ADN y encontr que contena cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina (pirimidinas), adenina y guanina (purinas); el azcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Fosfato. La virtud del material gentico es su habilidad para especificar una larga variedad de protenas. Un error inicial fue el pensar que la estructura del material gentico debera ser tan compleja como la variedad de protenas producidas, ya que, se pensaba, que nicamente las protenas posean la suficiente diversidad para especificar otras protenas, sin embargo, se aclar esta cuestin cuando se sugiri que el material gentico produca protenas siguiendo un cdigo basado en la diversidad de combinaciones que se podan obtener de los nucletidos, tomados de tres en tres. El descubrimiento del principio de transformacin en los ncleo celulares por Griffth (1928), dio la base para pensar que el cido nucleico era el material gentico. La bacteria del gnero Pneumococus provoca la muerte en ratones producindoles neumona, la virulencia de las bacterias estn determinadas por los polisacridos capsulares, componentes de la superficie de diferentes tipos de Pneumococos, estos pueden ser tres diferentes tipos (I, II y III) de polisacridos capsulares, todos con apariencia algodonosa (S) en la pared y por lo tanto en la colonias formadas. La bacteria S, con apariencia lisa, muerta puede transformar a las bacterias vivas R. A esta capacidad de transformacin se le aisl, como un principio de transformacin, en cultivo por Avery y colaboradores en 1944 y demostraron que era el cido desoxiribonucleico (ADN), que se encontraba en abundancia en los ncleos de las clulas (Figura 1).
Figura 1.1 Experimento de transformacin de Avery y colaboradores El papel del ADN luego fue confirmado con el descubrimiento de las enzimas ADNasas, pues al degradar los cidos la capacidad transformante se perda, lo que no suceda se empleaba la tripsina que degrada protenas lo cual no influa en la transformacin, se desech entonces la idea de que las protenas posean la capacidad de trasmitir la informacin gnica.
1.2 ADN MATERIAL GENETICO UNIVERSAL Despus de demostrar que el principio transformante consista de ADN, era necesario probar que este era el material gentico en todos los sistemas biolgicos. Procariotas: Cuando el fago T2 infecta a clulas de E. coli, cuando estas se aplican a la bacteria son absorbidos y 20 minutos mas tarde las bacterias son lisadas, liberando una gran cantidad de fagos. Hershey y Chase (1952), infectaron bacterias E. coli, con fagos T2 marcados radiactivamente ya sea con P32 en el ADN o bien con S35 en las protenas. Las bacterias infectadas fueron centrifugadas separndose en dos capas. La capa superficial consista de las envolturas de los fagos liberados de la superficie bacteriana y por lo tanto marcados con S35. La otra fraccin consista de las bacterias infectadas, la mayora de P32 se present en las bacterias infectadas. La progenie de fagos producidos por la infeccin contena un 30% del P32 marcado, y muy poco (1%) de S35 marcado. Este experimento demuestra que el ADN del fago interno entra a la bacteria y forma parte de la progenie de fagos, exactamente el patrn de herencia esperado 2
del material gentico. Aunque se demostr claramente que el ADN es el material gentico, el experimento de infeccin con fagos no es tan preciso como la transformacin bacteriana para excluir protenas contaminantes del ADN.
Figura 1.2 Experimento de Hershey y Chase Eucariontes: La discusin de los resultados de transmisin de Avery, son aplicados a un amplio rango de organismos tanto procariontes como eucariontes. Cuando el ADN es aplicado a poblaciones de clulas eucariticas simples crecidos en cultivos, los cidos nucleicos entran a la clula y en algunas resulta en la produccin de protenas nuevas. Al inicio la extraccin se realizaba en masa, pero ahora el ADN se puede purificar para incorporar secuencias que producen una protena particular. Como en el caso de clulas mutantes (TK-) para la produccin de Timidina kinasa (TK) y que pueden obtener esta capacidad cuando se le aplica una secuencia de 3
ADN que poseea el gen que la sintetiza Los experimentos de transformacin en clulas eucariotas se denominan como transfeccin, sin embargo es similar a la transformacin bacteriana. El ADN introducido se convierte en parte del material gentico de la clula que ha sido transfectada. Al inicio la tcnica se realizaba nicamente en cultivos de clulas, pero ms recientemente el ADN puede ser introducido en huevos de mamferos por microinyecciones. Estos experimentos demuestran no solamente que el ADN es el material gentico, sino que, puede ser transferido entre especies diferentes y permanecer funcional. El materia gentico de todos los seres vivos y algunos virus es el ADN. Sin embargo algunos virus poseen ARN como material gentico, no obstante an siguen siendo los cidos nucleicos los encargados de dirigir los cambios y perpetuaciones gnicas. 1.3 COMPONENTES DEL ADN La observacin de que las bases estn presentes en diferentes cantidades en el ADN de las diferentes especies dio como conclusin el concepto de que las secuencias de bases debe ser la forma en que la informacin gentica es almacenada.
Figura 1.3 Componentes del ADN.
Figura 1.4 Cada nucletido contiene un anillo heterocclico de carbono con tomos de nitrgeno (base nitrogenada), un azcar con cinco carbonos en forma de anillo de pentosa y un grupo fosfato.
Figura 1.5 Las bases nitrogenadas pueden ser pirimidinas: con anillos de seis miembros. Purinas: con dos anillos formados de cinco y seis miembros cada uno. Las bases purnicas son: adenina y guanina tanto en molculas de ADN como en las molculas de ARN. Por otro lado, se encuentran 2 pirimidinas en ADN, citosina 5
y timina, mientras que en el ARN se encuentran la citosina y el uracilo. La timina difiere del uracilo por la presencia de un sustituto del metilo en la posicin C5. Las pentosas tambin son diferentes entre las molculas de ADN y de ARN, de donde proviene su nombre: ADN = 2 desoxyribosa y ARN = ribosa.
Figura 1.6 Esquemas de los azcares presentes en las molculas de ARN (iquierda) y ADN (derecha). Son diferentes por ausencia o presencia del grupo hidroxil en la posicin dos. Las bases nitrogenadas se unen a la posicin uno de pentosa por una unin glucosidica en la posicin N1 de la primidina y en la N9 de las purinas. Una base ligada a un azcar es llamado nucleosido y cuando se une a un grupo fosfato se llama nucletido. Los nucletidos proveen de bloques, los cuales se unen para construir los cidos nucleicos. Los nucletidos se unen en una cadena de polinucletidos por una columna que consiste de series alternadas de azcar y residuos de fosfato. Los nucletidos pueden existir en formas en las cuales ms de un grupo fosfato se une a la posicin 5. Son enlaces de alta energa, la cual es proveda para actividades celulares. NTP nuclecido trifosfato, NDP nuclecido difosfato (ver figura 1.4).
Figura 1.7 La posicin nmero 5 de una pentosa se conecta con la posicin 3 del siguiente anillo de pentosa, por un grupo fosfato. Por lo que la columna de fosfodiesterazcar se dice que consiste en uniones 53, las bases nitrogenadas se pegan en la periferia de la columna azcar fosfato. 5 izquierda y 3 derecha.
1.4 LA DOBLE HLICE DEL ADN Tres puntos claves sirvieron de base para que Watson y Crick propusieran el modelo de doble hlice del ADN en 1953:
1. Los datos de las fotografas de los rayos X, que mostraban que el ADN tena una forma de hlice regular, dando una vuelta completa cada 34 A (3.4 nm) con un dimetro de 20 A (2 nm) aproximadamente.
2. La distancia entre nucletidos adyacentes es 3.4 A, 10 nucletidos por vuelta. La densidad del ADN sugera que la hlice debera contener dos cadenas de polinucletidos. El dimetro constante se explica si las bases de cada cadena se unen de manera restringida por lo que las purinas siempre son opuestas a las pirimidinas. Pirimidina con pirimidina, muy delgado Purina con purina, muy grueso
20 A
3. Independientemente de la cantidad de cada base, la proporcin G y C es siempre la misma en el ADN al igual que la proporcin A y T. la composicin de cualquier ADN se describe por la proporcin G + C que tiene un rango de entre 26 a 74 % para las diferentes especies. Watson y Crick propusieron que las dos cadenas estn unidas no por enlaces covalentes, sino por uniones de hidrogeno entre las bases nitrogenadas por lo que G pasa puentes de hidrogeno que la unen con C, y A con T de igual manera estas reacciones se conocen como bases pareadas. Estas bases pareadas se dice que son complementarias.
Figura 1.8 Para que se pareen las bases, estas deben de estar en su forma Tautomerica, es decir NH en lugar de NH2 y COH en lugar de C=O. El modelo tambin requiere de que las cadenas corran en direcciones opuestas antiparalelas. Una cadena corre en direccin 5- 3 y su contraparte 3- 5.
La cadena azcar- fosfato se presenta en la parte exterior por fosfato cargado negativamente, los cuales in vitro se neutralizan usualmente con Na+ y in vivo protenas positivamente cargadas neutralizan estos grupos, los cuales juegan un papel importante para determinar la organizacin del ADN en la clula. Las bases se encuentran en la parte anterior, forman los escalones de la escalera en hlice (figura 1.7). Estas bases intervienen en la estabilidad termodinmica de la doble hlice, de dos formas: a). Puentes de hidrogeno entre las bases b). Uniones hidrofbicas, resultando en intervenciones entre los sistemas de electrones de los pares de bases. Cada par de bases rota 36 alrededor del eje central relativo al siguiente par, por lo que 10 pares de bases dan un giro completo de 360. El giro completo de una hlice doble con surcos angostos (12 A) y surcos amplios (22 A), esta es la forma del ADN.
1.5 REPLICACIN SEMICONSERVATIVA DEL ADN Un experimento crucial del material gentico es que este debe reproducirse de manera adecuada. Debido a que las fibras de polinucletidos estn unidos nicamente por puentes de hidrogeno, es posible que se separen.
Figura 1.9 Cada cadena sirve como templete para la sntesis de la cadena complementaria. Por lo que la estructura del ADN lleva la informacin necesaria para perpetuar su secuencia. Este modo de replicacin produce que la cadena doble materna origine dos cadenas fijas y cada una con una cadena materna y otra hija nueva, por lo tanto la replicacin es SEMICONSERVATIVA. 9
Marcas con istopo (N15) en las bases nitrogenadas de las cadenas de ADN y ser fcilmente reconocibles en las cadenas, resultado de la replicacin, observndose que en la primera generacin se obtienen dos cadenas dobles, con una cadena original y una nueva cada una, en la segunda generacin se obtienen cuatro cadenas dobles y dos totalmente nuevas. Menselson y Stahl (1958) realizaron el experimento con 3 generaciones continuas de E. coli. La disrupcin es solamente transitoria y localizada en una pequea zona de la cadena doble, por lo que apenas se forme la cadena hija, la cadena original se acopla a sta, esta regin se denomina horqueta de replicacin, la cual se mueve sobre el templete.
Figura 1.10. Experimento de M. Meselson y F. Stahl para demostrar la hiptesis de la replicacin semiconservativa. Cultivos de E. coli en un medio cuya fuente de nitrgeno era un istopo pesado, el N15 que se incorporaba al ADN sintetizado. El cultivo se mantuvo durante varias generaciones para que el N15 formara parte de todo el ADN. Se extrajo a continuacin el ADN marcado y se transfiri a un medio con N14. Las incubaron el tiempo suficiente para que se dividieran una sola vez. Se someti la mezcla aultracentrifugacin para distinguir las molculas que contenan N15 y N14.
10
1.6 CDIGO GENTICO: TRIPLETES Debe sintetizarse al menos 20 aminocidos distintos con la del ADN y debido a que ste solo posee 4 bases distintas, el cdigo debe de ser de ms de una base. 42 = 16 combinaciones posibles 43 = 64 combinaciones posibles Por lo que algunos tripletes deben ser especficos, mientras que otros aminocidos pueden ser originados por ms de una combinacin de tripletes. Solo una de las dos cadenas codifica para protenas, por lo que el cdigo gentico es una secuencia de bases (no de pares de bases ). Tres nucletidos = 1 aa trinucletido = codn
Ledo de 5 3, los nucletidos que codifican para una protena comprende a la secuencia de aminocidos de la protena escrita en direccin N hacia terminacin C.
1 *
Segunda base U C A
G
T y r A l t o H i s G l n A s n L y s A s p G l u
3 *
C y s A Tr p A r g A r g S e r A r g G l y G l y
Figura 1.11. Cuadro con el codigo gentico casi universal. Los cuadros rojos representan los codones que significan alto en el proceso de sntesis. El cuadro verde con la letra I, representa el codn de inicio universal.
U P h U e U L e u U C L e u C C L e u C A Il e A A Ile A I G V a l G G V a l G
U U U U C C C C A A A A G G G G
S e r S e r P r o P r o T h r T h r A l a A l a
U C A G U C A G U C A G U C A G
11
El cdigo gentico es degenerado: un mismo aminocido puede estar determinado por ms de un triplete o codn. Debido a que existen 64 tripletes distintos y hay solamente 20 aminocidos diferentes. Es un cdigo sin superposicin o sin solapamientos: dos aminocidos sucesivos no comparten nucletidos de sus tripletes. La lectura del ARN mensajero es continua, sin interrupciones. Cualquier prdida o ganancia de un slo ribonucletido produce a partir de ese punto una modificacin de la pauta de lectura, cambiando todos los aminocidos desde el lugar de la alteracin. El triplete de iniciacin suele ser AUG que codifica para Formil-Metionina. Tambin pueden actuar como tripletes de iniciacin GUG (Val) y UGG (Leu) aunque con menor eficacia. Existen tres tripletes sin sentido o de terminacin que no codifican para ningn aminocido: UAA (ocre), UAG (mbar) y UGA. Las bases generales del cdigo fueron descubiertas por el anlisis gentico de mutantes del fago T4. En 1961 Crick y colaboradores demostraron que el cdigo debe de leerse en tripletes que no se traslapan a partir de un punto de inicio. Tres posibles maneras de leerse, lo que se conoce como Regin de lectura. ACG ACG ACG ACG CGA CGA CGA CGA GAC GAC GAC GAC Una mutacin cambian el sitio de inicio de la lectura y por lo tanto del aminocido lo que produce un cambio en la regin de lectura. El colorante Acridina puede provocar esta mutacin. Cuadro 1.1 Excepciones a la universalidad del cdigo en eucariontes ORGANISMO CODN SIGNIFICADO EN SIGNIFICADO EN CODIGO CODIGO MITOCONDRIAL NUCLEAR Trp FIN UGA Todos Thr Leu CUX Levadura Ser Arg AGA Drosophila FIN Arg AGA,AGC Humano, bovino Met (inicio) Ile AUA Humano, bovino Met (inicio) Ile AUU,AUC,AUA Ratn
12
1.7 MUTACIONES PUNTUALES CAMBIAN PARES DE BASES SENCILLAS Todos los organismos sufren de un cierto nmero de mutaciones como resultado de las operaciones celulares normales o por interacciones con el ambiente. Este tipo es llamado ESPONTNEO. El tratamiento con ciertos compuestos pueden aumentar la ocurrencia de mutaciones, estos compuestos son llamados MUTAGENOS y los cambios provocados por estos son referidos como MUTACIONES INDUCIDAS. Cualquier par de base del ADN puede ser mutado. Una mutacin que cambia nicamente un par de bases simples, se conoce como MUTACIN PUNTUAL, la cual se puede deber por: un mal funcionamiento del sistema celular que se encarga de replicar y reparar el ADN. Interferencia qumica directa con una de las bases en el ADN.
Figura 1.12. Esquema de una mutacin, puede deberse a un cambion en una base, o bien a una adicin o a una supresin (corte) de una base.
13
TRANSICIN: mutacin puntual ms comn, se presenta por una sustitucin de bases del mismo grupo o familia (purina por purina; pirimidina por pirimidina). Ejemplo: conversin qumica directa de una base a otra
Figura 1.13. Ejemplo de una transversin, por sustitucin de bases, el bromutoacil se une a Guanina o a Adenina. TRANSVERSIN: esta mutacin es menos comn, se presenta por sustitucin de bases de familias distintas. Ejemplo: cuando una base anormal se introduce en la cadena: BrdU (bromouracil) en lugar de T (timina). Las mutaciones por sustituciones de bases, generalmente poseen algunas funciones residuales. Luego entonces, se sustituye un aminocido pero no necesariamente cambia la funcin de la protena.
Figura 1.14. Cuando el colorante naranja de acridina cambia la regin de lectura el cambio provoca una alteracin completa de la protenay en la estructura de la molecula de ADN. 14
1.8 TASAS DE MUTACIN Mutacin espontnea que inactivan la funcin de un gen en una bacteria ocurre con una tasa de 10-5 a 10-6 eventos por locus por generacin. Se estima que la tasa en eucariontes debe ser similar. En un gen bacteriano de 1200 pares de bases, que codifica para 400 aminocidos la tasa de mutacin promedio para un cambio de nucletidos individuales es de 109 a 10-10 por generacin. Sin embargo no todas las mutaciones del ADN provocan cambios observables en el fenotipo. Las mutaciones silenciosas: no tienen un efecto aparente en el fenotipo. Se puede deber a: el cambio de bases en el ADN no cambian los aminocidos presentes en la protena, o bien el cambio en los aminocidos no afectan la funcin de la protena, por lo que se dice que se presentan substituciones neutrales. Cuadro 1.2 Algunos valores de tasas de mutaciones puntuales en los organismos ORGANISMO GEN TASA DE MUTACIN POR GENERACIN 2.5 x 10-9 Rango de hospederos Bacteriofago Resistencia a fagos 2.0 x 10-8 Escherichia coli Factor de color (R) 2.9 x 10-4 Zea mays Color de semillas (Y) 2.0 x 10-6 Drosophila melanogaster Letalidad 2.6 x 10-5
Mutacin directa: afecta la actividad de un gen, puede ser reversible por otra mutacin llamada MUTACIN REVERSA, que posee una probabilidad muy baja de presentarse en el mismo sitio.
1.9 TOPOLOGA DE LOS CIDOS NUCLEICOS La cadena de ADN es ms que una secuencia de bases ordenadas, posee ciertas caractersticas fisiolgicas que son de crucial importancia para su actividad. El nmero de pares de bases por cada vuelta en la molcula de ADN no es necesariamente fijo, sino que puede variar segn las circunstancias. La doble hlice no existe de manera estirada y recta, sino que se enrolla para ocupar un espacio menor. Ciertas secuencias tienen la propiedad de adoptar una confirmacin alterna de doble banda diferente a la configuracin beta del ADN. Para que el ADN se replique o se exprese, las bandas de la doble hlice deben separarse. Este ltimo punto es de mucha importancia, desde la perspectiva de su funcin en 15
la replicacin y expresin como protena, para lo cual no se rompen los enlaces covalentes. Es posible que las bandas se separen y se vuelvan a reponer bajo condiciones fisiolgicas y a las tasas (rpidas) necesarias para sostener las funciones genticas. La especificidad del proceso se determina por la complementacin de los pares de bases. Este proceso de separacin de las bandas es llamado DESNATURALIZACIN. Este fenmeno ocurre en un rango muy pequeo de temperatura (8593C) resultando en un cambio amplio de sus propiedades fsicas. La densidad ptica cambia, ya que la absorcin de luz del ADN disminuye en un 40 % de lo que se observa en una mezcla de nucletidos de la misma composicin. EFECTO HIPOCRMICO HIPOCROMICIDAD: se da por desnaturalizacin. Tm= es la temperatura de fusin, esta temperatura se ve afectada por la composicin de bases del ADN y las condiciones de desnaturalizacin. En condiciones fisiolgicas 85 95C. El valor exacto de Tm depende de la proporcin de pares de bases G C ya que estas poseen un triple enlace de H, siendo as, ms estable que A T. Mientras ms pares de base G C en el ADN ms E se necesita para separar las bandas. Esta relacin entre Tm y la composicin en pares de bases es lineal. ADN con 40% G C (mamferos) requieren 87C. ADN con 60% G C (aves) requiere 95C en condiciones similares. La fuerza inica de la solucin tiene tambin un efecto fuerte en la Tm. La desnaturalizacin del ADN es reversible bajo condiciones apropiadas. Esta habilidad de las bandas separadas de ADN se conoce como RENATURALIZACIN. Las hebras simples de ADN entran en contacto con su hebra complementaria por casualidad, si sus secuencias son complementarias se aparean formando regiones de hlices dobles. La regin de complementacin de pares de bases se extiende a lo largo de la molcula con un efecto similar a la cremallera, formando una molcula doble ms larga. La renaturalizacin provoca la restauracin de las propiedades originales del ADN.
16
DOBLE HLICE DE ADN
NUCLEOSOMAS
SOLENOIDE
BUCLE
CROMATIDAS ESPIRAL DE ROSETONES
ROSETN
CROMOSOMA
Figura 1.15. Grado de empaquetamiento y organizacin de la molcula de ADN, lo cual le confiere la topologa clsica. Esta propiedad de los cidos nucleicos de complementarse entre bandas sencillas se conoce como HIBRIDACIN, cuando los cidos nucleicos provenientes de fuentes distintas, o bien ADN y RNA. El ADN se organiza de tal manera que posee un cierto grado de arreglo o empaquetamiento. Con el que se relaciona algunos aspectos de su funcionamiento. La cromatina (ADN + protenas) puede ser dividida en dos tipos: Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma mittico su radio de empaquetamiento es aproximadamente de 1000 2000 durante la interfase. Heterocromatina: Muy densa cromosomas en mitosis, durante el ciclo celular no cambian su densidad. En esta forma el ADN no es transcripto. Heterocromatina es diferente a la Eucromatina solo por el grado de condensacin.
17
Heterocromatina constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadas incluyendo secuencias satlites de ADN
Figura 1.16. Cambio en la topologa (a diferentes niveles) de la molcula de ADN, como respuesta a los procesos celulares. A) Molecula en proceso de replicacin, B) Molecula en proceso de transcripcin.
1.10 AISLAMIENTO DE GENES A)Aislamiento a partir de protenas A partir de la secuencia de aminocidos de una protena, podemos deducir la secuencia del ADN que la codifica, utilizando el cdigo gentico (aunque de manera imperfecta), pues un mismo aminocido puede ser codificado por ms de un triplete o codn). 18
Se sintetiza una cadena de oligonucleotidos con la aproximacin de la secuencia y se marca radiactivamente generando una sonda o detector que mediante una hibridizacin nos permite detectar su secuencia complementaria. Ejemplo: Met-Val-Lys-Gly-Glu-Met-Asn AUGGUXAAA(G)GGXGAA(G)AUGAAU(C) TACCAXTTT(C)CC(X)CTT(G)TACTTA(G) Protena ARNm ADNsonda
Cuando se emplea una sonda, se puede analizar el contenido de las clulas de las colonias derivadas de una genoteca, las aplicaciones pueden ser: el diseo de una sonda con base en la secuencia de un gen de rata para intentar detectar el gen en humano.
Figura 1.17. Esquema del proceso de aislamiento de un gen bacteriano empleando una sonda marcada con isotopos radiactivos.
19
B) Aislamiento de genes utilizando anticuerpos En ocasiones las protenas cuyo gen correspondiente queremos aislar no se pueden purificar en gran cantidad y los mtodos para determinar la secuencia de aminocidos de una protena son bastante laboriosos. El sistema inmunolgico nos permite utilizar otro fenmeno de reconocimiento molecular para localizar genes. Desde hace muchos aos, los investigadores del campo de la inmunologa han utilizado animales de laboratorio para obtener anticuerpos especficos contra sustancias de inters. Las protenas, en particular; cuando son extraas a un animal, inducen en ste la produccin de anticuerpos. Estas molculas son, a su vez, protenas con caractersticas muy interesantes. Los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que reconocen, en medio de mezclas complejas, las sustancias especficas que indujeron su produccin. Si se inyecta una protena en un conejo, a partir del suero sanguneo del conejo podemos obtener anticuerpos dirigidos contra dicha protena. Estos anticuerpos, se usan de manera anloga a como se usaron los oligonucletidos o sonda de ADN, para detectar las clonas que contengan el gen que codifica para la protena de inters lo que se conoce tambin como "inmunobsquedao inmunodeteccin.
C) Aislamiento de genes utilizando sus ARN mensajeros A finales de los aos setenta, los trabajos pioneros de Phillip Sharp y Richard Roberts sorprendieron a la comunidad cientfica con un asombroso descubrimiento: la trasncriptasa reversa. En los tejidos que presentan una abundante cantidad de una protena especfica, por lo general poseen abundantes copias del gene en forma de ARN mensajero (como resultado de la transcripcin acelerada). Por ejemplo: si se purifica ARN mensajero del oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparacin estar constituida por el mensajero que codifica para la ovoalbmina. Se hace necesario utilizar un procedimiento que convierta la informacin de ARN a ADN. Es decir, que copie una hebra de ARN y la "transcriba", de manera reversa hacia ADN. Esto es, en principio, posible: la informacin (codificada en la secuencia) esta en la molcula de ARN. Lo que se requiere es una enzima que realice la copia, pero que acepte como molde al ARN, y nucletidos para incorporar a los del ADN. Tal enzima existe en la naturaleza: en los retrovirus. Usando una preparacin que contenga esta enzima, la transcriptasa reversa, sobre el ARN, se obtiene el llamado ADNc, o ADN complementario. El ADNc puede ser clonado igual que cualquier otro ADN.
20
Figura 1.18. Esquema que representa la reaccin de amplificacin de ADNc a partir de una molecula de ARN.
21
UNIDAD 2 PERPETUACION Y EMPAQUETAMIENTO DEL ADN

2.1 PERPETUACIN DEL ADN 2.1.1 Replicn: unidad de replicacin Replicacin: La replicacin del ADN es necesaria para perpetuar la informacin gentica y prepara a la clula para una divisin posterior. Cuando se inicia la replicacin, la divisin celular ocurre hasta que sta halla finalizado. Puede controlarse en la iniciacin, una vez que esto ocurre se replica todo lo comprendido entre origen y termino, la frecuencia de replicacin es regulada por ciertas protenas. La replicacin puede ser Unidireccional o bidireccional, formando un ojo que crece hasta que se replique el replicn entero. En molculas de ADN circular, por lo general, se forma una estructura en forma de letra griega teta (). Replicn: El material gentico est organizado en unidades denamonidas replicones, las cuales se confromoan de un sitio de Origen y un sitio de trmino, toda la secuencia de ADN que se encuentre entre estos puntos ser replicado una vez que comience el proceso. En procarintes: Todo el genoma se encuentra organizado en un solo replicn, si poseen plsmido, stos no son considerados como parte del genoma y cada uno representa un replicn autnomo. Cada fgo o virus de ADN constituye un replicn. En eucariontes: El genoma se encuentra organizado en un gran nmero de replicones. Cada replicn se activa una sola vez por ciclo celular, aunque no lo hacen simultneamente.
2.1.2 Horquilla de replicacin Todas las actividades de replicacin son reguladas por un conglomerado de enzmas y por la topologa misma del ADN. Las protenas que prevn estas actividades enzimticas no funcionan de modo independiente, y son contenidos en una estructura multiprotica. Replisoma: Es un conjunto de enzimas y protenas, que se ensamblan en una sola unidad antes de la replicacin, esta compuesto de: ADN Polimerasa: Que son enzimas capaces de sintetizar nuevas hebras de ADN a partir de un templete. Una enzima posee la funcin de replicacin las otras poseen varios subsidiarios en la replicacin o participa en la reparacin del ADN. Ninguna ADN polimerasa puede iniciar una cadena de deoxirribonucletidos, todas las enzimas requieren de una cadena previamente iniciada por lo que un paso esencial, es la presencia de una actividad "primaria" para comenzar la cadena de 22
ADN. Esta actividad involucra la sntesis de una secuencia corta de ribonucletidos que luego es removido PRIMER (primario). Creacin de la horquilla de replicacin en el origen Se requiere dos tipos de funciones para convertir una cadena doble de ADN a una cadena sencilla. I ) Una enzima Helicasa separa las hebras de ADN usando la hidrlisis de ATP para proveer la energa necesaria. I I) Una protena de unin a hebras.sencillas se une a la hebra sencilla del ADN previniendo la formacin del estado doble. I II) Un punto de desenrrollamiento se mueve sobre el ADN lo que marca la generacin de la orquilla de replicacin, que contina movindose durante la elongacin. I V) El primer nucletido de la cadena nueva debe ser sintetizado en el primer, esta accin es requerida una vez en la hebra lider pero es repetida al inicio de cada fragmento de Okasaki en la hebra convicta. Algunos eventos que se requieren para la iniciacin ocurren unicamente en el origen, y otros al inicio de cada fragmento de Okazaki durante la elongacin.
23
Figura 2.1 Esquema de la horquilla de replicacin de un eucariota. En Eucariontes: Existen cinco clases de ADN polimerasas con diferentes funciones, como se preenta en el siguiente cuadro 2.1. 2.2 Esquema de la replicacin del ADN mitocondrial. Se replica de una manera particular, ya que es circular, pero cada cadena de ADN posee su propio origen de replicacin, pero no se encunatra situado en sitios cercanos. El origen (OL) se encuentra en la cadena de ADN externa, y el origen (OH) en la cadena interna, por lo que el inicio de la replicacin acontece a tiempos diferentes en cada una, dirigida por la ADN polimerasa . Cuadro 2.1 Enzimas que intervienen en el proceso de replicacin del ADN en eucariontes. (1) (II) (III) Mitocondria Ncleo Ncleo Ncleo Localizacin Ncleo Funcin Sntesis de Sntesis de Reparacin Reparacin hebra cautiva hebra lider y priming I)Ncleo cataltico 2)Primasas I)Desconocida I) Ncleo catalitico I)Desconocid Requiere PCNA Si I) Ncleo 1.Ncleo cataltico catalitico 1.Sin funcin conocida Si No Replicacin
Subunidades
1.Ncleo cataltico 1.Sin funcin conocida Si
Actividad Exonucleasa No 3- 5
En procariontes: Las enzimas poseen actividad exonucleoltica que procede en direccin reversa, 3'-5', a partir de la sntesis de ADN ejecuta una funcin 24
postsinttica de prueba de lectura. Cuadro 2.2 Enzimas implicadas en la relicacin del material gentico de procariotas. ADN polimerasa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III Funcin principal Elongacin Reparacin Replicacin Nmero/clula Actividad enzimtica Subunidades 400 Elongacin5-3 Exonucleasa 3-5 Exonucleasa 5-3 1) Fragmento Klenow (68,000 da) 2) Fragmento pequeo (35,000 da) actividad de exonucleasa 5'-3' remueve 10 pares, inicia la replicacin en un corte, "Nick Traslatin Locus Pol A Pol B Desconocido Elongacin5-3 Exonucleasa 3-5 10-20 Elongacin5-3 Exonucleasa 3-5 , sintetiza ADN , sintetiza ADN , Factor I , Factor II , Exonucleasa 35
dna E (Pol C), dna N, dna x , dna q, dna t.
Figura 2.3 Horquilla de replicacin donde se muestran los componentes que intervienen en el proceso de incio de la replicacin en procariotas. 25
2.1.3 Mecanismo de replicacin: eucariotas, procariotas y virus Replicacin en procariotas El proceso de replicacin en procariontes y eucariontes es similar, las diferencias entre uno y otro son el mayor tamao del material gentico en eucariontes, su empaquetamiento con histonas, que en los eucariontes se producen muchas horquillas de replicacin al mismo tiempo, y que se conocen menos las protenas que intervienen en eucariontes que en procariontes. Al igual que en eucariontes, los procariontes replican su DNA de forma continua en la hebra 5' - 3' (conductora) y de forma discontinua en la hebra 3' - 5' (retardada).El DNA en las bacterias suele ser circular y su replicacin ocurre en tres etapas, empezando por un nico punto: 1. Desenrollamiento y apertura de la doble hlice 2. Sntesis de dos nuevas hebras de ADN 3. Correccin de errores
Desenrrollamiento y apertura de la doble hlice. Intervienen un grupo de enzimas y protenas, a cuyo conjunto se denomina replisoma. Primero intervienen las helicasas que facilitan en
desenrrollamiento en el punto ORI o de orgen que es un lugar con gran contenido de A y T. Despus actan las girasas y topoisomerasas que eliminan la tensin generada por la torsin en el desenrrollamiento y actan las protenas SSB que se unen a las hebras molde para que no vuelva a enrollarse. Sntesis de dos nuevas hebras de ADN. Actan las ADN polimerasas para sintetizar las nuevas hebras en sentido 5-3, ya que la lectura se hace en el sentido 3-5. Intervienen las ADN polimerasas I y III, que se encargan de la replicacin y correccin de errores.
La que lleva la mayor parte del trabajo es la ADN polimerasa III. Acta la ADN polimerasa II, corrigiendo daos causados por agentes fsicos.La cadena 3-5es leda por la ADN
polimerasa III sin ningn tipo de problemas (cadena conductora). La cadena 5-3 no puede ser leda directamente, esto se soluciona leyendo pequeos fragmentos (fragmentos de Okazaki) que crecen en el sentido 5-3y que ms tarde se unen. A esta hebra se le llama retardada porque su sntesis es ms lenta. La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar la sntesis por s sola, para esto necesita un cebador (ARN) que es sintetizado por una ARN polimerasa (primasa). Este cebador es eliminado posteriormente. La ARN primasa, va sintetizando a intervalos los ARN cebadores que van siendo incorporados a la copia como si fueran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA cebador del fragmento de Okazaki ya terminado. La ARN primasa se une directamente a la ADN helicasa, formando un complejo llamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formacin. Conforme van existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando los Fragmentos de Okazaki, cada uno de unos 1000-2000 nucletidos(en eucariotes es de 100-200). Hace falta un RNA cebador por cada fragmento de Okazaki. 26
Correccin de errrores. La enzima principal en esta fase es la ADN polimerasa I, que corrige todos los errores cometidos en la replicacin o duplicacin. Tambin intervienen otros enzimas como: endonucleasas que cortan el segmento errneo; ADN polimerasa II que rellenan correctamente el hueco y ADN ligasas que unen los extremos corregidos. La labor de la ADN polimerasa I es de exonucleasa, puede poner bases como sacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta protena encargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow. En E. coli la replicacin es bidireccional y se inicia a partir de un solo origen, que es conocido como Ori C: Sitio en la molcula de ADN en el que se Inicia el ciclo de replicacin, en este sitio se controla la frecuencia de los eventos de iniciacin, este debe segregarse a los cromosomas replicados que se dirigen hacia las clulas hijas. El origen de la replicacin contiene muchos sitios de unin de las protenas, PBS (por sus siglas en ingls), que son secuencias relativamente cortas de ADN y que funcionan como un sitio de anclaje para protenas que regulan el proceso de replicacn. Cuando la molcula de ADN que se replica es circular, y la replicacin es bidireccional, los dos ejes de replicacin se mueven alrededor del genoma hasta el punto de encuentro, el cual por lo general no se ubica en medio, la regin de termino provoca el cese de movimiento, debido a que en esta zona se adhieren unas protenas que detienen el avance de la horquilla de replicacin y por lo tanto el proceso.
Figura 2.4 Replicacin bidireccional del genoma circular de E. coli. La horquilla se mueve a una velocidad de 500 nucletidos por segundo, la hlice debe rotar a 50 revoluciones por segundo 27
Las bacterias por lo general poseen dos puntos de unin entre la replicacin y el crecimiento celular. La frecuencia de iniciacin de los ciclos de replicacin se ajusta para coincidir y dirigir la tasa de crecimiento celular y por lo tanto la complementacin del ciclo de replicacin se conecta con la divisin de la clula. En trminos de: C = Replicacin del genoma bacteriano entero. El proceso tarda aproximadamente 40 minutos, el movimiento de la horquilla de replicacin se da a 50,000 pb por minuto, esta velocidad es no variable a temperatura constante. D = Periodo entre la replicacin completa y la divisin celular, es de aproximadamente 20 min. En este perdo se da el ensamblaminto de los componentes necesarios para la divisin. Replicacin en virus Aunque, el proceso de replicacin, como ya se menciono, es similar para eucariotas y procariotas (incluyendo en stos a los virus), se describe en este apartado el modo de replicacin de los los virus que poseen su material gentico en forma circular. En el cuadro 2.1 se presentan los diferentes tipos de material gentico que poseen los virus, asi como la forma de su arreglo (cadena simple, circular, etc.).
Figura 2.5 Mecanismo de replicacin del crculo rodante. (a) ADN circular. (b) Una endonucleasa hace un corte en la cadena positiva (+). (c) La ADN polimerasa aade nucletidos en el extremo 3 de la cadena abierta, de manera que produce desplazamiento del extremo 5. (d) El desplazamiento del extremo 5 se hace ms extenso en la medida que la enzima polimerasa recorre el templado de ADN circular (cadena negativa). El resultado es la formacin de un ADN con longitud mayor a la normal. Ejemplo: fago l el fago XI74.
28
Cmo se regula el inicio de la replicacin en procariotas? Una protena iniciadora puede sintetizarse durante todo el ciclo celular, y cuando la concentracin aumenta se dispara la iniciacin. Esta es la hiptesis mas aceptada en trminos de que la sntesis proteica es necesaria para disparar la iniciacin. El gen FtsZ juega un papel importante, una mutacin en este gen provoca clulas mltinucleadas con filamentos. Este gen es el blanco de otra protena (Sol A) que bloquea la divisin celular bajo ciertas condiciones. Una sobreexpresin de este gen FtsZ provoca e induce mini-clulas, que carecen de ADN y son morfolgicamente normales. Por lo tanto la expresin del gen FtsZ determina la frecuencia de la divisin, actuando como una protena iniciadora.
Otra hiptesis relaciona una protena inhibidora que puede sintetizarse a una velocidad fija, cuando el volumen celular aumenta, esta se diluye y permite la iniciacin.
Replicacin en Eucariotas La sntesis de ADN est ligada con el ciclo celular, el inicio de la replicacin y su coordinacin con el ciclo celular parecen estar regulados por acciones de acelerado y frenado controladas por la produccin de diferentes ciclinas en la fase G1. En levaduras, el tamao de la clula regula la velocidad a la cual se dar el inicio de la replicacin, quizs esta estrategia sea usada por otras clulas.
La clulas que inician G1 siendo anormalmente pequeas tardarn mas en llegar al punto de inicio mientras que clulas anormalmente grandes llegarn a esta etapa ms pronto. Los mecanismos por los cuales los factores ambientales regulan el inicio se relacionan con el efecto que una disminucin de nutrimentos tiene sobre la tasa de produccin de ciclinas, las cuales reducen su concentracin en las clulas y por lo tanto la concentracin no es la suficiente para disparar la explosin de quinasa (Ver figura 2.6) La sntesis de ADN se lleva al cabo en la fase S del ciclo celular, por lo tanto las clulas en G2 son clulas con una contenido de ADN tetraploide. La mitosis reduce a un nmero diplide de ADN en cada clula hija. En los eucariotes, cada replicn se activa en un momento especfico durante el perodo S. Puede existir una replicacin bidireccional y cuando la horquilla de replicacin llega al punto de trmino se detiene la replicacin. Cualquier segmento de ADN con un origen puede replicarse, a estas regiones se le conoce como secuencias de replicacin autnoma, ARS (por sus siglas en ingls), conformada por una zona con secuencia consenso de nucletidos, que est formada por lo general de 11 pb y rodeada de una regin de ADN rica en los nucletidos Adenina y Timina. Cada cadena o zona de ADN que se replique necesita de su propia secuencia de origen. La velocidad de replicacin ADN en clulas de mamferos es de 50 nucletidos por segundo. El proceso esta regulado por protenas que actan rpido y sincronizadamente. El complejo multienzimtico que lleva al cabo este proceso constituye una elaborada maquina de replicacin.
29
Cuadro 2.3 Tipos de genomas virales. Virus con ARN ARN de cadena sencilla. Ej. TMV y Poliovirus.
ARN de cadena doble. Ej. Reovirus.
ADN de cadena sencilla Ej. Parvovirus.
Virus con ADN

ADN circular sencillo. Ej. M13 y bacterifago X174.
ADN de cadena doble. Ej. Bacterifago t4 y herpesvirus.

ADN circular de cadena doble. Ej. SV40 y polyoma.
ADN de cadena doble con terminaciones asociadas a protenas covalentemente. Ej. Adenovirus.
ADN de cadena doble con terminaciones covalentes selladas. Ej. Poxvirus.
Ciclina it ti
Quina d
Factor promotor
Ciclina
30
Figura 2.6 Control de la replicacin-ciclo celular. Esquema de las variacin de las actividades de las ciclinas dependientes de quinasasa (cdc) a lo largo del ciclo celular en una clula de mamfero. Diferentes ciclinas y diferentes quinasas, pueden unirse para formar los diferentes complejos, incrementando las opciones de combinaciones posibles de los complejos de ciclinas dependientes de quinasas que se forman en el transcurso de un ciclo celular.
ORIGEN
Crecimiento
Crecimiento
ORIGEN Figura 2.7 Esquema del proceso de replicacin bidireccional.
Inicio de la replicacin
ADN de nueva sntesis
Horquilla movindose en direccin contraria
Figura 2.8 El genoma de los eucariontes est organizado en muchos replicones, cada uno de los cuales comienza la replicacin a diferente tiempo, pero se replican solo una vez por ciclo celular. La horquilla de replicacin se mueve en una o en dos direcciones hasta llegar al sitio de termino de cada replicn. 31
Sntesis semidiscontinua del ADN La estructura antiparalela del ADN posee un problema en la replicacin, la orquilla de replicacin se mueve en direccin 5-3 en una hebra y 3-5 en la otra, y los cidos nucleicos son sintetizados unicamente en direccin 5-3 esto se resuelve sintetizando la hebra que crece de 3-5 en una serie de fragmentos cortos, cada uno de los cuales realmente son sintetizados de 5-3. La hebra que se sintetiza de 5-3 se conoce como hebra lider, la otra es la hebra convicta o cautiva, cada segmento es sintetizado en una direccin contraria al movimiento de la horquilla, los fragmentos sin embargo se sintetizan de 5-3y luego son unidos conformando una replicacin discontinua. La iniciacin de la sntesis es acompaada por un complejo proteico llamado Primosoma en E. coli. Las ADN polimerasas de Procariotas y Eucariotas no pueden iniciar la sntesis de una cadena de ADN a partir de nucletidos libres. Se requiere de un "primer" (primario) para proveer de un final libre 3-OH que pueda elongarse por la adicin de nuevos nucletidos, esto se da de varias formas: a) Una secuencia de ARN es sintetizada en el templete, por lo que la cadena de ARN se extiende por la ADN polimerasa. Comunmente usado en la replicacin del ADN celular y por algunos virus. b) Unos pares de bases de ARN preformado con el templete, permite que su final 3OH pueda ser usado por retrovirus para iniciar una transcripcin reversa de ARN. c) Un termino inicial es generado por el duplex de ADN, el mecanismo mas comn es la introduccin de un corte como el usado en la iniciacin de la replicacin del circulo rodante, en este caso la hebra preexistente es desplazada por una nueva hebra sintetizada (diferente de Nick Translation en la cual la hebra es degradada). d) Una protena inicia la reaccin directamente por la presentacin de un nucletido para la ADN polimerasa. Esta forma es utilizada por ciertos virus.
32
Figura 2.9 Esquema del avance de una horquilla de replicacin, se observa en el esquema de la derecha la formacin del fragmento de Okazaki en la hebra cautiva. Cmo se regula la iniciacin de la replicacin? A) Metilacin: la replicacin ocurre unicamente en un origen metilado, lo cual sucede en la secuencia palndroma: GATC/CTAG, y se metla la posicin N6 de la adenina por una enzima llamada DAM Metilasa. GAmetT CCT Amet G La replicacin sintetiza cadenas dobles hemimetiladas de ADN: GAmet TC - MaternaCTAG-NuevaGATC NuevaCTAmetMaterna Por lo tanto el complejo de iniciacin de la replicacin no reconoce el origen. B) Asociacin a la membrana: despus que el ciclo de replicacin se ha iniciado, los orgenes de las nuevas cadenas formadas se unen a la membrana previniendo que se repliquen de nuevo, lo cual puede ser de manera indirecta por que los orgenes han sido ocupados o bien de manera directa por que algunos componentes de la membrana inhiben la reaccin.
33
2.1.4 Mutaciones: mutgenos

Existen una gran variedad de agentes fsicos y qumicos que pueden inducir mutaciones. A continuacin se presentan algunos de los principales grupos y su modo de accin.
1.- Mutgenos qumicos

Se conocen varios productos qumicos que son mutagnicos, clasificndose segn su modo de accin en: Anlogos de bases: Debido a su similitud estructural los anlogos de bases como el 5-Bromouracilo o la 2-Aminopurina se incorporan en el ADN que se replica en lugar de las bases correspondientes timina y adenina. Cuando uno de estos anlogos de bases se incorpora en el ADN, la replicacin puede ocurrir normalmente aunque ocasionalmente ocurren errores de lectura que resultan en la incorporacin de bases errneas en la copia de ADN. As por ejemplo, el 5-Bromouracilo se puede aparear con guanina (la timina se aparea con adenina) ocasionando la transicin de AT a GC (la guanina se aparea con citosina). La 2-Aminopurina puede aparearse con citosina ocasionando la transicin de AT a GC.
Figura 2.10 Esquema que representa la sustitucin de las bases normales por una molcula de 5-Bromouracilo
Agentes que reaccionan con el DNA: Existen una serie de agentes qumicos que reaccionan directamente sobre el ADN que no se est replicando ocasionando cambios qumicos en las bases lo que provoca un apareamiento incorrecto.
Acido nitroso (HNO2), desamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a las distintas propiedades de apareamiento de los productos de desaminacin (hipoxantina aparea con citosina; uracilo con adenina) se producen transiciones AT---->GC y/o GC---->AT. Hidroxilamina (NH2OH), reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por un grupo hidroxilamino. Este derivado de la citosina se aparea con adenina producindose transiciones GC ----> AT.
Agentes alquilantes: Grupo de productos qumicos que afectan al ADN que no se replica. Junto con la luz ultravioleta son los sistemas mutagnicos ms potentes para aplicaciones prcticas. Los compuestos utilizados ms frecuentemente incluyen el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato (DES), diepoxi butano (DEB), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-Nnitroso urea y gas mostaza. 34
La mutagnesis con agentes alquilantes se produce a travs de varias vas ya que originan la formacin de un espectro completo de bases alquiladas en el ADN lo que origina transiciones y delecciones. El etil metano sulfonato (EMS) introduce un metilo en la guanina que ya no se aparea con la citosina provocando la transicin GC ----> AT.
Figura 2.11 Esquema de una mutacin de la Guanina provocada por el agente alquilante etil metano sulfonato (EMS) El N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), cancergeno, es uno de los mutgenos qumicos ms efectivos. Se obtienen, en condiciones ptimas, un gran nmero de mutantes con una tasa de muerte baja. El mecanismo molecular exacto de la reaccin de la NTG no se conoce todava. Agentes intercalantes: Un grupo interesante de sustancias como las acridinas y bromuro de etidio, son molculas planas que se insertan entre dos pares de bases del ADN, separndolas entre s. Durante la replicacin, esta conformacin anormal puede conducir a microinserciones o microdelecciones en el DNA, originando mutaciones por corrimiento de lectura.
Aunque las acridinas son tiles en investigacin, no son muy adecuadas para el aislamiento rutinario de mutantes durante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningn efecto mutagnico en bacterias.
Figura 2.12 Esquema del modo de accin del agente intercalante Acridina. 35
2.- Mutgenos fsicos
Luz ultravioleta: Uno de los agentes mutagnicos ms efectivos es la radiacin ultravioleta de longitud de onda corta. La longitud de onda efectiva para la mutagnesis est comprendida entre los 200 y 300 nm con un ptimo a 254 nm que es la absorcin mxima del ADN. La radiacin a longitudes de onda entre 300 y 400 nm tiene menos efectos letales y mutagnicos que la luz UV de longitud de onda corta.
Los productos ms importantes de la accin de la luz UV son dmeros (timinatimina; timina-citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (T, C) adyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante la replicacin del ADN, la ADN polimerasa inserte un nucletido incorrecto en tal posicin. La radiacin UV es muy til en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos. Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente a la luz visible de una longitud de onda de 300 a 450 nm, la velocidad de supervivencia aumenta y la frecuencia de mutacin desciende. Esto se debe a la activacin de un enzima de fotorreactivacin que corta los dmeros de timina. En presencia de luz, el enzima corta los dmeros originando pirimidinas monomricas.
Figura 2.13 Esquema que representa la formacin de dimeros de Timina provocada por la radiacin UV.
Radiacin ionizante: La radiacin ionizante es una forma de radiacin ms potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos X, rayos csmicos y rayos gamma. Esta radiacin causa la ionizacin del agua y de otras sustancias; producindose indirectamente efectos mutagnicos debido a esta ionizacin.
36
Entre las especies qumicas formadas por la radiacin ionizante se encuentran radicales libres, siendo el ms importante el radical hidroxilo (OH-). Los radicales libres reaccionan con el ADN, y lo inactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son las mutaciones cromosomales.
A bajas dosis de radiacin ionizante slo ocurren unos cuantos impactos sobre el ADN, pero a mayores dosis ocurren impactos mltiples que conducen a la muerte de la clula. Al contrario que la radiacin UV, la radiacin ionizante penetra fcilmente el vidrio y otros materiales
Figura 2.14 Diferentes tipos de radiaccin que se presentan en la naturaleza, se observa que la radiacin ionizante es de longitudes de onda muy pequeas. 2.1.5 Sistema de proteccin del ADN Despus de su incorporacin, las bases se metilan para marcar segmentos de ADN. Tanto procariotas como eucariotas contienen enzmas que metlan el ADN aunque sus funciones de metilacin son diferentes. Procariotas E. coli posee pequeas cantidades de 6-metil-adenina y 5-metil-citosina en su ADN, estas bases se generan por accin de tres metilasas. a) Sistema hsd: que confiere especificidad del hospedero metilndo la adenina. b) Sistema dam: que distingue las hebras de ADN de nueva replicacin, por metilacin de la adenina (involucrando el control de replicacin y marcaje de ADN para su reparacin). c) Sistema dcm: que metla citosina, su funcin es desconocida. Las bacterias que poseen mutaciones en los tres sistemas carecen de bases metiladas y siguen siendo viables, por lo que la metilacin no es un evento escencial.
37
Eucariotas La metilacin en este grupo tiene distinta funcin, es distinguir genes en las diferentes condiciones funcionales. Los daos al ADN pueden ser minimizados por un sistema de contencin del dao, que reconoce la presencia de un cambio y lo rectifica. Los sistemas de reparacin son similares a los complejos de replicacin, un indicativo de su importancia en la sobrevivencia de la clula. La tasa de mutacin refleja un balance entre el nmero de eventos dainos que ocurren en el ADN y el nmero que ha sido corregido (o mal corregido). Un dao al ADN consiste en cualquier cambio que desve la usual estructura de doble hlice, los cambios se pueden dividir en dos grupos.
2.1.6 Reparacin del ADN: pre y postreplicativa
Mecanismos de reparacin
A) Eliminacin directa del dao
Fotorreactivacin La luz ultravioleta induce la formacin de dmeros entre dos pirimidinas adyacentes (normalmente dmeros de timina). La fotoliasa, mediante el proceso de fotorreactivacin, que es dependiente de luz, revierte la primera reaccin y deshace el dmero. Alquiltransferasas Ciertos mutgenos (nitrosoguanidina, etilmetanosulfonato) aaden grupos alquilos en la posicin O-6 de las guaninas. Las alquiltransferasas eliminan esos grupos alquilos. B) Sistemas de reparacin dependientes de homologa Reparacin por corte y relleno Sistema general: El sistema reconoce una base anormal. Rompe puentes fosfodister a una distancia de varias bases a ambos lados de la lesin. Elimina el fragmento (12-13 nucletidos en procariotas, 27-29 en eucariotas). El hueco se rellena con ADN polimerasa I y se sella con ligasa. En E. coli intervienen los genes uvrABC. Sistema especfico: Una ADN glucosilasa libera la base daada al romper un puente N-glucosdico (base-azcar). Esto da lugar a un sitio apurnico o apirimidnico (AP). Una AP endonucleasa reconoce el sitio AP y rompe un puente fosfodister en ese sitio.Esto inicia un proceso de reparacin por escisin mediado por una exonucleasa, la ADN polimerasa I y la ligasa de ADN. C) Sistema de reparacin directa Varios tipos de daos son reparados sin la remocin de bases. El ejemplo mas estudiado es la fotoreactivacin directa de los dmeros de pirimidina ciclobutano, que es una a reaccin promovida por la ADN Fotoliasas. Los dmeros de pirimidinas resultan de una reaccin inducida por la luz, y las fotoliasas usan 38
energa derivada de la luz absorbida para revertir este dao. Las Fotoliasas generalmente contienen dos cofactores que sirven como agentes absorbentes de luz o cromoforos. Uno de los cromoforos es siempre FADH2. El otro es un folato en E. coli y levadura.
Figura 2.15 Esquema de reparacin directa de un dimero de pirimidina.

D) Reparacin de emparejamientos errneos
El sistema reconoce dos bases mal emparejadas tras la replicacin. MutS es la protena encargada en E. coli. Determina qu base es la incorrecta, la base incorrecta es la que se encuentra en la cadena recin sintetizada. La cadena vieja se distingue porque est metilada en las adeninas que se encuentran dentro de las secuencias 5'-GATC-3'. Esta metilacin es postrreplicativa y la lleva a cabo la metilasa Dam. La cadena nueva tarda de 1 a 2 minutos en re-metilarse tras la replicacin. MutL y MutH forman un complejo con MutS. MutH es un endonucleasa que corta la cadena nueva en el sitio GATC ms cercano al emparejamiento errneo y escinde la base incorrecta, llevando a cabo la sntesis reparadora. Una exonucleasa elimina un trozo de la cadena nueva desde el sitio GATC hasta ms all del emparejamiento errneo. Protenas de unin a ADN de cadena simple protegen el hueco. La ADN polimerasa III rellena el hueco y la ligasa lo sella.
39
REPLICACIN
Hebra vieja metilada y hebra nueva NO metilada
Las adeninas de la hebra nueva se metila por medio de la Dam metilasa
Figura 2.16 Esquema del proceso de metilacin de las adeninas en la cadena de ADN recin sintetizada, este proceso es necesario para que el sistema de reparacin de bases malparedas reconozca la hebra materna o vieja.
E) Reparacin sin hebra molde: El reguln SOS de E. coli Slo se induce en situaciones en que la replicacin del ADN est bloqueada por una lesin y la reparacin no es posible por uno de los sistemas antes mencionados. Etapas: 1.La ADN polimerasa III se detiene ante una lesin, lo que genera ADN de cadena simple. 2.Esto atrae a las protenas de unin a cadena simple (SSB) y a RecA. 3. La presencia de filamentos de RecA es una seal para que la clula sintetice UmuD y UmuC
4. RecA corta UmuD para dar lugar a UmuD.
5. El complejo UmuD' / UmuC permite que la polimerizacin de ADN contine a pesar de la lesin. El sistema SOS permite continuar la replicacin pero introduciendo nucletidos al azar. Este es un sistema de reparacin propenso a error. 40
Cuadro 2.4 Genes inducidos por el sistema SOS Nombre del gen Papel el el sistema de reparacin por SOS PolB (din A) uvrA uvrB uvrC umuC umuD SulA RecA Codifica para la ADN polimerasa II, involucrada en reparar. Codifican para la ABC exinucleasa. Codifican para protenas involucradas en la reparacin por prueba y error. Codifica para protenas que detienen la divisin celular. Codifica para la protena RecA involucrada en la reparacin por prueba y por recombinacin. PARTICIPACIN EN REPARACIN POCO CLARA ssb uvrD himA recN Protenas SSB. Codifica para Helicasa II. Codifica para subunidad de factor de integracin a hospedero. Protena involucrada en la reparacin por recombinacin.
dinB dinD dinF
FUNCIN DESCONOCIDA
2.2 EMPAQUETAMIENTO DEL ADN 2.2.1 Genomas y cromosomas Genoma bacteriano El genoma bacteriano se encuentra organizado en cuerpos definidos, aunque si bien no en estructuras morfolgicamente distintas como en eucariontes. El genoma puede verse como un conglomerado que ocupa cerca del 35% del volumen de la clula . El material gentico se condensa en un rea conocida como nucleoide. Las bacterias que han replicado parcialmente su ADN presentan en el nucleode mas de un juego de genomas en ADN. En la divisin el material se separa en dos nucleodes los cuales se particionan entre las clulas hijas, la segregacin involucra la adhesin del genoma bacteriano a la membrana interna. Mecanismo similar al de los cromosomas de eucariontes. Un locus especfico es conectado a un sitio en la membrana. 41
Si se rompe una bacteria E.coli las fibras de ADN se liberan en forma de rizos unidos a la envoltura rota los rizos condensan al ADN gracias a unas proteinas, muchas proteinas de union con el ADN han sido aisladas de E.coli. Cuadro 2.5 Protenas de unin al ADN en E. coli Protena Hu H H1 HLP1 P Composicin y subunidades 9000 d Nmero por clula Equivalentes eucariotas H2B 40,000 dimeros H2A Desconocido Desconocido protaminas en
2 sbunidades idnticas 28000 30,000 dimeros d 10,000 copias Subunidad de 1500 d 20,000 copias Monomero de 17000 d desconocido Subunidad de 3000 d
Genoma viral Con respecto al empaquetamiento del genoma, existen diferencias entre el genoma viral y el celular. El genoma viral se ve restringido por dos aspectos: a) la cantidad de cido nucleico est predeterminada por el genoma y b) el cido nucleico debe empaquetarse en una cpsula de protena. El genoma est contenido en una cpsula simtrica o cuasimtrica, ensamblada por una o mas protenas. Junto con la cpsula se pueden encontrar otras estructuras proteicas. El volumen interno de la cpsula pocas veces es mayor que el volumen de cidos nucleicos que debe contener. La cpsula es construida con protenas codificadas por el virus, por lo que se construye por un tipo simple de subunidades restringindose la forma de la cpsula a dos tipos: A. Filamentosas o forma de bastn. B. Pseudoesfricas o simetra icosaedrica Cmo se construye una cpsula que contenga el cido nucleico? 1. La cubierta proteica puede ensamblarse alrededor del cido nucleico, condensando el ADN o ARN por interacciones cido protena durante el ensamblaje. Un ejemplo es: el MTV, en el cual la cadena sencilla del ARN se ve cubierta por el ensamblamiento de las protenas. El ensamble comienza en un punto determinado del ARN y se dirige hacia ambos extremos de la cadena. Formndose una estructura cilndrica gracias a la interaccin con la forma helical del ARN. Estructuras semejantes se observan en cpsulas esfericas ejemplo: TYMV, la posicin del ARN en la cpsula es determinada directamente por su unin con la protena de la cubierta. 42
2. La cpsula puede ser construida a partir de sus componentes en forma de una cubierta vacia,despus de lo cual los cidos nucleicos pueden ser insertados siendo condensados cuando entran. Ejemplo: en los fagos lambda y T4 , cpsulas esfricas con ADN . Una cabeza vaca de la cpsula es ensamblada a partir de un juego pequeo de protenas, luego el genoma dplex es insertado en la cabeza, junto con un cambio estructural de la cpsula. El ADN insertado a la cabeza vaca de la cpsula tom una forma concatemrica. Genomas mltiples unidos final con final. Cada fago posee su propio mecanismo para reconocer la cantidad apropiada de ADN que debe ser insertada.
Figura 2.17 Esquema de un virus icosahedrico, se observan los componenetes y el material gentico (ADN) en el interior de la cabeza. Lambda: Los finales del genoma se encuentran marcados por sitios denominados COS. Este se corta a la izquierda del sitio COS que produce un final libre que es insertado dentro la cpsula. La insercin de ADN continua hasta que el sitio COS derecho se libera al cortarse para generar el otro fin. El ltimo final que entra en la cpsula durante el ensamblaje es el primero en entrar a la clula infectada. Cualquier ADN contenido entre ambos sitios COS puede ser empaquetado. El empaquetamiento no resulta si la distancia entre los sitios COS es muy grande o reducido. Solo un 15 % extra del ADN puede ser empaquetado.
Figura 2.18 Esquema de replicacin y recircularizacin del ADN del fago lambda. 43
Fago T4: La insercin del genoma se inicia en un sitio al azar en el precursor concatemrico. Continua hasta que un valor del genoma de ADN ha sido insertado lo que involucra la existencia de algunos mecanismos para medir la cantidad de ADN (realmente la cantidad de ADN insertado es un poco mayor que el genoma) creando una redundancia terminal.
Figura 2.19 Esquema de los ciclos reproductivos de los virus, se presenta la forma de propagacin del material gentico, y el esamble. Cromosomas en eucariotas Los cromosomas eucarioticos individuales solo se observan durante un periodo corto de tiempo, durante la divisin celular y pueden observarse como una unidad compacta con un radio de empaquetaminto de 10,000. Una cromtida consiste de una fibra de un diametro de aprox 30 Nm y de apariencia nebulosa. Durante el ciclo de vida de la clula eucaritica, sin embargo, el material gentico ocupa un rea en el ncleo, por lo que los cromosomas individuales no pueden ser observados. Cada cromosoma contiene un dplex de ADN muy largo, por lo que la replicacin de los cromosomas al igual que del ADN es semi-conservativa. Durante la mitosis las cromtidas hermanas se mueven hacia polos opuestos de la clula, el movimiento depende de la unin de los cromosomas a los microtbulos que se conectan en su otro final con los polos. El lugar al cual se unen los cromosomas en los microtbulos se le denomina: Centrmero, que tiene un significado funcional y estructural, el centromero es escencial para la segregacin. 44
El centromero posee una regin rica en ADN satlite y por lo tanto contiene una cantidad considerable de heterocromatina constitutiva. En esta regin, puede observarse una zona obscura fibrosa con un diametro o longitud de 400 nm aproximadamente. Esta regin es conocida como cinetocoro a la cual se unen directamente los microtubulos. Se asme que una secuencia especfica de ADN define el stio en que el cinetocoro se establece.
Figura 2.20 Esquema de la integracin del ADN para formar un cromosoma en mamfero. Otra estructura importante en los cromosomas es el telmero, que sella el final del cromosoma, es importante ya que se ha observado que cromosomas rotos sin esta estructura son inestables y tienden a pegarse a otros cromosomas. Se encuentra al final del cromosoma o al final de un ADN lineal. Confiere estabilidad a una molcula lineal. Cada telmero consta de una serie larga de secuencias cortas y repetitivas. En la regin telomrica se encuentran ciertas discontinuidades, en forma de bandas simples rotas que previene que la enzima ligasa los selle. La regin o longitud del telmero se encuentra bajo control gentico, diferentes cepas de levaduras presentan diferentes longitudes, algn mecansmo exste para prevenir longitudes muy largas, removiendo algunas repeticiones, por lo cual la secuencia excta es irrelevante ya que la regin puede crecer al avanzar en las generaciones.
45
Caractersticas necesarias para la existencia de los cromosomas: i)Telmeros propios para sobrevivir. ii)Centrmeros: para la segregacin. iii)Origen: inicio de la replicacin. 2.2.2 Estructura de la cromatina: histonas y nucleosomas Histonas La masa de la cromatina contiene dos veces mas protena que ADN, las protenas pueden ser histonas o no histonas, y el ARN es menos del 10% de la masa de ADN, ste ARN, est formado por cadenas recin sintetizadas que an se encuentran unidas al templete de ADN. Las histonas conforman aproximadamente la misma cantidad de ADN. Y son las protenas mas importantes. En todos los eucariontes se pueden encontrar las mismas histonas que son las siguientes: H2A Y H2B interactan directamente con el ADN son particulas de primer nivel en la cromatina. H1 muestra gran variacin entre tejidos y especies (ausente en levaduras) y una variante es la H5. Clulas sanguneas rojas en aves. Las no histonas son mas variables entre tejidos y especies, menor masa que las histonas, muchas mas protenas, por lo que una protena se encuentra en menor cantidad que una histona dada. Las protenas no histonicas incluyen funciones relacionadas con la expresin gnica. ARN Polimerasa es una no histona de mucha relevancia. Protenas HMG (high moblity group), son un grupo de protenas no histnicas bien definido. Las no histonas tienden a contaminarse con protenas nucleares. Cuadro 2.6 Protenas histonicas presentes en los mamferos Nombre de la histona Lisina (%) Arginina (%) Peso molecular y funcin H1 29 1 23,000 Sella el ADN que se sobre el enrrolla nucleosoma. H2A 11 9 13,960 Interacta directamente con el ADN. H2B 16 6 13,774 Interacta directamente con el ADN. H3 10 13 15,342 Interacta directamente con el ADN. H4 11 14 11,282 Interacta directamente con el ADN.
46
Nucleosoma Contiene aproximadamente 200 pb de ADN asociado a un octmero de histonas. El octamero es el ncleo del nucleosoma, est conformado por: 2 copias de H2A, H2B, H3 y H4. Asociada a cada nucleosoma una molcula sencilla de H1, la cual puede ser removida sin alterar la estructura del nucleosoma. El nucleosoma siempre posee un ncleo de ADN formado por 146 pb. Cortes enzimticos, demuestran que este ncleo permanece sin cortes despus de cierto tiempo, sin embargo, si contina la digestin se observan longitudes de ADN, la mayor de las cuales mide 146 pb y la menor, mide menos de 20 pb . El ADN nucleosomal mide entre el ADN ncleo y el ADN de unin o eslabn entre 80 a 114 pb por nucleosoma. Los nucleosomas in vitro se observan unidos por ADN libre, pero in vivo, debe exstir muy poco ADN libre (no asociado), por lo que todo o casi todo el ADN esta asociado en nucleosomas. Sin embargo, se pueden observar cambios en diferentes etapas embrionarias.
Figura 2.21 Esquema de un nucleosoma y los componantes que lo forman. Se observan las protenas histnicas disosiadas. 47
La H1 y protenas no histnicas influyen en la longitud del ADN asociado al octmero de histonas siendo protenas de ensamble sin formar parte estructural del nucleosoma. La protena H1 se une en la vecindad de los nucleosomas, en degradaciones con 160- 170 pb.de ADN, se encuentra H1 lo que sugiere que se encuentra en una regin cercana al ncleo del nucleosoma . Cortes de 16 pb no lo presentan. El nucleosoma es un disco o cilindro plano con un diametro de 11Nm y 6Nm de altura. Los 67 Nm (200 Pb) del ADN se encuentran rodeando dos veces al octmero con un giro de 34Nm cada una. El ADN entra y sale del octmero en la misma posicin o punto. Realmente el ADN gra alrededor del nucleosoma dando 1.8 vueltas. Los octameros del nucleosoma pueden obtenerse por: Extraccin de la cromatina. In vitro: dejando a las histonas en condiciones de alta salinidad. El ADN que se une al nucleosoma no lo hace al azar, pues un primer paso para la integracin del nucleosoma es la union de protenas no histnicas en sitios especficos del ADN. Por lo que se dice que el ADN del nucleosoma se encuentra fraseado es decir siempre reconoce la misma regin para unirse al octamero, al menos en secuencias cortas de ADN. La cromatina presenta dos tipos de fibras: fibras de 10nm de dimetro y fibras de 30 nm, la diferencia es la estructura y organizacin de los nucleosomas. 200 Pb = 262,000. Daltons.
Ncleo del nucleosoma ADN de unin
Protena no histnica
Histona H1
200 pb de ADN Figura 2.22 Esquema de una cadena de ADN asociada a nucleosomas 48
2.2.3 Naturaleza de la cromatina Durante la replicacin, cuando la cromatina se duplica, no se observa ninguna disrupcin. La cromatina puede ser dividida en dos tipos : Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma mittico su radio de empaquetamiento es aproximadamente de 1000 2000 durante la interfase . Heterocromatina: Muy densa, el grado de empaquetamiento es similar al de los cromosomas en mitosis, durante el ciclo celular no cambian su densidad. En esta forma el ADN no se transcribe. Cromocentro: Varias heterocromatinas agregadas en una regin. La heterocromatina se diferencia de la eucromatina solo por el grado de condensacin. Heterocromatina constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadas incluyendo secuencias satlites de ADN .
Figura 2.23 Empaquetamiento de la cromatina a diferentes niveles, hasta conformar un cromosoma en eucariotas.
49
Heterocromatina facultativa: Toma la forma de un cromosoma completo inactivo en una linea celular pero en otras circunstancias puede ser expresado. Ej: Cromosoma X en mamiferos, una copia elegida al azar es inactiva en una hembra dada, lo que compensa la presencia de dos X en hembras. El cromosma X inactivo se perpeta como estado heterocromatido. El cromosoma X activo se perpeta como estado eucromtido. Por lo tanto hay correlacin entre actividad de transcripcin y organizacin estructural. La condensacin del material gentico se asocia con su inactividad, pero lo contrario no necesariamente es cierto. Los genes activos son contenidos en la eucromatina, la localizacin en eucromatina es necesaria para la expresin gnica pero no sufiiente. In vitro la cromatina en interfase y cromosomas mitticos posen grandes rizos de fibra constitutiva formando regiones o campos independientes, como en los nuclesidos bacterianos. El desarrollo de la tcnica de bandeo G mostr que cada cromosoma pose una ultra estructura diferente y reproducible. El teir los cromosomas despus de un tratamiento, con el colorante giemsa , genera una serie de bandas. Aunque esta tcnica es muy ampliamente empleada aun no se reconoce por que se produce el bandeo.
50
UNIDAD 3 EXPRESIN DE LA INFORMACIN DEL ADN

3.1 TRANSCRIPCION Unidad de transcripcin: Se extiende del promotor al punto de trmino de un gen. La transcripcin se divide en tres etapas: 1. Iniciacin, en la cual se une el complejo enzimtico de transcripcin sobre una secuencia de ADN conocida como promotor, y avanza hasta la secuencia que significa el punto de inicio, que es donde se une el primer ribonucletido. 2. Elongacin, es el proceso de unin covalente de los ribonucletidos. 3. Terminacin, cuando el complejo enzimtico de transcripcin llega a una secuencia que significa el trmino de la transcripcin.
EL DOGMA CENTRAL EXPLICA EL AD TRASNCRI

TRASNCRIPCIN INVERSA
AR
PROTE
Figura 1 Dogma central del flujo de informacin en los sistemas vivos.
3.1.1 Unidad de transcripcin ARN polimerasa: enzima encargada de la sntesis de ARN a partir de templado de ADN. La ARN polimerasa fue descubierta independientemente en 1960 por Samuel Weiss y Jerard Hurwits. 51
La reaccin que cataliza consiste en:
(ARN)n-residuos + NTP
(ARN)n-residuos + 1 + PPi.
NTP: nuclesido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, el bifosfato (PPi) se hidroliza Todas las clulas contienen a la ARN polimerasa. En procariontes esta enzima sintetiza todo el ARN excepto el necesario para el cebador en la replicacin del ADN (esta reaccin es catalizada por la primasa). Algunos bacteriofagos sintetizan una ARN polimerasa que solo sintetiza ARN especfico del fago. En eucariontes hay 3 4 ARN polimerasas diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs. La ARN polimerasa mejor caracterizada es la de E. coli. Procariotas Posee una sola enzima ARN polimerasa (encargada de pegar los ribonucletidos). Esta enzima sintetiza los tres diferentes tipos de ARN: mensajero, transferencia y ribosomal. Esta enzima est conromada por varias subunidades, por lo que se le conoce como holoenzima o complejo enzimtico que tiene un tamao de 48,000 Daltons (Da). Cuadro 3.1 Componentes de la holoenzima ARN polimerasa de procariotas Subunidad Locus Nmero por holoenzima Funcin Rpo A 2 Unin al promotor Rpo B 1 Unin de nucletidos Rpo C 1 Unin al templete Rpo D 1 Iniciacin
El ncleo enzimtico de la holoenzima (,,) puede iniciar el proceso de transcripcin pero no reconoce la secuencia de inicio. El complejo enzimtico cubre 60 pares de bases (pb) de la molcula de ADN, sin embargo, slo desenrolla 17 pb. La velocidad de la reaccin de unin entre nucletidos es igual a 70 nucletidos por segundo a una temperatura media de 37C. El proceso de la trasncripcin en procariotas puede bloquearse por la accin de antibiticos, por ejemplo la Rimfacina acta bloqueando la actividad de la subunidad del complejo. La Estreptomicina inhibe el proceso de elongacin. La Heparina es un polianin que bloquea la transcripcin in vivo, unindose a la subunidad . 52
Eucariotas Este proceso es mas complejo e involucra la actividad de 3 polimerasas de ARN en el ncleo, cada una con una estructura compleja de subunidades y con una funcin diferente. Cuadro 3.2 Enzimas ARN polimerasas presentes en eucariotas Nombre Ubicacin Funcin ARN polimerasa I Nucleolo Transcribe ARNr ARN polimerasa II Nucleoplasma Transcribe ARNm y ARN nuclear heterogneo (ARN) ARN polimerasa III Nucleoplasma Transcribe ARNt y otras molculas de ARN menores La principal diferencia entre las enzimas eucarioticas es su respuesta al octapeptido biciclico. Amanitina, la cual bloquea los ciclos de la ARN polimerasa II. Unindose a ella y no la de ARN polimerasa I. Cada enzma se compone de dos subunidades grandes, con untamao de 200,000 y 140,000 Daltons y varias sbunidades con tamao de entre 10,000 a 90,0000 Daltons. No existe especificidad ni entre tejidos ni entre especies en la actividad de la enzima ARN polimerasa II, in vitro, sin embargo muchos otros factores regulan la transcripcin en condiciones naturales. ARN polimerasa en mitocondrias y cloroplasto son menos activos y diferentes de los nucleares y su control parece ser mas simple. 3.1.2 Transcripcin en procariotas y eucariotas Procariotas El factor sigma () en los procariotas juega un papel muy importante pues asegura que la ARN polimerasa bacteriana se una al ADN de los promotores y no en otros sitios, ya que la holoenzima por si misma presenta una alta afinidad por el ADN. Permite a la holoenzma reconocer sitios especficos en el ADN y que en ese momento requieren de ser trasncritos a ARN. Se forma un complejo terciario ADN-ADN-ARN naciente, cuando se une el primer ribonucletido a la secuencia de ADN que se trasncribe, lo que dispara la liberacin del factor sigma de toda la holoenzma. Este paso es el inicio de la trasncripcin propiamente dicho, cuando ocurre la sntesis del primer enlace fosfodister entre ribonucletidos. La proporcin entre el factor sigma bacteriano y el ncleo de la holoenzima es de 1:3. Por lo que cuando finaliza la transcripcin el tetrmero (holoenzma) se libera y debe unirse a otro factor sigma que dirija una nueva transcripcin. Se dan tres etapas en el movimiento de un sitio de unin a otro de la ARN polimerasa, este movimiento est limitado por la velocidad de difusin en el medio.
53
La afinidad de la holoenzma hacia el ADN es tan alto como la afinidad del factor hacia la secuencia del promotor. Sin embargo el factor solo no se une al ADN, nicamente se une si forma parte del complejo enzimtico. La iniciacin de la transcripcin es un punto crtico para controlar la expresin gnica. Los promotores varan en su afinidad hacia la ARN polimerasa.
HOLOEN
REGIN PROMOT
ARN POLIMERAS
UNIN DE LA ARN POLIMERASA
ARN POLIMERAS
NCLEO
INICIO DE LA
Figura 3.2 Esquema del proceso de transcripcin en procariotas.
3.1.3 Eventos de la transcripcin La ARN polimerasa comienza a copiar cuando encuentra una secuencia promotora de ADN, y termina cuando alcanza una seal de terminacin. En el caso de los procariontes el ARN transcrito se une desde el primer momento a protenas, debido a que es muy inestable ya que no tiene el 7-metil-guanocina (CAP), ni la poliA, que estabilizan el ARNm eucaritico. En la transcripcin intervienen factores de naturaleza proteica de tres tipos: Factores de transcripcin: Son diversas protenas que se unen al ADN promotor, convirtindolo en funcional, lo que atrae a las ARN polimerasas. Hay un factor especifico para cada tipo de ARN polimerasa. - Factores de iniciacin: Es la subunidad s de la ARN polimerasa y se libera tras la sntesis de los ocho primeros nucletidos. 54
Factores de elongacin: Se incorpora a la polimerasa tras la liberacin del factor de iniciacin. Sirve para la elongacin y terminacin de la cadena de RNA. En eucariotas gran parte del ARNm de la clula es producido por un complejo proceso que empieza en el ncleo con la sntesis y procesamiento de un RNA muy largo, denominado ARNm precursor, ARN nuclear heterogneo (ARNhn) o transcrito primario.
TRANSCRIPCION
Pre ARNm
ESCISIN DE INTRONES Y UNIN DE EXONES
POLIADENIZACI
ARNm
SALIDA AL CITOSOL PARA SER POR LOS
Figura 3.3 Proceso de maduracin del ARN en eucariotas Este transcrito tiene unos 8,000 nucletidos (llegando hasta 20,000) y contiene segmentos que se traducirn como aminocidos (exones) y segmentos no codificantes (intrones o secuencias intercaladas) y, adems secuencias reguladoras a las que se unirn las protenas de regulacin gnica. A continuacin, este transcrito sufre un proceso de maduracin, en el que se cortan y empalman largas secuencias de ARN (splicing), para eliminar los intrones y dar lugar al ARNm definitivo que es selectivamente transportado al citoplasma. En este proceso, la mayor parte del ARNhn (90%) se elimina y degrada en el ncleo. El transcrito primario de ARN hn es producido por la accin de una ARN polimerasa II. El ADN promotor contiene una secuencia llamada BLOQUE TATA, porque consta de secuencias ricas en T y A, esta secuencia est situada a unos 25 nucletidos por delante del nucletido de inicio de la transcripcin. En eucariotas (no en procariotas), al transcrito primario se le aaden dos seales, una en cada extremo: CAP: Al extremo 5 del transcrito se le aade un nucletido especial la 7-metilguanosina trifosfatada. Este nucletido (SELLO) se le aade cuando se llevan 55
sintetizados unos 30 nucletidos, y sirve para que la subunidad pequea del ribosoma reconozca el ARNm y se una a l en la sntesis proteica. Adems, evita que se degrade el ARNm recien creado. Secuencia poli-A: En el extremo 3 se aade una cadena de unos 200 residuos poliadenilados (polinucletido en forma de poli-A). La cola poli-A desempea las siguientes funciones:
a) Interviene en la exportacin del ARNm al citoplasma.
b) Contribuye a la estabilidad del ARNm en el citoplasma. c) Sirve de seal de reconocimiento al ribosoma.
3.2 Control por transcripcin de la expresin gnica 3.2.1 Interaccin ARN polimerasa-promotor Procariotas Existen diferentes factores sigma, especficos para cada clase de promotores. En E. coli, por ejemplo, se ha observado que en condiciones de choque calrico acta un factor sigma distinto ya que modifica su patrn de transcripcin como efecto del incremento en la temperatura. Tanto en procariotas como en eucariotas un aumento en la temperatura resulta en una reduccin de la sntesis proteica. Y un nuevo juego de protenas son sintetizadas como resultado de los genes de choque calrico. Probablemente protegen a la clula contra el estrs ambiental y quiz pueden ser sintetizadas en otras condiciones. E. coli se producen 17 protenas de choque calrico por un cambio en el blanco de la transcripcin, el gen htpr es un regulador necesario para encender la respuesta al choque calrico, pues produce una protena de 32,000 Da que funciona como un factor sigma alternativo. 70 .- factor sigma de 70,000 Da en condiciones normales. 32 - factor sigma de choque calrico, dirige a la holoenzima hacia el inicio de los promotores de los genes de choque calrico. Los promotores de los genes de choque calrico presentan ciertas diferencias en cuanto a la secuencias consenso. Ligeramente modificada la secuencia 35 y muy diferente la secuencia 10, con respecto a la secuencia consenso. 60 - factor sigma alterno utilizado cuando se presentan condiciones de carencia de nitrgeno, este factor se activa cuando el amonio falta en el medio, y los genes necesarios son activados para permitir el uso de fuentes alternas de nitrgeno, este factor permite a la holoenzima reconocer promotores que presentan secuencias consenso distintas, con elementos conservados en el sitio 10 y otra secuencia en el sitio 20.
56
En Bacilus subtilus se encuentran an mas factores distintos un ejemplo es cuando esta bacteria es infectada por un virus ltico SPO1 cuyo ciclo infectivo pasa por tres etapas : Genes tempranos: inmediatamente despus de la infeccin el genoma viral se transcribe con la holoenzma completa del husped que contiene un 43 lo cual indica que su promotor es reconocido por el complejo ARN polimerasa del husped. Esto produce la expresin del gen 28 (gp 28) el cual sustituye al factor 43 de la holoenzma que permite reconocer promotores distintos Genes medios: son expresados despus de 4-5 min de la infeccin como resultado de la holoenzima unida al factor gp 28 lo que provoca que se expresen los genes medios y la holoenzima no reconoce al genoma del hospedero y permite la transcripcin de los genes medios, estos transcriben los genes 33 y 34 dando como resultado las protenas GP33 y GP34 que de nuevo sustituyen al GP28 de la holoenzima. Genes tardos: despus de 8-12 min. Estos genes son transcritos por la holoenzima + gp33 y gp34 que nicamente reconocen los promotores de los genes tardos. Por lo tanto se observa un patrn de regulacin creado por cascada por la holoenzma del hospedero que transcribe un gen del fago cuyo producto es necesario para transcribir los genes medios, cuyo producto de los genes son necesarios para transcribir los genes tardios. Gp28= 26,000 Da, Gp33 =13,000 Da y Gp34 = 24,000 Da. Las sustituciones sucesivas de los factores tiene como consecuencia que cada vez que la subunidad es cambiada la ARN polimerasa es capaz de reconocer una nueva clave de gen y deja de reconocer la clave previa de genes. Por lo tanto constituye un cambio global en la utilidad de la ARN polimerasa, el cambio que sufre la polimerasa es irreversible. Durante la esporulacin de Bacilus subtilus, tambin entran en juego diferentes factores de la misma clula. 43 - Estado vegetativo. 37 - Esporulacin.- este factor nicamente se une al 10% del ncleo de la holoenzima. Probablemente 43 permanece durante la esporulacin, el 43 remanente no se destruye . 32 - Esporulacin, presente en clulas vegetativas y activo en etapas tempranas de esporulacin > 1% de la holoenzima se encuentra asociada con este factor sigma. 29 - Despus de cuatro horas del inicio de la esporulacin, este factor aparece y permite que se transcriban otros genes, no se encuentra en clulas vegetativas por lo tanto es el producto de genes activados por la ARN polimerasa + 37. 28 - Presente en clulas vegetativas, desaparece en clulas en esporulacin probablemente expresa genes cuyo producto detecta estrs nutritivo e inician la respuesta de esporulacin. 57
Eucariotas Promotores para ARN polimerasa II Para identificar la secuencia de los componentes del promotor, se puede usar varios criterios: a) Una secuencia consenso debe estar presente en varios ejemplos del sitio. b) Las mutaciones en el sitio deben provocar que la funcin se modifique. c) Las protenas involucradas en el uso del sitio pueden marcarse en ellas. Para definir un promotor se considera su habilidad de iniciar la transcripcin, tres sistemas han sido empleados: in vitro: Componentes definidos purificados para cada una de las tres ARN polimerasas. Comparacin de las actividades in vitro de las ARN polimerasas de diferentes tejidos y especies. Oocitos: Se lleva a cabo una inyeccin de un templete de ADN en el ncleo del oocito de Xilopus laevis. El ARN transcripto es aislado y analizado, se observa la formacin de la protena indicada en el templete inyectado, esta prueba se desarrolla bajo las condiciones prevalescentes en el Oocito. In vivo: Clulas cultivadas que transcriben un templete introducido por transfeccin. Utiliza el mismo aparato que se encarga de transferir el genoma de la clula husped pero el templete causante de un gen que no se transcribe usualmente en el husped. En cualquiera de los tres sistemas se emplea la misma tcnica para caracterizar al promotor: Cualquier seccin de ADN transcripta debe poseer un promotor, y para localizarlo se reducen los fragmentos a ambos sitios del punto, hasta que este se inactive.
Promotor Corte negativo(-)
Corte positivo (+) ADN 58
La misma longitud corriente arriba debe ser recolocada despus de que las fronteras del promotor han sido encontradas, entonces se puede analizar la importancia de bases particulares mediante la introduccin de mutaciones puntuales u otro re-arreglo en la secuencia . Una tcnica muy til para analizar la secuencia necesaria para que el promotor funcione es llamada: LINKER SCANING. La cual permite introducir mutaciones en sitios especficos. De esta manera la secuencia original puede ser monitoreada hasta encontrar un sitio sensible a la mutacin. En posicin corriente arriba, se pueden remover secuencias progresivamente sin ningn efecto, hasta alcanzar un punto localizado entre 45 y 30 pares de bases (pb), lo que define la frontera izquierda del promotor, cuando esta es traspasada la transcripcin se reduce en un 20% o ms . Corriente, abajo la frontera derecha del promotor se localiza cerca del punto de inicio y puede encontrarse despus de l a +6 o antes en 10 o 12 pb. Cuando se corta el punto de inicio, la iniciacin ocurre en un punto del templete localizado a la misma distancia del promotor, al igual que el punto de inicio original, a excepcin de que probablemente se ajuste en una base o dos para hallar una purina usualmente adenina (A) con la cual iniciar. Al igual que en bacterias, los promotores presentan regiones homologas cercanas al punto de inicio en tres regiones: a) Punto de inicio: homologa no extensa, pero con tendencia de la primera base del ARNm de ser flanqueado a ambos lados de pirimidinas. b) Secuencia a 25 pb: la mayoria de las protenas presentan una secuencia llamada TATA caja de Hogness en 19 a 17 pb, hallndose en mamferos, aves, anfibios e insectos, para los casos conocidos la secuencia consenso es: A63 T82 A97 T93 A85 A50
A83 T33 T37 La secuencia consta enteramente de bases A y T y en una minora de casos reales el par C-G esta presente. La caja TATA tiende a rodearse de secuencias ricas en C-G las cuales podran ser un factor de funcionamiento.La caja Hogness es equivalente a la Caja Pribnow, slo difieren en su localizacin, -25 en lugar de -10 pb. Es una secuencia corta bien definida y localizada cerca del punto de inicio de la transcripcin. Cuando la caja TATA es removida, la transcripcin contina pero el punto de inicio se corre de su ubicacin inicial. c) Secuencia a -75 pb: cuando esta regin es cortada la transcripcin inicia en el punto de inicio usual, pero disminuye en un 2%. Presenta una estructura multiperifrica localizada en regiones de -50, -70 y -80 a 110 pb, todos necesarios para una iniciacin eficiente.
59
Las regiones entre estas secuencias no parecen involucrarse en la funcin del promotor y la distancia que los separa entre s o de la caja TATA, puede ser flexible permitiendo un incremento de >15 pb en el primer caso y >30 pb en el segundo. In vivo los promotores parecen tener dos funciones: La frecuencia de la iniciacin parece estar fuertemente influenciada por las secuencias medias y distales de la regin 75 pb. Su funcin es la unin de la ARN polimerasa. La eleccin del punto de inicio parece estar influenciada por la secuencia cercana al punto, caja TATA altamente conservada, su papel es alinear a la ARN polimerasa para que inicie en el sitio correcto. Cmo se pone en contacto con regiones tan alejadas dentro del promotor? Regin alejada: muy importante para la unin de ARN polimerasa. Regin cercana: Importante para que se inicie en el punto correcto. La ARN polimerasa III posee un promotor corriente abajo El ARNm 5S posee un promotor que encaja dentro del gen a +50 pb. Se descubri empleando exonucleasas, 5S ARN segua siendo transcrito hasta que el corte del gen dejaba +55 pb. La transcripcin se inicia en la purina ubicada a 55 pb corriente arriba del promotor. Cmo? ARN polimerasa es lo suficientemente grande que abarca la regin a +55Pb. Factores de transcripcin Son protenas que reconocen secuencias consenso particulares, pueden ser de dos tipos: a) Factores de transcripcin que se unen a la ARN polimerasa durante o cuando el complejo de iniciacin se ha formado, sin formar parte de la enzima libre .Necesarios para iniciar o terminar la transcripcin. b) Factores de transcripcin que se unen en secuencias especficas de los promotores blancos . En este ltimo caso, se han podido aislar factores de transcripcin que reconocen secuencias determinadas. Cuadro 3.3 Factores de transcripcin en eucariotas Factor Especie Promotor Sitio de reconocimiento B Drosophila TATA TATA/Pto de incio TFIID Hombre Adenosin TATA CTF Hombre Globin, tk CAAT USF/MTLF Hombre Tardo GGCCACGTGACC SP1 Hombre TATA,CAAT,GC GC HSTF Drosophila Choque calrico Consenso de choque calrico.
60
Algunas estructuras caractersticas de los promotores actan directamente con los factores mas que con la ARN polimerasa. Los resultados indican que los promotores deben encontrarse en grupos generales identificados por la presencia de secuencias concenso y los factores que reconocen tales secuencias son los responsables de coordinar al reconocimiento de los promotores. Este reconocimiento por factores mltiples puede ser necesario para que se inicie la transcripcin. Cuando esto sucede, la interaccin con los promotores es de manera cooperativista: la unin de un factor promueve la unin de otro. Sin embargo, el papel de los factores es nicamente necesario para la transcripcin general sin incluir un papel regulatorio. Algunos factores pueden actuar como reguladores como es el caso de los genes de choque calrico. La respuesta al cambio calrico es similar en procariotas como en eucariotas. Un aumento en la temperatura apaga unos genes y enciende otros, y probablemente cambia la traduccin de los ARN mensajeros. Los genes de choque calrico en eucariotas poseen una regin consenso a -15 pb del punto de inicio. HTSF es activo en clulas con choque calrico y se une al sitio que posee la secuencia consenso, lo que provee un medio para iniciar la transcripcin de los genes especficos. Por lo que se puede decir que los factores son anlogos a los factores en procariotas. Un gen puede ser regulado por una secuencia en el promotor la cual es reconocida por una protena especfica, sta INICIO DE LA funciona como un factor necesario para que la ARN polimerasa inicie la transcripcin, la protena se encuentra disponible nicamente bajo condiciones en las que el gen necesita ser expresado, la ausencia, asegura que el promotor no pueda ser usado. Probablemente el promotor carece de ciertas caractersticas que le confieren los factores para poder ser reconocido por la ARN polimerasa .
PROTENA QUINASA
Figura 3.4 Esquema que representa la interaccin de las factores de trasncripcin con la ARN polimerasa II, el factor TFII D se une a la regin TATA y puede interaccionar con el factor TFIIB, interactuando con los factores TFIIH y TFIIE. El factor TFIIF se une a la ARN polimerasa. Lo cual prepara el medio para que se inicie el proceso de la trasncripcin. 61
INICIO DE LA TRANSCRIPCIN
Cuando un promotor es regulado en mas de una forma, cada evento regulatorio depende de la unin de su propia protena a una secuencia particular. Los promotores para la ARN polimerasa II contienen las secuencias bsicas (caja TATA) involucradas en el funcionamiento general con ARN polimerasa II y una serie de secuencias especficas que le permiten a la ARN polimerasa II unirse e iniciar la transcripcin bajo condiciones particulares. Aceleradores En algunos casos los promotores no funcionan solos, otras secuencias pueden incrementar enormemente la actividad de los promotores. Estas secuencias son conocidas como Aceleradores o Aumentadores. La diferencia entre un promotor y un acelerador es su posicin relativa al promotor, la cual puede variar y funciona en cualquier sentido, pueden asistir a cualquier promotor vecino. Cmo un aumentador estimula la iniciacin en un promotor? La razn puede estar relacionada con la estructura, localizacin o la unin enzimtica. a) El aumentador (intensificador) puede cambiar la estructura completa del templete. b) Si el intensificador provee de un sitio de unin puede ser responsable de mover al templete a un lugar particular de la clula. c) Un intensificador puede proveer de un sitio de entrada bidireccional, donde la ARN polimerasa se une con la cromatina
ACELERADOR
AUMENTADOR
Figura 3.5 Esquema que representa la forma de accin de las molculas aumentadoras y las regiones aceleradoras.
62
3.2.2 Operones
Las bacterias presentan un mecanismo simple para coordinar la regulacin de la expresin de sus genes. Los genes se encuentran arreglados de manera continua en el cromosoma y se transcriben simultneamente. Este arreglo, denominado opern, da origen a un ARNm en donde se encuentran muchos genes, es decir, es policistrnico. La transcripcin de este ARNm est regulada por un nico promotor, que es el sitio de regulacin para la expresin de la informacin codificada en el opern, no es un gen pues su secuencia es nicamente de reconocimiento.
Figura 3.6 Esquema del opern de lactosa de E. coli
Muchos de los principios de la expresin gentica en procariotas, tienen su origen en el estudio del opern de lactosa (opern lac) de E. coli, bacteria que puede utilizar a la lactosa (azcar de la leche), como nica fuente de Carbono. En 1960 Francois Jacob y Jacques Monod, publicaron cmo dos genes adyacentes involucrados en el metabolismo de la lactosa, son coordinados y regulados por un elemento gentico localizado en uno de los extremos de la fila de genes. El fenmeno que inspir la idea fu el de la induccin enzimtica. Grupos de genes que codifican para protenas relacionadas se agrupan en unidades conocidas como opern. Un opern consiste en: un operador, un promotor, un regulador y un gen estructural. El gen regulador codifica para una protena que se pega al operador, obstruyendo al promotor (y por lo tanto a la transcripcin), del gen estructural. El regulador no tiene que estar adyacente a los otros genes en el opern. Cuando se remueve la protena represora, puede producirse la transcripcin
63
3.2.3 Control en la terminacin: atenuacin y antiterminacin Opern trp: atenuacin La regulacin de la expresin de ciertos genes que participan en la biosntesis de aminocidos en E. coli en particular del opern trp, da origen a 5 protenas 3 de ellas son enzimas que participan en la sntesis del triptofano. Charles Yanofsky encontr que la expresin de este opern est controlada por el represor trp, que es un homodmero de 107 aminocidos por subunidad (trpR forma un opern independiente). El represor trp une L-triptofano que es el producto final de la va. Este complejo se une al operador (trpO) con lo que se reduce 70 veces la velocidad de la transcripcin.
Figura 3.7 Esquema que representa el control por atenuacin de la sntesis del triptfano. Un represor inactivo se activa cuando el triptofano se encuentra presente en el medio. Opern trp: antiterminacin Existe un control alterno para regular la expresin del opern de triptfano, y se basa en la velocidad de transcripcin. Cuando por algn motivo se presenta un aporte de triptfano al medio y an se est llevando a cabo la sntesis, sta puede detenerse a pesar de que ya se halla iniciado el proceso de expresin del opern. 64
En el opern de triptfano se encuentran cuatro regiones que son secuencia complementaria y pueden reconocerse y pegarse, cambiando la estructura de la molcula de ARN, y por lo tanto impidiendo el avance de los ribososmas sobre la molcula y deteniendo la sntesis de triptofano.
Figura 3.8 Esquema del control de la expresin del opern de triptfano por antiterminacin. 3.2.4 Cascada ltica y represin lisognica Los Virus consisten en un cido nuclico (ADN o ARN) envueltos en una cubierta de protena (conocida como cpsido). El cpsido puede ser una sola protena que se repite una y otra vez, como en el virus del mosaico del tabaco (TMV). Tambin puede estar formado por varias protenas, como en los bacteriofagos de la serie T. Los Retrovirus, como el de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), poseen una enzima: la transcriptasa reversa amn del ARN viral. La transcriptasa reversa fabrica ADN de una sola cadena , copiando el ARN viral. El ADN viral monocatenario se transforma por medio de la ADN polimerasa en bicatenario.
65
Figura 3.9 Esquema que representa los diferentes ciclos de los virus, se observa la cascada ltica y la represin lisognica. El ciclo ltico ocurre cuando el material gentico del virus penetra en la clula husped (recuerde que los virus son parsitos intracelulares obligados) y comienza a fabricar nuevos virus. Eventualmente los nuevos virus causan la ruptura o lisis de la clula y continan el ciclo infeccioso. El ciclo lisognico ocurre cuando el ADN viral es incorporado al ADN del husped como profago, y cuando la clula husped se divide, se duplica como si fuera ADN del husped. Algunas veces el profago emerge del cromosoma de la clula husped y entra en el ciclo ltico espontneamente (aproximadamente 1/10,000 divisiones). La luz ultravioleta y los rayos X tambin pueden producir este fenmeno. La transduccin es el fenmeno por el cual el ADN es transferido de una clula husped a otra por un virus. Algunos bacterifagos son "temperados" o atenuados dado que tienden a ser lisognicos mas que lticos.
66
3.3 Traduccin El proceso de sntesis de protenas o traduccin se divide en tres partes: Iniciacin: reaccin que precede a la unin entre los dos primeros aminocidos. El ribosoma se encuentra unido al ARNm, este paso es lento. Elongacin: sntesis del primer enlace peptdico entre el primer par de aminocidos, este es un paso rpido. Terminacin: movimiento del ribosoma hasta una secuencia de bases necesarias para completar la cadena peptdica, desensamble del ribosoma del ARNm. Este es una paso lento. La sntesis de protenas en procariotas se da a una velocidad de 15 aminocidos por segundo a una temperatura de 37 C. Mientras que en eucariotas este proceso es mas lento, la velocidad de sntesis es de 2 aminocidos por segundo a 37 C. El ribosoma posee dos: sitio A (ARNt- aminoacil) sitio P (ARNt- peptidil) polipeptido sintetizado.
Figura 3.10 Esquema que representa las tres etapas del proceso de traduccin o sntesis de protenas.
67
3.3.1 ARN de transferencia

El ARN de transferencia (ARNt): los diversos ARNt transportan los diferentes aminocidos hacia los ribosomas en la sntesis proteica. Constituyen el 15% del ARN celular. Es una molcula de 75-85 bases de longitud, existe al menos un ARNt por cada aminocido.
Reconoce a un solo aminocido al cual se une covalentemente. Cada ARNt contiene una secuencia de trinucletidos que es llamada ANTICODON, ya que es complementario a la secuencia del CODON que se encuentra en el ARNm. La estructura que presenta se conoce como trebol. Cuando el ARN se carga con su aminocido especfico, se conoce como ARNtaminoacil. El aminocido se une con una unin ster entre su grupo carboxilo y el grupo hidroxlo de la ribosa de la ltima base, la cual es siempre Adenina Una enzma especfica sintetiza la formacin de ARNt-aminoacil, la cual se conoce como ARN aminoacil sintetasa, la cual reconoce nicamente a un aminocido, por lo que al menos existen 20.
Una vez formado el complejo ARNt- aminoacil, el aminocido no juega un papel en la determinacin de la especificidad, la cual es regulada por el anticodn.
Figura 3.11 Esquema de una molcula de ARN de transferencia, se senala la regin del anticondn y los puntos donde se forman puentes de hidrgeno.
68
3.3.2 Ribosomas: fbricas traductoras

El ARN ribosmico (ARNr): conforman a los ribosomas los diversos ARNr, junto con sus protenas asociadas, intervienen en la sntesis proteica. Representa el 70% del ARN celular; mientras que sus precursores (45S), presentes en el ncleo representan el 5% del RNA celular.
ARN P
R O C A R I O T A
PROTE
SUBUNID
RIBOSOM AS
E U C A R
I O T A
Figura 3.12 Esquema de la formacin de los ribosomas en procariotas y eucariotas. Se observa el papel preponderante que las cadenas de ARN tienen como parte central de las subunidades de los ribosomas. Los aminocidos se ensamblan en protenas por los ribosomas. Los ribosomas son partculas de ribonucleoprotenas, que consisten de dos subunidades las cuales constan de varias protenas asociadas con una molcula larga de ARN conocida como ARN ribosomal (ARNr). Todos los ribosomas son idnticos y lo que hacen es descifrar el ARNm que proporciona el templete. Proveyendo un ambiente adecuado que controla el reconocimiento del codn del ARNm. Y el anticodn del ARNt Cada ribosoma se mueve en direccin 5 3 sobre el templete de ARNm permitiendo la formacin del polipptido, en ciertos casos, mas de un ribosoma se encuentra unido al ARNm, lo que se conoce como polirribosoma o polisoma. 69
Figura 3.13 Esquema que representa el ensamble de los ribosomas sobre el ARNm y su movimiento sobre la molcula, se observan mas de un ribosoma sobre la cadena de ARN, lo que se conoce como polisoma o poliribosoma. Se sintetiza un solo polipptido por accin de un ribosoma en el ARNm. El tamao de los poliosomas depende de la longitud del ARNm el cual puede codificar para varias proteinas. En bacterias los ribosomas se unen al ARNm an en formacin. Tanto en bacterias (en donde es rpidamente degradado) como en eucariotas, el ARNm no es abundante. En eucariotas, puede sobrevivir algunas horas en la clula, aunque representa nicamente el 3% de la masa nuclear del ARN . El ribosoma puede ser reconocido como una pequea fabrica migratoria, la energa para la sntesis proteica se obtiene de la hidrlisis de GTP (Guanina tri-fosfato). Los ribosomas son los componentes mayores de las clulas. En una bacteria en crecimiento activo, pueden presentarse cerca de 20,000 por genoma. 10% del total de las protenas bacterianas y aproximadamente 80% del total de la masa de ARN celular. En eucariotas estos porcentaje de protenas son menores. El nmero de ribosomas en las clulas est directamente relacionado con la actividad sinttica de protenas de stas. En bacterias se encuentran asociadas en ARNm naciente mientras que en eucariotas estn asociadas con el citoexqueleto o con estructuras celulares. 70
Cada subunidad contiene un gran componente de ARN y nucleoprotenas diferentes, la mayora presentes con una sola copia por unidad. La principal funcin del ARN es estructural, ya que las protenas se unen en sitios especficos del ARN. Los ribosomas varan en forma y tamao dependiendo de los organismos. Tripanosoma posee molculas de ARNr de menos de 2,000 bases, en mamferos se pueden encontrar molculas hasta de 7000 bases. El ARNm se une entre las dos subunidades. Las regiones importantes de la estructura secundaria del ARNr se encuentran conservadas, por lo que se encuentran tanto en 16S como en 23S ARNr. El ARNr presenta 4 campos principales con muchas bases pareadas, (menos de 8 nucletidos) y muchas regiones sin parear. Algunas protenas in vitro se unen fuertemente con el ARNr, pero algunas no lo hacen, lo que significa que requieren de la presencia de otros para la unin. Cada protena ribosomica se une a un sitio especfico del ARNr. Split Protenas: protenas separadas por centrifugacin en CsCl, se separan ncleos de 23S y 42S a partir de las subunidades 30s y 50s respectivamente. El reensamble requiere de los siguientes pasos: 1) ARNr 16S + 15 protena 2) Formacin de partculas RI 3) Partculas RI calentadas RI* (40C) 4) 6 protenas + RI* = 30S (Subunidad) 5) 23S + 6 protenas = 30S (Subunidad) Paso limitante es la conversin dependiente de la temperatura, que provoca el dobles en un estructura ms compacta. Los ribosomas presentan sitios activos especficos, divididos en: 1) Campo de Traslacin: conforma la tercera parte del ribosoma, centro de peptidil tranferasa, unin con EF- 50S. 2) Campo de Salida: factores de iniciacin ARNti Met 30S, se une a membranas.
71
3.3.3 ARN mensajero: templete El ARN mensajero (ARNm) son las diferentes secuencias de los nucletidos que constituyen los mltiples ARNm de la clula determinan las cadenas polipeptdicas que se sintetizarn en los ribosomas. La proporcin de ARNm vara mucho dependiendo del tipo de clula que se analice y el momento funcional. Por trmino medio representa el 3% del ARN celular y sus precursores (ARNhn) el 7%. Cuando lleva la informacin para una sola protena, se denomina monocistrn, y policistrn, si lleva informacin para ms.
3.3.4 Lnea de ensamble para la sntesis proteica; cdigo gentico Iniciacin en procariotas Ribosoma no se une directamente al ARNm para iniciar la sntesis. Cada ARNm posee un sitio de unin para el ribosoma (RBS, por sus siglas en ingls ribosome binding site) el cual es una secuencia corta de bases que precede a la regin codificante. La subunidad pequea del ribosoma se une al ARNm para formar un complejo de iniciacin (30S+RBS), posteriormente, se une la subunidad mayor del ribosoma 50S. La unidad pequea no puede sintetizar sola las protenas, posee factores de iniciacin (IF) que son protenas. Bacterias 3IF: IF1, IF2 e IF3 IF1: Se une a la subunidad 30S para completar el complejo de iniciacin, pero su papel es de estabilizacin mas que de reconocimiento. Probablemente es un factor de reciclamiento. IF2: Reconoce a un iniciador especial del ARNt y lo une a 30S, lo que asegura que solo el ARNtiniciador se una en la reaccin de iniciacin. Permanece como parte de la subunidad 30S durante esta etapa de iniciacin. Activa la hidrlisis de GTPs indirectamente, motivndola en alguna protena del ribosoma. IF3: Necesario para generar ms subunidades 30s y debe estar presente en ellas para que se unan al ARNm. Controlando su estado de asociacin con la subunidad 50S , ya que cuando se une a 30S, impide que se formen los complejos 70S. Existe una molcula de IF3 por cada subunidad y ya que hay pocos IF3 su disponibilidad determina el nmero de 30S libres. Absolutamente necesaria para unir la 30S al ARNm. No se involucra en la seleccin del sitio. Este factor es liberado antes de que 50S se una a 30S, por lo tanto 30S no puede tener unin con IF3 y 50S simultneamente. Y 30S existe libre unida a IF3 o bien en el complejo 70S. El nmero de copias de cada factor es suficiente para unirse nicamente a un pequeo numero de ribosomas libres, por lo que deben de ser reusados eficientemente.
72
El complejo de iniciacin esta formado por 30S unido a RBS en el ARNm. El codn de iniciacin es AUG universalmente, pero en bacterias puede ser tambin :GUG y UUG. AUG= Metionina, Existen dos tipos de ARNt que pueden transportar este aminocidos, un tipo reconoce la iniciacin y el otro reconoce los codones AUG durante la elongacin.
Figura 3.14 Esquema del proceso de iniciacin de la sntesis de protenas en procariotas 73
En bacterias y mitocondrias, el ARNt iniciador acarrea un residuo de metionina que ha sido modificado en su grupo amino, formando un formaldehido. ARNt-N-Formilmetionina : ARNtf Met . Bloquea el grupo del aminocido y previene su formacin en la elongacin, actuando nicamente como iniciador de protenas, usndose por lo tanto, este ARNt para reconocer las cadenas de iniciacin .AUG (algunas veces GUG; UUG) ARNtm met reconoce los codones internos. ARNtf met se une al sitio P originando as la sntesis. Siendo este el nico ARNt aminoacl que se vuelve parte del complejo de iniciacin, entrando directamente al sitio P. En bacterias y mitocondrias el residuo de formol es removido por una enzma (deformilasa especfica) que genera una terminal NH2 normal. Si la metionina es el aminocido terminal N de la protena este es el nico paso, pero en cerca del 50% de las protenas, la metionina es removida por una aminopeptidasa, creando un nuevo termino, cuando esto sucede, ocurre de manera rpida, cuando la cadena polipeptdica, naciente an, presenta una longitud de entre 15 y 30 aminocidos.
Iniciacin en eucariotas La subunidad pequea del ribosoma se une al extremo 5 del ARNm y se mueve hacia el sitio de iniciacin, ah se le une la subunidad mas grande. Existen al menos nueve factores de iniciacin, estos son llamados de la misma manera que en bacterias pero con el prefijo e. eIF2 y eIF3 contienen cadenas mltiples, mientras que los otro presentan polipptidos sencillos. La iniciacin en eucariotas inicia con la formacin de un complejo terciario : ARNt;Met - eIF2 y GTP. Primero se une GTP + eIF2 y despus este complejo se una al ARNtiMet . Este complejo terciario finalmente se une a la subunidad 40S. Esto sucede independientemente de la presencia de ARNm pero primero se debe formar el complejo de iniciacin para que 40S se una al ARNm. La unin del complejo terciario (ARNt;Met - eIF2 y GT) + 40S al ARNm depende del factor eIF3, que participa nicamente en la unin con el ARNm junto con otros factores. eIF6: mantiene disociadas a las dos subunidades, actuando sobre la subunidad mas grande 60S. 74
La unin de 60S con 40S unido al ARN nicamente se presenta cuando eIF2 y eIF3 han sido liberados del complejo de iniciacin, esta accin es realizada por el eIF5. eIF4c: determina la unin de 60S y40S. Es probable que todos los dems factores sean liberados cuando el ribosoma 80S ha sido formado.
Figura 3.15 Esquema del proceso de ensamblaje del complejo de iniciacin en eucariotas.
75
El factor eIF2 es el punto de control para la sntesis proteica, contiene tres subunidades, sus propiedades generales son similares en plantas y mamferos lo que indica semejanzas en muchos eucariotas. Cuadro 3.4 Subunidades que componen el factor de iniciacin de la traduccin eIF2 Subunidad Funcin Masa Union a GTP. Controlado por fosforilacin 35,000. Da. Factor de reciclamiento. 38,000. Da. met Union con ARN 55,000. Da. Para que el factor EIF2 est activo, la subunidad debe acarrear GTP, durante la iniciacin, GTP es hidrolizada a GDP, aqu interviene otro factor el eIF2B necesario para que se d la reaccin de generar GTP de nuevo y el factor eIF2 se active.
Elongacin e procariotas y eucariotas Una vez completada la formacin del ribosoma y que el sitio P se encuentre ocupado por un peptidl ARNt, cualquier aminoacil ARNt excepto el iniciador, puede entrar al sitio A, su entrada es mediada por un factor de elngacin (EF).
Formacin de nueva unin peptdica
Salida del ARNt sin aminoaci
Entrada de aminoacilARNt.
Movimiento del ribosoma
Figura 3.16 Representacin del proceso de elongacin de la cadena polipeptdica.
76
EF acta como IF2 en procariota, asocindose con el ribosoma nicamente mientras el aminoacil ARNt entra al ribosoma. Cando el aminocilARNt se encuentra en su sitio, este factor deja el ribosoma, para unirse de nuevo a otro complejo aminoacil-ARNt. Este factor de elongacin EF esta formado de dos componentes: EF-Tu y EF-Ts, denominados as por ser T un factor de transferencia, y su nombre representa su estado cuando es calentado: Tu inestable en el calentamiento y Ts estable en el calentamiento EF-Tu acarrea un nucletido de guanina, en su forma activa el factor posee GTP, el complejo binario EF-Tu+GTP se une al aminoacil-ARNt y forma el complejo terciario Aminoacil+EF-Tu+GTP, y este complejo se une al sitio A del ribosoma nicamente cuando el sitio P ya est ocupado por el peptidil-ARNt. Cuando el aminoacil-ARNt ha sido colocado en el sitio A, el GTP es cortado (hidrolizado) y el complejo binario EF-Tu+GDP es liberado. El factor EF-Ts interviene en la regeneracin de la formacin EF-Tu+GDP a su forma activa: EF-Ts desplaza el GDP de la forma EF-Tu formando el factor combinado EF-Tu+EF-Ts (factor T completo). El factor EF-Ts es desplazado por GTP, formando EF-Tu+GTP. Este factor activado se une al aminoacil y libera el EF-Ts que es reciclado. La mayor cantidad de EF-Tu se encuentra en forma de complejo binario o terciario, ya que existe mucho menos EF-Ts, su cantidad aprovecha el nmero de ribosomas. La GTP se necesita presente para que el aminoacil-ARNt se una al sitio A, pero su hidrlisis no es requerida hasta posteriomente. Traslocacin del Ribosoma El ribosoma permanece esttico, hasta que la cadena de polipptidos crece por la transferencia del polipeptidil, unido al ARNt en el sitio P al aminoacil-ARNt del sitio A. La sntesis del enlace peptdico es catalizada por la peptidil transferasa. Esta enzima est en funcin con la subunidad ms grande del ribosoma (50S 60S), debe encontrarse en el sitio ribosomico en que las terminaciones del peptidil-ARNt y el aminoacil-ARNt se encuentran juntos. La actividad de la transferasa se controla por la subunidad ms grande de ribosoma y 23S ARNr.
Etapa de terminacin
Determina la conclusin de la sntesis de la protena cuando el sitio A del ribosoma es abordado por el codn de terminacin del ARNm (UUA, UGA o UAG, indistintamente). Ello deja al sitio A sin el esperado aminoacil-ARNtaa, aunque pronto es ocupado por un factor de terminacin llamado RF o eRF en eucariotas (por sus siglas en ingls eucaryotic releasing factor), que sabe reconocer a los tres codones de terminacin. 77
Figura 3.17 Esquema del proceso de terminacin de la sntesis de protenas.
Figura 3.18 Esquema que representa el termino de la traduccin. Cuando un ribosoma llega a un codn de termino (UAA, UGA, UAG), los factores de liberacin (RFs) entran al complejo ribosomal, probablemente en o cerca del sitio A. En bacterias, RF1 o RF2 primero reconocen el codn de inicio. RF3-GTP entonces corta la cadena petidica del tRNA y libera las dos subunidades ribosomales, esta reaccin requiere de la hidrolisis de GTP.
78
En sntesis la terminacin de la cadena polipeptdica est sealada por el ARNm mediante un codn que no especifica la incorporacin de ningn aminocido . Ese codn de terminacin puede ser UUA, UGA o UAG, y sobre l no se une ningn ARNt. En cambio, es reconocido por dos protenas llamadas factores de liberacin (RF o eRF). Cuando esto sucede, la protena terminada se libera del ltimo ARNt, que tambin se separa del ARNm. Por ltimo tambin se disocian las subunidades ribosmicas. Todos estos elementos pueden ser reutilizados en una nueva sntesis.
Cdigo gentico El cdigo gentico consiste en 61 codones para aminocidos y 3 codones de terminacin, que detienen el proceso de traduccin. El cdigo gentico es por lo tanto redundante, en el sentido que tiene varios codones para un mismo aminocido. Por ejemplo, la glicina es codificada por los codones GGU, GGC, GGA, y GGG. Si un codn muta por ejemplo de GGU a CGC, se especifica el mismo aminocido.
Figura 3.19 Esquema del cdigo gentico y la manera de leerse, comenzando con la primera letra del lado izquierdo.
79
UNIDAD 4 TECNICAS DE RECOMBINACIN DEL ADN

4.1 ADN COMO MATERIA PRIMA EN LA RECOMBINACIN GNICA El requisito inicial y en muchas ocasiones limitante de la manipulacin del ADN es el acceso a cantidades suficientes o al conocimiento de la secuencia del ADN del gen en estudio. Por tanto, la clonacin es el paso inicial para poder utilizar a la Biologa Molecular como una herramienta de investigacin. Una clona es una grupo de clulas o molculas de ADN idnticas a una clula o molcula ancestral y clonar es el proceso mediante el cual obtenemos mltiples copias de una fragmento de ADN originados a partir de una copia. El resultado inmediato de clonar un fragmento de ADN es el poder reproducirlo en grandes cantidades, y adems secuenciarlo para determinar el ordenen que estn dispuestas las bases. As la clonacin lleva implcito el cumplir con los requisitos de la mayor parte de las metodologas en biologa molecular: tener acceso a grandes cantidades del gen y conocer su secuencia. La clonacin se basa en la produccin de una molcula recombinante (unin de dos o ms molculas de ADN provenientes de diferentes especies) entre el gen de inters a clonar (proveniente de cualquier especie) y un vector de clonacin. El ADN recombinante se utiliza para transformar clulas (usualmente bacterias), y una vez obtenidas clonas con ADN recombinante en su interior, el final del proceso de clonacin consiste en la identificacin de la bacteria que lleve el gen de inters. El procedimiento de clonacin involucra 4 pasos principales: 1.- Construccin de molculas de ADN recombinante mediante enlaces covalentes in vitro (unin o ligamiento) de fragmentos del ADN deseado (ADN blanco) a un replicon (cualquier secuencia capaz de replicar el ADN de manera independiente). Este paso se facilita por el corte del ADN blanco y de las molculas del replicon con endonucleasas de restriccin especficas antes de la unin de fragmentos de ADN diferentes con la enzima ADN ligasa. 2.- Transformacin. Las molculas de ADN recombinantes son transferidas dentro de las clulas husped (con frecuencia clulas bacterianas o de levadura) en las cuales el replicon seleccionado puede llevar a cabo la replicacin del ADN independientemente de los cromosomas de la clula husped. 3.- Propagacin selectiva de las clonas. Involucra dos etapas. Inicialmente las clulas transformadas se siembran en una caja de petri sobre una superficie de agar para asegurar el crecimiento de colonias de clulas bien separadas. Estas son las clonas (poblaciones de clulas idnticas todas descendientes de una sla clula). Subsequentemente, las colonias individuales pueden tomarse de la caja de petri y las clulas pueden extenderse despus en cultivo lquido. 4.- Aislamiento de clonas de ADN recombinante cosechando los cultivos celulares extendidos y aislando selectivamente el ADN recombinante.
80
4.2 PURIFICACIN DEL ADN: ENZIMAS DE RESTRICCIN Una consideracin importante para obtener el ADN purificado es su enorme tamao y la complejidad de las secuencias del ADN (comparada por ejemplo con la secuencia de protenas). Las molculas individuales de ADN nuclear contienen cientos de millones de nucletidos. Cuando el ADN es aislado de las clulas usando mtodos estndar, estas enormes molculas se fragmentan mediante fuerzas, generando mezclas complejas de fragmentos de ADN todava muy largos (aproximadamente de 50 a 100 Kb de largo). De acuerdo a lo anterior, Cmo se pueden preparar poblaciones de ADN relativamente homogneas a partir de mezclas complejas?. En el caso de ADN de clulas humanas y de una amplia variedad de clulas eucariontes complejas, el primer acercamiento fue separar las diferentes clases de fragmentos de ADN de acuerdo a la composicin de las bases. La preparacin de ADN fue sometida a ultracentrifugacin en equilibrio de gradientes de densidad (por ejemplo; en gradientes de densidad de CsCl). Cuando esto se realiz, el ADN se fraccion en una banda principal y en varias bandas menores de ADN satlite. Las especies de ADN satlite tienen diferentes densidades que el volumen principal de ADN debido a que tienen secuencias poco comunes y su composicin de bases es diferente a la mayora del ADN en las clulas (estas propiedades reflejan la participacin del ADN satelite en aspectos especficos de la estructura y funcin de los cromosomas). Aunque valiosos e interesantes, los ADN satlite purificados corresponde, sin embargo, a un componente menor del genoma y no contiene genes. Para el estudio de los genes, se han desarrollado varios mtodos para purificarlos. Debido a que los genomas de los mamferos son complejos, cualquier gen especfico o fragmento de ADN de inters representa normalmente solo una pequea fraccin del ADN total en una clula. Por ejemplo, el gen de la -globina comprende nicamente 0.00005% de las 3300 megabases (Mb) del ADN genmico humano, y an el gen ms grande hasta ahora identificado, el gen de la distrofina de 2.5 Mb, cuenta con slo el 0.08% del ADN genmico humano. Para seleccionar una fuente adecuada de ADN es importante saber el fragmento del gen que se pretende estudiar. Cuando la finalidad es conocer los mecanismos de regulacin de transcripcin del gen en estudio, entonces se desea clonar el ADN correspondiente a fragmentos no codificantes de un gen, conocidos como intrones. Cuando se pretende conocer la estructura completa de un gen, el investigador estar interesado en clonar los fragmentos del gen, tanto codificantes como no codificantes, es decir los exones y los intrones. Finalmente, cuando se quiere conocer la estructura primaria de una protena, se necesita clonar nicamente los fragmentos codificantes del gen, es decir, los exones. En los dos primeros casos la fuente apropiada es el ADN genmico (cromosmico) porque contiene los genes completos. En el tercer caso, lo ms apropiado es partir del ARN mensajero (ARNm) que representa nicamente las secuencias codificantes (exones). 81
La manera de obtener el ADN genmico es sencillo. Como todas las clulas de un individuo contienen el mismo ADN, se parte de clulas de fcil acceso, como los leucocitos en el caso del humano, mientras que en animales se parte de tejidos con alto contenido de ADN, como el hgado. Se realiza un extracto celular del cual, mediante precipitaciones con diferentes solventes, se separa el ADN genmico del resto del material celular. El siguiente paso es tratar el ADN genmico con enzimas de restriccin para reducirlo a fragmentos manejables. La enzima ms empleada es Sau 3 por tener sitio de restriccin de cuatro pares de bases, lo que asegura encontrarlo con frecuencia y por lo tanto, reducir el ADN genmico en mltiples fragmentos.
Figura 4.1 Modo de accin de las enzimas de restriccin, se representa el reconocimiento de una secuencia especfica y la generacin de extremos pegajosos. La segunda fuente de ADN es un poco ms complicada de obtener: la conocemos como ADN complementario (ADNc) por ser una copia en espejo del ARNm . En este caso la fuente de ARNm debe ser un tejido o lnea celular que se sabe de antemano que expresa la protena de inters. El primer paso es aislar el ARN del tejido o lnea celular a partir de un homogeneizado celular mediante extraccin con solventes. Despus, se debe separar el ARNm de los otros tipos de ARN (ribosomal y de transferencia), lo que se logra al tomar ventaja de que toda molcula de ARNm tiene al final (extremo 3) una cola de poliadeninas. Al pasar el ARN total por una columna de cromatografa con oligo-dT (fragmentos de 82
polideoxitiminas unidas a la celulosa), el ARNm se queda atrapado en las columnas debido a que la cola de poliadeninas del ARNm se hbrida con la de polideoxitiminas del oligo-dT. Ya descartados el ARN ribosomal y el de transferencia, se separa el ARNm de la columna con una serie de elusiones que promueven la desnaturalizacin (separacin) de las hebras de cidos nucleares. Una manera de obtener las secuencias gnicas es mediante el aislamiento del ARN total, o ARNm poly (A)+ a partir de clulas disponibles y convertir estas a ADN complementario (cADN) usando la enzima transcriptasa reversa. En algunos casos, esto puede resultar en el enriquecimiento profundo de secuencias de ADN exnicas cuando los genes relevantes se sabe que se expresan a niveles muy elevados en un tipo celular especfico. En la mayora de los caso, sin embargo, las secuencias gnicas deseadas todava representan nicamente una pequea proporcin del ADNc total de la poblacin.
4.3 MANIPULACIN DEL ADN PURIFICADO Gracias al desarrollo de la Ingeniera Gentica en los ltimos 20 aos, el ADN pas de ser la molcula ms difcil y complicada de estudiar, a ser la ms fcil. Mediante la tecnologa del ADN recombinante es posible manipular in vitro el ADN de manera tal que cada investigador puede estudiar un sinnmero de aspectos en relacin a su protena favorita. La manipulacin del ADN es el fundamento de las tcnicas utilizadas en un laboratorio de Biologa Molecular. As, las endonucleasas de restriccin son tiles para fragmentar el ADN en sitios especficos y obtener diversos genes. La ADN polimerasa sirve para sintetizar ADN in vitro que pueda posteriormente ser utilizado para clonacin o bien secuenciacin, con lo que se podr conocer la secuencia de bases en el ADN y por lo tanto, la estructura primaria de la protena. Con la transcriptasa reversa se puede sintetizar ADN a partir del ARNm, y as generar lo que se conoce como genoteca del ADN complementario, que representa el ADN que codifica para protenas en un tejido o clula particular. Se puede marcar el ADN o ARN con mtodos radioactivos o no radioactivos y generar una sonda que ser til para detectar ADN o ARN especfico tanto en bloques (Southern y Northern blot) como en el tejido mismo (hibridacin in situ). Con la reaccin en cadena de la polimerasa podemos amplificar ciertos fragmentos de ADN y as, aunque sean muy escasos, poder detectarlos, clonarlos y modificarlos. Finalmente se puede trasladar el ADN a clulas extraas con lo que se consigue clonar fragmentos de ADN o crear modelos de animales transgnicos. La tecnologa del ADN recombinante comprende un conjunto de tcnicas que son utilizadas en la manipulacin del ADN, las ms importantes son: 1.- El corte de ADN en sitios especficos mediante nucleasas de restriccin, que facilitan enormemente el aislamiento y manipulacin de genes individuales. 2.- La secuenciacin rpida de todos los nucletidos en un fragmento de ADN purificado, que hacen posible determinar las fronteras de un gen y la secuencia de aminocidos que codifica. 83
3.- La hibridacin de cidos nuclecos, que hace posible encontrar una secuencia especfica de ADN o ARN con gran precisin y sensibilidad con base en su habilidad de unirse a una secuencia de cidos nuclecos complementaria. 4.- La clonacin del ADN, en la cual una sola molcula de ADN puede copiarse para generar muchos millones de molculas idnticas. 5.- La Ingeniera gentica, mediante la cual secuencias de ADN son alteradas para crear versiones modificadas de genes, los cuales son reinsertados de nuevo dentro de las clulas u organismos. Las molculas de ADN recombinante son generalmente construidas usando la enzima ADN ligasa para unir dos molculas de ADN con extremos cohesivos complementarios. Para la produccin de una biblioteca de ADN, una de las dos molculas de ADN a unirse es el vector, derivado de un plsmido bacteriano o virus, mientras que la otra es un fragmento de un cromosoma o una molcula de ADNc. Una molcula de ADN recombinante puede a su vez servir como un vector para la clonacin adicional de molculas de ADN, y la repeticin sucesiva del procedimiento de clonacin, una serie de fragmentos de ADN pueden ser reunidos extremo con extremo. De esta manera pueden generarse molculas nuevas de ADN, las cuales son diferentes de cualquier molcula que ocurre naturalmente. 4.4 MULTIPLICACIN DEL ADN 4.4.1 Introduccin de ADN a clulas La transformacin es el fenmeno por el cual las clulas bacterianas adquieren nuevo material gnico. Cuando el fenmeno se lleva a cabo en clulas eucaritica se denomina transfeccin. Una vez obtenido el ADN recombinante, el siguiente paso es introducirlo dentro de una clula husped que le ofrezca la maquinaria necesaria para su autorreplicacin. En el caso de los bacterifagos y de los csmidos, el proceso es relativamente sencillo: se empaqueta el ADN en fagos viables in vitro y se exponen a las clulas para ser infectadas en forma natural. En el caso de los plsmidos existen algunas estrategias para transformar bacterias. El procedimiento estndar consiste en mezclar bacterias con plsmidos en una solucin de cloruro de calcio, exponerlas a un choque trmico (42C) de 30 a 90 segundos de duracin, y por razones, an no claras, las clulas se vuelven momentneamente permeables al ADN. Otra tcnica til por su alta eficiencia es la electroporacin, que consiste en colocar a las clulas en una solucin que contiene al ADN recombinante, y someterlas a pulsos elctricos que causan aberturas o agujeros momentneos en la membrana celular, permitiendo el paso del ADN recombinante al citoplasma. Para clulas eucariticas existen adems otras formas de transfeccin, como el uso de liposomas o la microinyeccin. De esta forma, las molculas de ADN recombinante son transferidas dentro de la clula husped en el cual un replicon seleccionado puede llevar a cabo la replicacin independientemente de los cromosomas de la clula husped. 84
4.4.2 Clulas competentes La membrana plasmtica de las clulas es permeable selectivamente y normalmente no admite molculas grandes como fragmentos de ADN muy largos. Sin embargo, las clulas pueden tratarse de ciertas formas ( por ejemplo, por exposicin a ciertas sales altamente inicas, choques elctricos, etc), para alterar las propiedades de permeabilidad de la membrana. Como resultado, una fraccin de las clulas se vuelven competentes, esto es, son capaces de introducir ADN extrao del ambiente extracelular. Slo un pequeo porcentaje de las clulas introducir el ADN extrao, esto es una transformacin de ADN. La clula toma nicamente una molcula de ADN, la cual se puede replicar muchas veces dentro de la clula. Esta es la base del paso de fraccionamiento crtico en la clonacin de ADN, la poblacin de clulas transformadas. Debido a que el ADN circular transforma mucho ms eficientemente que el ADN lineal, la mayora de la clulas transformadas contendrn productos circulares en vez de concatmeros de ADN recombinante lineal y si se hace un esfuerzo en suprimir la ciclizacin del vector, por ejemplo por defosforilacin, la mayora de las transformadas tendrn ADN recombinante. Entonces, las clulas transformadas se dejan multiplicar. En el caso de clonacin usando vectores plsmidos y de husped una clula bacteriana, una solucin que contenga las clulas transformadas se siembra en la superficie de una caja de petri con agar, lo que resulta en la formacin de colonias de bacterias que consisten en clulas clonadas. En general, cada bacteria puede ser transformada con una sola molcula de ADN recombinante (dos molculas son txicas para la bacteria). Por lo tanto, las bacterias transformadas con una sola molcula de ADN recombinante empezarn a crecer y sern seleccionadas gracias a la resistencia al antibitico que les confiere el vector. El resultado final es que cada clona de bacterias tendr en su interior un tipo especfico de ADN recombinante proveniente de una molcula ancestral. 4.4.3 Seleccin de recombinantes La identificacin de las clulas que contienen la molcula del vector requiere la construccin y seleccin del vector que contenga un gen marcador cuya expresin ofrezca un medio para identificar a las clulas que lo contienen. Los dos sistemas gnicos usados frecuentemente como marcadores se basan en los siguientes: 1) Genes de resistencia a antibiticos. Una cepa celular husped se selecciona por su sensibilidad a un antibitico en particular, con frecuencia a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. El vector correspondiente se construye de manera que contenga un gen que confiera resistencia al antibitico. Despus de la transformacin, las clulas se siembran en agar que contenga el antibitico para recuperar las clulas transformadas por el vector. 2) Complementacin por el gen de la -galactosidasa. La clula husped es una mutante que contiene un fragmento del gen de la -galactosidasa pero no puede producir una -galactosidasa funcional. El vector se construye de 85
manera que contenga un fragmento diferente del gen la -galactosidasa. Despus de la transformacin por el vector, la complementacin funcional ocurre resultando en una -galactosidasa activa que puede evaluarse mediante la accin de una sustancia colorante, al Xgal (5-bromo, 4-cloro, 3indolyl -D-galactopirano), para generar un producto azul. La identificacin de clulas que contienen ADN recombinante involucra con frecuencia la inactivacin insercional del gen marcador. La molcula vector se disea de manera que tenga un sitio de clonacin mltiple llamado tambin polilinker localizado entre el gen marcador. El nmero de nucletidos, en la secuencia polilinker que contiene los sitios de clonacin mltiple, es mltiplo de tres, de modo que su insercin en el gen marcador no resulta en alguna alteracin en la traduccin del marco de lectura. Como resultado de mantener el marco de lectura, y del pequeo tamao del polilinker, la actividad del gen marcador se mantiene a pesar de la insercin del polilinker. Sin embargo, si el vector contiene el ADN recombinante insertado en medio del polilinker, la insercin resultante causa prdida de expresin del gen marcador. En el caso de un gen marcador de la galactosidasa, la inactivacin insercional significa que las clulas que contienen ADN recombinante no se tien o permanecen blancas en presencia de X-gal, mientras que las clulas que contienen un vector no-recombinante son azules. Otro sistema de seleccin de recombinantes involucra el uso de genes supresores de tARN, genes mutantes de tARN que pueden reorganizar una seal normal de un codn de terminacin y en respuesta, introducir un aminocido en la cadena del polipptido. Esto es posible debido a que la mutacin en los genes tARN (con frecuencia genes tARNGlu o tARNTyr) resultan en una secuencia anticodn alterada que es complementaria a uno de los codones de terminacin normales: UAA, UAG, y UGA. En estos sistemas, la clula husped con frecuencia porta un gen marcador defectuoso que es diseado para tener un codn de stop prematuro, resultando en un fenotipo que puede ser identificado fcilmente. Si el vector porta un gen tARN supresor que inhiba el efecto del codon de terminacin, la actividad del gen marcador se recuperar y el fenotipo silvestre se restaurar. Sin embargo, si el gen supresor tARN se inactiva por inactivacin insercional, un fenotipo mutante se producir de nuevo. Si ya se tiene una sonda disponible que este muy relacionada al ADN recombinante deseado, las colonias que contengan el recombinante pueden detectarse directamente por hibridacin.
86
4.5 CLONACIN: VEHCULOS DE CLONACIN PARA E. COLI Y OTROS ORGANISMOS Vehculos de clonacin Los vehculos o vectores se utilizan para clonacin porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales del ADN sean incorporadas en su material gentico; se autorreplican utilizando la maquinaria de las bacterias, y en este proceso, no se mezclan con el ADN genmico de la bacteria. Existen tres tipos de vectores: los plsmidos que son fragmentos de ADN circular extracromosmico de las bacterias; los bacterifagos o virus bacterianos y los csmidos que son combinaciones entre plsmidos y bacterifagos. La desicin de cual utilizar depende principalmente de la longitud del ADN que se pretende clonar. Los plsmidos aceptan insertos de 0.1 a 6 kilobases (1Kb = 1,000 bases), los fagos de hasta 20 Kb y los csmidos de hasta 45 Kb. Por tanto, los plsmidos sirven cuando se trata de clonar ADNc, mientras que los fagos y los csmidos se utilizan ms en el caso de ADN genmico. Existen vectores de clonacin para hebras mayores de 50Kb conocidos como cromosomas artificiales de levadura (YACs del ingls yeast artificial chromosomes). Los tamaos de los fragmentos de ADN que se pueden obtener con los diferentes vectores de clonacin se describen en la Cuadro 4.1. Los vectores contienen una regin en la cual el ADN forneo puede insertarse sin interrumpir ninguna funcin vital del vector. Esta regin se conoce como sitio de clonacin mltiple. La digestin del plsmido con una enzima de restriccin, en el sitio de clonacin mltiple, lo convierte en una molcula lineal que puede ligarse (en presencia de ADN ligasa) con ADN que tenga en los extremos las mismas terminaciones cohesivas, y as, formar un plsmido quimrico nuevamente circular. De esta manera, para clonar ADN, se necesita digerir el vector con la enzima de restriccin para la cual los fragmentos de ADN tengan terminaciones cohesivas en los extremos 5 y 3, y despus, ligar los fragmentos de ADN en el vector con ADN ligasa. El ADN recombinante obtenido podr replicarse indefinidamente en la bacteria apropiada. Los vectores tienen adems secuencias que les confieren resistencia a uno o dos antibiticos. Las bacterias transformadas se pueden seleccionar fcilmente de las no transformadas porque adquieren la capacidad de crecer en presencia del antibitico. Adems, la insercin de ADN forneo interrumpe el gen para la galactosidasa y por eso en ausencia de insercin, las bacterias producirn colonias de color azul en presencia del sustrato galactosa, mientras que en los plsmidos con ADN forneo (ADN recombinante), no habr sntesis de -galactosidasa y las clonas sern blancas en presencia de galactosa. As, no solo es posible distinguir las bacterias transformadas por su capacidad de crecer en presencia del antibitico, sino tambin, se puede saber por el color si tienen en su interior ADN recombinante o nicamente plsmidos no quimricos. Finalmente, una ventaja de los vectores es que el sitio en donde queda el ADN forneo est flanqueado por los promotores para la sntesis de ARN y por las secuencias de iniciadores universales para la sntesis de ADN. El vector plasmdico tpico pUC18 (figura 4.1) posee un 87
tamao de unas 269 Kb y contiene un origen de replicacin que permite la replicacin del ADN del plsmido en un alto nmero de copias en las bacterias, un marcador de resistencia a frmacos (resistencia a la ampicilina) para permitir la seleccin de las clulas bacterianas portadoras del ADN del plsmido y sitios que permiten la insercin de una secuencia de ADNc o ADN genmico. Cuadro 4.1 Tamao de ADN que puede clonarse en los distintos vectores Vector de clonacin Tamao del inserto 0-10 Kb Plsmidos con No. De copia alto 0-10 Kb estndar 9-23 Kb Bacterifago de insercin 30-44 Kb Bacterifago de sustitucin 70- 100 Kb Csmidos 130-150 Kb Bacterifago P1 hasta 300 Kb PAC (cromosomas artificiales P1) 0.2 2.0 Mb BAC (cromosomas artificiales bacteriano) YAC (cromosomas artificiales de levadura)
Figura 4.2 El plsmido pUC18 Uno de los vectores por excelencia para E. Coli es el fago lamda, . Para disear vectores de clonacin apropiados, es necesario construir un sistema donde el ADN extrao pueda unirse al replicon de in vitro y para que el ADN recombinante resultante sea capaz de transformar clulas de E. Coli a alta eficiencia. Este ltimo requerimiento se logra por el desarrollo de un sistema de empaquetamiento in vitro, que mimetiza la manera en la cual el ADN de tipo silvestre se empaqueta en una cubierta proteca, resultando en alta eficiencia de infeccin.
88
La atencin en lo que respecta a vectores, tambin se ha centrado en los que poseen replicones con bajo nmero de copias, como el factor-F, que es un plsmido de fertilidad de E. Coli. El plsmido contiene dos genes, par A y par B, que mantienen el nmero de copias del factor F de 1-2 copias por clula de E. Coli. Los vectores basados en sistemas del factor-F son capaces de aceptar fragmentos de ADN extraos largos (> 300 Kb). Las recombinantes resultantes pueden transferirse con eficiencia considerable dentro de las clulas bacterianas usando electroporacin. El bacterifago es muy usado como vector de clonacin del ADN. Los brazos izquierdo y derecho del fago codifican genes estructurales fgicos y as son indispensables para la replicacin de este. Las secuencias de la regin media del fago son indispensables y pueden eliminarse para permitir la insercin de ADN o ADNc especficos. Los extremos del fago tambin tienen secuencias cohesivas de ADN monocatenerio, los sitios COS que se necesitan para envasar el genoma fgico dentro de la partcula viral. Los fagos envasados se utilizan para infectar E. Coli y las clulas infectadas forman placas en una capa bacteriana. Las placas con fagos pueden ser transferidas a filtros de nitrocelulosa para que estos sean analizados por medio de sondas de ADN o ARN, (figura 4.4).
Figura 4.3 Fago lambda como vehculo para la clonacin de ADN o ADNc.
4.6 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls) es un instrumento til para analizar el nivel de expresin gnica particularmente cuando se trata de genes de poca abundancia en donde la baja expresin en el northern blot complica la deteccin en los cambios de dicha expresin. 89
El principio de la utilizacin de PCR se basa en dos posibilidades: la PCR cuantitativa y la semicuantitativa. En la primera se coamplifica el ARNm del gen de inters junto con un control interno que pueda medirse con presicin y as utilizarse como gua de referencia para cuantificar el ARN de inters. Este procedimiento es muy utilizado en la cuantificacin del ARN viral en casos de infecciones virales. En la PCR semi-cuantitativa se coamplifica el ARNm de inters junto con el ARNm de un gen de expresin constitutiva, como la actina, que permita comparar cuanto del gen de inters se expresa en relacin con el gen control. La deteccin del producto amplificado se puede hacer mediante electroforesis o por cuantificacin con centelleo lquido. En ambos casos, la PCR es til para conocer cambios en la expresin de genes que estn en bajas cantidades. La PCR permite la amplificacin masiva de secuencias de ADN especficas, logrando producir en el laboratorio millones de copias de un segmento del gen que se desea analizar y que se encuentra en muy bajas cantidades en el material clnico a investigar. La reaccin tiene su fundamento en la unin de dos cebadores o iniciadores cortos, cada uno de ellos complementario a la secuencia de ADN flanqueante de la regin a ser amplificada. Estos cebadores inician la sntesis de ADN por la accin de una enzima ADN polimerasa termoestable especial (polimerasa Taq). La nueva molcula de ADN bicatenario, que se compone de una cadena modelo y otra neosintetizada, es luego desnaturalizada a altas temperaturas. En este momento los cebadores se unen o alinean nuevamente y otra vez son alargados para sintetizar la nueva cadena por la ADN polimerasa Taq. La PCR se realiza en ciclos, cada uno compuesto de tres fases: Desnaturalizacin: El ADN se calienta hasta que se separan las cadenas sencillas, aproximadamente de 93C a 95C. Apareamiento o alineacin: Las cadenas se aparean con el par de cebadores, que son oligonucletidos sintticos especficos, de los cuales uno es complementario al extremo 5 del gen o fragmento de ADN que se desea amplificar y el otro se aparea con el extremo 3 del mismo, pero en la cadena opuesta. La temperatura de alineacin es de 50C a 70C dependiendo de la temperatura de fusin (Tm) del ADN dplex esperado. Tpicamente la temperatura de alineacin ocurre aproximadamente 5C por debajo de la Tm. Extensin: Los oligonucletidos sintticos actan como iniciadores para que la ADN polimerasa termoestable sintetice a partir de los cuatro desoxirribonucletidos (dNTP) que usa como sustrato, las dos nuevas cadenas de ADN complementarias a las cadenas originales. La sntesis de ADN ocurre aproximadamente de 70C a 75C.
90
Este ciclo de desnaturalizacin/apareamiento/extensin se repite de 25 a 40 veces, logrndose en cada ciclo doblar la cantidad del ADN blanco, lo que causa una amplificacin logartmica de la secuencia de ADN de inters (figura 6). El ADN a copiarse (templado) se coloca en un microtubo en presencia de buffer a pH 8.3; MgCl2 y los cuatro anlogos de los nucletidos que se incorporan al nuevo ADN (dCTP, dATP, dGTP y dTTP). Se agrega una escasa cantidad de polimerasa termorresistente Taq (extrada de la bacteria Thermus aquaticus) y las dos secuencias cortas de ADN (18 a 25 bases) que sirven como cebadores, uno en una cadena y el otro en la segunda cadena, y que por crecer en sentidos opuestos se denominan sentido y antisentido. La mezcla de reaccin preparada en el tubo, todava sin reaccionar, se pone en una mquina de PCR o termociclador, el cual es un aparato que es capaz de calentar y enfriar rpida y repentinamente, en ciclos, los tubos. Las tres temperaturas que usa el aparato son generalmente: 96C para desnaturalizar el ADN, 55C para alinear y 72C para incrementar la longitud del nuevo ADN Esta capacidad de amplificar una secuencia de ADN mediante PCR tiene su principal aplicacin en la deteccin de mutaciones de trastornos genticos conocidos y en la deteccin de ADN o ARN viral o bacteriano responsable de infecciones en muestras clnicas. As mismo se la est aprovechando cada vez ms en diversas tcnicas de clonacin molecular y para el anlisis de la expresin de los genes. La PCR tambin se puede usar para modificar la secuencia precisa de un fragmento amplificado en otra secuencia a eleccin. Por ejemplo, si se hace que los extremos 5 de los cebadores de la PCR contengan sitios para enzimas de restriccin, entonces el producto final de la PCR estar flanqueado por esos sitios, lo que facilita enormemente su posterior clonacin y manipulacin. 4.7 ANLISIS DE SECUENCIAS A finales de los 70s se desarrollaron varios mtodos que permiten la secuencia de nucletidos de un fragmento de ADN purificado. Estos mtodos hicieron posible determinar la secuencia de ADN completa de miles de genes, incluyendo los que codifican para protenas bien conocidas como la insulina, hemoglobina, interferon y citocromo c. El volumen de la informacin de la secuencia de ADN ya es tan grande (muchas decenas de millones de nucletidos) que deben usarse computadoras para almacenar y analizar la secuencia. Los mtodos qumicos de secuenciacin del ADN que se emplearon al principio usaban una modificacin qumica especfica de cada base con el subsiguiente corte del ADN. Actualmente, la mayora de los mtodos de secuenciacin llevan a cabo un mtodo enzimtico: el ADN que se va a secuenciar se transforma a molculas de cadena sencilla de donde la ADN polimerasa sintetiza nuevas hebras de ADN complementario. Las reacciones de secuenciacin involucra la sntesis de ADN usando uno o ms nucletidos marcados y un iniciador de secuenciacin universal que es complementario a la secuencia del vector flanqueando el sitio de clonacin. 91
La sntesis de ADN se lleva a cabo en presencia de dideoxynucletidos baseespecficos (ddNTPs). Estos son anlogos de los dNTPs normales con la diferencia de que carecen de un grupo OH en la posicin del carbono 3 as como en el carbono 2. Un dideoxinucletido puede incorporarse en la cadena de ADN creciente mediante la formacin de un enlace fosfodister entre el carbono 5 y el carbono 3 del nucletido previamente incorporado. Dado que los ddNTPs carecen de un grupo OH 3, cualquier ddNTP que se incorpore a la cadena de ADN creciente no puede participar en el enlace forfodister en su tomo de carbono 3, causando as una terminacin abrupta de la sntesis de la cadena.
Figura 4.4 Amplificacin de ADN por PCR. En el ciclo se duplica el material gentico presente al inicio del mismo, generndose de 25 a 30 ciclos entre 106 a 107 copias de la molcula inicial. 92
Cuatro reacciones paralelas base-especfica se llevan a cabo usando una mezcla de los cuatro dNTPs y tambin una proporcin pequea de uno de los cuatro ddNTPs. Al poner la concentracin del ddNTP mucho menor que lo normal, la terminacin de la cadena ocurrir al azar en una de las muchas posiciones que contienen la base en cuestin. Por lo que cada reaccin es una reaccin parcial: la terminacin de la cadena ocurre al azar en una de las posibles bases en cualquier cadena de ADN. Sin embargo, el ADN a secuenciar en una reaccin de secuenciacin es una poblacin de molculas idnticas. Como resultado, cada una de las cuatro reacciones especficas de base generar una coleccin de fragmentos de ADN marcado de diferente tamao, con un extremo 5 comn pero extremos 3 variables (el extremo 5 comn se define por la secuenciacin del iniciador y los extremos 3 que terminan con el ddNTP seleccionado son variables debido a la insercin del dideoxinucetido que ocurre al azar en una de las muchas posiciones diferentes que aceptar la base especfica. Los fragmentos que son diferentes en tamao por un solo nucletido pueden separarse en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Los fragmentos de diferente tamao pueden detectarse incorporando grupos marcados en los productos de reaccin, incorporando nucletidos marcados, o usando un iniciador con un grupo marcado. La secuencia puede descifrarse, leyendo la secuencia de abajo hacia arriba del gel, una direccin que da la secuencia 5- 3 dela cadena complementaria del molde de ADN. 4.7.1 Gel de electroforesis La longitud y la pureza de las molculas de ADN puede determinarse adecuadamente por los mismos mtodos de gel de electroforesis que se usan en el anlisis de protenas, debido a que cada nucletido en la molcula tiene una carga negativa. Para fragmentos de ADN de menos de 500 nucletidos de largo, los geles de poliacrilamida diseados especialmente permiten que las molculas de diferente longitud, de hasta un solo nucletido de diferencia, puedan separarse de cada una. Los poros en los geles de poliacrilamida, son tan pequeos para permitir el paso de molculas de ADN muy grandes, que para separar estas por su tamao se utilizan geles con ms poros fromados con soluciones diluidas de agarosa. En los geles de agarosa, los fragmentos de ADN migran con una velocidad inmersamente proporcional a su tamao, es decir, que los fragmentos pequeos corren con mayor rapidez (figura 4.2). Los fragmentos de ADN se mueven en un campo elctrico simplemente porque poseen las abundantes cargas negativas de sus fosfatos, los cuales estn colocados regularmente a lo largo de la cadena. El gel de agarosa, usado en concentraciones entre 0.2 y 3%, produce mallas de espacios menores cuanto mayor es la concentracin.
93
A una concentracin dada, los fragmentos de ADN ms chicos sortean con ms facilidad las mallas y avanzan ms rpidamente hacia el nodo (polo positivo) mientras los fragmentos ms largos tardan ms en atravesar las mallas, debido a que el ADN es una molcula relativamente rgida y con forma de filamento. De esta manera, en geles de agarosa es posible separar fragmentos de ADN entre 50,000 nucletidos y 100-200 nucletidos. Debido a su gran densidad de cargas negativas, el ADN corre rpidamente y las electoforesis pueden realizarse en menos de una hora segn el voltaje aplicado.
Figura 4.5 Electroforesis en agarosa Una variante de gel de electroforesis en agarosa, llamado electroforesis de gel de campo pulstil, hace posible separar molculas de ADN an ms largas. El gel de electroforesis falla en separar esas molculas debido a que el campo elctrico constante las deforma por lo que viajan al primer extremo a travs del gel en configuraciones de forma como de serpiente a una velocidad independiente de su longitud. En la electroforesis de campo pulstil, por el contrario, la direccin del campo elctrico se cambia peridicamente, lo que fuerza a las molculas a reorientarse antes de continuar su movimiento en forma de serpiente a travs del gel. Esta reorientacin toma mucho ms tiempo para molculas ms largas, por lo que se mueven progresivamente ms lento. En consecuencia, an cromosomas enteros de bacterias o de levadura se separan en bandas discretas en geles de campo pulstil y as pueden acomodarse e identificarse con base en su tamao.
4.7.2 Visualizacin Las bandas de ADN en geles de poliacrilamida o agarosa son invisibles hasta que el ADN sea marcado o teido por algn mtodo. Un mtodo sensible de tincin de ADN es exponerlo a un colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que se observa bajo luz ultravioleta cuando se intercala en el ADN. Un mtodo de deteccin ms sensible involucra la incorporacin de un radioistopo en las molculas de ADN antes de la electroforesis, el fsforo 32 (P32), es el ms utilizado porque puede incorporarse en los grupos fosfato del ADN y emite una partcula energtica , la cual se detecta fcilmente por autorradiografa. 94
El procedimiento consiste, en que una vez terminada la electroforesis, se baa el gel en una solucin muy diluida del colorante florescente bromuro de etidio, que se introduce entre las dos hlices del ADN y absorbe intensamente la luz UV a 300 nm, emitiendo una luz anaranjada. El gel teido con bromuro de etidio y lavado se coloca sobre una fuente de luz UV (altamente daina para la vista y la piel no protegidas) y los lugares donde se encuentran los fragmentos de ADN se visualizan como bandas anaranjadas que deben ser fotografiadas para conservar la documentacin. Mediante este procedimiento se detecta hasta menos de un centsimo de g de ADN, lo que representa entre 1 y 10 ng (nanogramos). 4.7.3 Estimacin del tamao La electroforesis, el procedimiento por el cual molculas cargadas migran en un campo elctrico, ha tenido amplias aplicaciones en el anlisis de cidos nuclecos. Debido a que la velocidad de migracin en un gel de electroforesis est determinada por el tamao de las molculas y su carga elctrica, es un herramienta apropiada para la identificacin de muestras diferentes de ADN con el fin de estimar el tamao de los fragmentos de inters. La velocidad de migracin de las molculas de ADN conforme migran a travs de los poros en los geles de agarosa is inversamente proporcional a sus pesos moleculares. El tamao de los fragmentos de ADN puede determinarse en la electroforesis al comparar las movilidades electroforticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Existen patrones de ADN de varios rangos de peso molecular , se debe aplicar el que comprenda el peso molecular esperado para el fragmento de ADN que se quiere determinar. Estos marcadores estndar deben ser tratados de manera similar a la muestra y deben estar en cada gel que se desee medir el tamao de los fragmentos de ADN. Un marcador de pesos estndar de los ms usados y conocidos es el ADN del fago digerido con la enzima de restriccin Hindi. La secuencia completa del ADN del fago est bien conocida as como los tamaos de los fragmentos del ADN estn bien determinados bajo la digestin con varias enzimas de restriccin.
4.8 ANLISIS DE LOS PRODUCTOS DE EXPRESIN 4.8.1 Purificacin de ARN Una alcuota de una cantidad conocida de ARN (habitualmente 5 a 20 mg de ARN por pocillo) se somete a electroforesis horizontal unidimensional en un gel de agarosa. El gel se corre por el tiempo necesario de acuerdo al tamao del mismo, a bajo voltaje. Simultneamente con las muestras corridas en el gel de electroforesis, se corre una muestra que contiene estndares de ARN o ADN de tamaos conocidos para posteriormente identificar el tamao de los fragmentos de ARN obtenidos e hibridizados. El proceso de transferencia a una membrana de nailon es precedido de un lavado con una solucin altamente concentrada en sales para eliminar el formaldehdo y se procede a la transferencia por capilaridad que puede tener una duracin de varias horas. 95
Una vez transferido el ARN a la membrana de nailon, aqul debe ser fijado a la misma mediante horneo con altas temperaturas o anclaje con luz ultravioleta. Luego, se expone la membrana al anlisis de Northern blot que incluye la sntesis de la sonda, la hibridacin, los lavados y el revelado de la seal. La utilidad principal del Northern blot es para conocer cmo diversos estmulos pueden afectar la expresin de un gen al aumentar o disminuir el ARNm que codifica para este. La hibridacin del ARN de un gen de inters con la sonda puede hacerse ms especfica al someter la reaccin a la accin de las ARNsas. Este procedimiento permite no slo visualizar los fragmentos hibridados sino adems cuantificarlos. Para esto, se construyen sondas de ARN complementario anti-sentido mediante una reaccin de transcripcin in vitro. El ARN del tejido de inters se hbrida en una tubo de ensaye con la sonda marcada con radioactividad. Posteriormente, con la finalidad de digerir los fragmentos de ARN monocadena y en consecuencia no hibridados, se agrega a las muestras una solucin con ARNsas. Una vez completado el ensayo de proteccin de ARNsas o hibridacin en solucin, las muestras se precipitan y se cuentifican mediante centelleo lquido o bien son corridas con electroforesis en un gel. De esta manera, la evidencia por imagen de que la cantidad de ARNm cambi puede determinarse mediante conteo de radioactividad con centelleo lquido.
4.8.2 Plsmidos de expresin Los plsmidos de expresin han sido modificados de tal manera que poseen un promotor muy activo, lo que provoca una produccin inusualmente elevada de ARNm que producir la sntesis del polipptido en las clulas transformadas. Los vectores de expresin en E. coli permiten la produccin de cantidades abundantes de protenas de inters una vez que el ADNc que lo produce ha sido clonado. Uno de los sistemas de expresin ms productivos emplea clulas modificadas de E. coli que expresan una gran cantidad de ARN polimerasa T7 en presencia del anlogo de lactosa IPTG (Figura 4.6). Los vectores de expresin eucariticos son empleados para producir protenas que se modifican post-trasncripcionalmente, por ejemplo por la adicin de carbohidratos o grupos fosfatos. Debido a que E. coli carece de enzimas que catalizen estas modificaciones, estas protenas slo pueden ser producidas en el interior de clulas eucariotas. Los clones de ADNc pueden ser trasncritos y traducidos in vitro, pero la produccin de protenas por lo general es menor que en los sistemas de expresin in vivo. La ventaja de la produccin de protenas in vitro es que la protena de inters puede ser marcada radioctivamente durante la sntesis.
96
Figura 4.6 Produccin de protenas por medio de un plsmido de expresin. 4.8.3 Despliegue diferencial Un nmero importante de funciones celulares estn reguladas a nivel transcripcional en mamferos. Del conjunto de genes que forman el genoma de cada clula, una fraccin de ellos se estn transcribiendo activamente, se estn expresando en unas condiciones fisiolgicas concretas, mientras que otros muchos genes permanecen silentes. Entre los genes activos transcripcionalmente se encuentran un nmero importante de genes de expresin ubicua, que llevan a cabo funciones de mantenimiento celular y que se suelen expresar a niveles bastante uniformes, de modo constitutivo. Otro grupo de genes se expresa de manera especfica en el tiempo y el espacio, siendo sus niveles de transcripcin variables segn el momento del desarrollo, tipo celular y condiciones fisiolgicas. Es este ltimo grupo de genes, inducidos, el ms interesante a la hora de definir en trminos moleculares la respuesta celular a cambios ambientales y por tanto el que ha focalizado la atencin de los fisilogos. Los niveles de expresin gnica se pueden analizar a nivel proteico, midiendo la cantidad o actividad de producto gnico producido, o bien a nivel de ARN mensajero (ARNm). Los niveles de ARNm de un gen concreto no dependen slo del ritmo al que se transcriba, sino tambin de la vida media de la molcula, el ritmo a que se degrade. 97
Por otro lado, la interfase ARNm-protena, la traduccin proteica, tambin puede estar regulada, haciendo que los niveles de ARNm no sean extrapolables a los niveles de protena producida, pero no es lo mas frecuente. La tecnologa del ADN recombinante hace mucho ms fcil analizar niveles de ARNm que de protena, por lo que se ha generalizado la medicin de ARNm como indicador del nivel de expresin gnica. En las ltimas dcadas se ha profundizado en los mecanismos de respuesta fisiolgica midiendo los niveles de ARNm de uno o varios genes implicados en el proceso, utilizando herramientas como el Northern blot, el ensayo de proteccin con ARNasa, la RT-PCR o la hibridacin in situ. Pero dada la complejidad de la clula de mamfero, este tipo de anlisis, en serie, de uno o varios genes candidatos a jugar un papel en la respuesta estudiada conlleva una simplificacin notable del problema. Por esto es que ha existido gran inters en analizar, en paralelo, respuestas globales de los niveles de transcripcin de todos los genes a un determinado cambio ambiental. Este inters en analizar el conjunto de ARNm presentes en la clula en un momento concreto (su transcriptoma), ha llevado a desarrollar varias herramientas para el estudio de la expresin diferencial, para averiguar qu genes se expresan ms o menos en la situacin experimental con respecto a la control. Es as que se han utilizado variantes de procedimientos de hibridacin substractiva, despliegue diferencial (differential display), y anlisis seriado de expresin gnica (SAGE), que han contribuido notablemente a este conocimiento. Pero ha sido en los ltimos aos cuando se han dado dos avances importantes que han facilitado la generalizacin del anlisis global de la expresin gnica. Por un lado, el conocimiento del genoma humano y de organismos modelo como S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster o M. musculus hace que se disponga en la actualidad de colecciones de sondas moleculares capaces de detectar los niveles de expresin de cada gen en el genoma. Al mismo tiempo, se ha desarrollado nanotecnologa que posibilita la colocacin ordenada de miles de sondas moleculares en una superficie de uno o varios centmetros cuadrados. Estas micromatrices de sondas moleculares, conocidas como DNA-microarrays o DNA-chips se estn fabricando en laboratorios comerciales y acadmicos.
4.8.4 Purificacin y anlisis de protenas: anlisis de aloenzimas, Norther blot, Southern Blot, Western Blot y ELISA
Southern
La hibridacin molecular es uno de los pilares de la mayor parte de los procedimientos que se utilizan en un laboratorio de biologa molecular. La hibridacin se refiere al apareamiento especfico que ocurre entre cadenas de cidos nuclecos con secuencias complementarias: se lleva a cabo mediante la creacin de puentes de hidrgeno entre las bases de ambas cadenas lo que mantiene la inestabilidad del ADN. Con este principio se han desarrollado una serie de procedimientos en el laboratorio en las que se aprovechan las propiedades de 98
apareamiento de bases de los cidos nuclecos para hibridar ADN o ARN del tejido en estudio con un fragmento de ADN o ARN con secuencia conocida (denominado sonda) y marcado de manera tal que pueda detectarse con algn mtodo colorimtrico o mediante autorradiografa.
TRATAMIENTO
AISLAMIENTO DE ARNm
RT-PCR CON UN PRIMER AL AZAR
ANLISIS POR GEL ELECTROFORSIS
inducido Reprimido
RECUPERACIN Y CLONACIN DE LA BANDA
Figura 4.7 Esquema del proceso de despliegue diferencial de ARNm como respuesta a un estmulo. La primera de estas tcnicas surgi en 1975 en que Southern describe una manera de transferir ADN, previamente desnaturalizado o fraccionado segn su tamao en un gel, a una mebrana de nylon en la que el ADN poda ser hibridado con una sonda especfica y as detectar la secuencia deseada. Debido a que la transferencia de ADN del gel de agarosa a la membrana de nylon es por capilaridad, con el mismo principio utilizado por aos para limpiar manchas con papel secante, el proceso es conocido en ingls como blotting; Southern propuso utilizar el trmino blot (secado) o blotting para referirse a esta tcnica y actualmente se conoce como Southern blot.
99
Por lo tanto, el southern sirve para detectar secuencias especficas de ADN en una membrana de nylon. El esquema de los pasos generales para el anlisis de ADN por transferencia de tipo Southern se muestra en la figura 4.5. El ADN digerido con enzimas de restriccin especficas puede ser fraccionado sobre la base del tamao de los fragmentos mediante la electroforesis en gen de agarosa. Los fragmentos de ADN en el gel pueden transferirse a un soporte slido como la nitrocelulosa, ya sea electroforticamente o por medio de la transferencia de soluto a travs del gel hacia la lmina de nitrocelulosa. Luego puede hibridarse el filtro con una sonda radioactiva que contenga una secuencia de ADN o ARN de inters, eliminarse la sonda no fijada y localizarse las posiciones de los fragmentos de ADN en el gel complementarios a la sonda por medio de la autorradiografa sobre pelcula de rayos X.
Figura 4.8 Anlisis de ADN por transferencia tipo Southern
Western
La tcnica en la que se utilizan protenas en una membrana de nailon que se detectan con anticuerpos se le conoce como western blot. Este mtodo est diseado para la investigacin sobre la expresin de protenas usando extractos celulares que son fraccionados de acuerdo a su tamao. Esto se logra por anlisis de PAGE-SDS unidimensional, el cual es una forma de electroforesis en gel de 100
poliacrilamida en el cual la mezcla de protenas extradas se disuelve primero en una solucin de sodio duodecil sulfato (SDS, un detergente aninico que rompe casi todas las interacciones no covalentes en las protenas nativas). El Mercaptoetanol o ditiotreitol se agrega tambin para reducir los enlaces disulfuro. Despus de la electroforesis, las protenas fraccionadas pueden visualizarse por tincin con algn colorante (por ejemplo, azul de Comassie) o tincin con nitrato de plata. Los geles de dos dimensiones tambin pueden ser tiles: la primera dimensin incluye la migracin isoelctrica, que es la separacin de acuerdo a un gradiente de pH, y la segunda dimensin, involucra que se fraccionen las protenas por su tamao mediante SDS-PAGE. En este caso, las protenas fraccionada son transferidas a un pedazo de nitrocelulosa y luego expuestas a un anticuerpo especfico.
Northern
Esta tcnica se basa en el fraccionamiento de los diferentes ARNs de acuerdo a su tamao en un gel desnaturalizante de agarosa para posteriormente transferirlo a una membrana de nitrocelulosa o nailon sobre la cual puede ser hibridado con una sonda generalmente de ADN complementario (ADNc). Con este mtodo, de entre todos los ARNs contenidos en la muestra, se puede determinar la presencia especfica de uno de ellos, determinar su concentracin y analizar su variacin ente diferentes estmulos.
ELISA
Uno de los mtodos ms utilizados para la deteccin de protena transgnica es el ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). Como alternativa a este mtodo, ha aparecido recientemente en el mercado un sistema llamado LFA (Lateral Flow Strip) cuya diferencia fundamental es el formato ya que la base es la misma: deteccin de protenas usando anticuerpos especficos de la protena de inters. Estas tcnicas, que permiten cuantificar, estn limitadas a alimentos no procesados, es decir, no sometidos a tratamientos que hayan podido destruir la mencionada enzima. Los anlisis ELISA detectan o miden la concentracin de protena de inters en una muestra que puede contener numerosas protenas distintas. Se utiliza un anticuerpo fijado a un soporte que se une especficamente a la protena transgnica. Un segundo anticuerpo conjugado a un enzima genera un producto cuyo color es visible al aadir un sustrato determinado, y es fcilmente cuantificable mediante una curva patrnde la protena de inters. Frente a la tcnica PCR, los anlisis ELISA presentan menor sensibilidad, siendo sin embargo por ello, menos susceptible a falsos positivos. Por otra parte, se necesita desarrollar previamente anticuerpos que reconozcan especficamente la protena transgnica que se desee, por lo tanto no puede utilizarse este mtodo como tcnica de screening. La nica limitacin tecnolgica para utilizar el mtodo ELISA como anlisis rutinario es que se debe de conocer qu protena concreta se ha debido modificar en cada caso, y se deben desarrollar anticuerpos frente a esa protena. 101
4.9 BIBLIOTECA DE GENES 4.9.1 Identificacin de genes Por muchos casos, la clonacin de ADN se lleva a cabo para lograr simplemente la amplificacin de un ADN integrado para obtener cantidades suficientes por una variedad de estructuras subsiguientes y estudios funcionales. Sin embargo, hay muchas circunstancias donde en vez de solo amplificar y propagar el ADN clonado se desea poder expresar el gen de alguna manera (clonacin de expresin). En esos casos, las seales de expresin apropiadas necesitan estar en el sistema de clonacin. Existe una gran variedad de sistemas de clonacin que pueden usarse de acuerdo a lo siguiente: 1.- Al tipo de producto de expresin. Para algunos propsitos, sera suficiente poder obtener un producto de ARN. Los ejemplo incluyen la generacin de sondas de ARN antisentido (ribosondas) para el uso en estudios de hibridacin in situ, o generacin de ARN antisentido para inhibir o destruir la expresin de genes especficos, tanto en estudios funcionales como para propsitos teraputicos. 2.- Al tipo de ambiente. Algunas veces puede ser suficiente expresar el producto in vitro. Con frecuencia, se desea poder expresar el producto en un sistema celular particular, que puede ser una lnea celular bien definida procarionte o eucarionte. 3.- Al propsito del sistema de expresin. El sistema de expresin puede disearse simplemente para investigar la expresin. En algunos casos, sin embargo, el propsito puede ser obtener grandes cantidades de un producto de expresin, as como la necesidad de generar grandes cantidades de una protena especfica para subsiguientes estudios de cristalografa o preparar anticuerpos especficos contra la protena. La expresin de protenas eucariticas en bacterias puede usarse como un sistema blanco para tamizar con anticuerpos e identificar genes no caracterizados previamente. En estos casos, an cuando no haya informacin sobre la secuencia codificante del gen en cuestin, la purificacin parcial de un producto protico puede permitir generar un anticuerpo especfico. Filtros que contengan las colonias bacterianas individuales pueden tamizarse por exposicin al anticuerpo. La bacteria que reaccione positivamente puede ser propagada para aislar la clona de ADNc, la cual puede a su vez puede emplearse en una genoteca para identificar genes relacionados. Cuando se requiere la produccin de grandes cantidades de una proteina (por lo general extraa al husped), y la produccin a gran escala puede ser letal para el crecimiento de la bacteria, entonces se disean sistemas de expresin con promotores inducibles. La expresin del gen insertado puede activarse por exposicin a un agente inductor y las clulas pueden ser cosechadas pronto. Una aplicacin importante de este mtodo es el diseo que permite la construccin de un anticuerpo especifico para un polipptido eucaritico donde no se tiene ninguna informacin disponible. Entonces, se pretende preparar protenas de fusin que consisten de un pptido aminoterminal codificado por una porcin de un gen bacteriano, como el gen LacZ de E. coli, ligado al polipptido eucaritico deseado. 102
Las propiedades biolgicas de muchas protenas eucariticas sintetizadas en las bacterias pueden no ser muy representativas de las molculas nativas debido al procesamiento post-traduccional y al desdoblamiento incorrectos e ineficientes de la protena. Como resultado, se ha hecho un esfuerzo considerable para expresar protenas de mamfero preferentemente en clulas eucarinticas de mamfero. Los siguientes son los sistemas de expresin principales: 1.- Los que se disean para producir expresin estable del ADN transfectado; como los sistemas de expresin basados en clulas COS de mono, que se construyeron por transformacin de clulas CV-1de rin de simio con un genoma del virus SV-40 con un origen de replicacin defectuoso. 2.- Los que incluyen el uso de vectores de expresin virales, como los derivados de los virus SV40, adenovirus, de vaccinia, retrovirus y el baculovirus de insecto. Este ltimo sistema de expresin es el ms usado para la preparacin de una protena eucarintica especfica.
4.9.2. Localizacin del gen Cuando se parte de ADN genmico, o de una genoteca de ADNc, la transformacin celular resulta en miles o millones de clonas con molculas de ADN recombinante diferentes. El ltimo paso, es localizar entre esos millones de clonas aquella o quellas transformadas con el ADN recombinante del gen a estudiar. Las clonas se siembran en membranas de nylon o nitrocelulosa, a densidades de cientos o miles por membrana, sobre cajas de Petri con agar. Ya crecidas las clonas, se hacen copias en espejo con nuevas membranas que se utilizan para localizar la presencia y posicin de la clona de inters. La forma ms fcil y rpida de localizar una clona entre miles es por homologa, o sea, si conocemos al menos parte de la secuencia. Cuando conocemos parte de la secuencia podemos sintetizar una sonda (fragmento de ADN o ARN con secuencia complementaria), marcarla con algn mtodo radiactivo (32P-dCTP) o no radiactivo (digoxigenina-11UTP), y utilizarla para localizar a una clona entre miles mediante hibridacin del ADN en las membranas y autorradiografa de estas. Otra posibilidad es que no se conozca la secuencia de bases o de aminocidos de la protena que le interesa clonar, pero por alguna razn ha podido extraer la protena del tejido. En este caso, se generan primero anticuerpos, de preferencia monoclonales, en contra de la protena y despus, con dichos anticuerpos se analizan las membranas con las clonas. Se utiliza un vector de expresin, el cual permite a las bacterias no solo replicar el ADN, sino adems traducir su cdigo gentico y sintetizar la protena. La clona con el eptope apropiado ser localizada por los anticuerpos. El ADNc identificado sirve de molde para sintetizar una sonda til para localizar el resto del gen por homologa.
103
La tercera posibilidad es cuando no conocemos la secuencia de bases o de aminocidos, ni tampoco se tiene aislada a la protena, pero conocemos con cierto detalle la funcin de la protena. En este caso, nos podemos guiar en la funcin para identificar el ADN recombinante que contiene dicho gen. La estrategia es transfectar clulas en forma permanente (por ejemplo, clulas COS) o transitoria (ovocitos de Xenopus leavis), con ADN recombinante de grupos de clonas y buscar manifestaciones de su funcin. Las positivas son las que fueron transfectadas con ADN recombinante que contiene el mensaje para la protena de inters. A partir de ese momento se reduce progresivamente el nmero de clonas hasta llegar a una sola con el ADN recombinante que induce la funcin deseada.
4.9.3 Bibliotecas de ADN complementario

Como la expresin de un gen puede variar en las diferentes clulas y en las diferentes etapas del desarrollo, el material inicial para construir bibliotecas de ADNc es generalmente el ARN total de un tejido especfico o etapa de desarrollo especfico de embriognesis. De aqu, que un ARNm poli(A)+ puede seleccionarse por unin especfica a un oligonucletido complementario de cadena sencilla o polinucletido unido a una matriz slida. Por ejemplo, columnas de cromatografa que contienen puentes poli(U) a sefarosa o puentes oligo (dT) a celulosa son de los ms usados: el ARNm poli(A) se une selectivamente al poli (U) o componentes oligo (dT) y subsiguientemente puede eluirse usando amortiguadores o soluciones inicas de alta astringencia para disociar el puente de hidrgeno. El ARNm poli(A) aislado puede entonces convertirse, con transcriptasa reversa, a una copia de ADNc de doble cadena. Para fines de clonacin, los oligonucletidos linkers que tienen un sitio de restriccin apropiado se ligan a cada extremo del ADNc. Las bibliotecas de ADNc tienen dos apreciables ventajas: 1) todos los fragmentos son copias de genes; 2) son especficas para el tipo de clula del cual se extrae el ARN de la genoteca. Los ARNm detenidos y purificados, se incuban con deoxinucletidos y transcriptasa inversa, MgCl2 y un cebador o primer de polideoxitimidina con lo cual se copia la informacin del ARNm en una cadena complementaria de ADN. Luego de otros procedimientos es posible vehiculizar o clonar estos ADNc en bacterias, con lo cual se obtiene la genoteca de ADNc. Dado que cada ADNc es posiblemente idntico a los exones de un gen, cada inserto de un plsmido en una genoteca de ADNc podra transcribir un ARNm y finalmente codificar un polipptido. Para ello se usan los vectores o plsmidos de expresin, como el pUC19. Finalmente, una genoteca de ADNc es un conjunto de colonias de E. coli, cada una con un tipo de plsmido que contiene un inserto correspondiente a un ARNm.
104
4.10 SECUENCIACIN DE ADN: POLIMORFISMOS En la actualidad es posible secuenciar, es decir, obtener la secuencia exacta de las bases de fragmentos cada vez mayores, ya sea manualmente o con dispositivos automticos, y por lo general por el mtodo de dideoxinucletidos. Varios centenares de bases se pueden secuenciar manualmente en dos das. Al principio se desarrollaron dos mtodos de secuenciacin, el qumico y el enzimtico. Este ltimo se ha convertido en el mtodo estndar para la secuenciacin del ADN y se basa en la sntesis in vitro del ADN en presencia de nuclesidos trifosfato de cadena terminal. Para estudios sobre la determinacin de la estructura y funcin de genes es una prioridad inicial obtener la secuencia completa de ADNc. Una manera de lograr la secuenciacin completa se ADNc es tamizar diferentes genotecas de ADNc y luego mapear la extensin de las sobreposiciones entre los insertos de las clonas positivas. Debido a la enormemente rpida proliferacin de secuencias de ADNc en las bases de datos electrnicas es posible obtener secuencias de ADNc casi completas para un gen previamente no caracterizado. La secuenciacin por el mtodo de Sanger de terminacin de cadenas se vale de dideoxinucletidos que pueden ser incorporados en cadenas de ADN en crecimiento pero que, una vez incorporados, impiden la ulterior prolongacin de esa cadena de ADN. En esta reaccin de secuenciado se divide en cuatro la muestra de ADN a secuenciar y se agrega a cada una un cebador o primer de oligonucletidos radiomarcado que es complementario de un extremo de la cadena de ADN a ser secuenciada. Luego se alarga el cebador por accin de la ADN polimerasa en presencia de dNTP pero cada una de las cuatro muestras tambin contiene uno de los NTP en la forma didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). En condiciones adecuadas, esto produce una serie de molculas de ADN de longitudes variables que pueden ser separadas en geles de acrilamida contiguos y expuestas a pelculas de rayos X. El patrn de las bandas del ADN pueden entonces usarse para determinar la secuencia del ADN (figura 4.7). 4.10.1 Gel retardado Esta tcnica es alternativamente conocida como ensayo de desviacin en la movilidad electrofortica (EMSA, del ingls) y se basa en que la unin de una protena a un fragmento de ADN disminuye o retrasa su movilidad en un gel de electroforesis (gel de retardamiento). Un fragmento de ADN de una clona genmica o un correspondiente oligonucletido sinttico, que se sospecha contenga secuencias regulatorias, es marcado en un extremo y luego mezclado con el extracto de una protena. La preparacin resultante se fracciona en un gel por PAGE en paralelo con una muestra control en la cual el ADN no est mezclado con la protena. Los fragmentos de ADN que estn unidos a protena se identificarn como bandas de movilidad baja. Dado que el ADN es una molcula altamente cargada, puede haber la posibilidad para uniones inespecficas. 105
4.10.2 ADN footprinting Una modificacin del mtodo qumico para secuenciacin de ADN puede usarse para determinar la secuencia de nucletidos reconocidas por uniones de ADNprotena. Algunas de estas protenas participan en la determinacin de genes que estn activos en una clula en particular por unin a secuencias de ADN regulatorias, que generalmente estn localizadas fuera de las regiones codifcantes de un gen. Para analizar cmo funcionan estas protenas, es importante identificar las secuencias especficas a las que se une. Un mtodo usado para este propsito en el ADN footprinting. Primero, un fragmento de ADN puro marcado en un extremo con P32 se asla; esta molcula es luego fraccionada con una nucleasa o por un procedimiento qumico que corte al azar cadenas sencillas en el ADN. Despus de que la molcula del ADN se desnaturaliza para separar sus cadenas, los subfragmentos resultantes de la cadena marcada se separan en un gel y se detectan por autoradiografa.
Figura 4.9 Secuenciacin por el mtodo de Sanger 106
El patrn de bandas del ADN cortado en presencia de un protena unida a ADN se compara con el patrn de bandas de ADN cortado en su ausencia. Cuando la protena est presente, cubre los nucletidos en su sitio de unin y protege sus enlaces fosfodister de ser cortados. Como resultado, los fragmentos marcados que terminan en el sitio de unin se perdern, dejando una brecha en el patrn del gel llamada footprint o huella de pisada. Cuando una protena se une especficamente a una secuencia de ADN, solo pocos nucletidos del ADN estn incluidos en el contacto ADN-protena. La unin de protena encuentra, sin embargo, al segmento de ADN en cuestin relativamente resistente al corte por deoxyribonucleasa pancretica I (ADNsa I), cuando se compara con ADN desnudo (Figura 4.8). Fragmentos cortos de ADN clonados (por lo general de unos cientos de bases de largo) se usan como blanco y se marcan nicamente en un solo extremo. Los fragmentos clonados se incuban individualmente en presencia o ausencia de un extracto de protena ( por ejemplo, un extracto nuclear de clulas humanas HeLa) y luego expuestas brevemente a bajas concentraciones de ADNsa I. Esta condiciones de digestin parcial aseguran que para cualquier fragmento de ADN, cada molcula es cortada solo raramente y en una posicin al azar si no est unida a protena. Los productos de la digestin se fraccionan de acuerdo a su tamao en geles largos de poliacrilamiada no desnaturalizante y luego resueltos por autorradiografa. Las muestras control mostraran una serie de bandas correspondientes a los fragmentos de ADN de cada longitud posible. Los carriles que se analizan revelarn brechas donde no se observan fragmentos o footprints, en los que la ADNsa I no fue capaz de cortar estas posiciones debido a inhibicin estrica por unin a protena.
107
Figura 4.10 La prueba de footprint con ADNsa I identifican secuencias de ADN especficas que interaccionan con protenas.
4.10.3. Genes reporteros Adems del estudio de la expresin gnica, tambin es importante poder estudiar el control de la expresin gnica. Una manera de identificar elementos regulatorios es usar un sistema de expresin gnica artificial. Las clulas humanas son los sistemas ms apropiados para el estudio de la expresin de genes humanos, pero esto deja el problema de cmo seguir la expresin de un gen humano tranfectado en presencia de un homlogo endgeno que puede expresarse en las mismas clulas. Por lo que se recomienda clonar las secuencias regulatorias en un vector que contiene un gen reportero ro abajo del sitio de clonacin. El gen reportero se disea deliberadamente de manera que sea el nico que no se encuentre en las clulas humanas y que pueda evaluarse fcilmente. Los genes reporteros ms ampliamente usados son el gen CAT (cloranfenicol acetil transferasa,) bacteriano, derivado del transposon Tn9 de E. Coli, el gen galactosidasa y el gen de luciferaza de la liblula. La luciferasa tiene la ventaja de ser un ensayo muy sensible, porque cataliza la oxidacin de liciferina con la emisin de luz verde-amarilla que puede detectarse fcilmente y a bajos niveles. La potencia de un promotor gnico puede ser analizada mediante la transfeccin de construcciones informadoras para promotores. 108
La transfeccin en clulas eucariticas de vectores informadores de CAT trae como consecuencia la expresin del gen de la CAT, la cual puede ser investigada con facilidad midiendo la conversin de cloranfenicol- 14 C en cloranfenicol acetilado en presencia de extractos celulares transfectados. Si estos resultados son luego analizados por medio de cromatografa ascendente en capa delgada, la cantidad de cloranfenicol acetilado se puede cuantificar por autorradiografa. Los productos de la acetilacin del cloranfenicol migran ms rpido en el cromatograma (figura 4.9). En los sistemas de expresin artificial antes mencionados, el vector se construye para que la expresin del gen reportero se controle casi totalmente por las secuencias humanas introducidas ro arriba. El producto construido gene reportero-vector se transfecta luego a clulas blanco cultivadas mediante mtodos convencionales. Si todos los elementos necesarios se presentan por expresin del gen humano, altos niveles de expresin del gen reportero resultaran cuando el producto construido sea transfectado en un tipo apropiado de clulas humanas en cultivo. Con frecuencia, el producto construido es simplemente transfectado en clulas HeLa, una lnea celular bien establecida derivada de un carcinoma cervical humano. Sin embargo, si se sabe que el gen se expresa predominantemente en un cierto tipo de clulas, por ejemplo, hepatocitos, se recomienda usar una lnea celular receptora apropiada, una lnea celular de hepatoma en este caso. La transcripcin de un gen es controlada por secuencias de ADN regulatorias que no son transcritas. Estas secuencias determinan qu clulas expresarn el gen y bajo qu condiciones. En eucariontes superiores estas secuencias regulatorias pueden localizarse muchos miles de pares de bases ro arriba o abajo de las secuencias transcritas, y actan en combinaciones para controlar la transcripcin gnica. Las secuencias regulatorias de ADN pueden identificarse para cualquier gen en particular mediante una manipulacin que involucra sustituir parte de la secuencia codificante de un gen con una secuencia codificante diferente, llamada secuencia reportera, seleccionada porque la protena que codifica puede detectarse fcilmente por simple tincin citolgica o ensayo enzimtico. Las secuencias regulatorias para el gen de inters pueden identificarse uniendo la secuencia reportera a varios fragmentos o secuencias de ADN tomadas de los sitios ro arriba o abajo del gen. Cuando estas molculas de ADN recombinante se usan para transfectar clulas, el nivel, duracin y especificidad celular de la produccin de la protena reportera reflejar la accin de las secuencias regulatorias que cada ADN recombinante tiene.
109
Figura 4.11 Prueba del gen reportero de cloranfenicol acetiltransfersa (CAT)
4.10.4 Anlisis por deleccin Otra forma de estudiar el control de la expresin gnica es analizando cmo diferentes fragmentos delecionados del ADN ro arriba del gen u ocasionalmente en el primer intrn, afectan la expresin gnica. Una serie de construcciones de delecin progresiva se puede hacerse usando la enzima exonucleasa III de E. coli que est inactiva en el ADN de cadena sencilla pero progresivamente corta el extremo 3 en el ADN de doble cadena. Esto permite el mapeo de secuencias que controlan la expresin gnica. Alternativamente, se puede disear una serie de productos de amplificacin por PCR, que cubran las regiones de inters y luego clonarlas en un vector de expresin apropiado. El anlisis por delecin arroja slo una indicacin general de la localizacin de una secuencia que regula la expresin gnica. Debido a que estas secuencias de control pueden unirse especficamente a protenas regulatorias, una manera de identificarlas es el tamizaje de secuencias que se unen especficamente a protenas. Esto incluye el uso de oligonucletidos sintticos correspondientes a secuencias de una regin que contenga una secuencia regulatoria.
4.6 BIBLIOTECA DE GENES Los procesos modernos de clonacin de ADN ofrecen la posibilidad de realizar amplias colecciones de clonas de ADN conocidas como bibliotecas de ADN, de poblaciones de ADN extremadamente complejas, como por ejemplo, el ADN 110
genmico total humano. Este procedimiento permite que secuencias de ADN que son muy raras en la poblacin inicial estn representadas en una biblioteca de clonas de ADN, en cuanto puedan ser aisladas individualmente por seleccin de una colonia celular husped y amplificndola. Dos variedades bsicas de este mtodo son las que se ejecutan comnmente: la construccin de bibliotecas de ADN genmico y bibliotecas de ADNc. Bibliotecas de ADN genmico. Si el ADN de un organismo es sometido a la accin de una enzima de restriccin, se forman numerossimos fragmentos con un grado de repeticin determinado por el nmero de clulas usado para preparar el ADN. Esos fragmentos pueden ser ligados a un vector tratado con la misma enzima, de forma tal que se produce una coleccin de molculas de vector que llevan todos los tipos de fragmentos; esta coleccin se llama genoteca genmica. En el caso de eucariontes, como los mamferos, todas las clulas nucleadas tienen esencialmente el mismo contenido de ADN y con frecuencia es conveniente preparar una biblioteca genmica a partir de clulas fcilmente accesibles, como clulas sanguneas. El material inicial es ADN genmico que ha sido fragmentado previamente, por algn mtodo, por lo general digestin con una enzima de restriccin. Tpicamente el ADN se digiere con una enzima que corte 4 pb como la MboI que reconoce la secuencia GATC. Esta secuencia esta presente aproximadamente cada 275 pb en promedio sobre el ADN genmico humano, as que habr pocas secuencias de ADN que carecen del sitio de reconocimiento para esta enzima. Claramente, la digestin completa del ADN inicial con esta enzima producir fragmentos muy pequeos. Adems, el nmero de cortes puede acortarse bajo condiciones de restriccin parcial (baja concentracin de enzima, tiempo corto de incubacin, etc.). El corte ocurrir solamente en un pequeo nmero de sitios de restriccin potenciales. Esto tiene el beneficio de que da la capacidad de producir grandes filamentos para clonacin. Importantemente, tambin permite fragmentacin al azar del ADN. Entonces, para la localizacin de una secuencia especfica, el patrn de restriccin ser diferente en copias diferentes de la misma secuencia de ADN inicial. La fragmentacin al azar asegura que la biblioteca contenga mucha representacin del ADN inicial como sea posible. Adicionalmente, tiene la ventaja de que resulta en clonas con insertos sobrepuestos. Como resultado, despus de la caracterizacin del inserto de una clona, se pueden hacer ensayos para llegar a las clonas de la misma regin general, identificando aquellas con insertos que muestran algunas similitudes a la de la clona original. Las genotecas genmicas son colecciones de fragmentos de ADN presentes en colecciones de plsmidos o de fagos, que a su vez estn contenidas en cultivos bacterianos. Materialmente esa genoteca es un conjunto de cajas de Petri (20 o ms) con cultivos, donde cada colonia contiene un fragmento de ADN. La 111
genoteca tambin puede estar representada por improntas de cada cpsula, hechas en una membrana, o por un nico cultivo donde estn mezcladas colonias de bacterias conteniendo diferentes fragmentos. La cantidad de ADN usada para crear la genoteca debe ser bastante mayor que un genoma para descontar las fallas en las distintas etapas. Se considera que con 1/10 de mg de ADN (100 g) es factible hacer una genoteca genmica.
4.11 APLICACIONES DE LA TECNOLOGA DE ADN RECOMBINANTE 4.11.1 Medicinas gnicas
Figura 4.12 Esquema de un proceso de produccin de vacunas recombinantes a) Obtencin de proteinas de mamferos Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulacin, etc. tienen un inters mdico y comercial muy grande. Antes, la obtencin de estas protenas se realizaba mediante su extraccin directa a partir de tejidos o fluidos corporales. 112
En la actualidad, gracias a la tecnologa del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas protenas humanas en microorganismos adecuados para su fabricacin comercial. Un ejemplo tpico es la produccin de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana. b) Obtencin de anticuerpos monoclonales Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cncer y diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros sntomas. c) Obtencin de vacunas recombinantes El sistema tradicional de obtencin de vacunas a partir de microorganismos patgenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniera gentica. Como la mayora de los factores antignicos son protenas lo que se hace es clonar el gen de la protena correspondiente. 4.11.2 Plantas trasgnicas Mediante la ingeniera gentica han podido modificarse las caractersticas de gran cantidad de plantas para hacerlas ms tiles al hombre, son las llamadas plantas transgnicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas tcnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas despus de haber sido cosechados a) Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas Ya se dispone de semillas de algodn, que son insensibles a herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) daina para las larvas de muchos insectos. b) Incremento del rendimiento fotosinttico Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosinttica de plantas C4 que es ms eficiente. c) Mejora en la calidad de los productos agrcolas Tal es el caso de la colza y la soja transgnicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes. d) Sntesis de productos de inters comercial Existen ya plantas transgnicas que producen anticuerpos animales, interfern, e incluso elementos de un polister destinado a la fabricacin de plsticos biodegradables e) Asimilacin de nitrgeno atmosfrico Aunque no hay resultados, se ensaya la transfeccin del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrgeno, y que permitira a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados. 113
Figura 4.13 Se utiliza a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de los genes que se desean introducir en una clula vegetal, con lo que se transforma dicha clula, la cual puede regenerar, por micropropagacin, una planta entera que ser transgnica. 4.11.3 Animales transgnicos Entre las aplicaciones de los animales transgnicos se pueden destacar: la posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulacin, manipular de forma especfica la expresin gnica in vivo, estudiar la funcin de genes especficos, poder utilizar a mamferos como biorreactores para la produccin de proteinas humanas y la correccin de errores innatos de metabolismo mediante terapia gnica. a) Transferencia nuclear Se toman clulas embrionarias en fase de mrula o blstula, obtenidas por disgregacin, se cultivan in vitro, y despus se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el ncleo. Se provoca la fusin de las dos clulas animales de modo que el ncleo de la clula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo ste empezar a funcionar como un zigoto. b) Introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias totipotentes (clulas ES) o clulas embrionarias madres (clulas EM) Estas clulas se toman del interior de la blstula en desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguir que las clulas no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario. 114
Figura 4.14 Cerda Genie, que fabrica en su leche la proteina C humana que controla la coagulacin sangunea y es necesaria para los hemoflicos.
4.11.4 Microorganismos modificados genticamente La introduccin de ADN forneo en un microorganismo da lugar a los microorganismos transgnicos. La mayora de microorganimos transgnicos son bacterias unicelulares o levaduras. Las bacterias y levaduras transgnicas se usan principalmente en la industria alimentara, en la produccin de aditivos alimentarios, aminocidos, pptidos, cidos orgnicos, polisacridos y vitaminas. Tambin se han aplicado en procesos de bioremediacin y, en medicina, se emplean ampliamente para producir protenas de inters como por ejemplo, la insulina. Fabricar un transgnico unicelular es ms fcil que producir una planta o animal transgnico, ya que en stos hay que asegurar la presencia del nuevo ADN en todas las clulas del organismo. 115
Figura 4.15 Introduccin de clulas embrionarias a blastocitos receptores. Para desarrollar una bacteria transgnica, el gen de inters se incorpora en un plsmido (ADN circular extracromosmico capaz de autoreplicarse) y se incuba junto con la bacteria bajo condiciones especficas que favorecen la entrada del plsmido en el interior de la bacteria. Si la bacteria retiene el plsmido y la protena que expresa el gen de inters no resulta txica para su desarrollo, se obtiene una bacteria transgnica, con nuevas caractersticas determinadas por el gen introducido. La bacteria ms utilizada es la Escherichia coli. No obstante y a pesar que su fcil manipulacin, las bacterias no son siempre la mejor eleccin para producir protenas humanas. Algunas de stas no son funcionales si no estn glicosiladas, es decir, si no se aaden azcares a la cadena de aminocidos, y este proceso no lo pueden llevar a cabo las bacterias. En estos casos se utilizan levaduras transgnicas, que s son capaces de glicosilar. La produccin de levaduras transgnicas implica tambin el empleo de plsmidos, siendo la levadura Saccharomyces cerevisiae la especie ms empleada. 116
Aplicaciones de los microorganismos transgnicos Investigacin Los microorganismos transgnicos son una herramienta de fundamental importancia en investigacin. La introduccin en bacterias de plsmidos que contienen un gen concreto a estudiar se realiza de forma rutinaria en los laboratorios, ya sea con el objeto de tener un stock de dicho gen (mediante el crecimiento de colonias que permiten tener gran cantidad de clulas que lo contienen) o para expresar una protena de inters. Estas bacterias transgnicas ayudan a los cientficos a entender mejor algunos procesos bioqumicos, la regulacin de genes y su funcin. Produccin de protenas en medicina Como ya se ha comentado, se han desarrollado bacterias E.coli capaces de producir insulina humana, imprescindible para pacientes diabticos. Antes del empleo de bacterias transgnicas, la insulina se obtena de vacas y cerdos, pero, como su estructura difera ligeramente de la variedad humana, en algunos casos provocaba una reaccin alrgica. Las bacterias transgnicas han eliminado este problema. Asimismo, la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha modificado genticamente para obtener insulina humana. Tambin se han desarrollado bacterias transgnicas para producir la hormona del crecimiento, que se emplea para tratar a nios con enanismo. Otros usos en medicina de los microorganismos transgnicos son la produccin de vacunas, anticuerpos, etc Bioremediacin Existen microorganismos capaces de utilizar como nutrientes compuestos txicos o peligrosos, como hidrocarburos, detergentes, bifenilos policlorados, etc, de forma que su metabolismo los convierte en productos inocuos para el medio ambiente. El empleo de organismos vivos para degradar residuos se conoce como bioremediacin. La mayora de aplicaciones biotecnolgicas aplicadas al medio ambiente utilizan microorganismos naturales, pero se estn desarrollando microorganismos transgnicos para eliminar materiales difciles de degradar. Por ejemplo, bacterias Pseudomonas transgnicas son capaces de degradar compuestos polihalogenados. La investigacin en este campo busca los enzimas presentes en microorganismos naturales que son eficientes en el tratamiento de compuestos txicos y determinar como pueden mejorarse mediante ingeniera gentica. Industria alimentaria Los microorganismos modificados genticamente se emplean en la industria alimentaria para producir aditivos alimentarios como edulcorantes artificiales y aminocidos con el propsito de incrementar la eficiencia y reducir su coste. Otros productos de estos microorganismos son enzimas recombinantes que se emplean en panadera, produccin de cerveza, produccin de queso (por ejemplo, quimosina). Tambin se aplican en procesos de fermentacin, como por ejemplo el empleo de levaduras transgnicas para desarrollar el sabor y aroma en la industria de la cerveza.
117
Solari A.J. Gentica Humana. Fundamentos y aplicaciones en Medicina. Editorial Mdica Panamericana. 1996. p 24 2. Carnevale A. y Snchez-Torres G. Gentica y Biologa molecular en Cardiologa. Preludios del XVIII Congreso Nacional de Cardiologa. Sociedad Mexicana de Cardiologa. 1993. p 87. Innis A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., y White T.J. PCR protocols. A guide to Methods and Applications. Academic Press, inc. San Diego.1990 p472. Strachan T y Read A. Human Molecular Genetics. Second Ed. Wiley-Liss. 1999. 576p. Cox T y Sinclair J. Biologa Molecular en Medicina. Editorial Mdica Panamericana. 1998. 366p. Guizar-Vzquez J. Gentica Clnica. Diagnstico y manejo de las enfermedades hereditarias. Editorial El Manual Moderno. 2001. 984p. Lewin B. Genes VIII. Oxford University Press. 2000. 990p Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K. y Watson J. Molecular Biology of the Cell. 3ra edicin. Garland publishing. 1994. 1294p
118

Biologia Super)

Caricato da

Informazioni sul documento

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Biologia Super)

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

UNIDAD 1 ADN COMO FUENTE DE INFORMACIN

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

Figura 1.3 Componentes del ADN.

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

DOBLE HLICE DE ADN

CROMATIDAS ESPIRAL DE ROSETONES

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

UNIDAD 2 PERPETUACION Y EMPAQUETAMIENTO DEL ADN

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

1.Ncleo cataltico 1.Sin funcin conocida Si

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

dna E (Pol C), dna N, dna x , dna q, dna t.

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR

J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR