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Quim. Nova, Vol. 24, No. 4, 516-525, 2001. GLICDIOS NO MEL

Reviso

Ricardo Felipe Alves Moreira Departamento de Bioqumica, Instituto de Qumica, UFRJ, Rio de Janeiro - RJ Carlos Alberto Bastos De Maria* Departamento de Cincias Fisiolgicas, Instituto Biomdico, UNIRIO, Rua Frei Caneca 94, 40 andar, 20211-040 Rio de Janeiro - RJ Recebido em 28/7/00; aceito em 31/10/00

SUGARS IN THE HONEY. A review about composition, origin and importance of carbohydrates in honey is presented. Fructose and glucose are the major carbohydrates, ranging from 65-85 % of the total soluble solids. Other minor carbohydrates, chiefly di- and trisaccharides, have been also identified. Fructose, glucose and sucrose are mainly originated from nectar. Oligosaccharides are mainly formed by trans- -D-glucosylation reactions catalysed by honeybee -D-glucosidase. The profile of carbohydrates can be useful for the identification of the brazilian region in which honey was produced and may also be useful for testing brazilian honey authenticity. Keywords: honey; carbohydrates; nectar.

INTRODUO O mel um produto viscoso, adocicado e geralmente de aroma agradvel, apreciado, segundo alguns relatos, desde a Grcia antiga1. Sua qualidade nutricional (vitaminas, minerais, valor energtico elevado), suas propriedades medicinais (ao antioxidante e antissptica relacionada aos compostos fenlicos) e suas propriedades sensoriais tem atrado milhares de consumidores2. A matria-prima para produo do mel pelas abelhas o nctar ou a excreo de afdios ou o exsudato de plantas ou mesmo frutas. O nctar a matria-prima para a produo de mis florais que so os mais apreciados e alcanam os maiores preos no mercado. O mel floral pode ser monofloral, quando o nctar coletado de uma nica espcie vegetal; polifloral, se mais de uma espcie de planta contribui com o nctar; silvestre, que se caracteriza por ser um mel polifloral produzido em vegetao primria e, portanto, espcies nativas contribuem com o nctar. O mel extrafloral no produzido a partir do nctar e, sim, de exsudato de plantas ou de restos de frutas ou outra fonte de matria-prima. Os mis florais so caracterizados por anlise microscpica que identifica e quantifica os gros de plen. Atualmente, existe um grande interesse em se caracterizar o mel atravs da anlise polnica juntamente com a fsico-qumica. A anlise polnica depende de grande experincia por parte do analista j que desenvolvida atravs da comparao da morfologia do plen com descries da literatura. A matria-prima para produo dos mis de melato oriunda da excreo de artrpodes (insetos) da ordem Homoptera conhecidos como afdeos (ex. pulges) que sugam o fludo do floema (vaso condutor de material orgnico nas plantas)3. Esses insetos excretam um lquido adocicado na forma de gotas atravs do canal alimentar. Esse lquido se deposita na parte externa das folhas e em outras partes da planta. A abelha coleta esse lquido e o utiliza como matria-prima para produo de mel. Frequentemente, os mis de melato so classificados em 2 tipos: aqueles ricos em melezitose que so sujeitos granulao, e os ricos em erlose que no sofrem granulao4. Geralmente, as abelhas preferem coletar o nctar como matria-prima, utilizando outras fontes no perodo de baixa disponibilidade de nctar. Os mis de melato s apresentam valor de mercado na Europa Central; em outras
* e-mail: cabm@acd.ufrj.br/ricardoa@acd.ufrj.br

regies so considerados inferiores, do ponto de vista esttico, aos mis florais. Portanto, o enfoque principal desta reviso o mel floral. Neste trabalho abordada a composio de glicdios, sua origem e sua aplicao na avaliao da qualidade do mel. MONOSSACARDIOS INTRODUO A frao monossacardica do mel composta basicamente pelos acares simples frutose e glicose. A presena desses monossacardios no mel foi descrita em uma srie de trabalhos5,6,7. Em 19548, por exemplo, 21 amostras de mel que representavam 19 fontes florais diferentes foram analisadas atravs da cromatografia de adsoro seletiva e de mtodos analticos descritos anteriormente na literatura (p. ex. polarimetria)9 . Os resultados obtidos demonstraram que a frao monossacardica desses mis consistia de glicose e frutose. Em 197510 , foi descrito um mtodo simples para a deteco e quantificao da frutose e da glicose em amostras de mel empregando-se a cromatografia gasosa (CG). Nesse mtodo, alquotas secas de mel eram tratadas com o cido n-butanobornico em piridina de modo que os monossacardios eram convertidos em derivados n-butanobornicos cclicos. Subseqentemente, a trimetilsililao produzia derivados volteis separveis pela CG. A grande vantagem desse mtodo era fornecer picos nicos para a frutose e a glicose das amostras de mel e nctar estudadas. Os mtodos de CG que utilizavam apenas a trimetilsililao geravam picos mltiplos para esses compostos, o que prejudicava consideravelmente sua quantificao11,12,13,14,15. Apesar da vantagem mencionada acima e da boa reprodutibilidade do mtodo em questo, ainda necessrio estabelecer a exatido do mesmo. A determinao de frutose e glicose por CG tambm pode ser realizada de modo vantajoso transformando esses monossacardios em seus derivados de trimetilsililoxima com base em uma tcnica desenvolvida em 197716 e modificada posteriormente17. Pela aplicao dessa tcnica modificada, a frutose e a glicose renderam (cada uma separadamente) apenas um pico, j que os ismeros de cada um desses glicdios no foram separados pela coluna usada no estudo (coluna empacotada OV-17). A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) tambm pode ser empregada de modo eficaz para a anlise dos dois monossacardios em questo. Nesse contexto,

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podemos destacar o emprego da cromatografia de troca aninica em conjunto com um detector amperomtrico18 e da cromatografia de fase normal (Supelcosil-NH2, Lichrosphere5-NH 2, etc.) com uma mistura de acetonitrila e gua como eluente e um detector de ndice de refrao (IR)19,20. Alm da frutose e da glicose, a presena do monossacardeo D-galactose, em quantidades traos, tambm j foi relatada em amostras de mel21. Entretanto, importante ressaltar que esse monossacardeo quando na sua foram livre considerado um composto txico para as abelhas3 . COMPOSIO H vrios estudos sobre a composio da frao monossacardica do mel. Em um trabalho, 21 amostras de mel dos EUA foram examinadas e os valores mdios encontrados para glicose e para frutose foram, respectivamente, 32,29g %* 39,28g %8 . White e colaboladores22 , acreditando que maiores conhecimentos respeito das fontes florais, idade, rea de produo e ano de colheita de amostras de mel poderiam ser teis para os produtores, realizaram um amplo estudo com 504 amostras de mel (82 tipos florais simples e 93 combinaes de composio conhecida) de 47 estados norte-americanos. Os teores mdios de glicose e frutose encontrados nesse estudo para mis florais foi de 31,28g % e 38,19g %, respectivamente. J para os 14 mis de melato presentes, os teores mdios de glicose e frutose foram 26,08g % e 31,80g %, respectivamente. Em 196823 , experimentos que empregavam a CG foram conduzidos com o intuito de verificar a reprodutibilidade desse mtodo na anlise quantitativa de glicdios do mel. Para a realizao desses experimentos os glicdios tiveram que ser convertidos em seus derivados volteis de per(trimetilsilil). Quatro determinaes diferentes em uma amostra de melato forneceram os seguintes valores para a D-frutose: 36,7g %; 37,0g %; 36,8g % e 37,2g %. J para a D-glicose os valores relatados foram os seguintes: 27,8g %; 28,0g %; 27,5g % e 28,0g %. Em um outro estudo, vrios mis de diferentes partes do Canad foram avaliados com o intuito de se padronizar os mis desse pas3. As anlises foram conduzidas separando-se os glicdios atravs de cromatografia em papel, eluindo-se quantitativamente e determinando-se seus teores espectrofotometricamente por um mtodo descrito previamente24,25. Os dados obtidos para 95 amostras analisadas mostraram que apenas 4,2 % dos mis possuam o teor de monossacardios abaixo de 65g %, 32,6 % entre 65g % e 70g % e 63,2 % acima de 70g %. Nesses mis o teor mdio de frutose (37,1g %) foi significativamente maior do que o teor mdio de glicose (33,7g %). Alguns autores10 empregaram a CG e uma tcnica de derivatizao na qual os monossacardios eram tratados com o cido butanobornico em piridina antes da etapa de trimetilsililao. Valores apreciavelmente mais elevados do que os normalmente citados na literatura3 , foram encontrados. Por exemplo, em trs das quatro amostras de mel analisadas o contedo de frutose foi relatado como sendo superior a 40g % e, em um caso, o contedo de glicose foi de 40,6g %. Segundo Siddiqui, o limite de 65g % para o teor de acar invertido (D-glicose + D-frutose) abrange todos ou, pelo menos, a maioria dos mis originrios de nctar3 . Nesse contexto, os mis poliflorais apresentam contedos de D-frutose e D-glicose em propores quase iguais. Por outro lado, mis monoflorais como o mel de slvia e de castanha doce contm, de modo significativo, mais D-frutose do que Dglicose26,22. J os mis de melato so pobres em ambas as hexoses22. Mis ricos em D-glicose so raros, p. ex., o mel de colza26,22. Os teores de frutose e glicose so os principais responsveis pelo tipo de desvio que o mel produz no plano da luz polarizada. De modo geral, como nos mis florais h
* g% significa gramas do glicdeo em cada 100 gramas da amostra.

predominncia de frutose, estes devem ser levorotatrios. J o melato e alguns mis adulterados so geralmente dextrorotatrios. No estudo de Perez-Arquillu e colaboradores27, a maior parte das amostras (85,2 %) foi classificada como levorotatria e apenas quatro amostras com teores elevados de sacarose (3,21g % em mdia), foram classificadas como dextrorotatrias. Usando uma tcnica de CG-DIC, baseada originalmente em um mtodo descrito na literatura16 que foi posteriormente modificado28 , no qual derivados de trimetilsililoximas de glicdios eram separados e quantificados, esses mesmos autores27 determinaram que os valores mdios para os teores de frutose e glicose de 27 amostras de mel de alecrim da Espanha foram de 36,6g % e 31,2g %, respectivamente. Para esses mis, a razo frutose/glicose (F/G) foi de 1,17, uma proporo que estava levemente fora da faixa proposta anteriormente29 para mis do tipo alecrim (1,06 - 1,13). Em um outro trabalho18, usando a cromatografia de troca aninica em conjunto com um detector amperomtrico, foram encontrados valores mdios de 36,2-38,5g % e 33,2-40,0g % para frutose e glicose, respectivamente, em quatro tipos diferentes de mel. Um estudo realizado com diferentes mis (p. ex., accia, tlia, castanha doce, girassol, eucalipto, slvia, asclpsia e melato), utilizando um sistema de CLAE composto de uma coluna de gel de slica ligada a grupos amino (Supelcosil-NH2 , 250 x 4.6 mm, partculas de 5 m de tamanho), acetonitrila:gua (83:17 - v/v) como fase mvel e um detector de IR, mostrou que o mel de accia possua o maior teor de frutose (49,59g %) e o menor teor de glicose (30,44g %) entre os mis estudados19. Consequentemente, o mel de accia se caracteriza por uma razo F/ G elevada19. Esses dados esto em concordncia com estudos descritos previamente na literatura30. Em outro estudo, a composio de glicdios dos mis monoflorais mais importantes da Espanha (alecrim, flor de laranjeira, alfazema, girassol, eucalipto, urze e melato) foi analisada31 . Os monossacardios foram determinados por CG aps a obteno de derivados de trimetilsililoxima seguindo uma tcnica descrita anteriormente16 o qual foi modificada alguns anos depois17. Os mis de melato apresentaram concentraes baixas de frutose (34,3g %). Em compensao, os nveis de frutose foram elevados nos mis de eucalipto, alfazema e, especialmente, nos mis de girassol (mdia = 39,4g %). J os mis de flor de laranjeira, alecrim e urze apresentaram nveis de frutose intermedirios. Com relao ao teor de glicose, os mis de melato apresentaram um valor mdio baixo (25,8g %), o mel de girassol apresentou um valor elevado (35,4g %) e os demais tipos de mel ficaram em situao intermediria. A observao de que os mis de girassol apresentavam os maiores contedos para ambas as hexoses estava em concordncia com a composio de monossacardios dos nctares da famlia Asteraceae32. O contedo de monossacardios foi analisado em 74 mis de diferentes tipos florais correspondentes a 14 estados brasileiros20 . Nesse estudo, a CLAE foi utilizada conforme um trabalho anterior, sendo composta de uma coluna de fase amino e detector de IR33. Os contedos de frutose e glicose das amostras analisadas estavam na faixa de 22,8 - 47,2g % e 24,0 38,7g %, respectivamente. Esses valores foram considerados similares aos valores encontrados para mis de outras origens geogrficas4,27. A soma da frutose com a glicose mostrou que 97% dos mis analisados estavam dentro do limite (> 60 g/100 g) sugerido anteriormente para a Europe Union and Codex Alimentarius Standards34 . ORIGEM O mel uma soluo concentrada de dois monossacardios: D-frutose e D-glicose. Para entender a origem desses monossacardios nos mis florais necessrio conhecer a composio de glicdios do nctar. Em 188635, j se tinha evidncias da presena de D-frutose, D-glicose e sacarose no nctar. Alm

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de se conhecer a composio de glicdios do nctar usado pelas abelhas para produzir o mel, tambm necessrio entender a ao da enzima invertase que catalisa a hidrlise da sacarose liberando frutose e glicose. Percival36 examinou 889 espcies de plantas e encontrou trs padres de composio de glicdios para o nctar: (a) nctar com alto teor de sacarose, (b) nctar com quantidades aproximadamente iguais de glicose, frutose e sacarose e (c) nctar com alto teor de glicose e frutose. O nctar com sacarose dominante foi associado a flores de tubos longos nos quais o nctar era protegido (trevos), enquanto as flores abertas continham geralmente apenas glicose e frutose. Essas descobertas confirmaram estudos anteriores37,38,26 que sugeriram uma relao entre a taxa desses trs glicdios e as diferentes espcies de flor. Em um outro estudo, os nctares foram divididos em quatro classes diferentes em funo da razo sacarose/hexose (S/H): sacarose dominante (S/H > 0,999), rico em sacarose (0,5 < 0,999), rico em hexose (0,1 < 0,499) e hexose dominante (S/H < 0,1) 32 . No caso dos mis de melato, devemos conhecer a composio de glicdios da excreo dos insetos que sugam o fludo do floema (vaso condutor de material orgnico nas plantas)3 . Os depsitos das excrees de afdios usados para a produo de melato foram analisados por vrios grupos e foram sugeridas evidncias de que esses depsitos so misturas de glicdios um pouco mais complexas do que aquelas do nctar. Sabe-se que a glicose, a frutose, a sacarose e a melezitose so constituintes dessas excrees de afdios39,40,22. Com base no que foi relatado acima, fcil perceber que a frutose e a glicose existentes no mel podem j estar presentes, em maior ou menor grau, nos substratos utilizados para gerar esse produto ou podem ser produzidos pela inverso da sacarose atravs da ao da enzima invertase. IMPORTNCIA Os teores de frutose e glicose so extremamente importantes para o estabelecimento de uma srie de caractersticas do mel. A glicose, por exemplo, o monossacardeo responsvel pela granulao do mel. O maior problema resultante dessa precipitao de glicose o aumento do teor de umidade da fase lquida que permite que clulas de leveduras osmoflicas (microorganismos que se desenvolvem em condies desfavorveis: atividade de gua baixa e concentrao de glicdios alta), que ocorrem naturalmente no mel, se multipliquem e provoquem a fermentao do produto. Em um trabalho, foram obtidos resultados em relao solubilidade da glicose em solues de frutose41 . As concentraes dos glicdios foram similares s encontradas no mel. Foi verificado que a glicose se tornava mais solvel a medida que a concentrao de frutose aumentava. A explicao fornecida para essa observao foi baseada em um equilbrio entre a glicose anidra e a glicose monoidratada (a forma encontrada no mel granulado). Foi sugerido que em nveis de frutose elevados, o equilbrio favorece a forma anidra da glicose, que apresenta uma maior solubilidade em gua41. A importncia desse equilbrio para a granulao foi sustentada por um outro autor que observou que em solues saturadas com frutose, a temperatura de transio da glicose monoidratada para a glicose anidra estava abaixo de 30oC42. Pode-se concluir, ento, que mis com teores de frutose elevados e baixos teores de glicose so menos suscetveis granulao, fenmeno este que diminui a aceitao desses produtos naturais por parte dos consumidores. Outros autores22 demonstraram estatisticamente que a tendncia de granulao poderia ser estimada atravs da razo glicose/gua (G/A), descrita em um trabalho anterior43, ou da razo G-A/F (G, glicose; F, frutose; A, gua). Foi demonstrado que a razo G/A fornecia a relao mais significativa com a tendncia de granulao. Alm disso, a obteno desse ndice necessitava apenas da

determinao do teor de glicose e do teor de umidade. Razes G/A de 1,70 e inferiores estavam associadas a no granulao do mel, enquanto valores de 2,10 e superiores indicavam uma rpida granulao. Entretanto, um estudo com 54 amostras de mel de todo o mundo sugeriu que existe apenas uma correlao vaga entre a razo G/A ou F/A e a tendncia de granulao15. Foi descoberto que em apenas 40 - 50% das amostras a granulao podia ser prognosticada a partir dessas razes. Um outro autor, trabalhando com uma grande quantidade de amostras do Canad (95 amostras), confirmou a ineficcia desses ndices para o prognstico da granulao em mis3. Expressando os resultados obtidos por cromatografia em papel atravs das razes F/G, (G-A)/F e G/A e comparando esses dados com a taxa de granulao observada para cada amostra durante 6 meses atravs de um mtodo descrito na literatura22, no foi encontrada para essas amostras uma relao entre a taxa de granulao e qualquer um dos ndices usados3 . Foi sugerido, ento, que o fator verdadeiramente envolvido com a granulao seria a presena ou ausncia de grmens de cristalizao. A acidez do mel tambm est fortemente associada ao monossacardeo D-glicose. Esse monossacardeo convertido, atravs da ao da enzima D-glicose oxidase, no cido glicnico44. Esse cido constitui de 70 a 90% dos cidos orgnicos do mel45,46. A acidez do mel regida pela presena desse cido e de sua lactona. Durante o processo de converso da D-glicose no cido D-glicnico ocorre, tambm, a formao do perxido de hidrognio (H 2O 2) 44. Sabe-se agora que a inibina, nome dado a uma substncia com propriedades antibacterianas no mel, na realidade o perxido de hidrognio. Outra importante funo encontrada para os monossacardios do mel a utilizao, de modo complementar anlise polnica, na identificao de determinados tipos de mis. Com esse intuito o teor de frutose, o teor de glicose e a relao F/G podem ser empregados. Fldhzi19 , por exemplo, estudou a composio de vrios mis atravs de um sistema de CLAE e percebeu que os mis em estudo poderiam ser classificados em 5 grupos em funo do teor de frutose: mel de accia ( 49g %), asclpsia, slvia, castanha doce e mis florais misturados (45 46g %), tlia, girassol e mis de eucalipto (42 43g %), mel de crista de galo ( 36g %) e mel de melato ( 32g %). Ao estudar alguns mis de alecrim da Espanha, alguns autores sugeriram que a razo F/G poderia ser utilizada para distinguir mis de diferentes origens botnicas27. Esse parmetro apresentou uma variao consideravelmente baixa entre as amostras (DP = 0,05). Em um outro trabalho, foram estudados os principais mis uniflorais da Espanha (alecrim, flor de laranjeira, alfazema, girassol, eucalipto, urze e melato)31. Utilizando o Teste de Tukey (P = 0,95) os autores organizaram os mis em uma variedade de padres que dependia do glicdeo sob considerao. Com base no teor de frutose, o teste de Tukey forneceu um grupo nico para os mis de melato. De acordo com o contedo de glicose trs grupos foram bem separados pelo teste de Tukey: mis de melato, mis de girassol e demais tipos de mel em estudo. A razo F/G dividiu a populao de mis estudados em quatro grupos de acordo com o mtodo de Tukey, embora cada um tenha se sobreposto com pelo menos dois outros grupos devido a ampla distribuio desse parmetro. Nesse caso, os mis de melato e de urze, com as maiores razes F/G, formaram um grupo que no se sobreps ao grupo dos mis de girassol e alecrim, com razes F/G menores. As razes F/G para os mis de flor de laranjeira e eucalipto da Espanha foram superiores aos valores noticiados para os mis florais italianos47 , mas esto em concordncia com os dados publicados previamente para os mis de eucalipto australianos48. A razo G/A forneceu trs grupos de acordo com o teste de Tukey. O grupo dos mis de eucalipto e girassol apresentou valores que foram significativamente superiores aos valores dos outros tipos de mis. Os mis de alfazema formaram um grupo nico, com razes G/A intermedirias. As

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razes G/A elevadas dos mis de girassol da Espanha se correlacionaram bem com seus nveis elevados de glicose e suas umidades baixas, uma vez que eles so mis de vero, reunidos e colhidos em reas quentes da Espanha. A razo G/ A elevada dos mis de eucalipto devido principalmente a seu baixo contedo de gua. Dentre outros parmetros, o teor de frutose, glicose e a razo G/A foram selecionados, pelo programa de anlise de discriminao usado neste trabalho, como os ndices mais valiosos para estabelecer uma classificao acurada das amostras de mel em funo de sua origem. Esses mesmos autores31 publicaram um segundo trabalho que mostrou que o teor de frutose foi um dos principais parmetros discriminadores dos sete tipos de amostras de mis monoflorais comerciais da Espanha49. Alguns autores estudaram 74 mis de diferentes tipos florais correspondentes a 14 estados brasileiros20 . Dessa vez, o teor de frutose, o teor de glicose e a razo F/G foram os ndices mais importantes para a caracterizao dos mis em funo de suas regies de origem. Por exemplo, entre as regies brasileiras o maior contedo de frutose foi encontrado nos mis de eucalipto do sudeste. De modo contrrio, foi relatado que os mis de eucalipto da Zona da Mata (estado de Minas Gerais - regio sudeste) apresentavam um nvel de frutose baixo50. Em relao ao valor mdio de frutose, glicose e razo F/G, no houve diferena significativa (p < 0,05) entre as regies brasileiras20. Entretanto, os mis de eucalipto do estado de So Paulo apresentaram um valor mdio para a frutose (44,2g %) consideravelmente maior do que aqueles de outros estados brasileiros (40,2 - 41,3g %) e daqueles produzidos na Espanha (37,0 - 39,2g %)31 . Consequentemente, os autores sugeriram que os mis de eucalipto do estado de So Paulo poderiam ser caracterizados com base em seu contedo de frutose20. Apenas duas amostras do estado da Paraba apresentaram a razo F/G abaixo de 1, fato que foi associado ao baixo teor de frutose (< 30g %). Como estabelecido em um trabalho anterior, as amostras de mel com uma razo F/G menor do que 1 poderiam ser classificadas como mis adulterados51. Por outro lado, uma atividade metablica peculiar de leveduras osmoflicas que, quando elas crescem em alimentos que contm alguns glicdios simples como uma fonte de carbono, a frutose preferencialmente assimilada; essa propriedade denominada de frutofilia52. Uma vez que esse tipo de levedura cresce em mis com umidade acima de 20 % e, tambm, em regies de clima favorvel (temperaturas anuais altas), foi sugerido que esses microrganismos foram responsveis pela diminuio da razo F/G nos dois mis da Paraba20 . De fato, durante a anlise microscpica para a identificao polnica, foi evidenciada a presena de leveduras nesses mis. Portanto, uma razo F/G abaixo de 1 poderia ser originria de adulterao com acar comercial queimado ou do crescimento de leveduras osmoflicas. Alm disso, reaes no enzimticas como p. ex., a de reverso (condensao de monossacardios por catlise cida) poderiam ocorrer temperatura ambiente e em pH baixo, favorecendo a formao de oligossacardios com concomitante perda de frutose22. No mesmo trabalho foi ressaltado que em pH baixo tambm pode ocorrer a formao de anidridos difrutosdicos. OLIGO- E POLISSACARDIOS INTRODUO No incio do sculo 20, a composio de glicdios no mel era considerada como uma mistura de glicose, frutose e sacarose. A partir da dcada de 20, foram obtidas evidncias da presena de maltose em mis florais atravs da formao de sua osazona caracterstica53. Entretanto, outros autores54,55 concluram que as evidncias obtidas por Elser53 no eram suficientes para se considerar a maltose como um constituinte do mel. Mais tarde, foi demonstrado a presena de pelo menos 15

componentes, entre eles: maltose, turanose, isomaltose e melibiose56. Outros autores, baseados nos resultados obtidos por eletroforese em papel e espectroscopia por infravermelho, confirmaram a presena de maltose e a ocorrncia de outros dissacardeos (ex. maltulose, turanose)21,57. Em um outro trabalho, os glicdios foram isolados em coluna de carvo e 22 componentes foram detectados, dos quais 15 foram classificados como cetoses58. A identificao inequvoca de oligossacardios foi conduzida em um outro estudo, atravs da formao de octacetatos cristalinos, no qual a maltose, a nigerose, a isomaltose e a kojibiose (sugerida pela primeira vez como um dos oligossacardios do mel) foram detectadas59. A presena de leucrose tambm j foi descrita59, porm, no foi confirmada em trabalhos subsequentes18,19,31,60,61,62. Um fracionamento em larga escala foi conduzido atravs do uso de coluna de carvo-celite, separao por cromatografia em papel e, em menor grau, por eletroforese em papel, revelao com reagentes especficos, identificao das osazonas caractersticas e, em alguns casos, obteno de espectros na regio do infravermelho60,63. Estes autores identificaram 24 oligossacardios, com a descrio pela primeira de vez de 2 dissacardeos: gentiobiose e laminaribiose. A presena desses 2 dissacardes foi confirmada em estudos subsequentes18,61. Em um trabalho, foi sugerida a presena de , -trealose (neotrealose)60, entretanto, nenhum outro autor detectou at o momento esse dissacardeo no mel. Nem a , -trealose (trealose) nem a neotrealose foram detectadas de maneira inequvoca no mel, embora, a trealose seja um constituinte importante da frao glicdica do fluido circulante de abelhas operrias, rainhas e zanges64. A identificao de oligossacardios com resduos de galactose ( -galactosdeos) tem sido motivo de controvrsia na literatura. Alguns autores no encontraram vestgios da presena de -galactosdeos13,18,60,61,63. Apesar disto, a melibiose tem sido identificada por diferentes autores23,56,62,65. A CG-DIC foi usada para o estudo de oligossacardios do mel atravs da combinao das reaes de reduo com boroidreto de sdio e trimetilsililao com N-trimetilsililimidazol61 ou formao de um derivado ter trimetilsililoxima dos glicdios a partir da reao com hexametildisilazano e hidroxilamina31 . As maiores limitaes para o uso desta tcnica so: a formao de espcies tautomricas dos glicdios redutores e a necessidade de formao de um derivado voltil do glicdeo. Mesmo assim, foram identificadas pela primeira vez a celobiose e a palatinose, esta ltima confirmada por ressonncia magntica nuclear-carbono 1361. Enquanto a celobiose no foi detectada por outros autores, a palatinose foi detectada em uma amostra de mel de alfafa18. A CLAE foi usada a partir da dcada de 90 para anlise de oligossacardios no mel18,19,62 . Alguns autores usaram coluna de fase amino e detector de IR. As maiores limitaes foram: a resoluo dos oligossacardios e a sensibilidade do detector19,62. Em um outro trabalho, foram utilizadas duas colunas de troca aninica acopladas em srie e um detector amperomtrico, o qual mais sensvel que o de IR, para analisar oligossacardios18. Esta ltima tcnica mostrou-se mais adequada para anlise de glicdios no mel porm, o custo bem mais elevado em comparao com a metodologia de CLAE composta de fase amino e detector de IR. Alm do mais, embora a resoluo tenha melhorado bastante com o uso das 2 colunas de troca aninica em srie, os autores no conseguiram separar os pares isomaltose/maltulose, maltose/1cestose e turanose/gentiobiose18 . Ao todo 15 dissacardeos foram descritos na literatura como constituintes da matriz mel. Alguns dissacardeos, entretanto, ainda carecem de estudos mais detalhados para sua confirmao como glicdios do mel. Na Tabela 1 apresentada uma listagem dos dissacardeos do mel descritos na literatura. As primeiras evidncias da presena de trissacardeos em mis florais foram sugeridas por diferentes autores21,66,67,68. Somente a partir de um trabalho executado em larga escala

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Tabela 1. Listagem de di- e trissacardios descritos no mel. nome trivial dissacardios celobiose gentiobiose isomaltose isomaltulose kojibiose laminaribiose leucrose maltose maltulose melibiose neotrealose nigerose palatinose sacarose turanose trissacardios centose 1-cestose erlose 4- -gentiobiosilglicose 3- -isomaltosilglicose isomaltotriose isopanose laminaritriose maltotriose melezitose panose rafinose teanderose nome sistemtico O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-D-frutofuranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 2)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 5)-D-frutopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-D-frutose O- -D-galactopiranosil-(1 -> 6)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil- -D-glicopiranosdio O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-D-frutose O- -D-glicopiranosil- -D-frutofuranosdio O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-D-frutose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 2)-D-glicopiranose O-a-D-glicopiranosil-(1 -> 2)- -D-frutofuranosil-(1 -> 2)- -D-frutofuranosdio O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)- -D-glicopiranosil- -D-frutofuranosdio O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-D-glicopiranose O- -D-glicopiranosil-(1 -> 3)-O- -D-frutofuranosil-(2 -> 1)- -D-glicopiranosdio O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)-O- -D-glicopiranosil-(1 -> 4)-D-glicopiranose O- -D-galactopiranosil-(1 -> 6)-O- -D-glicopiranosil- -D-frutofuranosdio O- -D-glicopiranosil-(1 -> 6)- -D-glicopiranosil- -D-frutofuranosdio

Informaes extradas da literatura: celobiose e palatinose61, laminaritriose18 , rafinose62 e outros glicdios3,4.

que houve a confirmao da presena de trissacardeos no mel63. Foi noticiada a identificao inequvoca de 9 trissacardeos e sugerida a presena de outros dois: a 3- -isomaltosilglicose e a 4- -gentiobiosilglicose as quais no receberam nomes triviais. A concentrao em coluna de carvo-celite, a separao por cromatografia e eletroforese em papel e a cromatografia em camada fina combinada com hidrlise cida e enzimtica foram os procedimentos usados. A melezitose, 3- -isomaltosilglicose, maltotriose e isomaltotriose foram caracterizadas como undecacetatos cristalinos63 . A melezitose e a maltotriose tm sido identificadas por diferentes autores18,19,27,31,61,62,69. Aps a identificao de isomaltotriose em um estudo prvio63, somente Swallow e Low18 , usando CLAE composta de detector amperomtrico e coluna de troca aninica, foram capazes de detectar esse trissacardeo em mis de alfafa e trevo hbrido. A identificao de 3- -isomaltosilglicose e 4- -gentiobiosilglicose carece de outros estudos para sua confirmao ou no como trissacardeos presentes no mel. Em um trabalho pioneiro67, a erlose foi caracterizada pela primeira vez em mis florais e confirmada em vrias publicaes subsequentes18,19,27,31,61,63. Siddiqui e Furgala63 identificaram a 6- -glicosilsacarose (teanderose) ao verificarem que o trissacardeo isolado do mel, quando submetido hidrlise parcial com cido sulfrico e amiloglicosidase, apresentava um perfil de dissacardeos idntico a um padro autntico de teanderose sujeito as mesmas condies de hidrlise. Um derivado peracetilado foi obtido para cada um e, ambos os derivados apresentaram comportamentos similares quando submetidos cromatografia em camada fina. A teanderose foi assim denominada em homenagem ao Dr. O. Theander que foi o primeiro a isolar este trissacardeo em Aspergillus Niger70. A teanderose foi detectada em diferentes amostras de mis

monoflorais por outros autores18,61. Tanto a 2 -maltosilglicose (centose) como a 1-cestose foram identificadas e descritas somente uma vez no mel63. As ligaes entre os monossacardios foram estabelecidas pela caracterizao dos steres metlicos de glicdios obtidos aps as reaes de metilao e hidrlise dos trissacardeos. No caso da 1-cestose, a utilizao da CLAE no permitiu a sua separao da maltose18 ; enquanto, que pela CG, um padro deste trissacardeo foi bem separado61. Entretanto, os ltimos autores no identificaram 1-cestose em amostras de mel. Tanto a panose como a isopanose foram detectadas e identificadas em trabalhos diferentes 18,61,62,63, sendo que na penltima referncia62 somente a panose foi identificada. As vantagens e desvantagens da CLAE e CG para anlise de trissacardeos em mel so as mesmas das encontradas para determinao de dissacardeos. A presena de laminaritriose no mel foi descrita na literatura18. Foi encontrado somente traos deste trissacardeo em mel de alfafa. No h qualquer outra meno na literatura sobre a identificao deste trissacardeo em amostras de mel. A rafinose foi sugerida pela primeira vez em uma publicao56 e descrita em trabalhos subsequentes68,71 . Entretanto, a presena de rafinose no mel foi contestada devido ausncia de galactose como um monossacardeo constituinte do mel63. O argumento usado nesse ltimo trabalho foi que a cromatografia em papel usada para identificar a rafinose no seria suficiente para confirmar a presena deste trissacardeo, j que ele tem comportamento similar a teanderose. Como j mencionado na seo dissacardeos, alguns autores no identificaram -galactosdeos no mel13,18,61. Entretanto, em um outro trabalho, foram analisados 87 mis provenientes de vrias regies dos EUA onde constatou-se a presena de resduos de galactose em todas as amostras72. Esses autores usaram galactose oxidase para

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oxidar resduos de galactose terminal com a hidroxila da posio 6 livre o qual caracterstico da rafinose. Alm do mais, a rafinose tem sido identificada por diferentes autores atravs da CLAE usando coluna amino e detector de IR62 e da CG-DIC31,73. Um total de 13 trissacardeos foi detectado no mel, porm, alguns necessitam de estudos adicionais para sua confimao como constituintes do mel. Na Tabela 1 apresentada uma listagem dos trissacardeos do mel descritos na literatura. Alm de di- e trissacardeos j identificados no mel, alguns autores tem sugerido a presena de outros oligossacardios e tambm de polissacardios. Foi noticiada a presena de um tetrassacardeo e de um pentassacardeo em uma amostra de mel do Canad63. As evidncias para identificao da isomaltotetraose e da isomaltopentaose foram baseadas no perfil de tri-, di- e monossacardios obtidos aps hidrlise parcial com cido sulfrico e com amiloglicosidase e na determinao das rotaes especficas de cada um. Embora os componentes coloidais do mel sejam pouco estudados seus efeitos indesejveis so descritos desde a dcada de 3074,75,76. A tendncia do mel turbidez, caramelizao e cristalizao seria aumentada pela presena de colides. Essas substncias foram identificadas como cras, agregados de protenas e polissacardios. Helvey77, usando eletroforese em papel e anlise de sedimentao em mel de trigo sarraceno obteve trs polmeros: duas protenas e um polissacardeo, sendo este ltimo o componente minoritrio com massa molecular de cerca de 9.000Da. Um estudo detalhado da frao polissacardica de um mel do Canad foi descrita na literatura78 . A hidrlise cida do polissacardeo rendeu trs monossacardios: D-manose, D-galactose e L-arabinose (razo 1,0:4,04:2,04). A hidrlise parcial seguida de reao de metilao rendeu 7 fragmentos que foram caracterizados por completo. Foi concludo que o polissacardeo era constituido de 22-23 resduos de monossacardios que consistiam de 6 resduos terminais no redutores compostos de: 3 D-manose, 2 D-galactose e 1 Larabinose; 5 a 6 resduos de D-galactose compondo a parte ramificada do polissacardeo atravs das ligaes O-3 e O-6; 11 unidades no terminais consistindo de 6 resduos de Dgalactose unidos pela ligao (1 -> 6); 5 resduos de Larabinose onde 4 foram unidos pela ligao (1 -> 5) e/o (1 -> 4) e 1 unido pela ligao (1 -> 3)68. A rpida difuso do polissacardeo em uma ultracentrfuga possibilitou estimar a sua massa molecular em menos de 10.000. Infelizmente, nenhum estudo foi realizado para formular a estrutura qumica deste polissacardeo. Foi noticiada a presena de outros polissacardios, contudo, o isolamento e a caracterizao no foi possvel devido as pequenssimas quantidades destes componentes no mel3 . COMPOSIO Embora a frao dissacardica seja complexa no mel, no existem muitos estudos sobre a sua composio nessa matriz alimentcia. Em um outro estudo, foram examinados 21 mis monoflorais dos EUA onde foram encontrados 7,11 % de maltose, 1,62 % de sacarose e 1,03 % de uma frao glicdica desconhecida8. Os glicdios foram adsorvidos em coluna de carvo-celite e seletivamente eludos a partir de um gradiente de etanol. Nesse trabalho, a maltose foi expressa pelo contedo de dissacardeos redutores determinados pela reduo do on cprico a cuproso e a sacarose foi estimada atravs do aumento do poder redutor da frao aps hidrlise cida. Portanto, esses resultados superestimaram o contedo de maltose e sacarose em mis dos EUA. A composio de dissacardeos individuais s foi melhor desvendada a partir de um trabalho que foi mencionado anteriormente60 . Foi estimada a distribuio percentual de dissacardeos a partir do contedo total de oligossacardios (3,65 %) em base seca e obtido os seguintes resultados para mis do Canad: 29,4 % de maltose; 8,2 % de

kojibiose; 4,7 % de turanose; 4,4 % de isomaltose; 3,9 % de sacarose; 3,1 % de maltulose + isomaltulose; 1,7 % de nigerose; 1,1 % de neotrealose; 0,4 % de gentiobiose e 0,09 % de laminariobiose. Outros autores, analisando 54 mis comercializados na Sua atravs da tcnica de CG, identificaram a sacarose e a maltose e sugeriram a presena de outros 4 dissacardeos os quais no foram caracterizados73. O contedo mdio de sacarose e maltose foi 0,64 % e 9,07 %, respectivamente. Um estudo envolvendo 490 amostras de mel foi realizado nos EUA22 . Esses autores encontraram valores mdios de 2,74-15,98 % para maltose, 0,25-7,57 % para sacarose e uma frao desconhecida de oligossacardios foi estimada ao redor de 0,13-8,49 %. A distribuio de dissacardeos em 6 mis do Canad foi estudada atravs da CG61. Nesse trabalho, os glicdios foram expressos em relao a maltose, o qual foi o oligossacardeo majoritrio. Foi obtida a seguinte ordem decrescente: maltose (100 %), turanose (49 %), kojibiose (45 %), palatinose (36 %), sacarose (34 %), laminaribiose (28 %), gentibiose (22 %), celobiose (19 %), isomaltose (16 %), neotrealose (15 %), nigerose (10 %). Comparando esse trabalho61 com um outro estudo63, ambos analisando mis do Canad, pode-se inferir que dos 5 dissacardeos mais abundantes 4 (maltose, turanose, kojibiose e sacarose) foram consensuais, embora, o tamanho da amostragem e a metodologia tenham sido bastante diferentes. Em um trabalho61 foram identificados e quantificados 11 dissacardeos enquanto em um outro73 apenas 2, ambos usaram a tcnica de CG. O cromatograma pobre obtido no ltimo trabalho seria devido a formao de oximas por reao dos glicdios com hidroxilamina, antes da reao de sililao, o qual reduz apreciavelmente a resoluo dos glicdios73. Em contrapartida, no outro trabalho61 , os glicdios foram reduzidos com boroidreto de sdio, obtendo-se os alditis correspondentes antes da reao de trimetilsililao. A mesma limitao na resoluo de glicdios, com a formao de derivados oxmicos, foi obtida por Mateo e Bosch-Reig31 ao analisarem 85 mis monoflorais oriundos de diferentes regies da Espanha. Neste trabalho, a composio mdia de dissacardeos foi: 4,62g % de maltose; 2,23g % de kojibiose; 1,43g % de maltulose; 1,22g % de sacarose e 0,72g % de isomaltose. A maltose eluiu juntamente com a turanose e nigerose e, portanto, incluiu a contribuio desses 2 dissacardeos. Nem a trealose nem a melibiose foram detectadas31. Em trabalho anterior27, foi usado CG para analisar derivados de ter trimetilsililoxima, obtendo-se valores mdios de 7,2g % para maltose e 1,97g % para sacarose em 27 amostras de mel de alecrim da Espanha. A mdia para maltose foi maior do que a obtida por outros autores (3,9g %) 31,65. Em um estudo, foi usado CLAE com detector amperomtrico e coluna de troca aninica para estudar os oligossacardios de 4 mis monoflorais do Canad18 . Foram obtidos os seguintes resultados mdios: maltose/1-cestose (1,01g %), sacarose (0,67g %), kojibiose (0,40g %), nigerose (0,32g %), isomaltose/maltulose (0,27g %), laminaribiose (0,1g %), palatinose e neotrealose (traos) e melibiose (no detectado). No caso do mel de canola, a sacarose apresentou um valor mdio muito baixo (0,046g %); somente traos de laminaribiose foram achados no mel de trevo hbrido; no mel alfafa foi achado 0,067g % de palatinose. Como j observado em trabalhos anteriores31,61,63, a maltose, a kojibiose e a sacarose foram os dissacardeos predominantes18. A CLAE com detector de IR e coluna de fase amino foi usada para anlise de 34 mis mono- e poliflorais da Hungria19 . Foram encontrados valores mdios de 3,78g % para maltose, 2,17g % para turanose, 0,86g % para sacarose e 0,68g % para isomaltose. Em um outro trabalho, empregou-se a mesma tcnica para quantificar 6 dissacardeos em 70 mis de diferentes estados brasileiros62. A maltose (mdia = 3,05g %) foi o dissacardeo majoritrio com valores similares aos dos mis da Espanha (mdia = 3,96g %)31 e aos

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dos mis da Hungria (mdia = 3,36g %)19 , porm, com valores superiores aos dos mis do Canad (mdia = 1,07g %)60 e aos dos mis dos EUA (mdia = 1,01g %)18. Nesse estudo realizado no Brasil, foram achados valores mdios de 0,78-2,03g % e 1,11-2,81g % para turanose e nigerose, respectivamente62 . Os valores mdios de melibiose ficaram no limite de 0,050,15g %, bem inferiores aos dos outros dissacardeos. A distribuio de sacarose e isomaltose foi ampla, alcanando valores mdios de 0,07-0,77g % e 0,18-0,71g %, respectivamente. O contedo de sacarose dos mis brasileiros ficou dentro dos limites impostos pelo European Codex Honey Standards ( 5g/100g para mis em geral; at 10g/100g para mel de flor de laranjeira) e pela Legislao Brasileira ( 10g/100g)62 . O estado atual do conhecimento permite classificar os dissacardeos do mel em 4 grupos, com base na identificao inequvoca e na distribuio quantitativa: 1-majoritrio: maltose, kojibiose, turanose, sacarose 2-minoritrio: isomaltose, maltulose, nigerose, palatinose, gentiobiose, celobiose 3-traos: laminaribiose, neotrealose 4-carece de confirmao: leucrose, isomaltulose, melibiose Apesar da frao trissacardica estar em menor concentrao no mel sua complexidade equivalente a da frao dissacardica. O primeiro trabalho que apresentou dados quantitativos sobre trissacardeos foi publicado no final da dcada de 6063. Esses autores, a exemplo do que fizeram na anlise de dissacardeos, expressaram o contedo dos trissacardeos individuais, em 95 mis canadenses, em relao ao total de oligossacardios (3,65g %), apresentando os seguintes resultados: erlose (4,5 %), teanderose (2,7 %), panose (2,5 %), maltotriose (1,9 %), 1-cestose (0,9 %), isomaltotriose (0,6 %), melezitose (0,3 %), isopanose (0,24 %), centose (0,05 %), 3- -isomaltosilglicose e 4- -gentiobiosilglicose (traos). Em um estudo realizado com 54 amostras de mel suo, 20 apresentaram de 0,1-2,1g % de rafinose e 14 apresentaram de 0,1-1,26g % de melezitose73. Tambm usando CG, outros autores61 foram capazes de identificar 5 trissacardeos que foram expressos em relao ao dissacardeo maltose (100 %). A seguinte ordem foi obtida: erlose (48 %), isopanose (15 %), panose (4 %), teanderose (2 %), maltotriose (0,3 %). O perfil mais rico em trissacardeos obtido por alguns autores61 com relao ao obtido em um trabalho anterior73 foi devido a diferenas no mtodo de derivatizao, j mencionadas anteriormente. Outros autores27, usando CG, detectaram erlose (mdia de 0,61g %) e melezitose (mdia de 0,05g %) em 27 amostras de mel de alecrim. A mesma metodologia foi usada em um outro trabalho para determinar trissacardeos em 85 mis monoflorais da Espanha. Neste trabalho, a rafinose ficou ao redor de no detectado (nd) a 0,96g %, a erlose de nd a 2,1g % e a melezitose de nd a 3,9g %31 . Cerca de 9 trissacardeos foram investigados em 4 mis monoflorais dos EUA18 . Neste trabalho, foi usada a tcnica de CLAE com detector amperomtrico e 2 colunas de troca aninica. A seguinte distribuio foi encontrada: erlose (0,263,97g %), teanderose (0,067-0,38g %), melezitose (0,0380,056g %), maltotriose (0,023-0,10 g %), isopanose (nd-0,10g %), panose (traos-0,08g %), melezitose (0,038-0,056g %), isomaltotriose (traos-0,038g %), laminaritriose (nd-traos). importante ressaltar que altos teores de erlose foram encontrados em mis de trevo hbrido (3,97g %) e alfafa (3,46g %); foi encontrada uma pequena quantidade de teanderose (0,067g %) em mel de canola; a isopanose (0,10g %) s foi detectada em mel de trevo hbrido; somente traos de panose foram encontrados em mel de trevo hbrido; a laminaritriose foi identificada somente em mel de alfafa e em quantidades traos18. Lamentavelmente, esses autores no foram capazes de analisar a 1-cestose devido a sua co-eluio com a maltose. Em outro estudo, usou-se CLAE com detector de IR e coluna amino para analisar trissacardeos em 34 amostras de mis da Hungria19 .

Esse autor quantificou a erlose (mdia de 0,18-3,0g %), maltotriose (0-0,24g %), melezitose e rafinose (traos). O contedo mdio de erlose ficou ao redor de 3g % para mis de accia e slvia. Em um outro trabalho62, foi usada metodologia semelhante a do trabalho anterior19 para analisar-se 4 trissacardeos de 70 mis brasileiros. Os valores mdios de maltotriose alcanaram de 0,24-1,03g %, sendo considerados mais elevados do que os valores encontrados em outros pases (0,02-0,23g %)18,19. Em geral, os mis brasileiros apresentaram pequenas quantidades de panose (0,03-0,08g %). Esses resultados foram similares aos encontrados em mis canadenses (traos-0,09g %)18,61. A melezitose ficou no limite de 0,21-0,37g %62 o qual foi mais alto do que os valores mdios noticiados em outros pases (0,03-0,06g %)18,19,31,73. Para rafinose, foram achados valores mdios de 0,10-0,25g %62 que foram similares aos mis de origem espanhola (0,16-0,34g %)31 . Com base em resultados da literatura, os trissacardeos do mel podem ser classificados em 3 grupos, conforme a identificao inequvoca e a distribuio quantitativa: 1-majoritrio: erlose 2-minoritrio: teanderose, isopanose, panose, maltotriose, melezitose, rafinose, isomaltotriose 3-carecem de confirmao: centose, 1-cestose, 3- -isomaltosilglicose, 4- -gentiobiosilglicose, laminaritriose O contedo de isomaltotetrose e de isomaltopentose foi estimado em 0,33 % e 0,16 %, respectivamente63 . Com respeito aos polissacardios, foram isoladas duas fraes que perfizeram 0,002 % do mel78 . ORIGEM Em 1886 foi noticiado que o nctar continha glicose, frutose e sacarose35. Mais tarde, detectou-se rafinose e melibiose em alguns nctares79. Outros autores examinaram algumas variedades de nctar de trevo e constataram a presena de maltose, porm, sugeriram que este dissacardeo poderia ser um contaminante oriundo da ao de afdios80. Em um outro estudo, foi usada a CG para analisar alguns nctares11. Encontrouse somente frutose, glicose e sacarose. Outros autores, usando a mesma tcnica, encontraram alm desses 3 glicdios, tambm, rafinose e melezitose14. Maurizio81 detectou maltose em pequenas quantidades no nctar de algumas plantas, porm a maioria das plantas continha somente glicose, frutose e sacarose. Embora a composio de glicdios do nctar seja ainda pouco estudada, a origem dos diversos oligossacardios presentes no mel no pode ser explicada somente pela coleta de nctares de diferentes variedades de plantas realizada por abelhas operrias. A formao de oligossacardios no mel seria principalmente devido as reaes de trans-D-glicosilao e, em menor extenso, se que existe alguma, as de trans-Dfrutosilao. Neste processo, grupos D-glicopiranosila ou Dfrutofuranosila so transferidos para uma molcula receptora que pode ser um mono-, oligo- ou polissacardeo. A ocorrncia da reao de trans-D-glicosilao foi descrita previamente na srie oligossacardica82,83. Essas reaes seriam catalisadas pelas mesmas enzimas envolvidas em reaes de hidrlise de glicdios84. Esses autores postularam o seguinte esquema para a reao de trans-D-glicosilao: D-Gp-D-G p + E D-Gp + D-G p-E D-Gp-D-G p + D-G p -E D-G p-D-Gp-D-G p + E O mesmo foi postulado para reao de trans-D-frutosilao. Foi mostrado que em relao a -glicosidases de fungos a trans-D-glicosilao ocorreria preferencialmente para hidroxilas primrias de aldoses85. As reaes de trans-D-glicosilao e trans-D-frutosilao ocorreriam no aparelho digestivo das abelhas e seriam a principal rota de formao de oligossacardios. Outros autores demonstraram a atividade de trans-D-glicosilao

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em uma frao, rica em invertase, isolada do mel67. Nesse trabalho, foi constatada a grande atividade de -glicosidase, traos de frutosidase e nenhuma atividade de -glicosidase. Essa atividade de -glicosidase seria oriunda da prpria invertase. Os indcios para a presena de -glicosidase foram: a inatividade na presena de rafinose, grande atividade na presena de sacarose e maltose, formao de erlose a partir da incubao da sacarose com a frao contendo -glicosidase, inibio pela glicose. Esta enzima apresenta a peculiaridade de transferir glicose da sacarose para uma molcula receptora sem a necessidade de formao de um derivado fosforilado da glicose. Esses autores no foram capazes de obter uma evidncia direta da presena de uma enzima com atividade de trans-D-frutosilao67 . Existe uma grande variao na distribuio de sacarose nas amostras de mel o qual foi noticiada por diferentes autores19,31,62. O motivo para os nveis variveis de sacarose poderia ser devido reao de trans-D-glicosilao que iniciada pela transferncia da unidade -D-glicopiranosil da sacarose para uma molcula receptora62. J o alto contedo de erlose poderia ser explicado pelo fato deste trissacardeo ser um intermedirio durante a reao de trans-D-glicosilao no mel67 . A erlose seria formada pela transferncia do grupo -Dglicopiranosila de uma molcula de sacarose para a quarta posio do resduo de glicose de uma outra molcula de sacarose. Seus nveis aumentariam inicialmente e, em seguida, diminuiriam o que seria acompanhado pela formao de novos oligossacardios. Isso explicaria por exemplo as baixas concentraes de sacarose e de erlose em mis de canola18 e em mis de girassol31. Embora alguns nctares contenham maltose, a grande proporo deste dissacardeo no mel seria oriunda da reao de trans-D-glicosilao. Portanto, a maltose, a erlose e vrios outros oligossacardios presentes no mel como p. ex., a maltotriose, a isomaltose e a kojibiose seriam produtos secundrios, originrios da reao de trans-D-glicosilao catalisada principalmente pela invertase. Como j mencionado anteriormente, a ocorrncia da reao de trans-D-frutosilao no mel no foi comprovada at o momento. Com relao a melezitose e a 1-cestose, alguns autores consideraram estes trissacardeos como constituintes da seiva de vrias espcies de plantas86 enquanto, outros21,87 tm sugerido que esses glicdios seriam carreados para colmia atravs de coleta das excrees adocicadas de afdeos, as quais esto presentes na superfcie das plantas. De fato o mel de melato que produzido atravs de excrees de afdeos rico nesses 2 trissacardeos enquanto, mis monoflorais tm somente quantidades nfimas desses compostos4. Outros autores86 tambm sugeriram que a presena de erlose poderia ser devida a ao de afdeos, porm, a erlose encontrada em bem maior quantidade que a melezitose em mis monoflorais. Portanto, a origem da erlose estaria principalmente associada reao de trans-D-glicosilao no mel. Os -galactosdeos, particularmente a rafinose, poderiam ser oriundos da excreo de afdios4. Por outro lado, foi noticiado que as plantas poderiam ser divididas em 3 grupos, com base na composio de glicdios da seiva do floema (vaso condutor de gua e substncias orgnicas produzidas pelas plantas: 1- sacarose (maioria das plantas), 2- -galactosdeos, 3- alditis88 . As abelhas operrias ocasionalmente poderiam coletar nctar dos 2 ltimos grupos. Outros autores sugeriram que tanto o nctar como a excreo de afdios poderiam contribuir como fontes de -galactosdeos no mel72. Uma conjectura interessante seria a utilizao desses oligossacardios como um depsito de galactose por ao de mecanismo de desintoxicao. A galactose livre considerada um composto txico para as abelhas 3. Com respeito aos -D-dissacardeos (celobiose, gentiobiose e laminaribiose), alguns autores no acharam atividade de -glicosidase na frao bruta da invertase e concluram que esses dissacardeos seriam constituintes do nctar67 . Entretanto, outros autores tm descrito a ocorrncia de uma enzima com atividade de -glicosidase no mel89. O fato que

os -D-dissacardeos so encontrados em quantidades nfimas no mel. A origem dos -D-dissacardeos no mel ainda carece de estudos mais detalhados. Em um outro estudo, foi demostrado que o perfil de glicdios se altera mesmo quando o mel estocado a 26 3oC90. Durante 2 anos os autores observaram uma converso de 9 % ao ano de mono- para oligossacardios. A D-glicose livre desapareceu mais rapidamente do que a D-frutose livre, portanto, a razo F/G aumentou consideravelmente. Um outro autor achou uma reduo aprecivel de sacarose, uma pequena perda de erlose e um aumento no contedo de maltose durante 10 meses de estocagem temperatura ambiente 91 . A composio de oligossacardios no mel pode ser alterada pela ao de enzimas de leveduras osmoflicas. Como j mencionado anteriormente, essas leveduras podem crescer em alimentos com atividade de gua baixa e teores elevados de glicdios3 . Algumas preparaes enzimticas isoladas de fungos e leveduras tm mostrado atividade de trans-D-glicosilao e trans-Dfrutosilao em alguns substratos como glicose92 , maltose93 , sacarose94. O resultado dessa atividade foi a formao de oligossacardios como a nigerose, a kojibiose, a isomaltotriose, a turanose e a isomaltose. A reao de trans-D-frutosilao foi observada em fraes enzimticas isoladas de fungos que foram capazes de sintetizar trissacardeos como a panose a partir da maltose93 e a 1-cestose a partir da sacarose95,96. Um outro fator pouco estudado a alterao do perfil de oligossacardios durante o armazenamento do mel temperatura ambiente, atravs de reaes no enzimticas22. Esses autores sugeriram que o pH baixo do mel monofloral (mdia de 3,91) poderia promover reverso (condensao de monossacardios por catlise cida) e formao de compostos como anidridos difrutosdicos. A alta concentrao de glicdios e o pH baixo dos mis monoflorais favoreceria a reao de reverso. Embora o papel da reao de reverso na formao de glicdios do mel seja uma matria especulativa, esta via poderia ser responsvel pela formao de oligossacardios no comumente achados na natureza, como p. ex. os -D-dissacardeos: laminaribiose e gentiobiose. A origem de polissacardios no mel seria devida3: ao trans porte, para colmia, de gros de plen que contm polissacardios ou ao processo de desintoxicao que neutralizaria os efeitos txicos da D-galactose, D-manose, Larabinose para a abelha. A composio de glicdios do nctar ainda carece de estudos mais detalhados. A dificuldade em se obter nctar em quantidade suficiente a principal razo para o nmero restrito de trabalhos sobre o assunto. Um outro problema seria a ao das enzimas da prpria abelha sobre a matria-prima e tambm sobre o mel durante o seu armazenamento e amadurecimento. A atividade dessas enzimas afetada pelas condies climticas e variaes na composio da matria-prima. J a presena de leveduras osmoflicas bem como as reaes no enzimticas poderiam contribuir para modificaes na composio de glicdios. Todas essas variveis tornam o estudo da origem bioqumica dos oligossacardios um grande desafio para os especialistas. Se a ocorrncia dessa variedade de oligossacardios no mel fruto do capricho do acaso ou se tem relevncia para o metabolismo da abelha e, portanto, essencial para sua existncia, ainda um enigma a ser desvendado. IMPORTNCIA A utilizao do perfil de oligossacardios como um dos parmetros na identificao da origem botnica do mel tem sido objeto de estudo por diferentes autores. J no incio do sculo, grandes quantidades de melezitose foram detectadas em mel de melato39,40. Mais tarde, em outro trabalho, empregando a tcnica de CG, tambm foi encontrado um alto teor de melezitose e sugerido que esta propriedade distinguiria mis florais de mis

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Moreira & De Maria

Quim. Nova

de melato73. Vrios autores, usando CLAE18,19,62 e CG27,31, tambm encontraram quantidades menores de melezitose em mis florais. Portanto, o contedo de melezitose um parmetro importante na caracterizao de mis de melato. Em um outro estudo, foi sugerido que o perfil de oligossacardios poderia ser importante na determinao da idade e da autenticidade de mis florais61. Swallow e Low 18 acharam pequena quantidade de sacarose e traos de erlose em mel de canola o que diferenciou este de outros mis monoflorais. Estes autores concluram que o perfil de oligossacardios poderia servir como uma impresso digital para caracterizao da origem botnica do mel. Mateo e Bosch-Reig31 realizaram um trabalho extenso de avaliao do perfil de oligossacardios de 7 variedades de mis monoflorais da Espanha, obtidos por CG, como um mtodo de caracterizao desses mis. Os resultados foram testados estatisticamente atravs de anlise mono- e multivariada. A distribuio de sacarose foi significativamente maior em mel de flor de laranjeira quando comparado aos mis de alfazema, girassol, eucalipto, alecrim e urze. O contedo de maltose pareceu ser til na diferenciao do mel de girassol, do eucalipto, sendo o ltimo rico neste dissacardeo. Segundo esses autores, a kojibiose e a maltulose serviram para distinguir o mel de flor de laranjeira e girassol (baixo teor) do mel de alecrim (alto teor), uma vez que houve diferena estatisticamente significativa entre as mdias (p<0,05). Ainda nesse trabalho, foi concludo que o contedo de glicose, frutose, sacarose e maltose e a relao G/A foram os melhores parmetros para classificao correta das amostras de mel. No cmputo geral, foi obtido um valor de 77,9 % de classificaes certas; no caso de cada mel foram obtidos: 100 % para mel de melato, 92,9 % para girassol, 83,3 % para urze e 75 % para eucalipto. Para os outros mis (flor de laranjeira, alecrim, alfazema) a percentagem de acerto alcanou o limite de 53,8-69,2 %31. Os mesmos autores publicaram um outro trabalho, usando as mesmas amostras de mel do estudo realizado em 1997, onde a anlise multivariada foi aplicada para os parmetros condutividade eltrica, cor, contedo de gua, frutose e sacarose49 . O percentual geral de acerto foi de 95,7 %. No caso dos mis de girassol, eucalipto e melato houve 100 % de acerto. Alguns autores realizaram um trabalho extenso de identificao de oligossacardios em mis brasileiros62 . Foi sugerido que o perfil de oligossacardios poderia ser til na identificao da regio brasileira produtora de mel. Entre as regies brasileiras estudadas, o contedo mdio de maltose na regio sudeste foi significativamente menor (p<0,05) do que quele da regies sul, centro-oeste e nordeste. Os mis de eucalipto apresentaram valores mdios de maltose significativamente menores do que queles da regio sul. As amostras de mel da regio nordeste mostraram valores mdios de turanose e maltotriose significativamente menores do que os encontrados para as regies sul, sudeste e centro-oeste. Consequentemente, o contedo de maltose, turanose e maltotriose poderia ser til na identificao da regio produtora de mel62. Com respeito aos estados brasileiros, os mis do estado de So Paulo mostraram um contedo de melibiose significativamente menor do que o obtido a partir dos estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. Com base nos teores de maltose e nigerose, os mis do estado de Mato Grosso poderiam ser distinguidos daqueles oriundos dos estados do Mato Grosso do Sul e Gois. O valor de maltotriose foi significativamente maior no estado do Paran quando comparado ao estado do Rio Grande do Sul. As amostras de mel do estado do Piau mostraram valores mdios de rafinose e maltotriose significativamente maiores do que os obtidos no estado da Paraba. Portanto, o contedo de melibiose, maltose, nigerose, maltotriose e rafinose poderiam auxiliar na identificao do estado brasileiro produtor de mel62 . Um trabalho estatstico com uma amostragem maior de mis monoflorais representativa de cada rea produtora de mel em cada estado seria necessrio antes da utilizao do perfil de

oligossacardios como um dos parmetros para identificao da regio produtora de mel. A anlise microscpica do mel, principalmente do sedimento para identificao e contagem de gros de plen ainda a principal ferramenta usada para analisar a origem botnica do mel. Entretanto, a interpretao da anlise polnica apresenta algumas dificuldades como: a baixa ou alta representatividade dos gros de plen de algumas plantas e a determinao do gnero e da espcie. Considera-se, por exemplo, que os gros de plen da alfazema apresentam baixa representatividade. Portanto, para que o mel seja considerado de alfazema basta conter de 10-13 % deste tipo de plen. Portanto, o perfil de glicdios apresenta-se como um parmetro complementar anlise microscpica do mel, no que diz respeito a identificao do tipo floral. O perfil de oligossacardios poderia ser tambm til na caracterizao da regio em que o mel foi produzido. Este tipo de caracterizao seria til para os consumidores que estivessem interessados em consumir apenas mis de regies com legislaes mais rigorosas em relao a utilizao de agrotxicos bem como ao cultivo de plantas transgnicas. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio da Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) e da Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES). REFERNCIAS 1. Dustmann, J. H.; Am. Bee J. 1993, 133, 648. 2. Zumlai, A.; Lulat, A.; J. Royal Soc. Med. 1989, 83, 384. 3. Siddiqui, I. R.; Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1970, 25, 285. 4. Doner, L. W.; J. Sci. Food Agric. 1977, 28, 443. 5. Wiley, H. W.; US Dept. of Agric. Chem. Bull. 1892, 13, 744. 6. Browne, C. A.; US Dept.of Agric. Chem. Bull. 1908, 110, 1. 7. Ellegood, J.; Fischer, L.; Food Res. 1940, 5, 559. 8. White, J. W., Jr.; Maher J.; J. Assoc. Off. Agric. Chem. 1954, 37, 466. 9. Eckert, J. E.; Allinger, H. W.; Calif. Agric. Exp. St. Bull. 1939, 631, 1. 10. Wood, P. J.; Siddiqui, I. R.; Weisz, J.; J. Apic. Res. 1975, 14, 41. 11. Kleinschmidt, M. G.; Dobrenz, A. K.; McMahon, V.A.; Plant Physiol. 1968, 43, 665. 12. Echigo, T.; Bull. Fac. Agric., Tamagawa University (Japan). 1970, 10, 3. 13. Battaglini, M.; Bosi, G.; Apiacta 1972, 7, 5. 14. Battaglini, M.; Bosi, G.; Apic. Abstr. 1974, 25, 110. 15. Hadorn, H; Zrcher, K.; Strack, C.; Mitt. Geb. Lebensmittelunters. Hyg. 1974, 65, 198. 16. Pourtallier, J.; Rognone, C.; Symp. Int. Technol. Apic. (Bologna) 1977, 74. 17. Mateo, R.; Bosch, F.; Proc. 2nd Nat. Congr. Apic. (Gijn) 1984, 358. 18. Swallow, K. W.; Low, N. H.; J. Agric. Food Chem. 1990, 38, 1828. 19. Fldhzi, G.; Acta aliment. 1994, 23, 299. 20. Costa, L. S. M.; Albuquerque, , M. L. S.; Trugo, L. C.; Quinteiro, L. M. C.; Barth, O. M.; Ribeiro, M.; De Maria, C. A B.; Food Chem.1999, 65, 347. 21. Goldschmidt, S.; Burkert, H.; Z. Physiol. Chem. 1955, 300, 188. 22. White Jr., J.W.; Riethof, M.L.; Subers M.H., Kushnir, I.; US Dept. Agric. Tech. Bull. 1962, 1. 23. Pourtallier, J.; Z. Bienforsch. 1968, 9, 217. 24. Nelson, N.; J. Biol. Chem. 1944, 153, 375.

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Glicdios no Mel

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