Protocolos Engenharia Genética

DepartamentodeBiologia
BIOTECNOLOGIA
ENGENHARIAGENTICA
U
Manualprticoe
Protocolosexperimentais
20102011
CarlosSinogas
www.ensino.uevora.pt/biotec
NDICE
PROCEDIMENTOSDESEGURANA.................................................................................................................................................................3
Vesturioecomportamentos........................................................................................................................................................................3
Riscosfsicos........................................................................................................................................................................................................4
Riscosqumicos..................................................................................................................................................................................................4
Riscosbiolgicos................................................................................................................................................................................................5
Planeamento........................................................................................................................................................................................................5
Procedimentosgerais.......................................................................................................................................................................................5
REGISTOSERELATRIOS...................................................................................................................................................................................6
PreparaodoTrabalhoInventivo(Poster)................................................................................................................................................7
TcnicasLaboratoriaisBsicasemMicrobiologia....................................................................................................................................8
Meiosdecultura.................................................................................................................................................................................................8
Esterilizao.........................................................................................................................................................................................................8
TubosdeculturaePlacasdePetri..............................................................................................................................................................9
Instrumentosparatransfernciadeculturas........................................................................................................................................9
Cmarasdecultura.........................................................................................................................................................................................10
Frigorfico...........................................................................................................................................................................................................10
MtodosdeEsterilizao..................................................................................................................................................................................11
Esterilizaopelocalor.................................................................................................................................................................................11
Esterilizaoporgases.................................................................................................................................................................................12
Radiaes............................................................................................................................................................................................................12
Filtraoestril................................................................................................................................................................................................13
Desinfectanteseantispticos...................................................................................................................................................................13
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................................................................................14
PIPETAGENS,DILUIESESOLUES......................................................................................................................................................15
CULTURADEBACTRIAS(E.coli).................................................................................................................................................................20
PREPARAODEDNAPLASMDICO(LiseAlcalina)............................................................................................................................21
MINIPREPARAODEDNAPLASMDICO(MiniPrep).........................................................................................................................23
DIGESTOCOMENZIMASDERESTRIO................................................................................................................................................24
ANLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE.................................................................................................................................................25
PREPARAODEBACTRIASCOMPETENTES.......................................................................................................................................26
TRANSFORMAO...............................................................................................................................................................................................27
Anlisedeprotenarecombinante................................................................................................................................................................28
ELECTROFORESEDEPROTENAS(PAGE)................................................................................................................................................29
PreparaodasAmostras............................................................................................................................................................................30
Preparaodogel...........................................................................................................................................................................................30
UElectroforese..................................................................................................................................................................................................30
Electroforese.....................................................................................................................................................................................................31
Coloraodasprotenas...............................................................................................................................................................................31
ANEXOSPlasmdios..........................................................................................................................................................................................32
pCS11...................................................................................................................................................................................................................32
UpCS62................................................................................................................................................................................................................32
pCS62...................................................................................................................................................................................................................33
pCS71...................................................................................................................................................................................................................34
pCS84...................................................................................................................................................................................................................35
pSK+......................................................................................................................................................................................................................36
ANEXOSEnzimas..............................................................................................................................................................................................37
BamHI.................................................................................................................................................................................................................37
EcoRI...................................................................................................................................................................................................................37
SalI........................................................................................................................................................................................................................37
UANEXOSTabelaPeridica..........................................................................................................................................................................38
TrabalhoAutnomopararelatriofinal....................................................................................................................................................39
Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11
PROCEDIMENTOSDESEGURANA
(AdaptadodeBiotechnologyExplorations,ASMPress)
EnsinareaprendernolaboratriodeBiotecnologiaenvolvesempreumcertonvelderiscoparaooperadore
companheiros.Novosequipamentos,reagentesemateriaisbiolgicossoparteintegrantedostrabalhos
experimentaisqueenvolvemcidosnucleicoseprotenas.Osestudantesestoaaprendernovastcnicas,usando
reagentesemateriaisbiolgicosenovosequipamentosqueapresentamalgumrisconocontextodasuautilizao
laboratorial.Nosendopossvelfazeraexperimentaosemusarosequipamentos,osreagenteseomaterial
biolgico,esperasedosestudantesqueadoptemasatitudesadequadasparaminimizaodosriscosassociados.
Alertapermanente,umconceitoimportadodospilotosdeavio,criaoenquadramentoparaamanutenoda
seguranaapropriadafaceaosriscosinerentes.Talcomoopilotodeveestaralertaparaasuaenvolvente,com
constantevigilnciaparaasuaseguranaeadosoutros,assimosestudantesdebiotecnologiadevemfazerno
laboratrio.Opilototemsempredesaberondeest,paraondevaiecomolchegar.Traduzidoparaoambiente
laboratorial,osestudantesdevemestarconcentradosnastarefasquedesenvolvem,compreenderoequipamento,
osreagenteseosmateriaisbiolgicosqueusam,devendoseguirospassosadequadosconduodaexperincia.
Aomesmotempocadaestudantedeveconheceroqueosseuscolegasfazemeosprotocolosqueseguem.
Nesteenquadramentosoquatroasprincipaisquestesdeseguranaquesecolocam:
Vesturioecomportamentos
Riscosfsicos
Riscosqumicos
RiscosBiolgicos
VESTURIO E COMPORTAMENTOS
Reduziraomnimoospertencespessoaiseoutrosmateriaisnabancadadetrabalho.Casacos,sacoseoutros
pertencesdeveroserdepositadosnobengaleiroentradadolaboratrio.
Usodebataobrigatrio(Sempre),paraevitarsujaroucontaminararoupa.
Cabelo,quandocomprido,devidamenteapanhadoparaevitarasuaignionachamaouacontaminao
qumicaoubiolgica.
Sapatosfechadossorecomendados,poisosabertosnoprotegemdeeventuaisrespingosquepossamcair.
ProtecodosolhosepelenuaaquandodautilizaodeUV
Luvasdescartveissoexigveisquandosemanipulamcertosreagentesoumicrorganismos.
desaconselhadoousodejias,emespecialanisepulseirasqueimpedemoadequadousodasluvas.
Comer,beber,mascarpastilhaselsticas,aplicarcosmticosproibidonolaboratrio,paraqueeventuais
contaminaesnosejamdirigidasparazonasnoprotegidas.Roerasunhas,lpis,canetasededosnaboca
igualmenteproibido,pelasmesmasrazes.
Osestudantesdevemconhecerecompreenderbemotrabalhoafazer.Umaboaprogramaomeiocaminho
paraumaboaexecuo.Odocentedeverserquestionadosemprequesurjamdvidassobreos
procedimentosaseguir.
Asmosdevemsersemprelavadasantesdeiniciarotrabalhoedepoisdeconcludaaexperimentao,para
quecontaminantesnosejamintroduzidosnemtransportadosparaforadolaboratrio.
Asbancadasdetrabalhodevemsersemprelimpasesanitarizadascomlcoolantesdoinciodotrabalhoe
depoisdesteconcludo.Noseconheceoqueoutrosestudantespossamterdeixadonolaboratrio,nemse
pretendedeixarcontaminaesparaquemvieraseguir.
RISCOS FSICOS
Fogo
Identificaralocalizaodochuveiro,dosextintoresedosbaldesdeareia.
Identificaralocalizaodosquadroselctricosedatorneirageraldogs.
Aquecerprodutosaaltastemperaturaspodeprovocarqueimaduras.
Assoluesaquecidasnomicroondas,emespecialasagaroses,podemficarsobreaquecidaseentrarem
ebulioexplosivaapsagitao,provocandoqueimadurasgraves.
Bicosdegselamparinas
Conhecercomosedeveacenderobicodegs.
Nuncaabandonarumbicooulamparinaacesa.Evitarmovimentlosquandoacesos.
Flamejarosinstrumentoseostuboscomcuidadoparaevitarformaodeaerossis.
Nousarmaterialfacilmenteinflamvelnasproximidadesdachama(atenoaolcool).
Autoclave
Evitarexposioaosvaporesdaautoclaveaquandodasuaabertura.Podemprovocarqueimaduras.
Usarluvasisolantespararemovermateriaisdaautoclave
Vidrospartidosematerialcortante
Osvidrospartidosdeveroserremovidoscomauxliodepinaouluvas,nuncacomasmosdesprotegidas.
Nocolocarvidrospartidosnolixocomum.
Seapropriadorecolherparadescontaminao.
Usarlminascortantescomauxliodepinasouluvas.
Equipamentoelctricoedeelectroforese
Verificaroscaboselctricosdosequipamentosenuncausarcabosdefeituosos.
Evitarousodematerialelctricoprximodegua.
Desligaroequipamento(botoOFF)antesdeoligarcorrente.Nuncaligaroudesligarumaparelhode
electroforesesemantescortaracorrente(botoOFF).
Nuncaabrirumatinadeelectroforesesemantesdesligaracorrenteelctrica.
TransiluminadordeUV
AousarotransiluminadordeUV,nuncaoligueantesdebaixaratampaprotectora.
Desliguealuzantesdelevantaratampaeremoverogel.
RISCOS QUMICOS
Prestaratenosnotasdosprotocolossobreosriscosassociadosaalgunsreagenteseseguirasinstrues
dodocente.
Nuncapipetarboca.Usarpipetadoresmecnicos.
Osrestosdeprodutosqumicosnodevemserrejeitadosparaoesgoto.
Localizarochuveiroeosistemadelavagemdeolhos.
Aroupaatingidaporreagentesqumicosdeverserdeimediatoremovidaeapeleemcontactoser
abundantementelavada.
Noremoverprodutosqumicosdolaboratrio.
Algunsreagentesqumicosausarnasexperinciastmassociadosriscosparticulares.Ousodereagentesem
soluoouprmisturadosreduzonveldeexposioeotempodasuautilizao.Aquantidademanipulada
tambmimportante.Algunsreagentescomriscosespecficosautilizarnassesseslaboratoriais:
AcrilamidaebisacrilamidaMutagnico,carcinognicoeneurotxicoqunadoinaladoouingerido.Usar
apenassoluespreviamentepreparadasecomluvas.
PersulfatodeamnioOxidantepotente.Manterafastadodemateriaiscombustveisedefontesdecalor.
Clorofrmio
DTT(Ditiotreitol)Provocairritaonosolhos,pele,membranasdasmucosasetratorespiratrio.
EtanolInflamvel.
Brometodeetdio(solues)Mutagnico.Usarluvas.
SDS(laurilsulfatodesdio)Irritantedosolhosedapele.
cidosebasesconcentradosCorrosivos.Provocamqueimadurasaocontacto.
RISCOS BIOLGICOS
Desinfectarareadetrabalhoantesedepoisdemanipularmicrorganismos.
Usarlixviadiluda(10%dehipocloritodesdio)paradescontaminarreaseinstrumentoseventualmente
contaminados.
Evitarasmosnabocaounosolhos.
Flamejarcuidadosamenteinstrumentosetubosparaevitaraformaodeaerossis.
Noremovermicrorganismosdolaboratrio.
TratartodasasamostrasdeDNA,plasmdiosebactriascomomaterialcontaminado.
Rejeitarasculturaseoutromaterialcontaminadonotabuleiroparaautoclavar.
Nojuntarmaterialnocontaminadonotabuleiroparaautoclavar.
Norejeitarnolixocomumoquequerquesejaquetenhacontactadobactrias.
Sebemqueosmicrorganismosausarnaexperimentao(E.coli)nocoloquemriscosbiolgicosparticulares
devetersesempreemmentequesocriadascondiesdecrescimentodosmesmos.Orisconaturalmente
aumentacomaquantidadedebactriaseoutrosmicrorganismos,eventualmentepatognicos,podemcontaminar
asculturaseseramplificados.
PLANEAMENTO
Noiniciarqualquerexperinciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensoprviosdos
procedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefectivadisponibilidadedetodos
osrecursosmateriaisnecessriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperincias.Otempo
"perdido"numplaneamentoiniciallargamentecompensadopelonveldaaprendizagemconseguidoepela
prevenodanecessidadederepetiodeexperinciaseventualmentebloqueadas.
PROCEDIMENTOS GERAIS
Todososprocedimentosdeveroserefectuadostendoemmenteaminimizaodosriscosassociados
manipulao,numaperspectivadeprotecodoprpriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeum
conjuntoderegrasaobedecerautilizaodobomsensodooperadornostrabalhosarealizar.
muitoimportanteusaracabeaantesdasmos.
REGISTOSERELATRIOS
convenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrnciasedosresultadosdaexperimentao.
Sugereseousodecadernodelaboratrio,deprefernciacomfolhasnoamovveis,paraquenosejam
eliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequnciaquandosepassam
osapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraodorelatriofinalouparaa
eventualrepetiodaexperincia.Origorepormenordosregistosefectuadosduranteaexecuodotrabalho
experimentalfacilitaroaaprendizagemeainterpretaodosresultadosobtidos,emespecialquandoestesso
inesperados.
Umqualquerrelatriodeumaexperincialaboratorialdeverdocumentardeformatocompletaquantopossvel
oprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalmdissodeversertambmobjectivodorelatorredigir
umdocumentocompreensvelparaoleitoresusceptveldeapoiaraeventualrepetiodamesmaexperinciaem
idnticascondies.Paraaelaboraodosrelatriossugeremse,comoorientao,asseguintesseces:
Ttulo
Identificadordocontedodorelatrio
Resumo
Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusesobtidas
Objectivo
Razodeserdotrabalhorealizado
Introduo
Dadosconhecidosquejustificamarealizaodaexperinciarelatada
Palavraschave
Termosdirectamenterelacionadoscomotrabalho
Materialereagentes
Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado
Protocoloexperimental
Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deveroserrelatadosos
procedimentosconcretosexecutados,comrefernciaaeventuaisdesvios
relativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito
Resultados
Registodasobservaesefectuadasedosdadosrecolhidos
Discusso
Comentriocrticoaosresultadosobtidos
Concluso
Descriodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedos
resultadosobtidos
Notacrtica
Comentrioglobalidadedaexperincia,comrecomendaesparaasua
repetioououtrasconsideradasadequadas
Bibliografia
Refernciasconsultadasouutilizadasparaarealizaodotrabalho
Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatrioedasensibilidadedorelator,algumasdas
secesdescritaspoderoserfundidas,como"Resultadosediscusso"ou"Discussoeconcluses",por
exemplo
PreparaodoTrabalhoInventivo(Poster)
Umacomunicaoemposter,emprincpio,aapresentaodeumtrabalhointermdioemcursosdeexecuo.
Comasuaapresentaopretendese,emgeral,comunicarumamensagemaosvisitanteseesperasedestesuma
interacoquepermitamelhorarotrabalhoemcurso.
Amensagemapassardeverserimediata(primeiravista),defcilleituraederpidaapreensodistnciade,
pelomenos,ummetro.Tantoquantopossveldeverserminimizadootextoaincluirevalorizadososesquemase
grficos.
ParaalmdaIDENTIFICAOdo(s)autor(es)edaInstituioondeotrabalhofoirealizado,umposterdever
incluirumaprimeiraseco,quesedesignausualmenteporINTRODUO,emquecolocadooproblemaa
abordarpelotrabalhoquesecomunicafaceaostateoftheartactualequeconduzdirectamenteaosOBJECTIVOS
almejados.DeverdepoisexistirumaoutrasecoemquesedescrevaaMETODOLOGIAutilizada(ouautilizarno
casodepropostasdetrabalhofuturo)aantecederosRESULTADOSobtidos(ouesperados)quedeverodepoisser
contextualizadosnumaDISCUSSOdequeresultaaCONCLUSO.PorfimdeverserindicadaaBIBLIOGRAFIAem
queoautorsebaseouparaarealizaodotrabalho.
TcnicasLaboratoriaisBsicasemMicrobiologia
AodesenvolvimentodostrabalhosemBiotecnologiafundamentalrecorrerstcnicasprpriasdaMicrobiologia
paraamanipulao,crescimentoemanutenodebactriaseoutroshospedeirosdeDNAsrecombinantes.
Osmicrorganismossoubquos.Podemencontrarsenosolo,noar,nagua,nacomida,nosesgotosenas
superfciescorporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladonossavolta,onossoambienteest
repletodemicrorganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismonecessriosepararestaspopulaes
mistas,deformaamanipularnolaboratrioaschamadasculturaspuras,culturasdeumanicaestirpe.Apesardo
fornecimentodeestirpesbacterianaspurasparaarealizaodostrabalhos,asculturaspodemviraser
contaminadas.
Paraisolareestudarosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealgunsequipamentos
laboratoriaisbsicosedaaplicaodetcnicasespecficasusandomateriaisparticulares.Nasprticasque
aplicaremosnodecursodestadisciplina,tersederecorrerstcnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacom
utilizaodosequipamentosemateriaisespecficosqueseindicam:
Equipamento
Materiais
Autoclaveedispositivosdefiltraoestril
Ansaseagulhas.Pipetasemicropipetas
Banhosdeguaeestufas
Frigorfico
Fluxolaminar(conveniente)
guadestiladadequalidade
Meiosdecultura(bactrias)
Lquido
Semislido
Slido
Tubosparacultura
PlacasdePetri
MEIOS DE CULTURA
Asobrevivnciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrientese
convenientescondiesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenas
necessitamdesubstnciasolveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaoenzimticade
outrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluocontendoestesnutrientesdesignadacomomeiodecultura.Em
geral,osmeiosdeculturasolquidos,semislidosouslidos.Ummeiolquidosemagentesolidificante
designadoporcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,
originaummeioslidoousemislido.Oagarumextractodealgasmarinhas,umcarbohidratocomplexoque
contemmaioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarmuitoadequadocomoagente
solidificanteporqueseliquefazacercade100Cesolidificaa40C.Devidoaestaspropriedades,os
microrganismos,emespecialospatognicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37Csemreceios
deliquefacodomeiosolidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraodeagarda
ordemdos1,5a1,8%.Umaconcentraoinferiora1%resultanummeiosemislido.
Paraalmdasnecessidadesnutritivas,vriosoutrosfactoresambientaisprecisamdesercontroladosparao
sucessodaculturadosmicrorganismos,comosejamopH,atemperatura,oambientegasosoouapresso
osmtica.
ESTERILIZAO
Aesterilizaoumdospontoschaveparaosucessodotrabalhoemmicrobiologia.Paratrabalharemcondies
deesterilidadefundamentalousodematerialestrileaaplicaodetcnicasadequadas.Aesterilizao
processopeloqualsoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistcnicas
paraaesterilizaoderotinaemlaboratriosoasseguintes:
Calor
Filtrao
Produtosqumicos
Calorseco(arquente)
160Ca180Cdurante1/2horaa3horas
Materialdevidroemvazio
Calorhmido(vapor)
Circulaodevapora100C.Esterilizaointermitente(soluestermolbeis)
Autoclave.Vaporsobpresso,temperaturasacimados100C(meiosdecultura,
soluestermoestveis)
Membranasfiltrantescomporosde0,05ma0.8m
Remoodemicrorganismosdesoluestermolbeisporfiltrao
xidodeetileno
Materialdeplstico
Betapropiolactona
Tecidosvivos,materiaisbiolgicos
TUBOS DE CULTURA E PLACAS DE PETRI

TubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplsticoconstituemosprincipaissuportesparao
desenvolvimentodasculturasdemicrorganismos.Ummeionutritivoadequadonaformadecaldonutritivooude
agarusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetriapenasseusameioslido.Umambienteestril
preservadonostubosdeculturaporvriostiposdetampas.Historicamenteorolhodealgodohidrfobo,
desenvolvidoporSchroederevonDuschnosculodezanove.Hojeemdia,amaiorpartedoslaboratriosusam
tampasemformademanga,emmetalouplsticoresistenteaocalor.Avantagemdestastampasresidenofactode
noexigiremtantotrabalhonasuapreparaoeseremmaisfacilmenteremovidasereintroduzidasnostubos
duranteamanipulao.
AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfcieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.So
compostasporumabasecircularinferior,ondecolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoe
ligeiramentemaiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetridevriasdimensesparadiferentesexigncias
laboratoriais.Narotinasousadasplacasdecercade10cmdedimetro.Omeionutritivoestril,contendoagar,
numvolumede15a20mlvertidonasplacasquandoaindaquenteapsfusodoagaredeixadoarrefecera
temperaturainferiora40C.Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassoincubadasemposio
invertidaparaevitarqueasgotasdecondensao,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,tombem
sobreasuperfciedoagar.
INSTRUMENTOS PARA TRANSFERNCIA DE CULTURAS

Existeanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasde
armazenamentoamanutenoparaculturasdeanlise.oprocessodesubculturaquetemdenecessariamente
serefectuadocomtcnicaestrilparaevitarpotenciaiscontaminaesdassubculturas.
Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprpriosparaa
manipulao,soinstrumentosmuitodurveisdefcilutilizao.Sofacilmenteesterilizveisnomomentodasua
utilizaoporincineraochama,numaposioquaseverticalatometalficaraorubro.Importardepois
deixararrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismos
ambientaisviveisinferior.Depoisdearrefecidos,paranoinactivarosmicrorganismosatransferir,podemser
usadaspara"picar"umaculturaslidaoulquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeverserde
imediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada.
Aspipetassooutrosdosinstrumentosdetransfernciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Socalibradase
permitematransfernciadequantidadesdeculturaslquidaspreestabelecidas.Sodevidroouplstico,comuma
extremidadeafiladaeoutraparaaaspiraoeexpulsodolquidoquecontenham.Podemseresterilizadaspor
calorsecoouhmido,conformeotipodematerialdequesoconstitudas.Apesardetradicionalmenteserem
instrumentospara"pipetarboca"proibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliares
mecnicosdisponveisparaoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidade
largadapipeta.
AspipetasPasteur,tubosdevidronograduadoscomumadasextremidadesafiladassotambmdeusomuito
frequenteemtrabalhosdemicrobiologia,tambmpelasuafacilidadedeesterilizaoextempornea.
CMARAS DE CULTURA
Dascondiesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevantesasuatemperaturaptimade
crescimento.Asestufassousadasparaamanutenodatemperaturaptimadosmicrorganismosem
crescimentoduranteoperododecultura.Socmarasemqueatemperaturaambienteinteriorcontroladapor
termstato,paraqueamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamem
geralumsistemadecirculaodearaquecidoe,paraevitaradesidrataodosmeiosemincubao,devero
contertambmumafontedevapordegua(umrecipientecomguanoseuinterior,quandonovenham
preparadasparaoefeitodeorigem).
Osbanhosdegua(banhomaria)comguaatemperaturacontroladaportermstatoconstituemoutrodos
instrumentosfrequentementeempreguesparaacriaodascondiesdetemperaturaptimadecrescimentodos
microrganismos.Ontimocontactodaguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemos
microrganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrpidaeeficaztransfernciadocalor.Almdisso,os
banhoscomagitaofacilitamtambmoarejamentodasculturas,degrandeimportnciaparaocrescimentodos
microrganismosaerbios.Adesvantagemdobanhodeguaresidenofactodespoderserusadoparaasculturas
emmeiolquido,aocontrriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolquidocomoemmeio
slido.
FRIGORFICO
Ofrigorficooutradaspeasfundamentaisemlaboratriodemicrobiologia.Oambientedebaixatemperatura
quedisponibilizadamaiorrelevnciaparaamanutenoearmazenamentodasculturascelularesemfasede
nocrescimentoentreosperodosdesubculturaeparaaconservaodosmeiosesterilizadoseoutrosreagentes.
Tambmassoluesecompostostermolbeistmperodosdeconservaomaisalargadosquandoarmazenados
abaixastemperaturas.
10
MtodosdeEsterilizao
Esterilizaoumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremsuperfcieounointerior
deummaterial,podendoseralcanadopelaexposiodomaterialaagentesletaisfsicosouqumicosou,nocaso
doslquidos,pelaseparaomecnicadosorganismosatravsdefiltraes.Existemmuitasformasdeesterilizar
materiaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomoda
disponibilidadedemeiosdetrabalho.
Anoodeesterilidade(estril=infecundo)encontrasefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia
(ausnciadesepsis=putrefaco)eadedesinfeco(livrardainfeco).Estessignificadosliteraiscorrespondem,
defacto,snoestcnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimonosaesterilizaoquandose
pretendeimpedirapropagaodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambiente
desprovidodemicrorganismoseadesinfecoquandoseaplicamtcnicasdestinadasaeliminarmicrorganismos
potencialmentepatognicosparaooperador.
Destasnoes,aaprofundarnoexercciodaexperimentaoquesedesenvolvernadisciplina,importa
consideraremparticularastcnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaodemicrorganismos
viveis:aesterilizao.
ESTERILIZAO PELO CALOR

A.CalorHmido
Oaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaaautoclave.Asautoclavestrabalham
semelhanadepanelasdepressodomsticas.Asautoclavesdelaboratriooperamnormalmentesobuma
pressode1,02Baraumatemperaturade121C.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem1530
minutos,sendoavariaodotempodeesterilizaodevidarelaosuperfcie/volumedosmateriaisaserem
esterilizados.
Aspectosdaesterilizaoporvaporpresso
Temperatura
Osendoesporosdasbactriassoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiopodeser
conseguidaseforaplicadovaporsobrepresso.Umatemperaturade121Cofereceumaboamargemde
seguranaseformantidaduranteumespaodetempoapropriado.
Humidade
Acoagulaodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehmedidaqueesta
removidaatemperaturanecessriaparahavercoagulaoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecido
ficarmais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposioparaaesterilizao,que
nasituaoextremadeesterilizaoemcalorsecoserde170Cduranteumahora.Emconcluso,vapor
excessivamentequenteperdealgumadasuaeficciacomoagenteletalparaalmdepoderserlesivoparaos
materiaisaseremtratados.
Presso
Apresso,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisnoexercequalquerefeitonaesterilizao,sendotilpara
elevaratemperaturadovaporacimados100C.
Tempo
Otemponecessrioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaserem
esterilizados.Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaosoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosno
sotodosmortosdeumavez.Avelocidadedemorteumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidade
detempodeexposioaoagenteletal,umaproporoqueconstanteparaumadadapopulao.Normalmente
demora11a12minutosa121C(calorhmido)paramatarosendoesporosdasbactriastermoflicas,osagentes
maisresistentesnasmanipulaesdodiaadia.
11
Purga
Oarrelativamentefrionacmaradeesterilizaomuitomaispesadoqueovaportemperaturade
esterilizao.Senoforpermitidaasadadoarcriaseumaestratificaonaautoclavequeconduzaumafaltade
uniformizaodastemperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsolentosamisturaremse,as
diferenasdetemperaturaentrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooar
porvapor(purga).
Naturezadocarregamento
Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremummaiortempodeesterilizao,sendoprefervelesterilizar
pequenosvolumesdecadavez,porexemploprefervelesterilizar5balesdelitrodecadavezdoqueesterilizar
apenasumbalocomcincolitros.Osfrascosdevemsertapadoscomalgodooupapel.Sefornecessriousar
tampasroscadas,devemirpoucoapertadasparaaautoclavedemodoapermitiremasadadeareentradade
vapor,evitandoseassimorebentamentodefrascosnaautoclave.
B.Calorseco
Ocalorsecousadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaisslidostermoestveisealguns
componentesdemeiosoualimentosqueficariamimprpriosseexpostosaovapor.Tratasetambmdeumdos
mtodosdeesterilizaomaisusadosedemuitofcilaplicao.Oequipamentoindispensvelapenasuma
estufadealtatemperatura(160200C).Paraalmdeterdesertidaemcontaaresistnciatrmicadosmateriais
aesterilizarporestatcnica,aoutraprecauoaconsiderarprendesecomaminimizaodapossibilidadede
contaminaressesmateriaisdepoisdaesterilizao.
ESTERILIZAO POR GASES

Orecenteincrementodousodematerialdeplsticodeutilizaonicacomoseringas,caixasdePetri,tubosde
cultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaoqueusagasestxicosparaa
eliminaodosmicrorganismosdemateriaistermosensveis.Aaplicaodestatcnicarequerautilizaode
equipamentosprpriosqueforcemacirculaodogstxicoatravsdetodasassuperfciesdosmateriais,oquea
tornadedifcilutilizaoemlaboratriosdetiponoindustrial.
Oxidodeetilenoogsusadocommaiorfrequncianestetipodeesterilizaes.Estegs,aocontrriode
muitosprodutosqumicostxicos,poucocorrosivoenoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendo
facilmenteremovidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperodosde
exposioparaseobteraesterilizao(vriashoras),areactividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposde
plsticoseanecessidadedeequipamentosprpriosedisponibilidadedogs,comosereferiu.
RADIAES
Algunsprocessoscomerciaisusamasradiaesparaaesterilizaoafriodecertosmateriaiscomoprodutos
farmacuticos,porexemplo.Airradiaoousoderadiaesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgama
produzidosapartirdecobalto60oucsio139ederaioscatdicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresde
electres.
Airradiaocomluzultravioletanoumaformamuitosatisfatriadeesterilizaodadaasuafracacapacidade
depenetraonosmateriaiseprodutosaesterilizar.,contudo,deutilizaofrequentenadiminuiodonvelde
contaminaodeespaosconfinados,comosalasestreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteteis
tambmparaareduodainfecciosidadeviraldevidosalteraesinduzidasnomaterialgenticodaspartculas
viraisexpostas.
12
FILTRAO ESTRIL
Oprincipalmtodoparaaesterilizaodelquidosquecontenhamcomponentestermosensveistaiscomo
vitaminas,protenassricaseantibiticos,porexemplo,afiltrao.Tradicionalmenteosmicrobiologistas
esterilizavamestesprodutosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomceasefibrasdeasbesto,
previamenteesterilizadosemautoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstitudosporfiltrosdeacetatode
celuloseoupolicarbonatosnosquaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraescomelevadosgrausde
preciso.Existemactualmentedisponveisnomercadofiltrosesterilizantesdevriosporosecapacidades
filtrantes.Osmaisfrequentese,porisso,maisacessveissofiltrosdeporosde0,45mou0,2mdedimetro,
queretmosmicrorganismospresentesnassolues.
Paraesterilizarumasoluoporfiltrao,nohmaisquepassaressasoluoatravsdeumdestesfiltrospela
aplicaodeumapressopositivanolquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefacodoarno
contentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatcnicarequerarecolhadofiltradoemcondiesde
assepsiaparaimpediracontaminaodolquidoesterilizado.
Salvorarasexcepes,afiltraoestrilnoretmaspartculasvirais.Nopodendoserconsideradocomo
mtodode"esterilizaodevrus".Afiltraoestrilmesmoumatcnicafrequentementeusadaemvirologia
paraapurificaodesuspensesviraispelaeliminaodebactriaspotencialmentecontaminantes.
DESINFECTANTES E ANTI-SPTICOS
Mltiplosreagentesqumicossodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaodemicrorganismos.Os
produtosusadosna"limpeza"deutensliosdiversos,frequentementedemasiadotxicosparaserusados
directamentenoHomem,sochamadosdedesinfectantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmo
objectivodeeliminareventuaismicrorganismos,soantispticos.
Particularmenteeficazemuitotilnolaboratrio,paraeliminaodevrusemicrorganismosasoluode
hipocloritodesdio(lixvia)comquesetratamosmateriaisdelaboratrioapsexposioaagentesinfecciosos.
13
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS
(NBDeumamaneirageralosprotocolosconstantesdestemanualforamadaptadosduraodeumasesso
prticadeduashoras,noconstituindo,nasuageneralidade,asmelhoresopestcnicasparaosobjectivos
pretendidos).
14
PIPETAGENS,DILUIESESOLUES
Introduo
Origornasdiluiesaefectuarcomalgunsmateriaisbiolgicosereagentes,nocontextodevriosdostrabalhos
experimentaisqueaquiseincluem,crticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Porqueseobservacomfrequnciaalgumainabilidadedosestudantesparaamanipulaoadequadadas
micropipetaseparaumraciocniooperacionaltantodasdiluiesexpressascomopotnciasde10comonaforma
deprepararsoluestituladas,introduzseestetrabalhopreliminar.
Materialereagentes
Soluoconcentradadeazuldemetileno
Sorofisiolgico(salino)
guadestilada
Micropipetasdiversas
Microtuboseppendorf
Espectrofotmetro
Procedimentoindividual
Pipetagem
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Marcarquatromicrotuboseppendorf(de1a4)
Paratubo2pipetar5Ldeguadestilada,portrsvezes(total15L)
Pesarindividualmentecadaumdosquatrotubos.
Registaraspesagens
Avaliarosresultados
Procedimento(porgrupo)
Diluiesdecimais
1.
Marque6tubosdeensaio(de1a6)
2.
Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenoproceda,sseguintesdiluiessequenciais:
Tubo
Solvente(ml)
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
Corante(ml)
5,0
0,5
Soluoprecedente(ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
Diluio(10 x )
3.
Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiesemcadatubo.
4.
Registeasintensidadesdecorobservveisnosdiferentestubos
5.
Determineaabsorvnciadassoluesa600660nm(lerdamaisdiludaparaamaisconcentrada).
15
Diluiesdetrsemtrs
1.
Marque6tubosdeensaio(de1a6)
2.
Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenoproceda,sseguintesdiluiessequenciais:
Tubo
Solvente(ml)
Corante(ml)
5,0
2,5
Soluoprecedente(ml)
2,5
2,5
2,5
2,5
Diluio(10 x )
3.
Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiesemcadatubo.
4.
5.
Registeasintensidadesdecorobservveisnosdiferentestubos
Determineaabsorvnciadassoluesdostuboscomnmeropara600660nm
TPC
Diluionica
1.
Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenocomoprocederiaparaapreparaode5mlde
cadaumadasseguintessolues:
i. Diluiode5x10 2
P
ii. Diluiode5x10 2
P
Preparaodesolues
Pretendendoseobter100mldecadaumadassoluesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosa
misturarparaasuapreparaonolaboratrio:
1. NaOH0,1N
2.
SO 4 H 2 0,1N
3.
NaCl0,1M
4.
NaCl100mM
5.
Glicerol10%(frmulaC 3 H 8 O 3 )
6.
7.
Glucose10%(frmulaC 6 H 12 O 6 )
Etanol70%(frmulaC 2 H 6 O 2 )
16
RegistodeobservaeseResultados
PIPETAGENSEDILUIES
Operador:
Data: ____/____/____
Pipetagens
Tubo
Volume
total
Peso
Diferena
Observaes
270L
480L
Tubo
Amostra
DO 600nm /ml
Concentrao
calculada
Observaes
Tubo
Amostra
DO 600nm /ml
Concentrao
calculada
Observaes
Diluiesdecimais
Diluiesdetrsemtrs
17
Grfico
Notas:
18
SOLUES
Operador:
Data: ____/____/____
Diluio
Componentes
5X10 2
P
Diluio
NaOH0,1N
5X10 2
P
Peso/volume
(100ml)
SO 4 H 2 0,1N
(100ml)
NaCl0,1M
(100ml)
NaCl100mM
(100ml)
Glicerol10%
(100ml)
Glucose10%
(100ml)
Etanol70%
(100ml)
Notas:
19
CULTURADEBACTRIAS(E.COLI)
MaterialeReagentes
Bactriarecombinante
LB10X:
o Bactotriptona
100g
o Extractodelevedura
50g
o NaCl
100g
o H2Odestiladaat
1000ml
pH7,5.
Autoclavar.Conservarestrila4C.
Diluirextemporneaeesterilmentea1:10comguaestril.
Ampicilina1000X
o 50mg/mlemgua.
Esterilizarporfiltrao,conservara20C
ProtocoloExperimental
1.
2.
3.
Preparar50mldemeioLB1X,contendoampicilina(50g/ml).
Inocularcombactriacontendooplasmdioapreparar.
Incubar37Cduranteumanoitesobagitao.
20
PREPARAODEDNAPLASMDICO
(LISEALCALINA)
(NBlongadurao)
MaterialeReagentes
Bactriarecombinante
LB1Xcomampicilina.
Lisozima(p)
Isopropanol
5MNaCl
Etanolpuroe70%
TEpH8,0
o 10mMTrisHClpH8,0
o 1mMEDTA)
Pronase20mg/mlemgua
o autodigeridadurante2horasa37C.Conservara20C
PronaseMix:
o Pronase
50l
o 10%SDS
86l
o H2O
860l
RNAseA10mg/mlem:
o 10mMTrisHClpH7,5
o 15mMNaCl
o incubadapor15minutosa100Cearrefecimentolento.Conservara20C
RNAsemix:
o RNAseA
40l
o TEpH8,0
10ml
SoluoI:
o 25mMTrisHClpH8,0
o 50mMGlucose
o 10mMEDTA
SoluoII:
o 0,2NNaOH
o 1%SDS
SoluoIII:
o 5MKOAc
60ml
o Ac.acticoglacial
11,5ml
o H2Odestilada
28,5ml
pH4,8
Fenol:clorofrmio:
o Fenoldestilado
50ml
o Clorofrmio
50ml
o Alcoolisoamlico
1ml
o 8hidroxiquinolena
0,1g
o TEpH8,0
15ml
(usarapenasafaseorgnica,decoramarela,noagitar)
21
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Usar50mldeculturasaturadadebactriarecombinante.
a. Centrifugar4.000XGdurante15minutosa4C.
b. Lavarosedimentodebactriascom5mldeLB.
c. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante.
Ressuspenderbemosedimentocom2mldeSoluoI.
Adicionar10mgdelisozima.Misturar.
a. Repousar10minutostemperaturaambiente.
Adicionar4mldeSoluoII.
a. Misturarporinverso.
b. Repousar10minutosnogelo.
Adicionar3mldeSoluoIII.
a. Misturar.
Centrifugar7.000XGdurante30minutosa4C.
a. Filtrarosobrenadanteporgazehidrfila.
Adicionar0,6volumesdeisopropanol.
b. Centrifugar7.000XGdurante30minutos.
c. Decantar.
Lavaroprecipitadocometanola70%.
Lavaroprecipitadocometanola96%.
a. Secaroprecipitado.
Dissolvercom500ldeRNAsemix.
a. Incubara37Cdurante60minutos.
Adicionar100ldePronasemix.
Extrair2vezescomfenol:clorofrmio(igualvolume).
a. Tomarafaseaquosa,seminterfase.
Adicionar0,04v.de5MNaCl(24*l)e2v.deetanolpuro(1,2ml).
a. Precipitarduranteumanoitea20C.
RecuperarDNAplasmdicoporcentrifugao(7.000XGdurante30minutos).
a. Dissolvercom50ldeTEpH8,0.
AvaliaraconcentraodeumaalquotaporleituradaDOa260nm
a. (50g/ml=1UDO)
22
MINIPREPARAODEDNAPLASMDICO
(MINIPREP)
MaterialeReagentes
(mesmosdaPreparaodeDNAPlasmdico)
1.
Inocular5mldeLBcomcadacolniaaanalisar.
a. Incubara37Cduranteumanoitecomagitao.
2. Pipetar1,5a2mldesuspensoparamicrotubo.
a. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga.
b. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante.
3. Ressuspenderosedimentocom100ldeSoluoI;Misturar.
4. Adicionar200ldeSoluoII;Misturarporinverso.
5. Adicionar150ldeSoluoIII;Misturar.
6. AgitarfortementemoparapartirDNAcromosomal.
7. Centrifugar5minutosnamicrocentrfuga.
8. Pipetar400ldesobrenadantelmpido(seminterfacenemprecipitadosobrenadante).
9. Adicionar250ldeisopropanol.
b. Centrifugar20minutosnamicrocentrfuga.
c. Decantar.
10. Lavaroprecipitadocometanolpuro.
a. Centrifugar5minutosnamicrocentrfuga.
b. Decantar,escorreresecar.
11. Dissolvercom50ldeRNAsemix.
12. Usar10lparadigestocomenzimaderestrio.
23
DIGESTOCOMENZIMASDERESTRIO
MaterialeReagentes
SoluodeDNAaanalisar
Enzimasderestrio:
o BamHI(10U/l)
o EcoRI(20U/l)
o SalI(20U/l)
Fenol:clorofrmio
Tampodeenzima10X(dofabricante)ou
TUS10X(TampoUniversalStratagene)
o 1MKOAc
o 250mMTris/Acetato,pH7,6
o 100mMMgOAc
o 5mMMercaptoetanol
o 100g/mlBSA
1.
Emmicrotubo,adicionarsequencialmente:
a. H 2 Oestril
19,25l(ouq.b.p.25lfinal)
b. SoluodeDNA
1l(1g)
c. TUS10X
3,75l(1,5Xfinal)
d. Soluodeenzima
1l(10Unidades)
Misturarnovortex.
Centrifugarbrevementeparalevartudoparaofundodotubo.
Incubara37Cdurante1hora.
Desproteinizarpelofenol:clorofrmio:
a. Adicionar25ldefenol:clorofrmio.
b. Misturarbem.
c. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga.
d. Pipetarfaseaquosaparanovotubo.
Tomar10lparaanliseemgel.
B
2.
3.
4.
5.
6.
24
ANLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE
MaterialeReagentes
SoluodeDNAaanalisar
DNAmarcador:
o lambdaXBstEII
TBE10X
o 890mMTris
o 890mMcidobrico
o 20mMEDTA
pH8,0
AgarosemdiaoubaixaEEO(SigmaTipoIIouV)
Brometodeetdio10mg/ml
DyeDNAs(IndicadordeMigrao):
o 25%Ficoll400
o 0,25%OrangeG
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Preparaodogel
a. Prepararomoldeparaogel.
b. Fundiraagarose(0,7%)em95%volumefinaldegua.
c. Arrefeceracercade50C.
d. Adicionar5%deTBE10X(0,5Xfinal).
e. Adicionar0,005%Brometodeetdio(0,5g/mlfinal).
f. Misturareverternomolde.
g. Colocaropenteedeixarsolidificar.
Colocarogelnoaparelho,apenassubmersoemTBE0,5X.
AplicarasamostrasdeDNA,contendo10a20%deDyeDNAs.
AplicarumaamostradeDNAmarcador(0,5a1g)
Procederseparaoelectrofortica(75V),atconvenientemigrao.
VisualizarnotransiluminadorsobluzUV(300a320nm).
a. Observarogel
Registarasbandas(desenhar)
Fotografarogelcomfiltrovermelhodegelatina.
25
PREPARAODEBACTRIASCOMPETENTES
MaterialeReagentes
E.ColiXL1B
LB10X
Tetraciclina1000X:
o 12,5mg/mlem50%etanol.Conservara20C.
100mMCaCl 2 (filtraoestril)
Glicerol50%(v/v)(filtraoestril)
B
1.
2.
Inocular10mldeLB1X(Tetraciclinaopcional)comcolniadeE.coliXL1B.
a. Incubara37Csobforteagitao,duranteumanoite.
Usar4mldaculturaparainocular50mldeLBpraquecidoa37C.
a. Incubara37Csobforteagitaoat0,2UDOa600nm(cercade2X10 7 bactrias/ml)(2a4
horasantesdaaula).
b. Arrefecer15minutosembanhodegelo.
c. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4C.
d. Decantar.
Ressuspenderosedimentodebactriasem20mlde100mMCaCl 2 .
a. Repousar15minutosnogelo.
b. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4C.
c. Decantar.
Ressuspenderosedimentodebactriascom5mlde100mMCaCl 2 .
Adicionar20%deglicerola50%(10%final)
a. Repousardurante30minutosa4C
Repartiralquotasde50la500lpormicrotubos
a. Conservarcongeladoa80C
Testaraeficciadetransformaocom50ldebactriascompetentes
P
3.
4.
5.
6.
7.
26
TRANSFORMAO
MaterialeReagentes
Bactriascompetentes
SoluodeDNAsplasmdico(pDNA)
LB10X
Ampicilina1000X
PlacasdeAgar/LB/Amp:
BactoAgar
7.5g
LB10X
50ml
H 2 Oat
500ml
Autoclavar,Deixararrefecera50C.Adicionar500ldeAmpicilina1000X.
Repartirdeimediatopelasplacasdepetri.
B
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Pipetarparaummicrotubo5ldesoluodepDNA.
Pipetarparaoutromicrotubo5ldesoluodepDNAdiludaa1:100.
Adicionar50ldebactriascompetentesacadatubo.
a. Homogeneizarnovortex.
c. Incubara37Cdurante5minutos.
Adicionar1mldemeioLBpraquecido(semantibitico).
a. Incubara37Cdurante1hora.
b. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga.
c. Decantar.
Ressuspenderasbactriasem200ldemeioLB.
EspalharsobreplacadeAgar/LB/Ampatsecar.
a. Incubara37Cemestufaduranteumanoite.
Picarcolnias.
27
ANLISEDEPROTENARECOMBINANTE
NB.Apartirdecolniadebactriatransformada,queexprimaumaprotenarecombinante,extraireanalisarem
geldeelectroforeseosperfisproteicosdabactriainduzidaenoinduzida.
MaterialeReagentes
Bactriarecombinante(pCS938.15)
LB/Amp
IPTG100mM
Protocoloexperimental
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
RessuscitarculturadebactriarecombinanteemmeiodeculturaLB/Amp/Agar(slido)
Expandirumacolniaem10mLdemeioLB/Amp(lquido)
Incubaro/n37Csobagitao
Adicionar4mLdeLB/AMPpraquecidoa2tubosesterilizados
Inocular1mLdeculturabacterianaemcadatubo
Adicionaraumdostubos(INDUZIDO)50LdeIPTG100mM
Incubarasduasculturasa37Cdurante30minutos,sobagitao
Tomar,decadacultura,para2microtubos,1mldesuspenso(4tubos)
Centrifugar2minutos
Decantarerejeitarsobrenadantes
a. Congelar20Cumtubodebactriainduzidaeoutrodebactrianoinduzida
11. Resuspenderossedimentosdosoutrostuboscom1,5mLdesalino
a. AvaliareregistaraDOa550nm
28
ELECTROFORESEDEPROTENAS(PAGE)
MaterialeReagentes
Extractosdebactriarecombinante(pCS938.15)comexpressoinduzidaenoinduzida
Acrilamidaa50%(esterilizadaporfiltrao)
Bisacrilamidaa1,25%
Tris1,5MpH8.8
Tris1,5MpH6.8
SDS10%
TEMED10%
Persulfatodeamnio10%(extemporneo)
TampoLaemmli10X:
Tris250mM
Glicina1,92M
SDS1%
pH8.3
Tampodeelctrodos:
T.Laemmli1X
Tampodeamostra(2X):
Tris125mMpH6.8
SDS4%
Glicerol20%
BME10%
Azuldebromofenol0,2%
Soluodecolorao:
AzuldeCoomassie0,2%
Metanol50%
cidoacticoglacial10%
Soluodediferenciao
Metanol10%
cidoacticoglacial10%
29
PREPARAO DAS AMOSTRAS

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ressuspender,descongelando,cadasedimentodebactriasrecombinantesinduzidasenoinduzidas
com100ldetampodeamostra
Aqueceremguaferventedurante3minutos
Centrifugar10.000GX3min
Tomarosobrenadanteparanovotubo
Arrefeceremgelo
Conservarcongeladoa20C,senecessrio
Tomarparagel0,15UDOa550nm(calculadocombasenaDOdaculturaanteriormentedeterminada)
PREPARAO DO GEL
1.
2.
Montaromoldeparaogel(dentrodeplstico)
Preparargeldeseparao(emErlenmeyer):
a. Acrilamida40%
7,5mL
b. Bisacrilamida1,25%
3,0mL
c. Tris1,5MpH8.8
7,5mL
d. SDS10%
300L
e. H2O
11,4mL
f. TEMED10%
150l
g. Persulfatodeamnioa10%
150l
3. Homogeneizarsemintroduzirmuitoar
4. Verternomolde
5. Adicionarpequenovolumedeguanasuperfciedogel(semmisturar)
6. Deixarpolimerizar(20a30min)
7. Preparargeldestacking(emErlenmeyer):
a. Acrilamida40%
900L
b. Bisacrilamida1,25%
500l
c. Tris1,5MpH6.8
1,8mL
d. SDS10%
75l
e. H2O
5,1ml
f. TEMED10%
75l
g. Persulfatodeamnioa10%
75l
8. Removeraguasobrenadantedogeldeseparao
9. Colocaropente
10. Verterogeldestacking
11. Deixarpolimerizar(10a20minutos)
30
ELECTROFORESE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Montarogelnatinadeelectroforese
Encherascmarasdoselctrodoscomotampodeelectroforese
Aplicar50ldeamostraporpoodogel(0,15UDOa550nm)
Registaralocalizaodecadaamostra
Ligaracorrenteelctrica(70volts)ataoindicadordemigraoseposicionarnofimdogel(5horas)
Desmontarosistemarecuperandoogel
COLORAO DAS PROTENAS

1.
2.
3.
4.
5.
6.
Mergulharogelemabundantesoluodecolorao
a. Corardurante30minutoscomagitao
Passarogelparasoluodediferenciao.
Mergulharemabundantesoluodediferenciao
a. Diferenciarcomagitaoatcontrasteconveniente(mudarsoluoquandonecessrio)
Observaremtransiluminadordovisvel
Registarosresultados(desenharasbandas).
Fotografar
31
ANEXOSPLASMDIOS
PCS11
32
PCS62
33
PCS71
34
PCS84
35
PSK+
36
ANEXOSENZIMAS
BAMH I
Origem:BacillusamyloliquefaciensH
5...G^GATCC...3
3...CCTAG^G...5
ReacoEnzimtica:
150mMNaCl
10mMTrisHCl
10mMMgCl2
1mMdithiothreitol
100g/mlBSA.
pH7.9
Incubaoa37C.
Inactivaopelocalor:No
ECO RI
Origem:E.coliRY13
5...G^AATTC...3
3...CTTAA^G...5
ReacoEnzimtica:
50mMNaCl
100mMTrisHCl
10mMMgCl2
0.025%TritonX100
pH7.5
Incubaoa37C
Inactivaopelocalor:65CX20minutos
SAL I
Origem:StreptomycesalbusG
5...G^TCGAC...3
3...CAGCT^G...5
ReacoEnzimtica:
150mMNaCl
10mMTrisHCl
10mMMgCl2
1mMdithiothreitol
100g/mlBSA
pH7.9
Incubaoa37C.
Inactivaopelocalor:65CX20minutos
37
ANEXOSTABELAPERIDICA
38
TRABALHOAUTNOMOPARARELATRIOFINAL
CadagruporeceberumDNAplasmdiconoidentificado,emquantidadevestigial
Problema:
Identificaroplasmdio.
Relataraestratgiaadoptada,osprocedimentosutilizadoseosresultadosobtidos
Estratgiasugerida
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Prepararbactriascompetentes
TransformarcomoDNAdesconhecido
PrepararDNAplasmdicoemquantidadeadequada
Digerircomasenzimasderestrio
Analisarfragmentosemgel
Compararcomosperfisobtidoscomosdosplasmdiosincludosnestemanual,paraidentificao.
NOTAS/Registoderesultados
E:\Documents\UEVORA\Disciplinas\EngGenet\201011\Manual.docx
CarlosSinogas
39

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