STUDIO DI EFFICACIA IN VITRO

VALUTAZIONE IN VITRO DEL POTENZIALE DI PENETRAZIONE DI

DUE PRINCIPI ATTIVI ATTRAVERSO UN MODELLO DI
EPIDERMIDE UMANA RICOSTRUITA

IN VITRO EFFICACY STUDY

IN VITRO EVALUATION OF THE PENETRATION POTENTIAL
THROUGHT RECONSTRUCTED HUMAN EPIDERMIS
OF TWO ACTIVE INGREDIENTS

DIFA COOPER S.P.A.

ENSTILAR® SCHIUMA
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INDICE | INDEX

KEY PERSONNEL pag. 3

REGISTRO MODIFICHE REPORT / REPORT CHANGE RECORD pag. 3

1. DISEGNO DELLO STUDIO / STUDY DESIGN pag. 4

1.1 Titolo / Title pag. 4

1.2 Scopo dello studio / Study aim pag. 4

1.3 Prodotto sottoposto a test / Test item pag. 4

2. MATERIALI E METODI / MATERIALS AND METHODS pag. 6

2.1 Modello sperimentale / Experimental model pag. 6

2.2 Preparazione del campione / Preparation of the test item pag. 6

2.3 Modalità di esposizione /Exposure method pag. 7

2.4 Dosaggio analitico / Analytical dosage pag. 7

2.5 Risultati / Results pag. 8

3. RISULTATI E CONCLUSIONI / RESULTS AND CONCLUSIONS pag. 9

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KEY PERSONNEL

Società committente / Customer

DIFA COOPER S.P.A.

Via Milano, 160
21042 Caronno Pertusella (VA)
Italia

Sperimentatore / Experimenter

Dott. Andrea POGGI

Biologo / Biologist
Complife Italia S.r.l

Direttore dello studio / Study Director

Dott.ssa Silvana GIARDINA
Biologa / Biologist
Complife Italia S.r.l

Complife Italia S.r.l

Location
Via Angelini, 21
27028 San Martino Siccomario (PV)
Italy
tel. +39-0382 25504 - fax +39-0382 536006
Mail: info@complifegroup.com

REGISTRO MODIFICHE REPORT | REPORT CHANGE RECORD

La tabella sottostante riporta il registro di tutte le modifiche approvate fatte al documento a partire dalla sua
approvazione iniziale. |The table here below reports the change log of all approved changes made to the document
after initial approval.

Rev. no Date Description

00 21/04/2022 Draft Report release

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1. DISEGNO DELLO STUDIO | STUDY DESIGN

1.1 Titolo | Title
STUDIO DI EFFICACIA IN VITRO: valutazione in vitro del potenziale di penetrazione di due principi attivi attraverso un
modello di epidermide umana ricostruita.

IN VITRO EFFICACY STUDY: in vitro evaluation of the penetration potential through reconstructed human epidermis of
two active ingredients.
1.2 Scopo dello studio | Study aim
Lo scopo del test è la valutazione del potenziale di penetrazione del Betametasone e del Calcipotriolo contenuti in un
prodotto medicinale attraverso un modello di epidermide umana ricostruita in vitro. Lo studio è stato eseguito per la
valutazione sperimentale del potenziale di penetrazione attraverso l'epidermide umana in vitro (modello specifico per
la destinazione d'uso del prodotto).
Lo studio di penetrazione è effettuato secondo i principi generali dell'OCDE TG 428.

The purpose of the test is the evaluation of the penetration potential of the Betamethasone and Calcipotriol contained
in a medical product through an in vitro reconstructed human epidermis model. The study was performed for the
experimental evaluation of penetration potential through the in vitro human epidermis (specific model for product
destination of use).
The penetration study is performed following the general principles of OECD TG 428.

Il sistema sperimentale è rappresentato nella seguente immagine:

The experimental system is represented in the following image:

Penetrazione attraverso il tessuto Applicazione del prodotto sulla superficie del tessuto
/Penetration through the epithelium / Product spread on the surface of the epidermis

Epidermide umana ricostruita in vitro /

Reconstructed human epidermis

Medium di raccolta per le sostanze penetrate /

Medium for the collection of the penetrated substances

1.3 Prodotto sottoposto al test / Test item

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ENSTILAR® SCHIUMA

Descrizione del campione/ Sample description

Prodotto medicinale in forma di schiuma per uso cutaneo con la seguente composizione fornita dal Cliente / Medical
product in form of foam for cutaneous use with the following composition provided by the Sponsor:

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Date di esecuzione/ Data of execution

Da/ From 21/01/2022 a/to 15/04/2022

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2. MATERIALI E METODI | MATERIALS AND METHODS

2.1 Modello sperimentale | Experimental model
Il modello biologico utilizzato nel test è Human Reconstructed Epidermis di Mattek, con le seguenti specifiche:
The biological model used in the test was Human Reconstructed Epidermis by Mattek, with the following specifications:

2.2 Preparazione del campione | Preparation of the test item

Il campione è stato testato tal quale mediante applicazione diretta.
La quantità di prodotto da applicare sulla superficie del tessuto è stata scelta sulla base delle informazioni dello stesso
e del metodo sperimentale utilizzato.
50 mg di prodotto sono stati applicati sulla superficie del tessuto in esposizione singola per 4h di trattamento.
Il test viene svolto in triplo.

The sample was tested as it is by means of direct application.

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The quantity of product to apply on the tissue surface was chosen according to product information and to the
experimental method used. 50 mg of product were applied on tissue surface in single application for 4 hours exposure
of treatment.
The test was performed in triplicate.

2.3 Modalità di esposizione | Exposure method

Pre-incubazione / Pre-incubation step
Un numero appropriato di piastre è stato riempito con 900 μL di terreno di coltura di mantenimento.
Utilizzando pinzette sterili, i tessuti sono stati rimossi dall’agarosio e il fondo del pozzetto è stato pulito con carta
assorbente per rimuovere gli eventuali residui di agarosio.
I tessuti puliti sono stati trasferiti in terreno fresco e posti in incubatore a 37°C, 5% CO2 fino al momento del test.

An appropriate number of well plates are filled with 900 μL maintenance culture medium.
Using sterile forceps, tissues are taken off from the agarose, the bottom of the insert is cleaned on sterile absorbent
paper or gauze to remove eventual remaining agarose pieces. The tissues are transferred on fresh medium by first
sloping the insert before complete insert setting at the air-liquid interface. Tissues are placed at 37°C, 5% CO2 until test
substance application.

Applicazione del prodotto e risciacquo / Application of test substance and rinsing

Il terreno di coltura è stato pre-riscaldato a temperatura ambiente.
Piastre sono state riempite con 1000 μL terreno pre-riscaldato. I tessuti sono stati trasferiti nei pozzetti mediante
pinzette sterili.
50 mg di prodotto sono stati applicati sulla superficie del tessuto per 4 ore in singola applicazione.
In parallelo il test è stato eseguito su tessuti di controllo non trattati.
Alla fine del trattamento i tessuti sono stati sciacquati con 4 ml di PBS pipettando a 5-8 cm di distanza dal tessuto
ripetutamente per rimuovere ogni residuo di campione. Il liquido di scolo è stato fatto scivolare attraverso un imbuto
in un baker, stando attenti ad evitare schizzi e contaminazioni. Il fondo del pozzetto è stato asciugato su carta
assorbente o garza sterile per 1-2 secondi. Infine, la superficie del tessuto è stata asciugata con la punta di un
bastoncino di cotone.

The maintenance culture medium is pre-warmed at room temperature.

Wells plates are filled with 1000 μL pre-warmed maintenance culture medium. Using sterile forceps, tissues are
transferred by first sloping the insert before complete insert setting at the air-liquid interface.
50 mg of product were applied to the tissue surface for 4 hours in single application.
In parallel, the test was performed on not treated control tissues.
At the end of treatment, tissues were rinsed thoroughly several times with 4 ml of PBS at a 5-8 cm distance from the
insert to remove all residual test substance from the tissue surface. The run-off liquid was slipped through a funnel into
a beaker, being careful to avoid splattering and contamination. The bottom of the well was dried on sterile absorbent
paper or sterile gauze for 1-2 seconds. The surface of the tissue was dried with the tip of a cotton swab.

2.4 Dosaggio analitico | Analytical dosage

Al termine dei trattamenti sperimentali, i terreni di coltura, gli omogenati e le soluzioni di lavaggio sono stati raccolti
per i successivi dosaggi biochimici.
I dosaggi analitici sono stati eseguiti per dosare rispettivamente la quantità di attivi Betametasone e Calcipotriolo
penetrati e rilasciati nel medium sottostante, penetrati e non rilasciati dall’epidermide e la quantità di sostanze non
penetrate.
I dosaggi analitici sono stati eseguiti mediante kit ELISA commercialmente disponibili. I kit ELISA sfruttano il legame
competitivo di un antigene con il suo anticorpo primario. Il complesso immune (antigene-anticorpo) viene a sua volta
riconosciuto da un anticorpo secondario coniugato ad una perossidasi. L’aggiunta del substrato della perossidasi

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produce una reazione colorimetrica con intensità proporzionale alla quantità di complessi immuni presenti e quindi
alla quantità di molecola target legata. La determinazione quantitativa sfrutta una curva di calibrazione costruita con
concentrazioni note e crescenti di marker standard.

At the end of treatments, the media underlying the tissues of human reconstructed epidermis, homogenates and
washing solutions were collected.
Analytical dosages were performed on the media, homogenates and washing solutions to quantify the amount of the
active ingredients Betamethasone and Calcipotriol contained in the test item, penetrated and released into the
underlying medium; penetrated and not released by the epidermis; and to quantify the amount of substances not
penetrated through the epidermis.
Commercially available ELISA kits are used. ELISA kits use the competitive binding between an antigen and its primary
antibody. The immune complex (antigen-antibody) was bond by a secondary antibody conjugated to a peroxidase. The
addition of the enzyme substrate gives a colorimetric reaction with intensity proportional to the immune complex
presence, and so to the target molecule.
The quantitative determination uses a calibration curve made-up of standard known and growing concentrations of
standard marker.

2.5 Risultati | Results

La quantità di sostanza penetrata attraverso l’epidermide è stata calcolata sulla base dei dati sperimentalmente
ottenuti e del volume di prodotto applicato (50 mg)
I risultati sono espressi come quantità media di Betametasone e Calcipotriolo penetrato attraverso l’epidermide e
rilasciato nel medium sottostante e come percentuale di penetrazione comparata alla quantità di prodotto applicato
sulla superficie del tessuto.

On the basis of the experimental data obtained and the volume of applied product (50 mg), the quantity of substance
penetrated through the epidermis was calculated.
The results are expressed as mean amount of Betamethasone and Calcipotriol penetrated through the epidermis and
released into the underlying medium and as percentage of penetration compared to the amount of product applied on
the tissue surface.

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3. RISULTATI E CONCLUSIONI | RESULTS AND CONCLUSIONS

I risultati ottenuti dal dosaggio analitico del medium di coltura, negli omogenati e nelle soluzioni di lavaggio espressi
come quantità media di Betametasone (ng) e di Calcipotriolo (ng) e come percentuale di penetrazione, sono riportati
nella tabella sottostante.
The results obtained by the analytical dosage in culture medium, in homogenates and in washing solutions expressed
as mean amount (ng) of Betamethasone and (ng) Calcipotriol, and as percentage of penetration, are reported in the
table below.

Sperimentatore | Experimenter Direttore dello studio | Study director

Dott. Andrea POGGI Dott.ssa Silvana GIARDINA

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► The result(s) cited in the present report refer(s) only to the tested sample and to the particular experimental conditions hereby
described.
► This report or parts of it can be reproduced only with the Complife Italia s.r.l. agreement.
► A copy of this report is kept on file at Complife Italia s.r.l.

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