CLART PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2

GENOTIPADO DE PAPILLOMAVIRUS HUMANO MEDIANTE IDENTIFICACIN GENMICA PARA DIAGNSTICO IN VITRO

CLART PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2 Extraccin-Purificacin y Amplificacin 24 determinaciones 48 determinaciones Ref: AT-1104-24-MT Ref: AT-1104-48-MT Ref: AS-0108-48-PL Ref: AS-0108-96-PL

96 determinaciones

CLART PAPILLOMAVIRUS HUMANO 2 Genotipado 24 determinaciones 48 determinaciones Ref: AT-1204-24 Ref: AT-1204-48 Ref: CS-0208-48 Ref: CS-0208-96

96 determinaciones

Solicitud de patente internacional n PCT/6132006/05031 y solicitudes nacionales correspondientes.

GENOMICA, S.A.U. Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91 www.genomica.es

Versin 9 Diciembre 2010

NDICE: 1. GLOSARIO DE TRMINOS

2. INTRODUCCIN 3. DESCRIPCIN DEL PROTOCOLO

4. COMPONENTES Y CONSERVACIN DEL KIT 4.1. Reactivos de extraccin, purificacin y amplificacin 4.2. Reactivos de visualizacin 4.3. Otros componentes 5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO 5.1. Reactivos y material 5.2. Equipos 6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIN 6.1. Recomendaciones generales 6.2. Precauciones para la visualizacin 7. TOMA DE MUESTRAS 7.1. Frotis 7.2. Suspensiones celulares 7.3. Tejido fijado en formol e incluido en parafina 8. PROTOCOLO DE TRABAJO 8.1. Extraccin del ADN de PVH 8.1.1. Extraccin manual 8.1.2 Extraccin automtica 8.2. Reaccin de amplificacin 8.3. Visualizacin del producto amplificado 8.3.1. Visualizacin en Array Tubes (AT) 8.3.2. Visualizacin en CLART Strips (CS) 9. LECTURA DE RESULTADOS 10. INTERPRETACIN DE RESULTADOS 11. ESPECIFICACIONES TCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO 12. BIBLIOGRAFA 13. TABLAS

1.

GLOSARIO DE TRMINOS

Atencin, ver instrucciones de uso

Fecha de caducidad

Producto sanitario para Diagnstico In Vitro

Lote

25C

Conservar a temperatura ambiente

20C

8C

Conservar entre 4 C y 8 C
4C

-18C

Conservar entre 30 C y 18 C
30C

2.

INTRODUCCIN

El objetivo de esta nueva versin de CLART Papillomavirus humano 2 es el aumento significativo de la sensibilidad y especificidad de la tcnica, para dotar al facultativo de una herramienta de precisin a la hora de diagnosticar el Papillomavirus humano (PVH). La eficacia del tipado previo de VPH como herramienta de diagnstico y prevencin para la deteccin de cncer cervical y neoplasia intraepitelial ha quedado sobradamente demostrada en recientes y masivos ensayos clnicos (Ronco et al, 2010). Como resultado, GENOMICA ha diseado un producto cuya especificidad y sensiblidad diagnstica alcanza el 98 y el 100% respectivamente. En los ltimos aos se ha determinado que la infeccin con el virus del Papilloma Humano es la principal causa de cncer de cuello de tero y de neoplasia cervical intraepitelial (Walboomers et al. 1999, Bosch et al. 2002, Kjaer et al, 2010). 50 de los 100 tipos de PVH que han sido descritos hasta la fecha, se han encontrado en la mucosa anogenital. Los tipos anogenitales, virus de tramisin sexual, se han clasificado en dos grupos de riesgo segn su asociacin con el cncer de cuello de tero (Dunne et al., 2007): Tipos de bajo riesgo oncognico: incluyen los tipos 6, 11, 32, 40, 42, 44, 54, 55, 61, 62, 64, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 87, 89 y 91. Tipos de alto riesgo oncognico: incluyen los tipos 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82 y 85.

Esta clasificacin epidemiolgica resalta la relevancia de identificar los tipos de PVH causantes de la infeccin, para poder determinar el tratamiento mdico adecuado.

Figura 1: JAMA, Dunne et al., 2007

El kit est basado en la amplificacin de fragmentos especficos del genoma vrico y su posterior hibridacin con sondas especficas para cada tipo de PVH. CLART Papillomavirus humano 2 es capaz de detectar infecciones y coinfecciones de hasta 35 genotipos en un nico tubo, lo que conlleva un amplio nmero de ventajas: 1 2 Su alta sensibilidad permite la deteccin de cantidades mnimas de ADN vrico. La elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una regin altamente conservada dentro del genoma vrico y sondas de captura especficas para cada tipo de PVH. Fcil de estandarizar en un laboratorio hospitalario. Rapidez, se obtienen los resultados de los anlisis en 8 h.

3 4

3.

DESCRIPCIN DEL PROTOCOLO

CLART Papillomavirus humano 2 detecta la presencia de los 35 virus de PVH (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89) con mayor importancia clnica (ver Fig. 1) en distintos tipos de muestras humanas (frotis, suspensiones celulares y tejido fijado en formol e incluido en parafina). La deteccin se lleva a cabo mediante la amplificacin de un fragmento de unos 450 pb dentro de la regin L1 del virus por tratarse de una secuencia que est altamente conservada entre los distintos tipos de PVH. Sin embargo, esta regin presenta suficientes variaciones como para poder diferenciar cada tipo de virus con sondas especficas. De esta manera, se asegura la especificidad de la deteccin. La deteccin del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una nueva plataforma tecnolgica basada en microarrays de baja densidad: CLART (Clinical Array Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy cmodo y eficaz que consiste en incluir un microarray en la parte inferior de un tubo de 2 ml (Array TubeTM-AT) o en el fondo de un pocillo de placa microtiter (CLART Strip-CS) (Figura 2), lo que simplifica todo el proceso de hibridacin y visualizacin frente a los sistemas de arrays clsicos.

Figura 2. Plataforma CLART Strip-CS en forma de tira de 8 pocillos.

El sistema de deteccin con CLART Papillomavirus humano 2 se basa en la precipitacin de un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridacin de los productos amplificados con las sondas especficas. Durante la PCR, los productos amplificados se marcan con biotina. Despus de la amplificacin, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas especficas que estn inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a travs de la estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas especficas) y la actividad peroxidasa provoca la aparicin de un producto insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en las que ocurre la hibridacin (Figura 3).

Sondas sobre array

Producto marcado biotina

Hibridacin

Incubacin con el conjugado Reaccin de revelado

Conjugado

Precipitacin del sustrato

Figura 3: Esquema del mtodo de visualizacin. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A travs de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de rbano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la accin de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridacin.

La sensibilidad obtenida combinando la amplificacin genmica y la visualizacin en el microarray con el kit CLART Papillomavirus humano 2 es tan alta, que no es necesario hacer dobles amplificaciones (nested) evitando el riesgo de contaminacin que stas conllevan.

4. COMPONENTES Y CONSERVACIN DEL KIT El kit CLART Papillomavirus humano 2 contiene suficientes reactivos para la extraccin y anlisis del ADN de 24, 48 96 muestras clnicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas de conservacin hasta la fecha de caducidad indicada. 4.1. Reactivos de extraccin, purificacin y amplificacin 1 El kit de Extraccin y Purificacin CLART Papillomavirus humano 2 se enva a 4C o a temperatura ambiente. La proteinasa K una vez resuspendida debe conservarse a 4 C. Sus componentes son: 1 Columnas de purificacin acopladas a tubos de 2 ml 2 Tubos de 2 ml 3 Buffer T1 4 Buffer B1 5 Buffer B2 6 Buffer B5 7 Buffer BE 8 Buffer BW 9 Etiqueta para Buffer B3 10 Proteinasa K liofilizada 11 Buffer PB

Los reactivos de amplificacin se envan a -20 C. Son los siguientes: Tubos de Amplificacin contienen 45 l de mezcla de reaccin. Estn listos para su uso y deben mantenerse a -20C. Slo se deben descongelar sobre hielo el nmero preciso de tubos de amplificacin que se vayan a procesar, conservando el resto de los tubos a la temperatura indicada. En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura; la aparicin de un color rojizo en la ventana de visualizacin indica que en algn momento los productos han sobrepasado la temperatura de conservacin de 20oC y no deben utilizarse.

4.2. Reactivos de visualizacin Se envan a 4 C. Son los siguientes:

1. Microarrays: Tubos AT o Tiras CS (sondas especficas incluidas). Se suministran en un sobre termosellado. Conservarlos siempre cerrados, a temperatura ambiente y protegidos de la luz. 2. SH (Solucin de Hibridacin). Conservar a 4 C. 3. DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 C. 4. CJ (Conjugado). Conservar a 4 C. Dar un pulso en la centrfuga antes de usar. 5. RE (Solucin de Revelado). Conservar a 4 C. 6. TL (Tampn de Lavado). Conservar a 4 C. 7. Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos. ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, los microarrrays deben conservarse a temperatura ambiente.

4.3. Otros componentes Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesita un equipo o lector, un adaptador, y un software, capaces de generar de manera automtica un informe por cada muestra analizada: Lector CAR (Clinical Array Reader) (figura 4): permite la lectura e interpretacin automtica de hasta 12 CS, es decir, de hasta un mximo de 96 muestras. En este lector tambin pueden leerse ATs. Est fabricado y distribuido por GENOMICA para su uso exclusivo con los kits de diagnstico. Soporte adaptador que se coloca sobre la bandeja del CAR, sobre el cual se acopla la placa antes de la lectura. Software: especfico para CLART HPV2, diseado y validado por GENOMICA.

CAR (Clinical Array Reader)

Figura 4. CAR

5.

MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO

5.1. Reactivos y material 1 2 3 4 5 6 7 8 Agua destilada. Etanol 96% Guantes desechables. Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo. Recipiente con hielo picado. Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados. Gradillas para tubos de 1,5 ml. Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.

5.2. Equipos 2 3 4 5 6 7 8 Microcentrfuga. Termociclador. Tres micropipetas ajustables entre 1-20 l, 20-200 l y 200-1000 l para el laboratorio de extraccin. Tres micropipetas ajustables entre 1-20 l, 20-200 l y 200-1000 l para el laboratorio de visualizacin. Termomixer con agitacin ajustable a 37, 55, 60 y 100C. Compatible con tubos tipo Eppendorf y con tiras de 8 pocillos. Vortex. Sistema de vaco (opcional).

6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIN Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente antes de comenzar la tcnica.

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6.1. Recomendaciones generales: 1. La tcnica se debe realizar en dos reas separadas fsicamente, para evitar la contaminacin de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de las reas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas. 1 rea pre-PCR: En esta rea se hace la extraccin del ADN y preparacin de las muestras. rea post-PCR: En esta rea se lleva a cabo la amplificacin y la visualizacin del producto amplificado. El material de esta rea nunca ha de entrar en contacto con el del rea de extraccin. Evitar ir al rea de pre-PCR despus de haber estado trabajando en el rea de visualizacin.

2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con cierta frecuencia. 3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas, termociclador) en profundidad con leja diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente despus de una contaminacin. 4. Emplear siempre puntas con filtro o pipetas de desplazamiento positivo para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. 5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado. 6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes aunque sean del mismo lote. 7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente despus de su uso para evitar contaminaciones. 8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo. 9. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas o ADN extrado por un protocolo distinto al indicado. 6.2. Precauciones para la visualizacin

1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vaco toque el fondo del tubo, ya que podra daarse el micro-array situado en el fondo.

2. Se recomienda aadir cada solucin sobre la pared del tubo AT/CS, nunca directamente sobre el fondo. 3. Es conveniente no aadir la solucin SH hasta que se vayan a aadir los

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productos desnaturalizados de PCR. 4. En el caso de procesar AT es muy importante eliminar completamente todo resto de solucin antes de aadir la siguiente. En el caso de procesar CS se dejar un ligero remanente de volumen de manera que el array en ningn momento quede seco. 5. Tras la incubacin con la solucin CJ, es muy importante lavar bien el tubo AT/CS y la tapa del tubo para evitar que queden restos de ste y que reaccionen con la solucin RE, produciendo un precipitado inespecfico que pueda dar lugar a interpretaciones errneas del resultado. 6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al aadir cualquiera de las distintas soluciones. 7. Mantener limpia la base del tubo AT/CS para evitar posibles interferencias en la lectura de resultados. 8. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de posicin y de que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso contrario, limpiar el fondo del tubo por fuera con un papel de celulosa o golpear suavemente el tubo con el dedo.

7. TOMA DE MUESTRAS 7.1. Frotis Tomar la muestra con una torunda seca y estril, de algodn o alginato, lo suficientemente grande como para obtener una buena cantidad de muestra. No utilizar dispositivos que produzcan el sangrado de la lesin. Volver a introducir la torunda en su tubo sin ningn tipo de medio. Conservar la muestra a 4C si se va a procesar antes de 7 das o a 20C si se va procesar despus.

7.2. Suspensiones celulares Estas suspensiones celulares son del tipo de las utilizadas para realizar citologas cervicovaginales de capa fina por filtracin a travs de membranas (ThinPrep, Cytyc). Tomar la muestra con un cepillo o esptula. Resuspender la muestra agitando el dispositivo utilizado en un vial con medio de transporte. Desechar el dispositivo utilizado y conservar la muestra a 4C hasta su procesamiento. 7.3. Tejido fijado en formol e incluido en parafina Fijar las muestras en formol tamponado durante el menor tiempo posible (nunca ms de 24 horas). El empleo de formol no tamponado o la fijacin durante ms de 24 horas puede degradar el ADN de la muestra. Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla con xileno, antes y despus de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada anteriormente. Quitar con una

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cuchilla la parafina sobrante alrededor de la pieza. Hacer con el microtomo 2-3 cortes de 5 m y ponerlos en un tubo estril de 1,5 ml.

8. PROTOCOLO DE TRABAJO 8.1.1. Extraccin manual del ADN de PVH Recomendaciones especficas antes de comenzar la extraccin: 1 Preparar la solucin B3: aadir el Buffer B1 al Buffer B2 y agitar. El Buffer resultante B3, ha de almacenarse protegido de la luz y a temperatura ambiente; en estas condiciones, es estable durante 5 meses. Disolver la proteinasa K en PB antes de usar (la cantidad de PB est indicada en el bote de proteinasa K), para alcanzar una concentracin de 20 mg/ml. La proteinasa K, una vez disuelta, debe almacenarse a 4 C. Aadir etanol (96-100 %) al Buffer B5 antes de usar. El volumen de etanol est indicado en el bote Buffer B5. Calentar la Solucin BE a 70 antes de usar. C Todas las centrifugaciones del proceso se realizarn a temperatura ambiente, a no ser que se especifique otra cosa.

4 5

Atencin: Las Soluciones B3 y BW contienen hidrocloruro de guanidino. Se recomienda el uso de guantes, gafas y bata de laboratorio para su manejo. Extraccin del ADN de PVH. 1. Preparacin de la muestra Frotis: Aadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sdico 0,9%) al tubo que contiene la torunda y agitar vigorosamente en un vortex durante 1 minuto. Decantar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml estril.

Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrfuga a 12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de lquido, cuidando de no llevarse el precipitado. Resuspender en 180 l de Solucin T1. Continuar con el paso 2.

Tejido fijado en formol e incluido en parafina:

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Introducir 4 o 5 cortes de tejido de unos 5 m en un tubo estril de microcentrfuga de 1,5 ml y aadirles 180 l de Solucin T1. Tras machacar el tejido con la punta de la pipeta, mezclar en el vortex para facilitar la lisis. Continuar con el paso 2.

Suspensiones celulares: Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que est contenida y pasar 1 ml a un tubo estril de microcentrfuga de 1,5 ml. Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrfuga a 12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de lquido, cuidando de no arrastrar el precipitado. Resuspender el precipitado con 1 ml de agua destilada estril. Centrifugar las muestras durante 10 minutos en una microcentrfuga a 12.000 r.p.m. y retirar con una micropipeta los restos de lquido, cuidando de no llevarse el precipitado. Resuspender en 180 l de Solucin T1. Transferir a un tubo estril de microcentrfuga de 1,5 ml.

A partir de este paso, todas las muestras sern tratadas de la misma manera, de acuerdo con el siguiente protocolo: 2. Aadir 25 l de la solucin de Proteinasa K. Mezclar en vortex. Incubar a 56 1-3 horas, (toda la noche en el ca so de las muestras C, en parafina), en un bao o un Termomixer con agitacin, hasta que la muestra est totalmente lisada. Para acelerar esta lisis, se recomienda agitar las muestras en un vortex cada 15 minutos.

3. Una vez lisada la muestra, aadir 200 l de Solucin B3 a cada muestra. Mezclar en vortex e incubar a 70 durante 10 min. C

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4. Aadir 210 l de etanol inmediatamente.

96% a cada muestra y agitar en vortex

Nota: No descartar ningn precipitado blanquecino que se pueda haber formado tras la adicin del etanol; este precipitado debe aadirse con el resto de la solucin a la columna de purificacin en el siguiente paso.

5. Preparar una columna de purificacin por muestra y colocarla en un tubo de recogida de 2 ml. Aadir la muestra y centrifugar durante 1 minuto a 12.000 r.p.m. Si el lquido no ha atravesado completamente la membrana, repetir la centrifugacin. Descartar el fludo filtrado y el tubo de recogida de 2 ml.

6. Colocar la columna en otro tubo colector y aadir 500 l de la Solucin BW a la columna. Centrifugar a 12000 r.p.m. durante 1 min. Descartar el fluido filtrado y el tubo colector.

7. Colocar la columna en otro tubo colector y aadir 600 l de Solucin B5 a la columna. Centrifugar a 12000 r.p.m. durante 1 min. Descartar el fluido filtrado.

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8. Reinsertar la columna en el tubo de recogida. Centrifugar a 12000 r.p.m. durante 1 min para eliminar cualquier resto de la Solucin B5.

Nota: El etanol residual que pueda quedar de la Solucin B5 inhibe reacciones enzimticas, por lo que se debe eliminar completamente mediante esta centrifugacin.

9. Colocar la columna en un tubo limpio de microcentrfuga de 1,5 ml. Eluir el ADN con 100 l de la Solucin BE (previamente calentada a 70 Incubar esta C). Solucin caliente en la columna a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 12.000 r.p.m. durante 1 min.

10. Recuperar el filtrado (aproximadamente 100 l) en el tubo de microcentrfuga de 1,5 ml. Utilizar 5 l para la reaccin de amplificacin y guardar el resto a 20 C. 8.1.2. Extraccin automtica del ADN de PVH 8.1.2.1. Equipo easyMAG de Biomrieux Se recomienda realizar el mtodo siguiente: 1. Preparacin de la muestra para la lisis interna (se realiza dentro del equipo). Frotis: Aadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sdico 0,9%) al tubo que contiene la torunda y agitar vigorosamente en un vortex durante 1

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minuto. Decantar el sobrenadante en un tubo estril de 1,5 ml. Transferir 1 ml a un pocillo de la cubeta (cada cubeta tiene 8 pocillos).

Suspensiones celulares (volmenes inferiores a 3 ml): Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que est contenida. Transferir 1 ml a un pocillo de la cubeta.

Medio de Captura de hbridos: Agitar la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que est contenida. Transferir 0.5 ml a un pocillo de la cubeta.

2. Lisis interna y extraccin del ADN: seguir la gua de usuario del equipo. Hay que identificar en el programa que el volumen de eluccin es 110 l. 3. Una vez finalizada la extraccin se toman con pipeta los 110 l de ADN eluido y se introducen en tubos eppendorf de 1,5 ml. Utilizar 5 l para la reaccin de amplificacin y guardar el resto a 20 C.

8.1.2.2. Equipo BioSprint 96 de Qiagen. Se recomienda realizar el mtodo siguiente: PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES Asegrese de que las soluciones estn preparadas antes de comenzar el proceso de extraccin. 1. La proteasa se encuentra liofilizada, antes de su uso aadir 4.4 ml del buffer indicado en la etiqueta, a partir de este momento conservar a 4 C, hasta 2 meses. 2. Preparacin Buffer AW1 Volumen AW1 Volumen de Etanol 96% Volumen Final (ml) concentrado (ml) a aadir 19 25 44 27 35 62 98 130 228 Nota: guardar a T ambiente. Antes de utilizar agitar la botella unas 5 veces. 3. Preparacin Buffer AW2 Volumen AW2 Volumen de Etanol 96% concentrado (ml) a aadir

Volumen Final (ml)

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17 40 57 68 160 228 Nota: guardar a T ambiente. Antes de utilizar agitar la botella unas 5 veces.

4. Preparacin de Tween 20 al 0.0002%. H2O RNasa free 30 ml Tween 20 6l Nota: Una vez hecha la mezcla se guarda a 4 C. PREPARACIN DE LA MUESTRA

250 ml 50 l

1. Importante, encender el Termomixer a 70C para la lisis con Proteasa!. Frotis: Cortar e introducir el bastoncillo en un microtubo de 1.5 ml. Aadir: - 400 l de buffer ATL - 20 l de Proteasa Suspensiones celulares (volmenes inferiores a 3 ml): Citologas lquidas: agitar previamente en vortex y aadir a la placa (S-Block). -200 l de muestra -20 l de Proteasa 2. Incubar en el Termomixer 10 min. a 70C. Si la incubacin se realiza en la placa, cubrir sta con un film transparente y colocar una placa metlica previamente calentada a 70C encima. De esta manera se evita la condensacin de la muestra y por tanto una posible contaminacin. 3. Preparacin de la master mix. Preparar volumen para una muestra extra por cada serie de 10. Aadir los siguientes volmenes: Componentes Buffer AL Isopropanol MagAttract Suspension G Volumen por muestra (l) 200 200 20

4. Dispensar las soluciones en las placas. Se van a necesitar 6 S-Block y 2 Microplate MP.

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En la tabla 1 aparece el orden de carga de las placas en el equipo y los distintos volmenes que hay que aadir a las placas. Posicin en el equipo 8 7 6 5 4 3 2 1 Placa Microplate MP Microplate MP S-Block S-Block S-Block S-Block S-Block S-Block A aadir Situar el soporte con el cobertor encima. Buffer AE (Buffer de Elucin) H2O RNasa free + Tween 20 Buffer AW2(2) Buffer AW2(1) Buffer AW1(2) Buffer AW1(1) Muestras lisadas + Master mix (*) Volumen por pocillo (l) -----100 200 500 500 500 500 500 200 + 420

(*)En el caso de frotis, antes de aadir el lisado, se da un pequeo spin a las muestras. Aadir primero los 200 l de muestra lisada y sobre ella los 420 l de la master mix por pocillo. En el caso de haber lisado en placa, aadimos directamente los 420 l de master mix a cada pocillo. En ambos casos, se mezcla con la pipeta.

5. Extraccin. Una vez que estn todas las placas preparadas con el volumen correspondiente, encender el equipo con el botn de encendido. Abrir la ventana protectora. Seleccionar mediante las flechas superior e inferior el programa ADN Swab y se pulsa START. Aparece un mensaje en el LCD pidiendo que se introduzca la placa de la posicin 8 (ver tabla 1). Despus de cargar la placa 8 presionar Star. El carrusel gira y aparece un mensaje pidiendo que se introduzca la placa de elusin en la posicin 7. Despus de cargar la placa 7 presionar Star. Continuar el proceso hasta tener todas las posiciones cubiertas. La tabla 1 muestra la posicin que debe ocupar cada una de las placas. Todas las placas deben quedar con las etiquetas hacia el interior. Una vez colocadas todas las placas se cierra la ventana protectora del Biosprint 96. El proceso de extraccin durar unos 20 minutos. El ADN extrado se puede almacenar en la placa de elucin (posicin 7) a -20C, tapando los pocillos con un film transparente. Si no se utiliza la placa entera, tomar el ADN extrado mediante pipeta e introducirlo en un microtubo de 1,5 ml para el posterior almacenamiento a -20C.

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8.2. Reaccin de amplificacin 1. Descongelar un Tubo de Reaccin por cada muestra que se va a estudiar y mantenerlos en hielo. No usar temperaturas superiores a 37C para la descongelacin. 2. Centrifugar unos segundos los Tubos de Reaccin en la microcentrfuga para que quede todo el lquido en el fondo del tubo (si no se dispone de adaptadores de microcentrfuga para los Tubos de Reaccin, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamao mayor a los que se les haya cortado la tapa). 3. Si el ADN ha sido obtenido de muestras incluidas en parafina, aadir 1,5 l de Cloruro de Magnesio 25mM en los tubos de amplificacin. 4. Aadir 5 l del ADN extrado de las muestras a los Tubos de Reaccin y resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo. 5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas: - Para Tubos de Reaccin de 0,2 ml:

1 ciclo 40 ciclos

95C 5 min 94C 0,5 min 55C 1 min 72C 1,5 min 1 ciclo 72C 8 min 20C continuo hasta la recogida de tubos (opcional) 6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reaccin en el termociclador cuando el bloque haya sobrepasado los 90 C. De este modo se minimizan las posibles amplificaciones inespecficas debidas a incubacin por debajo de la temperatura de hibridacin. La duracin de la amplificacin es de unas 4 horas, aunque puede variar ligeramente dependiendo del termociclador.

8.3. Visualizacin del producto amplificado 8.3.1. Visualizacin en Array Tubes (AT)

Recomendaciones especficas antes de comenzar la visualizacin:

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EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL REA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL REA DE PRE-PCR. 1. Encender el lector de ATs al comienzo del proceso, la autocalibracin del equipo tarda unos minutos y debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado. 2. Limpiar el termociclador con solucin de leja diluida al 10% antes de poner en marcha el programa de desnaturalizacin. Colocar los tubos de amplificacin separados en el termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalizacin. 3. Durante la visualizacin no hace falta utilizar puntas con filtro. Salvo en la adicin de amplificados al tubo AT donde s es necesario. 4. Atemperar la SH (solucin de hibridacin) a temperatura ambiente. Asegurarse de que no tiene cristales antes de su uso. 5. Asegurarse de que los termomixers han alcanzado la temperatura adecuada antes de introducir los tubos AT. 6. En caso de fallo de lectura, escribir el nmero que aparece en el tubo AT especificado como Assay ID. Visualizacin

1.

Desnaturalizacin: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95 C durante 10 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95 C. Sacar los tubos de la incubacin a 95 C y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo.

2. Preparacin de la Solucin TL diluida: Para 24 muestras, aadir 3 ml de Solucin TL a 27 ml de agua destilada. Para 48 muestras, aadir 6 ml de Solucin TL a 54 ml de agua destilada. 3. Pre-lavado del tubo AT: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los tubos AT aadiendo 300 l de Solucin TL diluida a cada AT e invertiendo el tubo 4 5 veces. Desechar la Solucin TL diluida con pipeta o preferiblemente con vaco. Se debe dejar el tubo sin restos de la solucin de lavado, para ello tambin secamos las tapas, pero

21

en ningn momento se deben dejar los tubos secos. Aadir la siguiente solucin inmediatamente. 4. Hibridacin: Antes de usar la Solucin SH, sta debe estar a T ambiente y sin cristales. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, aadir 100 l de Solucin SH (evitar que se forme espuma) a cada tubo AT. Aadir 5 l de producto de PCR desnaturalizado al tubo AT, resuspender varias veces para que se mezcle con la solucin de hibridacin, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar en el termomixer durante 1 hora a 55C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubacin, sacar los tubos y desechar la Solucin SH con pipeta o vaco. (Dejamos programado el termomixer a 30C y en movimiento para su utilizacin posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 5. Lavado: aadir 300 l de Solucin TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 5 a 10 veces. Desechar la Solucin TL diluida si se usa vaco con una pipeta pasteur diferente en cada AT, o si se usa la pipeta manual con una punta distinta. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30C se dejan los tubos con Solucin TL diluida hasta que el termomixer alcance la temperatura.

6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridacin, se debe preparar la solucin CJ diluida y mantener en hielo. Se recomienda centrifugar la solucin CJ durante 10 segundos antes de usarla. A continuacin, preparar la solucin CJ diluida. Para ello, mezclar en un tubo 100 l de Solucin DC y 1 l de Solucin CJ por cada AT (preparar mezcla para un AT extra por cada serie de diez, para compensar los errores de pipeteo). Se debe dar un vrtex a la solucin una vez diluida para homogenizar. Desechar la Solucin TL diluida y aadir al tubo AT 100 l de Solucin CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos a 30C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubacin, desechar la solucin del tubo AT con pipeta o vaco inmediatamente. Bajamos la temperatura del termomixer a 25 C para su utilizacin en el paso 8. 7. Doble Lavado: Aadir inmediatamente 300 l de Solucin TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 5 a 10 veces, desechar la solucin con la pipeta o vaco. Repetir la operacin. Es muy importante que no queden restos de Solucin CJ ya que sta reaccionara con la Solucin RE dando lugar a una seal inespecfica. No es necesario el cambio de punta para cada tubo, pero s es importante no tocar al cristal. 8. Revelado con Solucin RE: Se recomienda trabajar en tandas de 12 tubos AT. Quitar la solucin TL, aadir 100 l de solucin RE al tubo AT e incubar 10 minutos a 25 C en el Termomixer sin agitacin.

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Advertencia! Es muy importante utilizar el Termomixer sin agitacin y leer las muestras inmediatamente despus de la incubacin. 9. Leer en forma Anlisis seriados en la que se toman las imgenes de todos los tubos para posteriormente ser analizadas automticamente. 8.3.2. Visualizacin en CLART Strip (CS) Recomendaciones especficas antes de comenzar la visualizacin: EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL REA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL REA DE PRE-PCR. 1. Encender el CAR (Clinical Arrays Reader) al comienzo del proceso. La autocalibracin del equipo tarda unos minutos y es necesario adems introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. El aparato debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado. 2. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridacin el termomixer de placas ha estado a 65C al menos durante 30 min. o 1 hora. 3. Atemperar la SH (solucin de hibridacin) a temperatura ambiente. 4. PREPARAR LA SOLUCIN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD. 5. Limpiar el termociclador con solucin de leja diluida al 10% antes de poner en marcha el programa de desnaturalizacin. Colocar los tubos de amplificacin separados en el termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalizacin. 6. Durante la visualizacin no hace falta utilizar puntas con filtro pero s es necesario usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se aada un reactivo, aunque se trate de TL. S es necesario utilizar puntas con filtro durante la adicin de amplificados al tubo CS. 7. En el caso de utilizar bombas de vaco equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las soluciones, desechar los peines despus de cada uso o descontaminarlos con una solucin de leja diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo del pocillo. 8. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin tocar el array.

23

VISUALIZACIN: 1. Desnaturalizacin: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95C durante 10 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95C. Sacar los tubos de la incubacin a 95C y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo. 2. Preparacin de la Solucin TL diluida: Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solucin de lavado diluida, aadiendo 1 ml de Solucin TL a 9 ml de agua destilada. 3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los tubos AT aadiendo 200 l de Solucin TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Desechar la Solucin TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vaco. El array debe quedar sin restos de solucin, aunque nunca debe permanecer seco durante mucho tiempo. Aadir la siguiente solucin inmediatamente. 4. Hibridacin: Antes de usar la Solucin SH, sta debe estar a T ambiente. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, aadir 100 l de solucin SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. Aadir 5 l de producto de PCR desnaturalizado a cada pocillo de los CS, resuspender varias veces para que se mezcle con la solucin de hibridacin, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar la tira cubierta con la tapa de plstico transparente en el termomixer de placa tapado durante 1 hora a 65 C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubacin, sacar la placa y desechar la Solucin SH con pipeta o bomba de vaco. (Dejamos programado el termomixer de placa a 30 C y en movimiento para su utilizacin posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 5. Doble Lavado: usar puntas diferentes para cada pocillo en ambos lavados. Aadir 200 l de Solucin TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solucin TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vaco multicanal. Repetir la operacin. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30 C, se dejan los pocillos con esta solucin hasta que el termomixer alcance la temperatura. 6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridacin, se debe preparar la solucin CJ diluida y mantener en hielo. Se recomienda centrifugar la solucin CJ durante 10 segundos antes de usarla. A continuacin, preparar la solucin CJ diluida. Por cada CS, se aade 1 ml de solucin DC y 7.5 l de Solucin CJ. Se debe dar un vrtex a la solucin una vez diluida para homogenizar.

24

Desechar la Solucin TL diluida sin dejar seco el array y aadir a cada pocillo del CS 100 l de Solucin CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el termomixer de placa a 30 C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubacin, sacar la placa y desechar la solucin rpidamente con pipeta o bomba de vaco multicanal. (Dejar programado el termomixer de placa a 25 C y en movimiento para su utilizacin posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 7. Triple Lavado: aadir inmediatamente 200 l de Solucin TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar la solucin con la pipeta o vaco sin dejar seco el array. Repetir la operacin dos veces ms. Es muy importante que no queden restos de Solucin CJ ya que sta reaccionara con la Solucin RE dando lugar a una seal inespecfica. 8. Revelado con Solucin RE: quitar la solucin TL diluida sin dejar seco el array, aadir 100 l de solucin RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25 C en el termomixer de placa sin agitacin. Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitacin 9. Desechar la Solucin RE completamente con pipeta o vaco. El array debe quedar seco 10. CAR (Clinical Arrays Reader): Se coloca un adaptador especial sobre la bandeja del CAR y a continuacin se colocar la placa en el CAR para tomar las imgenes de todos los pocillos para posteriormente ser analizadas automticamente.

9. LECTURA DE RESULTADOS El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los anlisis, se realiza de forma automtica. El equipo de lectura y anlisis presentar un informe en el que se indican los resultados. 10. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Uno de los inconvenientes de la deteccin por amplificacin genmica son los falsos negativos debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN de la muestra (por toma de cantidad insuficiente de muestra, por degradacin del ADN debida a una incorrecta conservacin o por prdida del ADN de la muestra durante su extraccin), o bien a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere analizar la presencia del virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el kit CLART Papillomavirus humano 2 se han eliminado estos falsos negativos gracias a la introduccin de dos controles internos en el mismo tubo de reaccin donde se analiza la muestra. Cada tubo de amplificacin contiene los siguientes oligos:

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Un par de oligonucletidos que amplifican un fragmento del gen CFRT humano. ste es el control de extraccin de ADN genmico o control del ADN del paciente. Un par de oligonucletidos que amplifican un plsmido modificado incluido en el tubo de amplificacin y que se usa como control de amplificacin de la reaccin de PCR. Oligonucletidos especficos de PVH.

El tubo de PCR se ha diseado para favorecer la amplificacin de PVH frente a la de los dos controles. En relacin a estos ltimos, la amplificacin del control de ADN genmico prima sobre la del control de la reaccin de amplificacin. La razn de este diseo es: El control interno de ADN genmico es necesario para la confirmacin de un verdadero resultado negativo, ya que nos informa de la presencia de ADN del paciente en la muestra, aunque no haya habido amplificacin de ningn tipo de VPH. El control interno de amplificacin nos permitir distinguir entre los casos de inhibicin de la reaccin de PCR y aqullos en los que no se encontr ADN en la muestra. En ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado nmero copias de un virus de PVH o cuando la muestra presenta varios tipos de PVH a la vez) puede suceder que no se amplifiquen los dos controles o alguno de ellos y aparezca una lectura de: SIN SEAL.

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Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes interpretaciones de los resultados de lectura:

MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO

CONTROL DE AMPLIFICACIN

INTERPRETACIN POSITIVO

ste se considera un RESULTADO VLIDO

Control de amplificacin Control Genmico

VPH

AT-array tube / CLART strip

MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO

CONTROL DE AMPLIFICACIN

INTERPRETACIN POSITIVO

Este se considera un RESULTADO VLIDO, aunque el control de amplificacin se muestre SIN SEAL. Esto se debe al efecto de la competencia entre los tres tipos de ADN.

VPH

Control Genmico

AT-array tube / CLART strip

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MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO SIN SEAL

CONTROL DE AMPLIFICACIN SIN SEAL

INTERPRETACIN POSITIVO

ste se considera un RESULTADO VLIDO, aunque ambos controles se muestren SIN SEAL. Esto se debe, bien a que hay una gran cantidad de copias de virus, o a un elevado nmero de genotipos de VPH presentes en la muestra.

VPH

AT-array tube/ CLART strip

MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO

CONTROL DE AMPLIFICACIN

INTERPRETACIN NEGATIVO

ste se considera un RESULTADO VLIDO. En este caso podemos decir que se trata de un verdadero resultado negativo.
Control de amplificacin Control Genmico

AT-array tube/ CLART strip

MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO

CONTROL DE AMPLIFICACIN SIN SEAL

INTERPRETACIN NEGATIVO

ste se considera un RESULTADO VLIDO, aunque no haya aparecido la seal del control de amplificacin, debido a una elevada concentracin de ADN genmico.

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Control Genmico

AT-array tube/ CLART strip

MUESTRA AGUA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO SIN SEAL

CONTROL DE AMPLIFICACIN

INTERPRETACIN NEGATIVO

ste se considera un RESULTADO VLIDO, ya que en este caso se trata de una muestra blanco (en vez de muestra, ponemos agua destilada en los tubos de PCR), donde slo debe aparecer el control de amplificacin, porque no hay ADN en la muestra que se pueda amplificar.

Control de amplificacin

AT-array tube/ CLART strip

MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO SIN SEAL

CONTROL DE AMPLIFICACIN

INTERPRETACIN NO HAY ADN

ste se considera un RESULTADO NO VLIDO. Se debe a que no hay ADN en la muestra, por distintas razones: 1. Insuficiente material celular en la toma de muestra. 2. Prdida de ADN durante el proceso de extraccin. La solucin en estos casos es repetir la tcnica desde la extraccin o bien pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente.

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MUESTRA

POSITIVO para algn genotipo

CONTROL GENMICO SIN SEAL

CONTROL DE AMPLIFICACIN SIN SEAL

INTERPRETACIN PCR INHIBIDA

ste se considera un RESULTADO NO VLIDO. Esto se debe a que algunas sustancias pueden inhibir la reaccin de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa. La solucin es verificar que en las muestras o en el material gentico extrado no hay presencia de ninguna de estas sustancias. En la mayora de los casos se recomienda repetir la extraccin o, si esto no es posible, pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente.

Marcadores

AT-array tube/ CLART strip

Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No Concluyente: En aquellos casos en que las tres rplicas de una sonda sean muy distintas entre s. En coinfecciones para aquellos virus que se encuentren en el lmite de deteccin de la tcnica.

11. ESPECIFICACIONES TCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO Control de interferencias conocidas: Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART Papillomavirus humano 2. Principalmente, son sustancias que inhiben la ADN polimerasa y, por tanto, la reaccin de amplificacin. Las interferencias ms conocidas son: 1 Presencia de hemoglobina o parafina. Tanto el ADN extrado a partir de frotis cervicovaginales como el obtenido a partir de muestras de tejidos

30

incluidos en parafina puede contener restos de hemoglobina. No obstante, el kit de Extraccin-Purificacin de GENOMICA minimiza estos efectos. 2 Presencia de cido actico o iodina en la muestra a analizar. Si la toma de muestra para el anlisis con el kit CLART Papillomavirus humano 2 se realiza despus de una colposcopia, esta muestra puede contener cido actico o iodina, que inhiben la PCR. Para evitar esto, realizar la toma de muestra para el anlisis con CLART Papillomavirus humano 2 previamente a la colposcopia. Utilizacin de muestras no adecuadas. El anlisis de cualquier otro tipo de muestra clnica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART Papillomavirus humano 2, as como una toma incorrecta de las muestras, puede conllevar que el resultado del anlisis no sea concluyente. Por ejemplo, si la torunda ha sido incluida en algn tipo de medio, la PCR puede resultar inhibida. Si el tiempo de fijacin de un tejido en formol es excesivo, el ADN puede degradarse, resultando la muestra inhibida por falta de amplificacin del control del ADN de la muestra. Actividad residual de la Proteinasa K. En el proceso de extraccin de ADN, se tiene que inactivar la Proteinasa K mediante incubacin a 70 C durante 10 minutos. Bajo estas condiciones, la inactivacin se produce de forma completa. Si este paso fuera omitido o las condiciones se suavizaran significativamente, podra ocurrir que permaneciese una actividad residual de la Proteinasa K, lo que podra resultar en una degradacin de la ADN polimerasa y, por tanto, inhibicin de la PCR. La conservacin inadecuada de las muestras puede influir en el resultado del anlisis. Si las muestras se someten a condiciones que puedan provocar una degradacin del ADN que contienen, el resultado del anlisis ser de muestra inhibida por falta de amplificacin del control del ADN de la muestra.

Especificaciones tcnicas: 1. Parmetros Analticos: Sensibilidad analtica. La sensibilidad analtica se determin mediante la amplificacin de los fragmentos especfica de la regin L1 para los diferentes genotipos de VPH clonados en plsmidos recombinantes. La sensibilidad para los tipos 16 y 18 tambin fue determinada a partir de la deteccin de muestras del programa de evaluacin de herramientas de laboratorio para el tipado del VPH, de la organizacin mundial de la salud OMS (2010 WHO HPV LabNet Proficiency Study of HPV DNA Typing).
2

GENOTIPO VPH 6 11 16 18

10 copias 100% 100% 100%

50 copias*

10 copias 40% 60% 80%

100% 100%

31

26 31 33 35 39 45 51 52 53 56 58 59 66 68 82

100% 100% 100%

100% 100% 100% 100%

100% 100%

80% 80% 80% 100% 100% 60% 80% 80% 80% 100% 100% 80% 100% 80% 100%

N=95 * Datos expresados en equivalents genmicos.. Tabla 1. Sensibilidad analtica del kit CLART VPH 2 kit

Dado el significado clnico de los genotipos de VPH 16 y 18, se ha incluido los datos de sensibilidad para esos tipos obtenidos a partir de la deteccin de muestras del programa de evaluacin de herramientas de laboratorio para el tipado del VPH de la organizacin mundial de la salud OMS. Este programa compara y evala las diferentes metodologas de deteccin de VPH comerciales disponibles para una efectiva implementacin y monitorizacin de los programas de vacunacin para VPH. Basado en este programa, se considera una herramienta como apta para el diagnstico si detecta al menos 50 unidades internacionales (equivalentes genmicos o copias) de los tipos de VPH 16 y 18, hecho demostrado con CLART VPH 2.

Especificidad analtica. La especificidad analtica es de un 100%. Con el kit CLART Papillomavirus humano 2 no se produce deteccin inespecfica de otros virus patgenos habituales de muestras cervicovaginales, como son los herpesvirus.

2. Parmetros de utilidad diagnstica. Para determinar los parmetros de utilidad diagnstica del nuevo kit CLART Papillomavirus humano 2, se han realizado estudios comparativos frente a la versin antigua del mismo producto. Dichos estudios se realizaron en colaboracin con dos hospitales espaoles y uno portugus. Servicio de Microbiologa del Hospital Universitari Germans Tras i Pujol de Badalona. Unidad de Virologa del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Departamento de enfermedades infecciosas. Instituto Nacional de Salud Ricardo Jorge, I. P. Lisboa (Portugal).

32

Se analizaron 386 muestras de las cuales 9 fueron torundas, 25 tejidos incluidos en parafina y 352 citologas lquidas. En la siguiente tabla se ilustran los datos de sensibilidad y especificidad diagnsticas para los tipos de VPH detectados por el kit CLART Papillomavirus humano 2:
Tipo HPV 6 11 16 18 26 31 33 35 39 42 43 44 45 51 52 54 Sensibilidad 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Especificidad 100,00 100,00 99,70 100,00 100,00 100,00 99,73 99,74 100,00 99,47 99,50 100,00 99,74 100,00 100,00 100,00 Tipo HPV 56 58 59 61 62 66 68 70 71 73 81 82 83 84 85

Sensibilidad 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 94,44 100,00 100,00 100,00

Especificidad 100,00 100,00 99,73 100,00 99,47 100,00 98,35 100,00 100,00 99,74 100,00 99,48 100,00 100,00 100,00

Tabla 2. Parmetros diagnsticos de la tcnica CLART VPH2.

Los parmetros diagnsticos anteriormente descritos fueron determinados en la plataforma CLART Strip-Cs. Para validar los resultados en formato AT (Array Tube) se ha efectuado una validacin comparando los resultados de visualizacin de 232 tubos de amplificacin CLARTVPH2 en paralelo en las plataformas CS y AT, con la siguiente distribucin respecto a los tipos virales.
Virus 6 11 16 18 26 31 33 35 39 42 43 44 Muestras Resultado Resultado analizadas en CS en AT 8 2 25 7 1 14 12 4 6 9 0 1 8 2 25 7 1 14 11 4 6 9 0 1 8 2 25 7 1 14 12 4 6 9 0 1

33

45 51 52 53 54 56 58 59 61 62 66 68 70 71 72 73 81 82 83 84 85

5 13 14 14 2 6 13 8 8 9 19 5 8 0 1 4 5 1 1 8 1

5 13 14 14 2 6 13 8 8 9 19 5 8 0 1 4 5 1 1 8 1

5 13 14 14 1 6 13 7 8 8 19 5 8 0 1 3 5 1 1 8 1

Tabla 3. Anlisis comparativo del kit CLART VPH2 para cada tipo viral en las plataformas de visualizacin CS/AT.

La concordancia a nivel de resultados de visualizacin entre las dos plataformas es de 98.27%, hecho que no modifica los parmetros diagnsticos descritos anteriormente

12. BIBLIOGRAFA Alameda, F., Bellosillo, B., Fust, P., Musset, M., Marifloso, M-L., Mancebo, G., Lopez-Yarto, M.T., Carreras, R., Serrano, S.: Human papillomavirus Detection in Urine Samples: An alternative screening method. American Society for Colposcopy and cervical pathology of the lower Genital Tract disease, Volume 17, Number 1, 2007, 5-7. Bosch, F.X., Lorincz, A., Muoz, N., Maijer, C.J.L.M. and Shah K.V.: The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathl. 55, 244-265 (2002). Calleja-Macas, I.E., Villa, L.L., Prado, J.C. et al. "Wordwide genomic diversity of the high-risk human papillomavirus types 31, 35, 52, 58, for close relatives of human papilloma virus type 16. Journal of Virology. 79, 13630-13640 (2005). De Villiers, E.M.: Heterogeneity of the human papillomavirus group. J. Virol. 63, 4898-4903 (1989).

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Santos Salas, J., Gonzlez Morn, M.A., Gonzlez Medina, A., Martn, Polo, R. Hernando Martn, M., Ribas Ario, M.T.: Asociacin de mas de un tipo de VPH en lesiones displsicas de cervix. En publicacin. Suarez Moya, A., Esquivias Gmez, J.I., Vidart Aragn, J.A. Picazo de la Garza, J.J.: Deteccin y tipificacin mediante biologa molecular del virus del Papilloma humano en muestras genitales. Rev. Esp. Quimioterap., Junio 2006; Vol. 19 (N2); 161-166. Verdasca, N.; A. Coelho; F. Ribeiro; A. Pista.: Detection of VPH ADN from cervical samples in a group of portuguese women: comparison of two VPH genotyping assays. 24th internacional papillomavirus conference and clinical workshop, Nov 3-9, 2007, Beijing, P.R.China." Verdasca, N., A. Coelho, F. Ribeira, A. Pista.: Detection of VPH ADN from cervical samples in a group of portuguese women: comparison of two VPH genotyping assays. 23rd International papillomavirus conference and clinical workshop. September 2006. Praga. Walboomers, J.M., Jacobs, M.V., Manos, M.M., Bosch, F.X., Kummer, J.A., Shah, K.V., Snijders, P.J., Peto, J., Meijer, C.J., Munoz, N.: Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. Journal of Pathology 189, 12-19 (1999).

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13. TABLAS TABLA 4. En la siguiente tabla se indica el riesgo oncognico de los PVH que se detectan en este kit. TIPO PVH 6 PVH 11 PVH 16 PVH 18 PVH 26 PVH 31 PVH 33 PVH 35 PVH 39 PVH 40 PVH 42 PVH 43 PVH 44 PVH 45 PVH 51 PVH 52 PVH 53 PVH 54 RIESGO ONCOGNICO * Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo PVH 56 PVH 58 PVH 59 PVH 61 PVH 62 PVH 66 PVH 68 PVH 70 PVH 71 PVH 72 PVH 73 PVH 81 PVH 82 PVH 83 PVH 84 PVH 85 PVH 89 TIPO RIESGO ONCOGNICO * Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo Bajo Riesgo Alto Riesgo Bajo Riesgo

* Clasificacin riesgo oncognico segn Dunne et al. (2007).

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