Ancona 27 ottobre 2003

Validazione dei metodi ed incertezza di misura nei laboratori di prova:

le linee guida della Agenzie Ambientali.

LA VALIDAZIONE DEI
METODI ANALITICI

Graziano Bonacchi
ARPAT
Agenzia regionale protezione ambientale della Toscana
Il Gruppo di lavoro ANPA - ARPA-APPA ha ritenuto
utile proporre le Linee Guida sulla “ Validazione dei
metodi ” e sulla “Stima dell’incertezza di misura”, dopo
aver verificato che è condivisa l’esigenza di avere
riferimenti comuni per affrontare questi temi , da
sempre all’attenzione degli operatori delle Agenzie
impegnati nell’attività di prova, che devono
confrontare i risultati con “ limiti di legge ” o produrre
valutazioni sui fattori di pressione e di rischio
ambientale supportate dalla qualità e dalla
confrontabilità dei dati ottenuti in laboratorio.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 2

Il Gruppo di lavoro si è proposto come obiettivo quello
di tracciare delle linee guida generali, e di evidenziare
le eventuali criticità nell’applicazione della metodologia
di validazione , che comprende evidentemente la stima
dell’incertezza.

Le linee guida non trattano il tema del campionamento ,

primario e secondario , e quindi non considerano
“nel budget” dell’incertezza i contributi di queste
importanti e critiche fasi di prova.

La recente costituzione del Laboratorio di metrologia in

APAT consentirà di concertare il lavoro anche su
questi obiettivi.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 3

La necessità di applicare la nuova norma UNI CEI EN
ISO/IEC 17025 :2000 “Requisiti generali per la
competenza dei laboratori di prova e taratura”, per
ottenere l’accreditamento delle prove , previsto nei
programmi di tutte le Agenzie, ha senz’altro contribuito
ad alzare il livello dell’attenzione dei Responsabili dei
laboratori e dei Direttori Generali delle Agenzie stesse.

D’altra parte , su questi temi , negli ultimi anni , sono

state prodotte Linee Guida da tutti i più importanti
organismi internazionali ed è anche aumentata la
produzione di articoli e pubblicazioni apparsi in
qualificate riviste scientifiche nazionali ed internazionali

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 4

• Manuale UNICHIM 179/0 (Ed. 1999)
“Linee guida per la validazione dei metodi analitici”
• Manuale UNICHIM 179/1 (Ed.2001)
“Valutazione della precisione(ripetibilità) di un metodo analitico”
• Manuale UNICHIM 197 (Ed.2003)
Guida alla scelta ed all’uso dei materiali di riferimento”
• EURACHEM/CITAC Guide (Ed.2000)
“Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement”.
• IUPAC,ISO,AOAC International - TECHNICAL REPORT
“ Harmonised guidelines for single-laboratory validation of analysis”
( Resulting from Symposium Budapest 1999 and published Pure
Appl.Chem 74,pp835-855,2002).
• FAO / IAEA Training &Reference centre (1997)
“Guidelines for single –laboratory validation of analytical methods for
trace-level concentrations of organic chemicals”

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 5

La validazione di metodi dentro il processo di pianificazione/
progettazione di un servizio.

La validazione dei metodi : Conferma , sostenuta da evidenze

oggettive che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o
applicazione prevista sono stati soddisfatti

La ISO 17025 prevede non solo che i metodi sviluppati dal

laboratorio “devono essere validati in modo appropriato prima
dell’ uso” , ma anche che la loro introduzione nell’uso “ deve
essere un’attività pianificata e deve essere affidata a
personale qualificato con risorse adeguate”

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 6

La validazione dei metodi , oltre a costituire un processo tecnico, è
anche un processo di sistema qualità , i cui requisiti sono definiti
dalla norma UNI EN ISO 9001:94 .
La ISO 17025, al punto 1.6 , richiede infatti che i laboratori devono
operare “ secondo un sistema qualità per le loro attività di prova e di
taratura che soddisferà anche i requisiti della ISO 9001, quando
comprendono la progettazione/sviluppo di nuovi metodi ….”

La norma UNI EN ISO 9001:94 prevede ( punto 4.4) che la progettazione

di qualsiasi prodotto o servizio ( e quindi anche la progettazione di un
nuovo metodo di prova) parta dall’esame delle richieste del cliente( nel
caso dei laboratori pubblici di controllo , molto spesso, il cliente è il
legislatore) e si sviluppi attraverso diverse fasi :
- pianificazione;
- definizione delle interfaccie organizzative e tecniche;
- riesame della progettazione;
- verifica, validazione;
- modifiche della progettazione.
Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 7
 Fasi della pianificazione della progettazione del metodo.

La validazione di un metodo interno, così come la verifica

dell’applicabilità di un metodo normalizzato nell’uso del laboratorio
fa parte di un processo che si sviluppa attraverso le seguenti fasi
coordinate dal responsabile dell’attività di prova:
¾ richiesta di introduzione/modifica di un metodo prova
¾ studio di fattibilità
¾ approvazione dello studio di fattibilità
¾ stesura del metodo
¾ sperimentazione (validazione metodo interno o verifica di applicabilità metodo
normalizzato)
¾ stesura del rapporto finale
¾ approvazione del metodo
¾ riesame del metodo
¾ eventuale rivalidazione del metodo.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 8

 Richiesta di introduzione/modifica del metodo

La richiesta deriva in genere da disposizioni di legge , ma può essere

promossa anche da organizzazioni pubbliche e/o private o da singoli
clienti privati e può provenire anche dall’interno dell’Agenzia sia da parte
di operatori impegnati in compiti di controllo territoriale istituzionale sia
dagli stessi operatori tecnici impegnati nell’attività di prova.
La richiesta può essere motivata per:
•estendere / modificare il campo di applicazione,
•estendere/ modificare il campo di misura,
•modificare / integrare i parametri qualità del metodo,
•determinare un nuovo analita mai ricercato nella matrice/ matrici indicate
nel metodo,
•determinare un analita già ricercato, ma in una diversa matrice,
•apportare modifiche a metodi (normalizzati e non) impiegati per la
determinazione di uno o più analiti,
•utilizzare tecniche diverse.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 9

Il responsabile dell’attività di prova , dopo aver valutato
ed accettato le richieste, deve assumere o assegnare ad
un collaboratore qualificato, il compito e la responsabilità
di pianificare le attività di progetto relative alle diverse
fasi.

Il responsabile della pianificazione deciderà a chi

assegnare i compiti di ogni fase ed informerà il
Responsabile della Garanzia della Qualità sull’andamento
dell’intero processo.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 10

 Studio di fattibilità

Lo studio ha come presupposto la definizione dei requisiti che il metodo

deve avere per garantire il soddisfacimento della richiesta, anche in
rapporto ai tempi ed ai costi.

Il responsabile dello studio deve verificare l’esistenza di metodi

normalizzati adeguati e , in questo caso, valutare se proporne
l’impiego oppure proporre, sulla base di motivazioni documentate, di
sviluppare un metodo interno,

Lo studio di fattibilità deve comprendere anche una valutazione relativa

alla sicurezza ed alla compatibilità ambientale.

Approvazione dello studio di fattibilità

Il responsabile dell’attività di prova approva lo studio congiuntamente

al responsabile del laboratorio

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 11

Stesura e sperimentazione del metodo di prova scelto

Tutti i metodi di nuova introduzione nell’uso di laboratorio, sia

normalizzati che interni, devono essere sperimentati.

La sperimentazione deve prevedere le seguenti fasi:

• controllo dello stato di manutenzione e taratura delle apparecchiature;
• informazione e formazione degli operatori tecnici , sulle caratteristiche
del metodo ( che deve essere consegnato scritto)
• verifica , nel caso si tratti di un metodo normalizzato, che il laboratorio è
in grado di applicarlo garantendone le prestazioni ( in particolare
ripetibilità ,riproducibilità ed esattezza). Se il metodo normalizzato non
riporta i parametri di validazione , il laboratorio deve progettare uno
studio adeguato ad esprimere il risultato della prova , se richiesto, con il
dato dell’incertezza.
•verifica preliminare , nel caso sia scelto un metodo interno, della sua
specificità e successivamente degli altri parametri di validazione

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 12

 Alcune caratteristiche di un metodo :

Specificità Campo Campo

Sensibilità
(Selettività) di applicazione di misura

Limite di
Limite di
determinazione Linearità Accuratezza
rivelabilità o quantificazione

Precisione
Esattezza Ripetibilità Incertezza Robustezza
Riproducibilità

Modalità , tipo e limiti della validazione di un metodo possono

variare in ragione all’applicazione , al settore o a quanto
specificato in ambito regolamentato , sia esso volontario
(es. metodi normati) o cogente (es. metodi ufficiali ).

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 13

Classificazione dei metodi analitici secondo UNICHIM (Manuale UNICHIM 179/0:1999 )

Tipo di prova
Prove Titoli composti Prove rispetto Saggi di purezza Saggi di purezza Prove di
Parametro identificazione principali valore fissato quantitativi al limite comportamento

Accuratezza * * *
Precisione * * * *
Specificità ;
recupero * * * * *
Limite di
rivelabilità * *
Limite di
quantificazione *
Taratura * * *
Campo di
applicazione * *
Robustezza * * * * * *

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 14

 Controllo qualità e riesame dei requisiti del metodo

Il metodo nuovo una volta introdotto nell’uso routinario, deve

essere sottoposto al controllo qualità, ad esempio con l’uso di
carte di controllo che consentono di verificare se le prestazioni di
precisione ( ed anche di esattezza) stimate si mantengono nel
tempo.
Il riesame dei metodi deve essere eseguito con periodicità
programmata.

Rivalidazione del metodo

La rivalidazione di un metodo interno deve essere eseguita se:

• non è impiegato da tempo
• vengono introdotte modificazioni significative:

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 15

 MODIFICHE
Analista diverso
Modifica nella preparazione del
campione (diverso solvente, diverso
intervallo di concentrazione)
Modifica nella preparazione del
campione (stesso solvente, stesso
intervallo di concentrazione)
Variazione dei prodotti e reagenti
Modifiche strumentale
Graziano Bonacchi
PARAMETRI
Verifica dell’adeguata qualificazione
(controllo interno della qualità della
prestazione tramite campioni civetta
ecc.)
Verifica completa di tutti i parametri di
validazione
Verifica del recupero, esattezza,
precisione, robustezza
Specificità, esattezza, precisione
Curva di taratura, precisione, LOD e
LOQ
Ancona 27 ottobre 2003 16
Stesura del rapporto finale della sperimentazione

Il responsabile del progettazione redige il rapporto finale , al quale sono

allegati :
•la stesura definitiva del metodo interno o la eventuale procedura
integrativa che dettaglia il metodo normalizzato
•la stesura definitiva delle procedure operative per il controllo e la
manutenzione delle apparecchiature
•Il riferimento alle schede di sicurezza relative a reattivi ed
apparecchiature .

Approvazione ed autorizzazione del metodo di prova

Il metodo di prova (o la procedura integrativa) è approvato dal

responsabile dell’attività di prova ed è autorizzato dal responsabile del
laboratorio.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 17

 Validazione di un metodo di prova:
requisiti tecnici

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 18

PARAMETRI CARATTERISTICI DI UN METODO
ANALITICO
* Specificità e selettività
* Limite di rilevabilità (LOD)
* Limite di quantificazione o determinazione (LOQ)
* Intervallo di lavoro ed intervallo di linearità
* Accuratezza (Precisione+esattezza)
* Precisione (ripetibilità e riproducibilità)
* Sensibilità
* Robustezza
* Incertezza
* Recupero

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 19

 ACCURATEZZA
Il parametro dell’accuratezza è definito in due modi :
-grado di accordo tra il risultato di una misurazione e il valore vero del
misurando (VIM) ;

-grado di accordo tra il risultato di un procedimento analitico e il valore di

riferimento accettato (IS0 5725:1994 “ Accuracy ( trueness and precision)
of measurement methods and results”.

La valutazione dell’accuratezza si basa sul confronto tra il risultato

ottenuto applicando il metodo stesso a un campione per la misurazione
di un certo analita e il valore atteso per quell'analita in quel campione.

Il parametro dell’accuratezza è, quindi, il più importante tra quanti

vengono impiegati nella valutazione di un metodo d'analisi.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 20

L’accuratezza dipende dalla combinazione di errori casuali e
sistematici .

L’accuratezza di un risultato è espressa con la sua incertezza ,

definita come l’intervallo di valori entro cui è stimato che ricada , ad
un definito livello di probabilità (es. p =0,95), il valore del
misurando.
Le esigenze del cliente possono essere meglio soddisfatte da dati
meno accurati, ma ottenuti con rapidità o a minor costo o con
procedimenti più sicuri per l’operatore e l’ambiente, ma, in ogni
caso, l’accuratezza deve essere conosciuta, come richiede
esplicitamente la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 21

Dalla considerazione appena riportata, nasce l'opportunità di
ripartire l'esposizione sul parametro accuratezza, come sopra
definito, in due parti:

una riguardante la precisione (ricavata

quantitativamente dallo scarto aleatorio)

una riguardante l'accuratezza della media o

esattezza (misurata quantitativamente dallo
scostamento).

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 22

 PRECISIONE

Definizione:
“ Grado di accordo tra i risultati indipendenti ottenuti con un
procedimento d’analisi in condizioni ben specificate ”.
Queste condizioni sono individuate da alcuni fattori : metodo, materiale
esaminato , laboratorio, operatore, apparecchiatura, sua taratura ,
intervallo di tempo tra le prove.
Premesso che il metodo ed il materiale esaminato devono , in ogni
caso, essere sempre gli stessi , si possono avere, a seconda della
variazione degli altri fattori, tre tipi di precisione:
- Ripetibilità stretta o ripetibilità
- Ripetibilità intermedia o riproducibilità intermedia
- Riproducibilità.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 23

• La Ripetibilità stretta o ripetibilità( Sr ) = precisione ottenuta nelle
condizioni in cui tutti i fattori sopra indicati cono mantenuti costanti.
• La Ripetibilità intermedia ( SI ) o riproducibilità intermedia (“ Long
term repeatibility ”) = precisione ottenuta nelle condizioni in cui quattro
fattori:
1) operatore,
2) apparecchiatura,
3) taratura,
4) tempi di esecuzione variano con diverse modalità.
• La Riproducibilità ( SR) = precisione ottenuta nelle condizioni in cui ,
oltre ai fattori sopra indicati, varia anche il laboratorio.
La riproducibilità è stimabile soltanto da prove interlaboratorio.
Rimanendo all’interno del laboratorio è quindi possibile stimare
soltanto la ripetibilità stretta o intermedia.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 24

La precisione di un metodo “ misura” la dispersione dei risultati di prove
ripetute sullo stesso campione dovuta a fattori casuali.

La distribuzione è assunta di tipo normale o gaussiana e la dispersione

“random” intorno al valore medio è misurato dallo scarto tipo di ripetibilità
( “standard deviation”) :

∑ (X )
n
2
i − X
Scarto tipo di ripetibilità
Sr = i =1
n −1
n

∑X i
Media X= i =1
n

Con n = numero delle prove e Xi = valore della prova singola

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 25

Il quadrato dello scarto tipo è la varianza.

Tutte le operazioni relative alla composizione dei diversi contributi delle

incertezze ( “ Legge di propagazione degli errori”) devono essere
effettuate sommando le varianze e non gli scarti tipo.

∑ (X )
n
2
i − X
V r = S r2 = i =1
n −1
n

∑X i
X= i =1
n

Con n = numero delle prove e Xi = valore della prova singola

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 26

Lo scarto tipo della media delle n prove di ripetibilità è espressa dalla
relazione :
Sr
S r (media ) =
n
Il limite di ripetibilità è definito come il parametro con il quale si deve
confrontare la differenza tra dati in doppio ottenuti in condizioni di
ripetibilità.
La definizione vale anche per il limite riferito alle condizioni di ripetibilità
intermedia o riproducibilità).

Limite di ripetibilità r = X 2 − X1 = t × Sr × 2
Limite di ripetibilità ri = X 2 − X 1 = t × S I × 2
intermedia

Limite di riproducibilità R = X 2 − X1 = t × SR × 2

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 27

Nella relazione del limite di ripetibilità è considerato un fattore di
copertura : il “ t di Student ” che accompagna tutti i calcoli statistici
impiegati nella gestione dei dati di prova .

r = t( p =0,95;ν = n −1) × S r × 2
Serve una premessa.
Lo scarto tipo, ottenuto con un numero elevato di prove documenta che
l’oscillazione intorno al valore medio definita dall’intervallo ±1S copre il
68% dei dati dentro la distribuzione gaussiana (a due code), mentre
l’oscillazione dentro l’intervallo ± 2S copre il 95 % ( vedi slide n.21).
Il laboratorio fa riferimento ad un intervallo di fiducia del 95%, , per cui il
valore di t, se il numero di prove è sufficientemente elevato (diciamo
n>20), dovrebbe essere 2 ed il limite di riipetibilità diventa :

r = 2×Sr × 2 = 2,8×Sr

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 28

Inserendo il t di student,il cui valore si trova riportato in tabelle , che
fanno riferimento al grado di libertà (ν =n-1) ed al livello di fiducia
(“confidence limits”), es . p=0,95, da considerare nel calcolo dei
risultato, il laboratorio tiene conto delle correzioni necessarie per il fatto
che le n prove eseguite non rappresentano con efficacia la popolazione
campione .
Ad esempio , se la ripetibilità è stata stimata con n= 10 prove , il t di
Student per ν = n-1=9 è = 2,26 ed il limite di ripetibilità sarà :

r = 2,26 ×Sr × 2 =3,2×Sr

Il t di Student è utilizzato anche nell’espressione dell’intervallo di
confidenza (I.C). stimato per il valore medio delle n prove di ripetibilità
ad un livello di fiducia del 95% (p=0,95):

S
Risultato= X ± t ×
n

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 29

La stima corretta dello scarto tipo di ripetibilità ha una importanza decisiva
nella gestione dei dati non solo di precisione , ma anche di esattezza e di
incertezza.

Il valore dello scarto tipo di ripetibilità stretta dei risultati ottenuti

applicando il metodo, consente di confrontare le prestazioni del
laboratorio con quelle dichiarate nel metodo ufficiale oppure riportate nella
documentazione di un circuito interlaboratorio od anche definite dal
laboratorio stesso come adeguate a “ soddisfare le esigenze del cliente”.

La statistica insegna che il rapporto tra scarto tipo Sr del laboratorio e

scarto tipo “ target ” indicato con σ è funzione del numero delle prove n :

Sr
A≤ ≤B
σr

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 30

 Sr
A≤ ≤ B
σr
Limite inferiore Limite superiore
Gradi di libertà ν=n-1 A B
1 0.0316 2,241
2 0.160 1,921
3 0,268 1,765
4 0,348 1,669
5 0,408 1,602
6 0,454 1,551 p =0,95
7 0,491 1,512
8 0,522 1,480
9 0,548 1,454
10 0,570 1,431
11 0,589 1,412
15 0.646 1,354
20 0,692 1,307
30 0,748 1,251

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 31

 Il confronto tra scarti tipo può essere eseguito , sostanzialmente con gli
stessi risultati, utilizzando il test di Fischer che confronta le varianze :

S r2(max,ν = n −1) )
2
≤ F(ν = n −1;ν = m −1; p =0,95 )
S r ( min,ν = m −1)

IL MODULO STATISTICO 30, disponibile nel CD distribuito opera in

automatico tutti i calcoli necessari a stimare lo scarto tipo di ripetibilità dopo
aver controllato l’esistenza di normalità della distribuzione e di “outliers” dati
anomali operando gli opportuni e previsti test statistici.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 32

La relazione dello scarto tipo di ripetibilità rappresenta un esempio di
propagazione degli errori, ed infatti, se la consideriamo senza fattore di
copertura, possiamo vedere che la differenza tra i due valori ha una incertezza
data dalla somma delle due varianze, che si assumono entrambi uguali a quella
stimata con le n prove di ripetibilità

r = X2 − X1 = Sr × 2

S differenza = S + S = S r 2
2
r
2
r
La cosa più importante da considerare e da ricordare è questa:
• la relazione, per essere valida, comporta che lo scarto tipo di
ripetibilità , calcolato, ad esempio, sei mesi prima, sia ancora valido e
che, quindi, i risultati delle due prove , eseguite “oggi” appartengano
alla stessa popolazione dei risultati delle n prove di ripetibilità iniziali.
Per poter essere sicuri di questo , il laboratorio deve assicurare il
controllo statistico del metodo:
DEVE AVERE LE CARTE DI CONTROLLO

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 33

La stima della precisione inizia sempre con le prove eseguite in
condizioni di ripetibilità, perchè l’acquisizione del dato di scarto tipo
Sr risulta fondamentale nel processo di validazione del metodo e nel
processo di controllo del mantenimento nel tempo delle prestazioni
degli operatori e del metodo stesso.

Il parametro della ripetibilità potrebbe essere stimato anche senza

conoscere il valore presunto vero del parametro da determinare.

Nella pratica del laboratorio, tuttavia, sono scelti, come campioni di

prova, materiali di riferimento , certificati o preparati dal laboratorio,
che siano rappresentativi delle prestazioni ( campo di applicazione e
campo di misura) del metodo di prova sotto indagine, sia per il tipo di
matrice che per il livello , presunto noto, dell’analita da determinare.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 34

Dal momento che il laboratorio esegue le n prove di
ripetibilità su un campione rappresentativo conoscendo il
valore presunto vero dell’analita da determinare , il valore
medio delle prove definisce il valore dell’ eventuale
differenza (“ scostamento”) rispetto al valore di
riferimento.
Se non esiste differenza significativa ( ossia se il metodo
è esatto) , l’incertezza del risultato ottenuto coincide con
l’imprecisione del risultato ed è esprimibile con lo scarto
tipo di ripetibilità, di ripetibilità intermedia o di
riproducibilità

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 35

Se esiste una differenza significativa tra il valore medio delle n
prove ed il valore di riferimento, e tale differenza permane
nonostante che il laboratorio abbia cercato di migliorare le
prestazioni del metodo, il laboratorio stesso può decidere di
correggere i risultati ottenuti inserendo nel calcolo un fattore di
correzione , per tener conto dello scostamento.

In questo caso , l’incertezza composta del risultato non è stimata

soltanto con il parametro dell’imprecisione (espresso dallo scarto
tipo di ripetibilità , stretta o intermedia, o di riproducibilità) , ma
dovrà tener conto anche del contributo dell’incertezza del fattore di
correzione , ossia del valore dello scostamento.
Il valore dello scostamento varierà infatti da sequenza a sequenza
di n prove e tale variazione sarà tanto più casuale quanto più i
valori medi ottenuti saranno indipendenti tra di loro , come avviene
appunto nelle condizioni di riproducibilità.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 36

 RIPRODUCIBILITA’
Lo scarto tipo di riproducibilità è ricavato dallo scarto
tipo di ripetibilità dei p laboratori partecipanti e dallo
scarto tipo interlaboratorio , che è a sua volta ricavato
dallo scarto tipo delle medie dei risultati ottenuti nelle n
prove ripetute dai singoli laboratori:
p

σ = σ +σ
2
R
2
L
2
r
∑ j
S 2

j =1
σ r2 =
σ r2 p
σ L2 = σ M2 −
( )
p 2
1
n
∑
Numero repliche effettuate dai
laboratori σ M2 = Xj−X
( p − 1) j =1
2
S
σ =σ −
2
L
2
R
r
Numero prove effettuate in
Media delle
prove in doppio
m routine

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 37

 RIPRODUCIBILITA’
Dallo scarto tipo di riproducibilità si ricava direttamente il
valore dell’incertezza dei risultati del metodo, considerata
naturalmente al livello di concentrazione studiato nel circuito.
Un laboratorio che non ha partecipato al circuito , può
appropriarsi dei dati di riproducibilità del circuito stesso se ,
operando su un campione simile a quello studiato , ottiene da
m prove di ripetibilità un valore di scarto tipo coerente con
quello determinato dai laboratori partecipanti.
La coerenza è definita dal rapporto tra gli scarti tipo già
riportato precedentemente.
Se così è,esprimerà l’incertezza, al 95% di confidenza (p=0,95),
in uno dei due modi:

Incertezza = 2 × σ R
2
S
Incertezza = 2 × σ L2 + r
m
Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 38
 ESATTEZZA
( ACCURATEZZA DELLA MEDIA )
Definizione : “ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto da una larga
serie di risultati ed il valore di riferimento accettato ”
Se laboratorio ha eseguito le n prove di ripetibilità su un materiale di
riferimento in cui è noto il valore , presunto vero, dell’analita, la differenza
tra la media dei valori trovati ed il valore noto misura l’esattezza del
risultato , che viene espressa con il termine “ scostamento” ( “bias”).

Lo scostamento quindi misura “il recupero” dell’analita dalla matrice.

Se il laboratorio esegue sullo stesso materiale di riferimento una

successiva serie di n prove , è certo che troverà dei valori diversi di
scostamento.

In questo senso è necessario tener conto anche della variabilità

( “incertezza”) del recupero.
Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 39
 ESATTEZZA
Confronto con un materiale di riferimento
Si eseguono n prove replicate ( almeno 6 ; possibilmente 10) indipendenti su
un materiale di riferimento o su una matrice bianca fortificata e , dopo aver
valutato che lo scarto tipo trovato è in linea con le aspettative di ripetibilità, si
confronta il valore medio trovato con il valore di riferimento e si verifica se la
loro differenza è significativa o meno al 95 % (p=0,95).
Se è conosciuta l’incertezza del materiale di riferimento la verifica è eseguita
con il seguente test statistico :

C CRM − X
≤ t p ,ν
2
s r
+ u CRM
2

con CCRM = valore certificato del CRM

con Xmedio = valore medio delle n prove di ripetibilità

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 40

 2
⎛S 2
⎞
⎜⎜ r
+ uCRM ⎟⎟
2

ν= ⎝ n ⎠ × (n − 1)
2 2
⎛ Sr ⎞
⎜⎜ ⎟⎟
⎝ n ⎠
e concludere che lo scostamento riferibile al metodo e quello riferibile al laboratorio
sono trascurabili.

Se ne potrebbe concludere che il metodo è esatto ,che l’incertezza del recupero è

compresa nella ripetibilità del metodo e che , l’incertezza del risultato della prova,
ottenuto ad esempio come valor medio di m replicati è esprimibile dalla relazione:

Sr2 2
U = tp,ν +uCRM
m
Con m = numero delle prove eseguite sul campione vero . Per prova singola m =1.

N.B. La relazione non tiene conto di altri contributi all’incertezza , quali ad esempio,
l’incertezza di taratura ecc.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 41

 ESATTEZZA
Confronto con un materiale di riferimento
Se si verifica che il valore medio trovato con le prove di ripetibilità ha uno
scostamento, stimato con la relazione precedente, significativo rispetto al
valore di riferimento, il laboratorio ne verifica , se applicabile, la significatività
tenendo conto, nella stima dell’esattezza, anche della variabilità riferibile a
condizioni di riproducibilità.

Se sono conosciute l’incertezza del materiale di riferimento ed anche la

varianza interlaboratorio , la verifica è eseguita con il seguente test
statistico :

CCRM − X
≤ t p,ν
2
s
σ + + uCRM
2
L
2 r
m

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 42

 ESATTEZZA
Confronto con un metodo normalizzato

Il metodo da validare viene confrontato con uno normalizzato che dispone di dati di
scarto tipo di ripetibilità e di riproducibilità . Se il laboratorio esegue sullo stesso
campione due serie di prove na e nb , con il metodo da validare e con quello
normalizzato , ottenendo due valori medi e due valori di scarto tipo sa e sb non
significativamente diversi tra loro ed entrambi compatibili con gli scarti tipo ( vedi
PG 99-022) del metodo normalizzato allora il metodo interno può essere considerato
esatto se :
xa − xb
≤ t p ,ν
1 1
S× +
na nb

con t = valore della variabile di Student al livello di probabilità p( al 95%) e con ν=

gradi di libertà.

S=
(na − 1)S a2 + (nb − 1)Sb2
(na + nb − 2)

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 43

 Precisione – Esattezza - Incertezza

Incertezza: “Parametro associato al risultato di una misurazione

o prova, che caratterizza la dispersione dei valori
ragionevolmente attribuibili al misurando ”.

Precisione: “ Grado di accordo tra i risultati indipendenti ottenuti

con un procedimento d’analisi in condizioni ben specificate”.

Esattezza: “ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto da

una larga serie di risultati ed il valore di riferimento accettato ”

Se la precisione è stimata eseguendo n prove su un campione

di cui si conosca la concentrazione dell’analita ed in condizioni
che garantiscano l’indipendenza dei dati ( RIPRODUCIBILTA’ O
ANCHE RIPETIBILITA’ INTERMEDIA ), lo scarto tipo esprime
anche il valore dell’incertezza se il valore medio delle prove non
si discosta significativamente dal valore di riferimento , ossia se
il metodo è esatto.
Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 44
 PRECISIONE ed ESATTEZZA

PRECISIONE = Differenza (scarto aleatorio) tra un singolo valore e la media degli n valori

ESATTEZZA ( accuratezza della media) = Differenza (scostamento) tra il valore presunto vero ed il valore
medio degli n. valori
ACCURATEZZA = Differenza ( scarto) tra il valore presunto vero ed il valore singolo del misurando

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 45

 Riepilogo:

Scarto aleatorio: differenza tra il risultato della singola prova e la

media dei risultati delle n prove di ripetibilità ( PRECISIONE);

Scostamento :differenza tra il valore medio delle n prove ed il

valore presunto vero (ESATTEZZA - trueness);

Scarto :differenza tra il risultato della singola prova ed il valore

presunto vero ( ACCURATEZZA - accuracy).

Dalla definizione di accuratezza sopra riportata, si comprende che

questo parametro racchiude in sé sia il concetto di esattezza che quello
di precisione.

scarto = scostamento ± scarto aleatorio

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 46

 ACCURATEZZA = ESATTEZZA + PRECISIONE ( Scarto = Scostamento ± Scarto aleatorio )
ESATTEZZA
Scostamento = ( XM – XR ) = + 4,2
ACCURATEZZA
10,0 14,2 Scarto = ( Xi – XR ) = + 9,0
+ 4,2
+ 9,0
+ 8,5
+ 8,0
+ 7,0
+ 6,0
+ 5,0
- 5,0
+ 4,0
- 2,0 + 2,5

* *
xR xM

15
5 10 25
0 + 0,8 20
- 0,2
- 7,2 + 1,8
+ 2,8
PRECISIONE
- 9,2
+ 3,8 Scarto aleatorio = (Xi – XM)= + 4,8
+ 4,3
+ 4,8

xR = valore di riferimento accettato Dati distribuiti normalmente test Shapiro-Wilks ( α = 0,05 %) n<40
xM = media delle misure
* Dati anomali per test di Grupps coppia di dati ( α = 0,05 %)
x1, x2, x3, x4…. xn = risultati singole misuse

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 47

 DATI SPERIMENTALI RIPORTATI NEL GRAFICO
Parametri statistici tutti i valori senza
anomali
Numero misure 10 8
Intervallo valori (range) 14 6,5
Valore minima misura 5 12,5
Valore massima misura 19 19
Mediana 15,5 16,5
Media 14,2 16,2
Scarto tipo ( Sr ) 4,8 2,3
Coeff. Variazione % (CVr ) 33,8 14,1
Gradi libertà ( ν = n-1) 9 7
t di student ( ν = n-1 ; p =0,95) 2,262 2,364
Intervallo confidenza media ( p = 0,95 ) 3,4 1,92
Limite inferiore intervallo 10,8 14,3
Limite superiore intervallo 17,6 18,2
Limite di ripetibilità metodo ( r ) ( p = 0,95) 15,3 7,7

bias = Xm − X R
Esattezza
Scostamento (bias) 4,2 6,2
Scostamento (bias) % 42,0 62,5
Xm − X R Verifica esattezza per confronto t di student NON ESATTO NON ESATTO
bias % = × 100 t calcolato ( ν = n-1 ; p=0,95) > t tabulato 2,769 > 2,262 7,689 > 2,364
XR

Xm − X R
tcalcolato = =
Sr
n

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 48

 LIMITE DI RIVELABILITA’

Determinazione del limite di rivelabilità del metodo di prova

La determinazione del limite di rivelabilità rappresenta spesso un
requisito importante , soprattutto nel caso di analisi in tracce.
Il limite di rivelabilità può essere calcolato , per via empirica,
analizzando campioni preparati per aggiunta del misurando alla
matrice in quantità via via decrescenti , fino ad identificare il valore
del misurando in grado di dare un rapporto segnale / rumore (S/N)=3.
Il limite di rivelabilità può essere statisticamente definito (
considerando un livello di fiducia del 95%) come il valore del
misurando che produce un segnale Y equivalente al segnale
prodotto da un bianco ( ottenuto dal trattamento della matrice priva
del misurando) YB più il triplo dello scarto tipo determinato sul
segnale del bianco 3SB; ( METODO IUPAC ) Y=YB+3SB;
Da un punto di vista statistico la relazione corretta, ad un livello di
fiducia del 95%, è: Y= YB +3,28 SB.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 49

• il limite di rivelabilità può essere stimato dai dati della retta di taratura,
assumendo che lo scarto tipo del bianco coincida con lo scarto tipo dei
residui :
∑ (y − yˆ i )
2
i
sy = i

x
n−2

con yi = valori sperimentali ed valori stimati dalla retta di regressione ed

n = numero complessivo delle determinazioni eseguite per costruire la
retta di regressione
Nel caso il metodo preveda la costruzione di una retta di taratura e si
disponga di opportuni programmi statistici, il limite di rivelabilità può essere
agevolmente stimato , utilizzando opportuni programmi statistici che
applicano la relazione che fornisce l’incertezza della retta:

Sx =
Sy
x 1 1
+ +
( y − y)
2

b m n b 2 ∑ ( xi − x )2
Dalle considerazioni precedenti si desume l’importanza di conoscere le
modalità di stima del limite di ripetibilità . Il metodo progettato dal laboratorio
deve quindi dare evidenza a questa informazione.
Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 50
 LIMITE di QUANTIFICAZIONE:
Il limite di quantificazione = limite di determinazione : minimo valore del
determinando che può essere rivelato e calcolato con accettabile
precisione
Il limite di quantificazione può essere stimato dai dati della retta di taratura,
disponendo di opportuni programmi statistici, impostando il livello di
precisione desiderato: ad esempio una precisione non inferiore al 10%.
IUPAC stima ,ad un livello di fiducia del 95%, il limite di quantificazione
come il livello di concentrazione corrispondente al segnale del bianco + 10
volte lo scarto tipo del bianco.

LIMITE di DECISIONE
Il limite di decisione non deve essere confuso con il limite di rivelabilità:
esso è definito come il livello di segnale con una probabilità del 50% di
essere confuso con quello del bianco e quindi con la stessa probabilità di
appartenere al determinando.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 51

 STIMA DELL’INCERTEZZA

Qualsiasi sia il criterio scelto per la stima dell’incertezza, è chiaro , dalle

cose dette finora, che essa può essere intrapresa solo dopo aver
eliminato o corretto tutti gli effetti sistematici conosciuti, perché il valore
del risultato deve rappresentare la miglior stima possibile della grandezza
da misurare .

Nella parte della relazione relativa all’esattezza, è stato visto come

stimare la significatività o meno degli effetti sistematici.

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 52

 INCERTEZZA
Modalità di stima

Approccio chimico /olistico

- Impiego dello scarto tipo di ripetibilità intermedia( R Chart)
- Impiego dello scarto tipo di riproducibilità
Ricavato da metodi ufficiali
Ricavato dal confronto con metodi validati
Ricavato da dati riportati nei certificati dei MRC
Ricavato dalla relazione di Horwitz (C : espressa in m/m):

CVR (%) = 2 (1−0,5logC)

Ricavato dalla relazione di Thompson ( valida sotto 120 ppb;

C: espressa in m/m)

σ R = 0,22 × C
Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 53
 INCERTEZZA
Modalità di stima
Approccio metrologico
-Legge di propagazione degli errori

La norma ENV 13005/2000 considera due fonti di incertezza:

-quelle valutabili dallo scarto tipo di ripetibilità (categoria A):
-quelle valutabili attraverso informazioni o stime di provenienza interna (
incertezza di taratura ) o esterna ( incertezza dei materiali di riferimento;
incertezza di pesata ; incertezza di diluizione ecc) – (categoria B).

In entrambi i casi si utilizza un modello matematico ,che descrive la

relazione funzionale tra grandezze da quantificare Y e le grandezze X
effettivamente misurate (grandezze di ingresso)

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 54

 INCERTEZZA
Modalità di stima
Approccio metrologico
-Legge di propagazione degli errori

⎡ ⎛ δ f (x ) ⎞⎟ ⎤
y = f ( x1 , x2 ,...xi ...x N )
2
N
u c (y ) = ∑ ⎢ ⎜⎜ i
⎟ .u ( x i )⎥
2

i =1 ⎢⎣ ⎝ δ x i ⎠ ⎥⎦

Nella maggior parte dei casi che interessano i calcoli sono semplificabili,
come risulta dai due esempi:

y = x1 + x2 + x3 uc ( y) = u2 (x1) + u2 (x2 ) + u2 (x3 )

x1 . x 2 . x 3 uc ( y) u2 (x1 ) u2 (x2 ) u2 (x3 ) u2 (x4 )

y = u&c ( y) = = + + +
x4 y x1 x2 x3 x4

Graziano Bonacchi Ancona 27 ottobre 2003 55

 Fine presentazione

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