Elfos Scientiae 2001

Aplicaciones de la calorimetra diferencial de barrido

al estudio de la estabilidad de las protenas
Alejandro Beldarran
Departamento de Evaluacin de Procesos y Sistema. Planta de Produccin.
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa.
AP 6162, CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: evalproc@ta.cigb.edu.cu
RESUMEN
En este manuscrito, se analizan las posibilidades de aplicacin de la calorimetra diferencial de barrido al estudio
de la estabilidad de las protenas. Se describe la metodologa de la tcnica cuando los procesos de desnaturalizacin
trmica son de equilibrio, como aquellos casos en los que existe un control cintico. Se ofrecen tambin las
ecuaciones necesarias para el tratamiento de los datos, aplicadas a algunas protenas producidas en la Planta de
Produccin del Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa de La Habana, Cuba.
Palabras claves: apoFLD, desnaturalizacin trmica, estabilidad de protenas, rHu-IFN, rSk
Biotecnologa Aplicada 2001;18:10-16
ABSTRACT
Application of Differential Scanning Calorimetry to Protein Stability Studies. In this manuscript, the possibilities
of application of the differential scanning calorimetry to the study of protein stability are analyzed. The methodology
of the technique is described when the processes of thermal denaturation are in equilibrium, like the cases in
which a kinetic control exists, and the necessary equations for data treatment are given, applied to some proteins
produced in the Production Plant of the Center for Genetic Engineering and Biotechnology in Havana, Cuba.
Keywords: apoFLD, protein stability, rHu-IFN, rSk, thermal denaturation
Introduccin
Una de las principales prioridades de la industria bio-
tecnolgica moderna es la obtencin de molculas es-
tables o estabilizadas; es decir, molculas resistentes a
los efectos de la temperatura, a los agentes caotrpicos,
a los solventes orgnicos, a los detergentes, etc. A esto
se adicionan las estrategias de estabilizacin de estruc-
turas moleculares para prevenir su inactivacin biol-
gica por cualquier agente externo, asunto al que se le
dedican esfuerzos considerables en la actualidad. Es-
tos aspectos estn relacionados directamente con la
falta de comprensin del mecanismo de plegamiento
de las biomolculas in vivo; o sea, la falta de conoci-
mientos sobre la segunda parte del cdigo gentico.
La organizacin compleja y la estabilidad de la es-
tructura tridimensional de una biomolcula, se pueden
investigar experimentalmente in vitro a travs del es-
tudio del proceso de su destruccin; es decir, del estu-
dio de su desnaturalizacin y de los factores externos
que influyen. El mtodo calorimtrico es el nico que
no necesita suponer a priori los mecanismos de estos
procesos. La tcnica de calorimetra de barrido es la
ms eficiente para su estudio, debido a que proporcio-
na informacin muy certera acerca de los parmetros
termodinmicos de estabilizacin de la estructura
macromolecular [1].
En los ltimos aos, la calorimetra diferencial de ba-
rrido (CDB) de alta sensibilidad se ha convertido en una
herramienta poderosa para caracterizar los cambios
conformacionales inducidos por la temperatura en las
macromolculas biolgicas, y se ha empleado fundamen-
talmente en estudios de prediccin del mecanismo de
plegamiento de las protenas. Esta tcnica ha servido
para determinar con exactitud los factores que influyen
en la estabilidad de las biomolculas [1-11]. En los lti-
mos aos, se han publicado trabajos sobre la aplicacin
de la CDB en anlisis cuantitativos y semicuantitativos
de la estabilidad de compuestos farmacuticos [6, 12,
13], y en la evaluacin de aditivos de formulaciones l-
quidas de compuestos de gran valor teraputico [14, 15].
El objetivo de este trabajo fue hacer una explicacin
de esta tcnica con la inclusin de ejemplos que de-
muestren su potencialidad a partir del estudio de pro-
tenas recombinantes, entre ellas algunas producidas
por el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa
de La Habana, Cuba.
Qu es la calorimetra
diferencial de barrido?
Esta tcnica es relativamente sencilla. Mediante la CDB
se mide la capacidad calorfica relativa de un sistema
determinado cuando sufre una transicin inducida por
un cambio trmico [1, 3, 4]. En el experimento, las cel-
das con la muestra y la referencia se calientan simult-
neamente a una misma velocidad predeterminada. La
muestra es una solucin o una suspensin del material
que se desea estudiar, y la referencia contiene solamen-
te el disolvente utilizado. Cuando se calientan ambas
celdas y se produce una transicin inducida por la tem-
peratura (por ejemplo, la desnaturalizacin de una pro-
tena o una transicin orden-desorden en una bicapa
fosfolipdica), la muestra absorbe parte del calor que se
le est suministrando a la celda. Como resultado, la c-
lula de la muestra tendra una temperatura algo inferior
a la de la celda de referencia, pero el sistema de control
del equipo suministra una potencia calorfica adicional
para que ambas celdas mantengan la misma temperatu-
ra. Esta potencia en exceso es proporcional a la diferen-
cia de capacidades calorficas entre las dos celdas y sus
contenidos. De esta forma simple se obtiene la capaci-
dad calorfica del soluto en funcin de la temperatura.
Biotecnologa Aplicada 2001; Vol.18, No.1 11
Alejandro Beldarran Calorimetra y estabilidad de las protenas
En la Figura 1 se muestra un experimento tpico de
CDB aplicado a una protena. Se puede observar que el
valor de capacidad calorfica de la protena Cp, no es el
mismo antes y despus del proceso de desnaturalizacin,
con un valor de Cp>0. Esta capacidad calorfica intrn-
seca, LB
quim
, se resta de la curva de capacidad calorfica
anterior para obtener la capacidad calorfica de exceso,
Cp
exc
(Figura 2). La reversibilidad de la transicin se com-
prueba normalmente con el recalentamiento de la mues-
tra de protena en la celda calorimtrica, inmediatamente
despus de enfriar la celda que se calent en el primer
barrido. Esta prueba de reversibilidad slo muestra que el
sistema vuelve al estado inicial (nativo) despus del en-
friamiento, pero es posible que el sistema no est en equi-
librio todava si est controlado cinticamente por la
velocidad de barrido utilizada. Una prueba de reversibilidad
mejor consiste en comprobar que la curva obtenida no
depende de la velocidad con que se vara la temperatura
[16]. Tanto para esta comprobacin como para la realiza-
cin de cualquier experimento de CDB, conviene siempre
asegurar que la respuesta del instrumento sea lo suficien-
temente rpida para que no se distorsione la seal (o al
menos que se pueda corregir por los mtodos de correc-
cin dinmica existentes) [7]. En la referencia 17 se
puede encontrar una descripcin detallada de un mi-
crocalormetro diferencial de barrido y de la metodologa
experimental que se debe seguir para su utilizacin.
Procesos de equilibrio
La informacin que se puede obtener de un experi-
mento de CDB es diferente cuando el proceso est en
equilibrio durante el barrido de temperatura (transicin
reversible), en comparacin con un proceso controlado
cinticamente (transicin irreversible).
En los casos de reversibilidad en las desnaturaliza-
ciones seguidas por CDB, se acepta, por lo general, la
aplicacin de la termodinmica de equilibrio para el
anlisis de los datos.
Modelo de equilibrio de dos estados
La desnaturalizacin ms simple es aquella en la que
solamente los estados nativo (N) y desnaturalizado (D)
estn poblados significativamente, y sus cantidades re-
lativas a una temperatura determinada estn determi-
nadas por el valor de la constante de equilibrio de
desnaturalizacin K:
donde:
K = D/N
A este modelo se ajustan protenas pequeas co-
mnmente [1].
La Figura 2 es una representacin de una curva de
capacidad calorfica de exceso obtenida para la apoFLD,
a pH neutro y a baja fuerza inica. Esta curva fue cal-
culada para un proceso de equilibrio simple entre dos
estados cuando el sistema sufre un barrido de tempe-
raturas en el rango en que ocurre esta transicin, a
travs de la ecuacin:
suponiendo que Cp = 0, Tm = 330,45 K y
H = 263 kJ/mol.
La entalpa del proceso en estudio (H) es simple-
mente el rea bajo la curva, que a veces se conoce

N D
RT
H
) K + (1
K
= Cp
2
2
2
exc
Figura 2. Curva de capacidad calorfica de exceso para la
apoFLD fosfato s dico en 50 mM pH 7,0. A la curva expe-
rimental (lnea continua) se le rest la lnea base, la lnea
qumica y est ajustada por mnimos cuadrados no lineales
a una curva terica de dos estados (lnea discontinua).
290 300 310 320 330 340 350 360
Temperatura (K)
C
p

(
k
J
/
m
o
l

K
)
e
x
c
20
15
10
5
0
Figura 1. Curvas de capacidad calorfica contra tempera-
tura para la apoFLD en fosfato sdico 50 mM pH 7,0
(c =1,5 mg/mL, vb = 2 K/min). Cp
desnat
(T): capacidad
calorfica del estado desnaturalizado; LB
quim
:

capacidad
calorfica intrnseca; Cp
nat
(T): capacidad calorfica del estado
nativo; CP: variacin de capacidad calorfica; H: entalpa
especfica total; Tm: temperatura en el mximo de la curva.
como entalpa total de la transicin o entalpa
calorimtrica (H
cal
), pues:
donde:
T1 y T2: temperaturas antes y despus de la transicin
H: entalpa especfica total para el proceso N D
La temperatura en el mximo de la curva (Tm) coin-
cide prcticamente con la temperatura a la que se pro-
duce la transicin justo a la mitad, con poblaciones
similares de los estados nativo y desnaturalizado.
Para este proceso, el calor absorbido a una tempe-
ratura determinada es proporcional al avance de la
reaccin. Por lo tanto, la constante de equilibrio del
proceso (K) a cada temperatura se puede obtener f-
cilmente a partir de esta curva, y a partir de la ecua-
cin de vant Hoff se puede calcular el cambio de
entalpa (H
vH
) correspondiente del proceso N D,
segn:
dT Cp = H
exc
2
1
T
T

2
vH
p
RT
H
dT
dlnK

,
`

.
|
290 300 310 320 330 340 350 360
30
35
40
45
50
55
60
Temperatura (K)
C
p

(
k
J
/
m
o
l

K
)
T
m
H
Cp
Cp (T)
desnat
Cp (T)
nat
LB
quim
Biotecnologa Aplicada 2001; Vol.18, No.1 12
Alejandro Beldarran Calorimetra y estabilidad de las protenas
Se puede demostrar de forma simple que a T = Tm [5]:
donde:
Cp
m
: valor de Cp
exc
en el mximo de la curva
Si este proceso es, como se ha supuesto, un equili-
brio entre dos estados A y B, los valores de H
vH
y
H
cal
deben ser idnticos. De hecho, H
vH
carece de
sentido si ste no es el caso. Sin embargo, la razn
r = H
cal
/H
vH
, que debe ser igual a 1 en este modelo,
se utiliza muy a menudo para comprobar si el modelo
se cumple o no, e incluso para obtener informacin del
proceso que se est estudiando (vea ms adelante).
Una vez que se conocen los valores de Cp y H a
T = Tm, a partir de un experimento nico, es posible
obtener los cambios de entalpa (H), entropa (S) y
energa de Gibbs (G) a otras temperaturas para el
proceso entre los dos estados, a partir de ecuaciones
termodinmicas conocidas [1]:
H(T) = H(Tm) + Cp(T-Tm)
S(T) = H(Tm)/Tm + Cp ln(T/Tm)
G(T) = H(T) + TS(T)
En la Figura 3 se muestra una representacin de
G(T) para la apo-FLD en funcin de la temperatura
como medida de la estabilidad conformacional y en fun-
cin del pH. Se observa que los valores de la energa de
Gibbs son bajos (entre 20 y 80 kJ/mol) los cuales repre-
sentan una compensacin entre valores de entalpa y
entropa de un orden de magnitud superior. A cada tem-
peratura, los valores de G se pueden interpretar como
una medida de la estabilidad de la protena en estudio, si
se admite que todas las protenas tienen, aproximada-
mente, un estado desnaturalizado de igual energa como
se comprob hace ya bastantes aos [18]. Tambin se
puede observar en esta figura que la estabilidad (o G)
es nula a Tm y que, adems de una desnaturalizacin por
calor, se puede producir tambin una desnaturalizacin
por fro, hecho que se ha comprobado de forma inde-
pendiente para otras protenas [4].
Existe cooperatividad intermolecular cuando se ob-
serva que H
vH
> H
cal
, aunque el proceso siga siendo
de equilibrio. Un caso extremo es el de una transicin
de primer orden, en el que r tiende al infinito. Cuando
una protena es un dmero en ambos estados, el nativo
y el desnaturalizado, r tiende a 2. Si la protena es un n-
mero en el estado nativo, pero est totalmente diso-
ciada en el estado desnaturalizado, se puede demostrar
que a T=Tm:
r = 4[(n-n
1/2
)/(n-1)]
2
En el caso de las transiciones trmicas conocidas de
las bicapas fosfolipdicas, la razn r indica el nmero medio
de molculas de lpido que sufren la transicin, a las que
se le llama tamao de la unidad cooperativa [19].
Adems del anlisis termodinmico explicado ante-
riormente, se puede obtener una medida de la estabili-
dad conformacional de cualquier biomolcula en funcin
de las condiciones del medio, si se toman como refe-
rencia la temperatura en el mximo de la transicin
(Tm) y la entalpa calorimtrica que caracteriza al pro-
ceso de desnaturalizacin.
Equilibrio entre ms de dos estados
El hecho de que H
vH
<H
cal
en el proceso de equilibrio,
indica que este proceso no es de dos estados y que
existen intermedios estables termodinmicamente [2].
Esta situacin corresponde normalmente al caso en que
ciertas regiones de la protena, o dominios cooperati-
vos, se desnaturalizan ms o menos independientemente
uno del otro. Se han propuesto varios modelos para
explicar estos casos. El ms antiguo y ms frecuen-
temente usado es el modelo secuencial, que consiste
en varios estados consecutivos durante el proceso de
desnaturalizacin [20]. Los parmetros termodinmi-
cos de cada estado se pueden calcular a partir de la
curva experimental Cp(T) por ajuste de mnimos cua-
drados no lineales, por el anlisis en etapas recursivas
en funcin de la temperatura hasta que se obtengan las
Figura 3. Dependencia de G de la temperatura para la
apoFLD en acetato sdico 50 mM en funcin del pH en
orden ascendente.
Figura 4. Curvas de capacidad calorfica contra temperatura
para la rSk en fosfato sdico 10 mM pH 7,5. La lnea con-
tinua corresponde a los datos experimentales. Las lneas se
obtuvieron por el ajuste de los datos al modelo de dos es-
tados. La lnea discontinua representa la suma de las cua-
tro transiciones individuales.
cal
m
2
m
vH
H
Cp
RT 4 H

270 280 290 300 310 320 260 340
Temperatura (K)

G

(
k
J
/
m
o
l
)
330
0
3
6
9
12
15
18
21
-3
24
300 310 320 330 340 350 290 360
Temperatura (K)
C
p

(
k
J
/
m
o
l

K
)
e
x
c
40
30
20
50
0
10
Biotecnologa Aplicada 2001; Vol.18, No.1 13
Alejandro Beldarran Calorimetra y estabilidad de las protenas
constantes de equilibrio, la fraccin de molculas en
cada estado, los cambios de entalpa y cualquiera otra
funcin relacionada con ellos. En la Figura 4 se mues-
tra un ejemplo de un sistema analizado por este mto-
do, correspondiente a la transicin trmica de la
estreptoquinasa recombinante (rSk) a pH neutro.
La deconvolucin del termograma (lneas disconti-
nuas en la Figura 4) muestra que la protena tiene cua-
tro dominios que se desnaturalizan independientemente
en funcin del pH con diferente estabilidad
(Figura 5). Aunque los dominios sean termodinmica-
mente estables e independientes, la estabilidad global
de la protena y, por consiguiente, su actividad biolgi-
ca, puede estar determinada por la estabilidad del do-
minio ms sensible. Por lo tanto, se hace indispensable
conocer cul es la parte de la estructura que corres-
ponde a este dominio. Una manera bastante efectiva
que se ha utilizado, incluso para la estreptoquinasa, es
la fragmentacin por digestin proteoltica y la evalua-
cin posterior del fragmento obtenido, con la compara-
cin de su comportamiento calorimtrico con el
observado para la protena ntegra [21, 22].
Otro aspecto interesante que vale la pena destacar
es la cantidad de dominios de esta protena, que vara
de 1 a 4 segn algunos reportes [21-26]. La posibilidad
de que pequeos cambios en las condiciones experi-
mentales o en la estructura de la misma protena pue-
dan influir en la cantidad de dominios, ha sido analizada
por Beldarran y colaboradores [27].
Otro modelo al cual se ajustan muchos datos experi-
mentales bastante bien es el llamado modelo de transi-
ciones independientes [28]. Este modelo supone que la
desnaturalizacin de una protena es un proceso de
desnaturalizacin de cada uno de sus dominios y que
estos procesos son independientes unos de otros; es
decir, que la desnaturalizacin de un dominio no influye
en la desnaturalizacin de los dems.
En los ltimos aos, se han introducido otros mode-
los [8, 29] que tienen en cuenta el hecho de que los
diversos dominios interaccionan ms o menos entre e-
llos. Esto se suele hacer con la introduccin de una
energa de Gibbs de interaccin (Gij) entre los domi-
nios i y j. Este modelo coincide con el modelo de transi-
ciones independientes cuando Gij es muy grande.
Procesos de no equilibrio
Los equilibrios descritos anteriormente no se cumplen
para muchas protenas solubles y para ninguna de las
protenas de membrana estudiadas hasta la fecha. Por
lo tanto, los parmetros termodinmicos que se obten-
gan mediante la aplicacin de la metodologa descrita
anteriormente pueden ser falsos, excepto el rea deba-
jo de la curva que representar todava la entalpa de
desnaturalizacin del proceso, pues las curvas
calorimtricas estn altamente distorsionadas por el
efecto de la alteracin irreversible. La desnaturaliza-
cin trmica irreversible es atribuida generalmente a
alteraciones del estado final, como la autlisis, las
agregaciones, las alteraciones qumicas de los residuos
de aminocidos, etc., que impiden que la protena adop-
te su estructura nativa.
Estas alteraciones irreversibles son fundamentalmen-
te procesos cinticos que se pueden describir a travs
de ecuaciones de velocidad. Las curvas que se obtie-
nen normalmente en casos de no equilibrio son simila-
res a las que se muestran en la Figura 6 (lneas
continuas). Sin embargo, tambin en este caso es posi-
ble obtener informacin til acerca del proceso de des-
naturalizacin, aunque ser, claro est, de carcter
cintico y no termodinmico. Para ello se pueden apli-
car diversos modelos cinticos que permiten el anlisis
de las curvas experimentales de CDB [7, 16, 30]. Aqu
se describe simplemente el ms sencillo de todos: el
modelo de Lumry y Eyring [16].

donde:
F: estado final, al que se llega irreversiblemente des-
de el estado desnaturalizado D.
El equilibrio entre los estados N y D se describe
mediante la constante de equilibrio K y la etapa irre-
versible es de primer orden con una constante de velo-
cidad kF.
Este modelo de Snchez-Ruiz (NF) permite de-
terminar la constante de velocidad (kF), y su energa de
activacin (EA), relacionadas por la ecuacin de
Arrhenius:
donde:
R: constante de los gases
e: base de los logaritmos naturales
A: factor de frecuencia
El modelo conduce a una serie de ecuaciones me-
diante las cuales se puede calcular EA:
A) La constante de velocidad de la reaccin, a una tem-
peratura dada, se puede calcular mediante la ecuacin:
Figura 5. Dependencia de H
cal
(arriba) y la temperatura
en el mximo de la transicin (Tm) (abajo) en funcin del
pH para la rSk.
11 10 9 8 7 6 5 4
pH
Transicin 1 Transicin 2 Transicin 3 Transicin 4
300
310
320
330
340
T
m

(
K
)
400

H

(
k
J
/
m
o
l
)
c
a
l
150
200
250
300
350
) RT / E (
A
Ae k

H H
vCp
k
exc

kF
K
N D F
Biotecnologa Aplicada 2001; Vol.18, No.1 14
Alejandro Beldarran Calorimetra y estabilidad de las protenas
Figura 6. Representaciones grficas para la determinacin
de la EA del interfern humano recombinante (rHu-IFN)
en fosfato sdico 10 mM pH 6,8. A) Representacin de
Arrhenius segn el mtodo A. B) Aplicacin del mtodo B,
donde 1/T significa 1/Tm. C) Aplicacin del mtodo C.
donde:
H: calor total de la transicin
H: calor desarrollado hasta la temperatura T
Cp
exc
: capacidad calorfica de exceso a la tempe-
ratura T
v: velocidad de barrido
Mediante el uso de la ecuacin de Arrhenius, se puede
representar ln k contra a 1/T para los valores de k
obtenidos a cada temperatura. Todos los valores
deben quedar en una recta independientemente de
la velocidad de barrido a la que se han obtenido. En
la Figura 6A se muestra la representacin para el
interfern recombinante (rIFN-).
B)El modelo predice que la temperatura del mximo
(Tm) debe cambiar con la velocidad de barrido; se-
gn la ecuacin:
de manera que, si se representa ln(v/Tm
2
) contra 1/Tm,
se debe obtener una recta de pendiente -EA/R. Esta
representacin para el rIFN- se muestra en la Fi-
gura 6B.
C)El calor desarrollado a cada temperatura H es:
) / (
T
v
2
m
m A
A
RT E
e
E
AR

,
`

.
|

,
`

.
|

,
`

.
|

T T R
E
H H
H
m
A
1 1
ln ln
H
T eRCp
E
m
m
A

2
por lo que se puede obtener EA de una representa-
cin del primer trmino de esta ecuacin contra 1/T,
que debe ser una lnea recta de pendiente -EA/R. En
la Figura 6C se muestra esta representacin para el
rIFN-.
D)Tambin se puede calcular EA directamente a partir
de la ecuacin:
donde:
Cp
m
: capacidad calorfica de exceso a la temperatu-
ra Tm
Cuando estos cuatro mtodos conducen a valores
coincidentes para la energa de activacin, se puede
concluir que se cumple el modelo. Sin embargo, es
preferible comprobar los resultados experimentales
con los valores calculados (ver el modelo E).
E) Un quinto mtodo se deduce a partir de la deriva-
cin de la ecuacin del modelo C y teniendo en cuen-
ta la ecuacin del modelo D:
La energa de activacin se puede obtener mediante
un ajuste no lineal de mnimos cuadrados de los datos
experimentales de Cp (T) (Figura 7).
Se ha visto que las transiciones dependen en gran
medida de la velocidad de barrido en este modelo, como
se haba mencionado antes para procesos de no equili-
brio. sta es una regla general independientemente del
modelo que se emplee para explicar los datos de CDB
de desnaturalizaciones controladas cinticamente. Por
lo tanto, se puede emplear como criterio de aplicacin
o no de la termodinmica de equilibrio cuando se en-
cuentren transiciones irreversibles desde el punto de
vista calorimtrico.
Este modelo tan sencillo ha descrito muy bien los da-
tos de CDB de protenas que se desnaturalizan de forma
irreversible [31-35]. En la Tabla y la Figura 7 se puede
apreciar la buena concordancia entre los valores experi-
mentales y las curvas tericas calculadas para el rIFN-.
Cp (T) eCp exp
E
RT
(T T exp exp
E
RT
(T T )
exc m A
m
2 m
)
A
m
2 m

]
]
]

|
.

`
,

]
]
]
]
2,96 3,00 3,04 3,12 3,16 3,08
10 (T/K)
3
-4
-2
0
-6
2
-13
-11
-4
-2
-6
0
A
B
C
l
n

K
l
n

(
v
/
T
m
)
2
l
n

l
n
[
H
/

H
-
(
H
)
]
}
2 K/min 1 K/min 0,5 K/min 0,25 K/min
Figura 7. Aplicacin del mtodo E del modelo cintico de dos
estados para el rHu-IFN en fosfato sdico 10 mM pH 6,8.
Los smbolos representan los datos calculados de Cp
exc
contra
la temperatura a las velocidades estudiadas utilizando la
ecuacin descrita en el mtodo y EA =350 kJ/mol. Las lneas
continuas corresponden a los datos experimentales.
310 315 320 325 330 335 340 305 345
Temperatura (K)
10
20
30
40
50
60
70
0
80
C
p

(
k
J
/
m
o
l

K
)
e
x
c
2 K/min 1 K/min 0,5 K/min 0,25 K/min
Biotecnologa Aplicada 2001; Vol.18, No.1 15
Alejandro Beldarran Calorimetra y estabilidad de las protenas
Es obvio que se puede extraer informacin cintica
slo de la aplicacin de este modelo, ya que la informa-
cin termodinmica queda totalmente enmascarada por
la presencia del proceso irreversible. No obstante, para
una velocidad de barrido especfica, el valor de Tm se
puede utilizar como parmetro comparativo para eva-
luar la estabilidad de una biomolcula en funcin de las
condiciones del medio (Figura 8).
Conclusin
La CDB puede proporcionar informacin valiosa acer-
ca de la naturaleza del desplegamiento de una macro-
molcula y de las fuerzas que influyen en la estabilidad
del estado nativo. Por esa razn esta tcnica se puede
emplear ampliamente para la evaluacin rpida y efec-
tiva de molculas nuevas o modificadas con relevancia
biotecnolgica, producidas por tcnicas de ingeniera
gentica ya sea para uso clnico o industrial y
constituye una herramienta indispensable en el mo-
mento de elegir una estrategia para la obtencin de
una molcula muy estable trmicamente en condicio-
nes biolgicas ptimas.
Aunque la utilidad de esta tcnica es indudable,
es muy conveniente utilizarla junto a otras tcnicas
calorimtricas, en particular la calorimetra de titula-
cin isotrmica o con la calorimetra de flujo, pues
estos mtodos pueden proporcionar informacin adi-
cional en el examen de, por ejemplo, la termodinmi-
ca de las interacciones entre macromolculas y
ligandos especficos en funcin de la temperatura,
en estudios de oligomerizacin de protenas o, sim-
plemente, en la evaluacin de la influencia de la es-
tabilidad de una macromolcula en una formulacin
especfica.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido realizado con la ayuda del Ministe-
rio Espaol de Ciencias gracias a una beca otorgada a
AB (Accin Especial BIO95-2068-E) en la Unidad de
Resonancia Magntica Nuclear del Instituto Pluridisci-
plinar de la UCM. Tambin agradecemos la colabora-
cin de las Divisiones de Estreptoquinasa e Interferones
de la Planta de Produccin del CIGB que suministra-
ron parte de las protenas estudiadas.
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Figura 8. Influencia del pH y la fuerza inica en la
estabilidad conformacional del rHu-IFN a una velocidad
de barrido (2 K/min). Los tampones utilizados fueron:
acetato pH 4-5, fosfato pH 6-9 y glicina pH 10.
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

(
K
)

H

(
k
J
/
m
o
l
)
c
a
l
10 9 8 7 6 5 4
pH
315
320
325
330
335
200
300
400
500
600
5 mM 10 mM 20 mM 50 mM 100 mM
Tabla. Valores de energa de activacin obtenidos por
diferentes mtodos para la desnaturalizacin trmica
del rIFN- en tampn fosfato 10 mM pH 7,0.
Mtodo Energa de activacin kJ/mol
A 340
B 400
C 342
D 318
Promedio 350 30
16 Biotecnologa Aplicada 2000; Vol.17, No.1
Alejandro Beldarran Calorimetra y estabilidad de las protenas
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