Sei sulla pagina 1di 5

perch creare animali transgenici Creazione di animali geneticamente modificati per: y y y Studio della funzione e della regolazione genica

Modelli animali per le malattie umane Modelli sperimentali per: 1. Correzione del difetto genico 2. Messa a punto di terapia farmacologica

Un organismo di considera transgenico quando il gene esterno : y y y Integrato nel suo genoma Espresso correttamente e selettivamente in uno o pi tessuti dell animale Integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall animale fondatore della progenie

Knock in: gene endogeno inattivato per inserimento di un altro gene che viene espresso. Il gene pu appartenere alla stessa specie o derivare da specie differenti. Knock out: introduzione di sequenza genica per l abolizione della funzione ge nica endogena. L inserzione del gene esogeno avviene grazie ad una ricombinazione omologa tra il DNA esogeno e il DNA endogeno sia per knock in che per knock out . Naturalmente devono essere note delle sequenze che si possano riconoscere per omologia a monte e a valle. Es. nel caso di geni engrailedomeotici per sviluppo del cervello attivati in successione temporale. Ci sono topi in cui c erano anomalie cerebrali a livello del gene EN1, sostituito con gene EN2 che ha una funzione molto simile, important e che il tutto rimanga sotto controllo del promotore di EN1, quindi espresso temporalmente come lo sarebbe EN1. Quando faccio knock in mi servono dei marcatori. Metodi di trasferimento genico: 1. Trasferimento genico diretto: Trasfezione mediata da liposomi (per endocitosi) Trasfezione mediata da recettori Trasfezione di DNA libero con microiniezione 2. Trasferimento genico con vettori (infezione virale) 3. Bersagli: Microiniezione del pronucleo maschilein oocita fecondato Trasferimento nucleare di cellula somatica ingegnerizzata in oocita fecondato privo di nucleo y Trasferimento in cellule embrionali staminali ES e reimpianto in blastocisti 4. Inserzione Ectopica Mirata

y y y

y y

y y

1. Liposomi: doppio strato lipidico, possono essere a carica esterna negativa (anionici) cosicch il DNA entra nel liposoma, o a carica esterna positiva (cationici) e il DNA si lega esternamente. A contatto con la membrana della cellula target e per endocitosi il DNA entra nella cellula bersaglio. Mediata da recettori: DNA plasmidico coniugato insieme a polilisina e transferrina . Se la cellula ha recettori specifici ingloba in complesso poi bisogna vedere se entra nel nucleo. Uso di DNA libero come segmenti, o DNA con vettore non complessato, inse risco con micro pipetta nel pronucleo maschile e mi aspetto che il DNA si integri. 2. Tramite vettori: infezione virale, adenovirus, virus adeno-associati e retrovirus. 3. Bersagli: Se microiniezione va a buon fine tutto l animale trasgenico, anche se faccio trasferimento nucleare, ma se prendo le ES ottengo una chimera, parte delle cellule normale e parte trasgenica. Un mosaico quando ho uno zigote con mutazione genetica e ottengo due popolazioni cellulari dallo stesso genotipo. Invece la chimera ha due ge notipi diversi, quello della blastocisti e quello impiantato, le ES mi danno due popolazioni cellulari. Per avere poi topi transgenici le gonadi devono essere chimeriche (trasgeniche) per dare figli totalmente trasgenici. TRANSGENESI IN M.musculus Nel topo si impiegano due tecniche di trasgenesi, ciascuna delle quali presenta vantaggi e svantaggi. y INSERZIONE ECTOPICA. I transgeni sono inseriti in modo casuale nel genoma utilizzando assetti multi copia. y INSERZIONE MIRATA. La sequenza del transgeneviene inserita nel genoma in una posizione occupata da una sequenza omologa. In pratica il transgene sostituisce la controparte omologa normale. Inserzione ectopica: transgeni inseriti in posizioni casuali con questa procedura: si inietta nel nucleo di un uovo fecondato una soluzione di DNA batterico clonato. Numerose uova cos trattate sono immesse nell ovidotto di una femmina e alcune di esse svilupperanno dei topi. In una fase pi avanzata dello sviluppo il transgenesi integra nei cromosomi di alcuni nuclei. Talvolta pu accadere che cellule transgeniche entrino a far parte della linea germinale, in tal caso un embrione contenente il trasgene si svilupper in un topo adulto le cui cellule germinali conterranno anche esse il transgene inseritosi in qualche posizione casuale in un cromosoma. Una parte della progenie di questi topi adulti erediter il transgene in tutte le sue cellule. In ogni punto di inserzione ci sar un assetto multi copia del transgene, ma la posizione, la dimensione e la struttura di tali assetti saranno diverse nei vari eventi di integrazione. Questa tecnica presenta alcuni problemi,il primo che il pattern con cui si esprimono geni inseriti casualmente pu essere anormale (effetto di posizione) perch l ambiente cromosomico in cui viene per caso a trovarsi il gene pu essere privo delle normali sequenze regolatrici. Il secondo che all nterno degli assetti multi copia possono verificarsi riarrangiamenti del DNA, in pratica cambiamenti nelle sequenze. Malgrado ci, questa tecnica molto pi efficace e meno laboriosa dell Inserzione mirata. Inserzione mirata: tale tecnica permette di eliminare o modificare la funzione codificata da un certo gene. In una applicazione, un allele mutante pu essere riparato mediante una sostituzione genica, un processo in cui un allele di tipo selvatico sostituisce un allele mutante nella sua normale posizione sul cromosoma. La sostituzione genica permette di evitare sia l effetto di posizione sia i riarrangiamenti del DNA associati all inserzione ectopica, poich l unica copia del gene viene inserita esattamente nel suo normale ambiente cromosomico. Nel

topo l inserzione mirata viene eseguita su colture di cellule embrionali staminali ES. In generale, una cellula staminale una cellula indifferenziata di un certo tessuto o organo che si divide asimmetricamente, producendo nella progenie una cellula staminale e una cellula che andr incontro a differenziamento nel tipo cellulare finale. Le cellule ES sono cellule staminali speciali in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo cellulare dell organismo, tra cui le cellule germinali. Esempio: come sostituire un gene normale con un gene inattivo ovvero un knockout genico. Dapprima un gene clonato, non funzionante viene indirizzato a sostituire il gene funzionante in una coltura di cellule ES, producendo cos ES che contengono il gene knockout. Costrutti di DNA contenenti il gene difettoso sono poi iniettati nei nuclei di cellule ES in coltura. Il gene difettoso va a inserirsi molto pi spesso in siti non omologhi ( inserzione ectopica) che nel sito omologo per cui il passo successivo consiste nel cercare le rare cellule in cui il gene difettoso ha sostituito il gene funzionante. Un tipo di selezione potrebbe essere questo: Copie del gene clonato sono alterate in vitro per produrre il vettore per il bersaglio. Il gene in questo caso stato inattivato mediante l inserzione del gene neoR, il gene per la resistenza alla neomicina, nella regione codificante per la proteina ed stato poi inserito nel vettore. neoR servir poi come marcatore per indicare che il DNA vettore si inserito nel cromosoma. Il vettore stato ingegnerizato per portare su una sua estremit un altro marcatore: il gene tk(timidina chinasi, recupera i nucleotidi e converte la timidina libera in timidinamonofosfato che serve per la sintesi del DNA) dell herpes. Questi marcatori sono standard. Quando il vettore con i suoi due marcatori completato, si pu introdurre in cellule isolate da un embrione di topo. Quando avviene ricombinazione omologa le re gioni del vettore insieme a qualsiasi segmento di DNA intermedio ma escludendo il marcatore all estremitprendono il posto del gene originale. Questo evento molto importante perch le sequenze del vettore servono come etichette per evidenziare la presenza di questo gene mutante. In molte cellule per l intero vettore compreso anche il marcatore all estremit si integra in posizione ectopica o non si integra affatto. Per isolare le cellule che contengono la mutazione mirata, tutte le cellule sono trasferite in un mezzo di coltura contenente farmaci selettivi in quest caso una sostanza affine alla neomicina detta G418 e Ganciclovir. Il G418 letale per le cellule che non portano l allele neoR e pertanto elimina tutte quelle cellule in cui il DNA vettore n on si integrato. Allo stesso tempo il ganciclovir letale per le cellule che portano il gene tk e quindi elimina le celllule con un DNA vettore che si integrato in modo casuale. Di conseguenza, le uniche cellule che riescono a sopravvivere e a proliferare sono quelle che contengono l inserto con la mutazione. Nella seconda parte della procedura le cellule ES contenenti una copia del gene di interesse sono iniettate in un embrione in fase iniziale di sviluppo. Gli adulti cresciuti da questi embrioni sono incrociati con topi normali. Da questi incroci nascer una progenie chimerica, in cui alcuni tessuti deriveranno da linee cellulari originarie altri dalle linee ES trasferite. I topi chimerici sono poi incrociati con i loro fratelli per produrre topi omo zigoti con il gene knockout al posto di ogni copia del gene originario. I topi contenenti il transgene bersaglio in ogni cellula sono poi identificati mediante sonde molecolari che riconoscono le sequenze esclusive del transgene. Altro esempio di produzione di un topo knockout che porta la mutazione mirata. Da un ceppo di topi aguti marrone si isolano le cellule staminali embrionali con genotipo A/A che vengono poi alterate in modo da portare una mutazione mirata in un cromosoma. Le ES vengono quindi introdotte in embrioni in una fase precoce dello sviluppo. Il colore del mantello dei futuri piccoli funge da indicatore per capire se le cellule ES sono sopravvissute nell embrione ricevente. Infatti in assenza delle cellule ES che vengono introdotte, gli embrioni si svilupperebbero in topi dal mantello completamente nero poich derivano da un ceppo che manca dell allele dominante aguti a/a. Gli embrioni contenenti le cellule ES crescono in madri

sostitutive fino al termine della gravidanza. La presenza di chiazze nere e aguti nel manto di un piccolo indica che in quell animale le cellule ES sono sopravvissute e hanno proliferato. Questi individui sono detti chimere poich contengono cellule derivate da due ceppi differenti. Un manto completamente nero indica che le cellule ES sono morte, i topi che mostrano questo fenotipo vengono esclusi dall esperimento. A il simbolo per l allele aguti, a per il nero, m indica la mutazione mirata e M l allele di tipo selvatico. Maschi chimerici vengono accoppiati con femmine nere non aguti. La loro progenie viene poi saggiata per la presenza della mutazione mirata nel gene che interessa. L esame diretto dei geni nei topi che hanno fenotipo aguti rivela quali di questi animali hanno ereditato la mutazione. Quindi si incrociano tra loro maschi e femmine che hanno ereditato la mutazione mirata in modo da ottenere topi le cui cellule hanno entrambe le copie del gene bersaglio mutate e di conseguenza, mancano di un gene funzionale quindi si ha knockout del gene. L identificazione d efinitiva di questi animali avviene mediante l analisi diretta del loro DNA. Il knockout del gene determina la comparsa di un fenotipo con coda arricciata. 1. Ricombinazione omologa nelle ES 2. Selezione con G418 e ganciclovir 3. Iniezione delle cellule transgeniche in una blastocisti e impianto in madre pseudo gravida 4. Progenie chimerica 5. Incrocio con eterozigoti tra loro per ottenere topo omozigote Effetto di posizione nella inserzione ectopica, influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori). Influenza struttura cromatina (etero cromatina, DNA ipermetilato) Controllo di espressione del transgene, uso di promotori costitutivi (es. promotore+enhancer di SV40) per geni sempre attivi e molto espressi, uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo. Esempi di modelli murini di patologie umane: fibrosi cistica CFTR inattivazione da inserzione mirata, Beta talassemia beta globina inattivazione da inserzione mirata. I topi sono sempre un buon modello per le mutazioni umane? A volte nei topi ci sono mutazioni spontanee, patologie spesso diverso dalle umane. Topo NOD diabetico ma senza obesit assomiglia al diabete insulino dipendente. y y y y Differenze nelle vie biochimiche Differenze nei percorsi di sviluppo Durata della vita media (esordio tardivo nell uomo) Differenze nel contesto genetico

Modelli per malattie con perdita di funzione: topo knockout (invece di alleli nulli, mutazioni leaky per geni modificatori o attivazione geni con funzione simile). Effettisul fenotipo: quasi sempre mutazioni recessive, l eterozigote non esprime il fenotipo mutante, quindi senza aploinsufficienza (meccanismi compensatori dell altro allele?) o con aploinsufficienza (pochissimi i casi di alleli recessivi che manifestano il fenotipo). A volte mutazioni leaky con diminuzione dell attivit del prodotto genico. Modelli per malattie umane con acquisto di funzione:topo knockin es. inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse. Effetti sul fenotipo: in genere dominanti,aumento della produzione proteica e funzione rispetto al wild type, produzione di una nuova proteina e funzione rispetto al wt.