HOSPITAL PEDITRICO UNIVERSITARIO OCTAVIO DE LA CONCEPCIN Y DE LA PEDRAJA LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Holgun

Gua para la Identificacin de las Bacterias ms frecuentes en el Laboratorio de Microbiologa Clnica

Autor: Dra. Deysi Marrero Carralero Coautores: Ing. Doralvis Colom Rodrguez Dr. Leonel Rodrguez Rodrguez Ao 2006

INDICE 1. Introduccin 2. Aislamiento e identificacin de las bacterias ms frecuentes aisladas en el laboratorio. 3. Identificacin de cocos Grampositivos 4. Identificacin de cocos Gramnegativos 5. Identificacin de Bacilos Gramnegativos 6. Anexos 7. Bibliografa

Introduccin AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA.

El aislamiento de los microorganismos, presentes en las muestras biolgicas, suele indicar que se trate del agente causal de la enfermedad infecciosa que se est investigando y se lleva a cabo, utilizando medios de cultivo slido contenido en una placa de Petri, siguiendo la tcnica de la siembra por estra en la superficie. Los medios de cultivo que se van a usar dependen del tipo de muestra y de los microorganismos presentes en ella. De esta manera pueden emplearse medios nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios enriquecidos. Los medios ms usados en el laboratorio, comprenden el de agar sangre de carnero 5%, agar MacConkey, agar nutritivo. Otro de los medios de cultivo recomendados a utilizar con este fin es el agar CLED, se trata de un medio diferencial que contiene lactosa y un indicador de pH (azul de bromotimol) que permite observar la fermentacin cida del azcar, por el viraje del indicador de pH, de color verde a amarillo. Su dficit en electrolitos impide la invasin de la placa por microorganismos mviles, como son las especies del gnero Proteus, facilitando as su aislamiento y posterior identificacin. Para la identificacin de los distintos microorganismos aislados se realizarn pruebas bioqumicas, fisiolgicas y serolgicas. Estos procedimientos nos permiten aplicar tcnicas de siembra por estra en el medio, obtener cultivos puros del microorganismo y luego proceder a la identificacin de cada uno de los aislados clnicos. Material. Asa bacteriolgica, cultivo mixto de bacterias, placas de agar CLED, agar sangre de carnero 5%, agar MacConkey y agar nutritivo. Dependiendo del microorganismo a identificar, se necesitarn otros medios de cultivo y reactivos, que se indican en cada procedimiento.

Procedimiento.
Si despus de efectuar la inoculacin de las muestras obtenemos cultivos mixtos tenemos que realizar subcultivos, con el objetivo de obtener la bacteria en cultivo puro. Seleccionamos colonias caractersticas y la inoculamos mediante estras, en la superficie del medio, como el CLED o de otros medios, como agar sangre de carnero 5%, agar MacConkey, de acuerdo a cada caso. Posteriormente se colocan las placas en la incubadora, en posicin invertida a 37 C durante 24-48 horas. Al cabo de este tiempo, se observarn en las placas los tipos de colonias que han crecido en la superficie del medio y se anotarn las caractersticas ms importantes que puedan ser tiles en una identificacin preliminar, en el libro de trabajo.

Para estudiar la pureza de los cultivos se realizar la coloracin de Gram de los distintos tipos de colonias aisladas, y luego se podr efectuar un nuevo aislamiento en placas de agar nutritivo con cada una de las colonias crecidas en las placas primarias. Despus de incubar 24 horas a 37 C, se proceder a la identificacin de cada uno de los cultivos puros que se hayan obtenido. Los cultivos puros se verificarn mediante coloracin de Gram y se proceder de acuerdo al resultado y a la. Finalmente se proceder a la realizacin de las pruebas de sensibilidad a los diferentes antimicrobianos (antibiograma) en agar Meller-Hinton. 1. COCOS GRAMPOSITIVOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS FACULTATIVOS. Con los cultivos donde se observen cocos Grampositivos, los que pueden estar presentes en casi todas las muestras clnicas con una poblacion mixta de bacterias, debemos considerar con claridad, si se trata de estafilococos o estreptococos, stos crecen bien en los medios comunes del laboratorio, especialmente en agar sangre. Para diferenciarlos podemos realizar distintas pruebas, pero primero debemos observar como son las colonias en el cultivo y el resultado de la coloracin de Gram. Observar el crecimiento de colonias en agar sangre de carnero y ausencia de colonias en agar de MacConkey. Coloracin de Gram: se puede realizar de una colonia sospechosa en cultivo de agar e inocular en caldo de BHI. En medios lquidos se observan los estafilococos en forma de racimos y los estreptococos en forma de cadenas. Tener en cuenta que los estreptococos aislados de colonias en medios slidos pueden presentar formas elongadas o difteroides.

Diferenciaciar Micrococos de Estafilococos y Estreptococos.

Los Micrococos, Estafilococos y Estreptococos se diferencian sobre la base de la prueba de la catalasa.

Prueba de la catalasa.
Esta prueba detecta la presencia de enzimas catalasa capaces de convertir el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos que contienen citocromo, excluyendo los estreptococos. Material Perxido de Hidrgeno 3%, cultivo bacteriano y portaobjetos. Procedimiento Tomar de la superficie de una colonia con un aplicador de madera y transferirla a una lmina portaobjetos, depositar sobre ella una o dos gotas de Perxido de Hidrgeno al 3%. Interpretacin La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas, la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar

los gneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo). Si se trata de cocos Grampositivos, catalasa positiva, entonces se utiliza la prueba de Oxidacin Fermentacin de la glucosa para diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus.

Utilizacin de la glucosa (O/F).

Es una prueba til para distinguir aquellos microorganismos que son incapaces de utilizar la glucosa anaerbicamente de aquellos que lo pueden hacer. Material Cultivo bacteriano en estudio, dos tubos con medio Hugh-Leifson para estafilococos, aceite mineral estril. Procedimiento Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que se hierven brevemente antes de utilizarlos para eliminar el oxgeno disuelto. Una vez atemperados, se inoculan por puncin, llegando al fondo y ascendiendo hacia la superficie. Dejar solidificar ambos tubos y recubrir uno de ellos con aceite mineral estril (Tubo cerrado), el otro se deja expuesto al oxgeno ambiental (Tubo abierto). Incubar a 37 C durante 48 horas. Interpretacin La produccin de cido se evidencia por un cambio de coloracin del medio, de prpura a amarillo. Los Micrococcus acidifican el medio en el extremo del tubo abierto solamente, sto indica que la bacteria utiliza la glucosa en forma oxidativa. Los Staphylococcus acidifican los dos tubos, por tanto, los dos tubos cambian a amarillo (+/+) y significa que el microorganismo utiliza la glucosa en forma oxidativa y fermentativa. Para la posterior identificacin de las especies del gnero Staphylococcus se realizan otras pruebas como la coagulasa, que se exponen en el diagnstico por especies (ver Gua para Staphylococcus). Si son cocos Grampositivos, catalasa negativa, se consideran del gnero Streptococcus se observarn las caractersticas morfolgicas y tintoriales as como las pruebas bioqumicas, para tener un agrupamiento preliminar e identificacin presuntiva, las que se describen en el diagnstico de especies (Ver Gua para Streptococcus y Enterococcus(Ver Gua para Streptococcus) ) y se relacionan a continuacin: Reacciones hemolticas en agar sangre de carnero: alfa, beta o gamma hemlisis. Prueba de Bacitracina. Prueba de CAMP. Reaccin a la Bilis Esculina. Tolerancia de crecimiento en 6.5% de Cloruro de Sodio. Solubilidad en Bilis. Susceptibilidad a la Optoquina. Hidrlisis del Hipurato.

 Prueba PYR. 2. IDENTIFICACIN DE COCOS GRAMNEGATIVOS. Si tenemos un cultivo que corresponda con cocos Gramnegativos se realizar la prueba de la catalasa y oxidasa; ambas son positivas en el caso del gnero Neisseria (Ver Gua para Neisseria) y Moraxella. La identificacin se completara entonces mediante pruebas bioqumicas, principalmente de fermentacin de azcares.

Prueba de la oxidasa (citocromo oxidasa).

Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de electrones en la respiracin aerbica, transfiriendo electrones al oxgeno, con la formacin final de agua. Material Tiras de papel de filtro, reactivo de oxidasa, aplicadores de madera y cultivo microbiano. Procedimiento Con un aplicador de madera, se toca la cpula de una colonia, se frota sobre una tira de papel de filtro impregnada en solucin acuosa al 1% de tetrametil para-fenilen-diamina (Reactivo de Kovacs). Interpretacin En caso positivo el papel cambia de color, pasando de rosado a marrn y a negro finalmente, en 10-20 segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en presencia de citocromo oxidasa. En caso negativo la tira de papel no cambia de color. 3.IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS. Los bacilos gramnegativos se aislan con mucha frecuencia en los laboratorios de Microbiologa Clnica. Los ms comunes pertenecen a Enterobacterias, Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes y Vibrios. La identificacin de los bacilos Gramnegativos puede iniciarse con la prueba de la oxidasa (ya descrita). Cualquier organismo que resulte positivo en esta prueba queda excluido de la familia Enterobacteriaceae, cuyos miembros no poseen la enzima citocromo oxidasa. Estudio de la familia Enterobacteriaceae. Estos microorganismos son oxidasa negativa, y se van a identificar mediante las caractersticas de las colonias en los medios de cultivo y de una serie de pruebas bioqumicas que comienzan con la siembra en medio Kligler. Segn los resultados obtenidos, se continuar con otras pruebas de identificacin como: Produccin de indol, movilidad, crecimiento en citrato, produccin de ureasa, Rojo de Metilo, VogesProskauer, descarboxilacin de la lisina, malonato, acetato y desaminacin de la fenilalanina.

Prueba de fermentacin de la glucosa. ( O/F de glucosa, ya descrito).

 Prueba de fermentacin de glucosa y lactosa en medio de Kligler.

Esta prueba se usa en la identificacin inicial de bacilos Gramnegativos, especialmente de enterobacterias. En este estudio se observa la fermentacin de glucosa y/o lactosa con produccin de cido y/o gas y la produccin de SH2. Material Asa de siembra (aguja), tubos de Kligler y cultivo bacteriano. Procedimiento Los tubos de Kligler se inoculan con la aguja de siembra, con microorganismos de la colonia que se va a identificar y se hacen picadura del mismo sin llegar hasta el fondo del tubo, continuando la siembra por estra en la superficie. Incubar a 37C durante 24 horas. Interpretacin La interpretacin de los resultados se har de la forma siguiente: Fermentacin de glucosa. Se aprecia en el cambio a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol) nicamente en la parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequea proporcin de glucosa que existe en el medio (0,1%), que al ser fermentada en el fondo del tubo, donde existen condiciones de anaerobiosis, produce suficiente cido para que cambie el indicador, pero no a medida que nos aproximemos a la superficie, donde las condiciones son ms aerbicas, all la bacteria respira y la produccin de cido es menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo sembrado no fermenta la glucosa con produccin de cidos, todo el tubo toma una coloracin roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser ms intenso. Fermentacin de lactosa. Se pone de manifiesto por el cambio a amarillo del indicador, tanto en el fondo del tubo como en la superficie. La concentracin de lactosa es diez veces mayor que la de glucosa, con lo que la produccin de cido formado es tan elevada que hace cambiar el indicador en todo el tubo. El hecho de que la fermentacin de lactosa enmascare la de la glucosa no tiene importancia, ya que para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido degradada, como ya se ha comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose aminas, que neutralizan la pequea cantidad de cidos presentes en la porcin inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo aparecer de color rojo intenso y el fondo de color amarillo debido a la fermentacin previa de la glucosa. Produccin de gas. La produccin de gas en la fermentacin se manifiesta por la aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo. Produccin de SH2.

Para detectar la produccin de SH2 a partir de tiosulfato sdico debe incorporarse al medio de cultivo un indicador, dado que el SH2 es incoloro. Para tal fin se utiliza una sal de hierro que reacciona con el SH2, para producir un precipitado negro de sulfuro de hierro. La produccin de SH2 tiene lugar en ambiente cido, de ah que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As, un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.

Reduccin de nitratos.
La reduccin de nitratos a nitritos es una caracterstica propia de varios microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de electrones en la respiracin anaerbica. Esta prueba es til en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias aunque tambin sirve para identificar otros microorganismos. Material Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solucin de - naftilamina (A) y solucin de cido sulfanlico (B). Procedimiento Inocular el medio lquido de nitrato con un asa de cultivo puro del microorganismo, e incubar a 37C durante 18-24 horas. Pasado ese tiempo, aadir al cultivo 1 ml de solucin de - naftilamina (reactivo A) y un ml de cido sulfanlico (Reactivo B). Interpretacin El desarrollo de una coloracin roja en el medio de cultivo, tras la adicin de los reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de reduccin de nitratos se considera positiva. Si no se desarrolla color, la prueba puede considerarse negativa (no se han reducido los nitratos) o bien se han reducido originando otros compuestos (amonaco, nitrgeno molecular, xido ntrico u xido nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso negativo. En este caso se puede aadir al medio de cultivo una pequea cantidad de polvo de zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la existencia de nitratos en el medio y confirma que la reaccin es negativa.

Produccin de indol/movilidad.
El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrlisis del triptfano y su desaminacin, produciendo indol, cido pirvico y amonaco. Material Medio de cultivo para produccin de indol/movilidad, cultivo bacteriano y reactivo de Ehrlich. Procedimiento

Inocular el medio con el microorganismo e incubar a 37C durante 24-48 horas. Transcurrido ese tiempo, aadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich (paradimetilamino benzaldehido en etanol), por la pared del tubo sin agitar. Interpretacin La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo.

Movilidad.
Es otra caracterstica til en la identificacin de los microorganismos. Se puede llevar a cabo observando el crecimiento en el medio semislido. Material Aguja de siembra, medio semislido (agar movilidad/indol), y cultivo bacteriano. Procedimiento Sembrar, por picadura, con la aguja de siembra en medio semislido, incubando a 37C durante 48 horas. Interpretacin La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen, si son mviles. Por ello, observando si el crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.

Citrato.
Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como nica fuente de carbono, esta caracterstica es importante en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias. Material Un tubo con medio de Citrato de Simmons y cultivo bacteriano. Procedimiento Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37C durante 24-48 horas. Interpretacin En caso positivo, el medio de cultivo cambia de color verde a azul. Si el microorganismo utiliza el citrato como fuente de carbono, tambin utiliza las sales de amonio como fuente de nitrgeno, con produccin de amonaco, lo que da lugar a una alcalinizacin del medio. Esto se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH azul de bromotimol, de verde a azul intenso, a la vez que se observa crecimiento en la superficie.

Produccin de Ureasa.
La ureasa es una enzima presente en algunos microorganismos como Klebsiella, Enterobacter y Proteus. Esta enzima es capaz dehidrolisar la urea, con produccin de dixido de carbono y amonio, lo que causa una alcalinizacin del medio.

Material Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano. Procedimiento Inocular el medio de cultivo mediante estra en superficie e incubar a 37C durante 24 horas. Interpretacin Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por un cambio del indicador de pH (rojo de fenol).

Prueba del rojo de metilo ( Modificacin de Barry).

Esta prueba consiste en comprobar si el microorganismo en estudio fermenta la glucosa con produccin de cidos (succnico, lctico, actico, etc.) o va cido mixta. Material Un tubo de medio de caldo RM-VP, cultivo bacteriano y reactivo rojo de metilo. Procedimiento Inocular el medio lquido e incubar a 37C durante 18-24 horas. Transcurrido ese tiempo aadir, 1 2 gotas de la solucin de rojo de metilo y agitar ligeramente. Interpretacin En caso positivo aparece un color rojo estable, lo que indica una produccin de cidos elevada que disminuye el pH del medio. Un color anaranjado no indica que la prueba sea positiva, ya que otros microorganismos pueden producir pequeas cantidades de cidos.

Prueba de Voges-Proskauer.
Consiste en comprobar si el microorganismo estudiado fermenta la glucosa siguiendo la va butilngliclica, detectando un producto intermedio en la reaccin que es el acetil-metil-carbinol o acetona. Material Un tubo de medio de caldo de RM-VP, cultivo bacteriano, solucin de -naftol e Hidrxido de Potasio (o Hidrxido de sodio al 40%) . Procedimiento Inocular el medio lquido con el cultivo puro del microorganismo e incubar a 37C durante 24-48 horas. Despus de la incubacin, transferir 1 ml del cultivo a un tubo estril y se aade 0,6 ml de -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Es necesario adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxigeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. Interpretacin El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcurridos 10 a15 minutos desde la adicin de los reactivos, indica que la prueba es positiva, es decir, que la acetona se ha oxidado pasando a diacetilo. No debe leerse despus de 1 hora,

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ya que los cultivos negativos pueden mostrar un color cobrizo y dar un falso positivo.

Desaminacin de la fenilalanina.
Esta prueba es til para la diferenciacin inicial de las especies de Proteus y Providencia de otros bacilos Granmnegativos (Enterobacterias). Slo los miembros de estos gneros poseen la enzima responsable de la desaminacin oxidativa de la fenilalanina. La fenilalanina es un aminocido cuya desaminacin por medio de una desaminasa, da lugar a la formacin de amonaco y de cido fenilpirvico, el cual puede detectarse por la adicin de un reactivo. Material Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacteriano y solucin de cloruro frrico al 10%. Procedimiento Sembrar el microorganismo en la superficie del medio agar fenilalanina inclinado e incubar a 37C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo aadir 4 5 gotas de la solucin de cloruro frrico directamente sobre la superficie del agar, rotar el tubo para desprender el cultivo de la superficie. Interpretacin La prueba se considera positiva cuando aparece una coloracin verde intensa. Esto se debe a que las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa, transforman el aminocido en cido fenilpirvico, que da reaccin coloreada con el cloruro frrico.

Descarboxilacin Arginina).

de

los

aminocidos

(Lisina, Ornitina

Las descarboxilasas son un grupo de enzimas, especficas para un aminocido, que actan sobre el grupo carboxilo de los aminocidos con la formacin de aminas de reaccin alcalina, conocida como descarboxilacin. Se usan para determinar la descarboxilacin de los aminocidos (lisina, ornitina y arginina) en la identificacin de enterobacterias. Aminas especficas: Lisina Cadaverina Ornitina Putrescina ArgininaCitrulina Material Tubo de cultivo con el medio base para aminocidos, con el aminocido a ensayar, un tubo de control del medio base sin aminocido, cultivo bacteriano y aceite mineral. Procedimiento Inocular con material de una colonia dos tubos con caldo descarboxilasa de Moeller, uno con el aminocido a ensayar y el otro sin aminocido (control).

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Cubrir ambos tubos con aceite mineral estril (1cm de espesor) e incubar a 35 C por 18 a 24 horas. Interpretacin El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el organismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente como para activar las descarboxilasas. El retorno al color azul prpura del tubo que contiene el aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarboxilacin.

Descarboxilacin de la Lisina. (LIA)

Material Un tubo con Agar Hierro Lisina (LIA), cultivo bacteriano. Interpretacin Descarboxilacin de la lisina: descarboxila la lisina --fondo y tendido prpura (K/K) no descarboxila la lisina --- fondo amarillo (A) y tendido prpura (K/K) Desaminacin de la lisina: Desamina la lisina - fondo amarillo (A) y tendido rojo (R) No desamina la lisina- fondo amarillo (A) y tendido prpura (K) Produccin de H2S Produce H2S ---- Ennegrecimiento del medio No produce H2S- sin cambios Produccin de gas Produce gas - Ruptura o desplazamiento del agar No produce gas - sin cambios Los bacilos oxidasa positiva pueden clasificarse en fermentadores de glucosa y no fermentadores; por ello, estos dos grupos de microorganismos se identifican mediante la prueba de utilizacin de la glucosa (oxidativa o fermentativa).

Utilizacin de la glucosa
Oxidativa: (Pseudomonas utiliza la glucosa por va oxidativa) (ver Gua para BNF). Fermentativa: ( Vibrio por va fermentativa (ver Gua para Vibrionceas). Incapacidad de utilizar glucosa por las dos vas: es una caracterstica importante de Alcaligenes, alcaliniza el medio (ver Gua para BNF). Interpretacin de las pruebas de identificacin de bacilos Gram negativos fermentadores o no de la glucosa. Una vez realizadas todas las pruebas determinar el gnero con ayuda de los flujogramas: Estafilococos. Flujograma 1 Estreptococo. Flujograma 2 Enterococo. Flujograma 3 Enterobacterias. Flujograma 4

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 BNF (Bacilos no fermentadores). Flujograma 5 (Anexos). Vibrionceas. Flujograma 6 (Anexos). Haemophilus. Flujograma 7 Neisserias. Flujograma 8 Gardnerella vaginalis. A continuacin describimos los aspectos ms importantes de los microorganismos teniendo en cuenta: Microorganismo. Especies de mayor relevancia en el hombre (respetando la correcta ortografa y nomenclatura actual). Caractersticas generales. Morfologa, agrupacin, coloracin. Cultivo: Medio, temperatura, tiempo de incubacin. Diagnstico de Laboratorio: Muestras biolgicas. Examen directo. Serologa. Antibiograma.

Sthaphylococcus.
Los estafilococos son cocos grampositivos que se agrupan en racimos. La especie S. aureus es la de mayor patogenicidad reconocida por su capacidad de producir enzimas extracelulares y toxinas. La enzima coagulasa permite diferenciar esta especie del resto de estafilococos de inters mdico, como S. epidermidis y S. saprophyticus. ( Ver flujograma1). Especies: Existen 30 especies, las tres de ms importancia clnica son S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus. Clasificacin: Staphylococcus coagulasa positiva: Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulasa negativos (SCN): Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus schleiferi Staphylococcus intermedius Staphylococcus hycus Staphylococcus capitis Caractersticas generales. Son clulas esfricas (cocos) grampositivas, que se agrupan de forma irregular, formando racimos de uva. Tambin pueden observarse aislados, en cadenas cortas y en pares. No son mviles, ni forman esporas. Son anaerobios facultativos y catalasa positiva. Cultivo: Crecen bien en los medios no selectivos como agar sangre de carnero, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 C, en 18 a 24 horas, formando colonias redondas, lisas, elevadas, algunas son beta hemolticas y otras son pigmentadas, con variaciones desde color gris, blanco hasta amarillo intenso.

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Los estafilococos pueden producir enfermedades por su capacidad de multiplicarse en los tejidos o por la produccin de sustancias extracelulares, como enzimas o toxinas. Entre las ms significativas se encuentran las enzimas catalasa, coagulasa que provoca la formacin de un coagulo visible al coagular el plasma oxalatado o citratado en presencia de un factor contenido en muchos sueros. Adems produce otras enzimas como hialuronidasa, estafilocinasa, proteinasa, lipasa, lactamasa y otras. Entre las toxinas estn las exotoxinas que producen necrosis de la piel, leucocidinas, toxina exfoliativa, toxina del shock txico y enterotoxinas. Entre las lesiones ms frecuentes encontramos celulitis, imptigo, infeccin de heridas quirrgicas, fornculos, Muestras biolgicas: Los estafilococos pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, pus de abscesos, LCR, Catter, exudados de odo, ojos, piel, orina, fornculos, en general aparecen en infecciones tanto adquiridas en el hospital como en la comunidad. Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 C. Asas bacteriolgicas. Juego de coloracin de Gram. Agar sangre de carnero 5%, Agar Soya Tripticasa, H2O2, Agar Meller-Hinton para antibiograma, plasma citratado (preferentemente de conejo), discos de Novobiocina de 5 g, caldo BHI o Meller-Hinton, tioglicolato. Se incuban por 18 a 24 horas entre 35 a 37 C. Se obtienen colonias redondas, lisas, pigmentadas o no, algunas con hemlisis. Examen directo: se realizan extensiones de las muestras tiles y se colorean con Gram, observndose cocos grampositivos en racimos, caractersticos. Identificacin: Se utilizan diferentes tcnicas y observacin de los cultivos como: morfologa de las colonias, pruebas fisiolgicas o reacciones bioqumicas que incluyen la prueba de catalasa, coagulasa en tubo, prueba de novobiocina y otras. Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el mtodo de difusin en discos con la tcnica de Kirby y Bauer

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 Streptococcus.
Los estreptococos son cocos grampositivos que se disponen en cadenas o parejas. Al cultivarlos en agar sangre producen una serie de colonias con diferentes tipos de hemlisis lo que permite unido a su estructura antignica, sus propiedades fenotpicas y nutricionales establecer una clasificacin. Las especies de mayor significacin en enfermedad en el hombre son: S pyogenes, relacionado con faringoamigdalitis, sinusitis, otitis media, fiebre escarlatina, imptigo, erisipela, celulitis y secuelas tardas, inmunolgicas; S. agalactiae que produce infecciones neonatales y S. pneumoniae que causa neumona y meningitis. El grupo viridans con importancia en patologa bucal. Los estreptococos forman parte de la flora normal y otros se relacionan con diferentes enfermedades. La identificacin precisa de estas infecciones es muy importante tanto para erradicarlas como para prevenir sus secuelas. (Ver flujograma 2). Clasificacin: Streptococcus pyogenes (Estreptococo hemoltico del grupo A). Son hemolticos y susceptibles a la Bacitracina y producen hidrlisis del1Lpirrolidonil- -naftilamida (PYR positivos). Streptococcus agalactiae (Estreptococo hemoltico del grupo B). Son hemolticos y susceptibles a la optoquina, hidrolizan el hipurato de sodio, factor CAMP positivos y la mayora Bacitracina negativos. Streptococcus equisimilis (Estreptococo hemoltico del grupo C). Estreptococo hemoltico del grupo C y G. Son hemolticos, sensibles al disco de trimethoprim-sulfametoxazol (SXT), resistentes a Bacitracina, CAMP negativos. Streptococcus pneumoniae (Neumococo). Son hemolticos, sensibles a la optoquina, solubles en bilis y en sales biliares. Streptococcus viridans.son hemolticos. Caractersticas generales. (Ver flujograma 2)

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Son clulas esfricas (cocos) grampositivas, que se agrupan en pares o en cadenas. Tambin pueden observarse aislados, en cadenas cortas y en pares. Son inmviles, no forman esporas. Algunas especies elaboran cpsulas, de polisacrido en neumococos y de cido hialurnico en los grupos A, B y C. Son anaerobios facultativos, catalasa negativa y oxidasa negativa. Cultivo: Crecen bien en los medios no selectivos como agar sangre de carnero, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 C, en 18 a 24 horas, formando colonias discoidales, grises, opalescentes, de bordes lisos o arrugados, pueden ser, , o hemolticas lo que permite su identificacin. En los estreptococos del grupo A las colonias suelen ser mucoides, mates o brillantes. Algunas especies requieren de un 5 a un 10% de CO2. Los estreptococos pueden producir enfermedades por su capacidad de multiplicarse en los tejidos e invadirlos o por la produccin de sustancias extracelulares, como enzimas o toxinas. En los del grupo A se encuentran las enzimas como hialuronidasa, estreptocinasa, estreptodornasa y otras. Entre las toxinas est la toxina eritrognica, estreptolisina O y S. Muestras biolgicas: Los estreptococos pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, LCR, exudado farngeo, esputos, exudados de odo, lesiones de piel y tejidos blandos, orina, heridas quirrgicas y otras heridas. Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 C. Asas bacteriolgicas. Juego de coloracin de Gram. Agar sangre de carnero 5%, Agar Soya Tripticasa, Agar Meller-Hinton para antibiograma, discos de Bacitracina diferencial de 0,04 Ud, discos de optoquina de 5 g, discos de SXT, caldo BHI o MellerHinton, til para ver la formacin de cadenas en la coloracin de Gram, tioglicolato. Se incuban por 18 a 24 horas entre 35 a 37 C. Se obtienen colonias algunas con hemlisis o no. Examen directo: se realizan extensiones de las muestras tiles y se colorean con Gram, observndose cocos grampositivos en cadenas cortas, sueltos o en pares, caractersticos. En la especie Neumococo se ven diplococos lanceolados, encapsulados y grampositivos. Identificacin: se realiza por pruebas presuntivas o fisiolgicas y por pruebas serolgicas. Para ello se utilizan diferentes tcnicas y observacin de los cultivos como: morfologa de las colonias, las pruebas fisiolgicas o reacciones bioqumicas incluyen la prueba de catalasa, Bacitracina, Optoquina, SXT, solubilidad en Bilis, test de CAMP, Hidrlisis del Hipurato de Sodio, prueba de PYR y otras. La identificacin definitiva se realiza mediante la serologa (para determinar grupos de Lancefield A, B, C, F, G ). Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el mtodo de difusin en discos con la tcnica de Kirby y Bauer.

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 Enterococcus.
Los enterococos anteriormente pertenecan a los estreptococos, desde el ao 1984 han sido clasificados dentro del gnero Enterococcus. Constituyen un numeroso grupo bacteriano que forma parte de la flora normal del intestino del hombre y de animales, de las vas respiratorias superiores, cavidad oral, tracto genitourinario. Hoy en da es considerado como un patgeno emergente y se ha relacionado con infecciones nosocomiales, bacteriemias, infecciones de heridas quirrgicas y del tracto urinario. (Ver flujograma 3). Clasificacin: Enterococcus faecalis. Es la especie tipo. Enterococcus faecium. E. avium E. gallinarum y otros. Caractersticas generales. (Ver flujograma 3) Son cocos grampositivos que se disponen de forma irregular, sueltos, en cadenas o parejas, en medios lquidos. No poseen cpsulas ni forman esporas. Son inmviles, anaerobios facultativos y catalasa negativa. Cultivo: Crecen bien en medios como agar sangre de carnero 5%, agar soyatripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 C en 18 a 24 horas, forman colonias ms grandes que las de estreptococos del grupo A, menos opacas y a veces blanca brillantes como las de estafilococos, pueden ser, o hemolticos con excepcin de algunas especies que pueden ser hemolticos. Pueden crecer a temperaturas entre 10 y 45 C y tolerar hasta 60 C, y a un pH 9,6. Adems crecen en presencia de 6,5% de cloruro de sodio e hidrolizan la Bilis-Esculina y producen hidrlisis del L-pirrolidonil- -naftilamida (PYR positivos). (ver flujograma para clasificar en gnero y especie). Muestras biolgicas: Pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, LCR, punta de catter, lesiones de piel y tejidos blandos, orina, exudado vaginal y vulvar en nias, exudado tico, heridas quirrgicas y otras heridas, lceras.

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Materiales y medios de cultivo: Agar sangre de carnero 5%, Agar Soya Tripticasa, Agar Meller-Hinton para antibiograma, caldo BHI o Meller-Hinton, til para ver la formacin de cadenas en la coloracin de Gram, tioglicolato. Se incuban por 18 a 24 horas entre 35 a 37 C. Examen directo: Se realizan extensiones de las muestras y se colorean con Gram, observndose cocos grampositivos en cadenas cortas, sueltos o en pares. Identificacin: se utilizan pruebas para identificacin de gnero y de especies. Pruebas de gnero: Hidrlisis de la Bilis-Esculina, tolerancia a 6,5% de ClNa, catalasa negativa, crecimiento a 42 C y a pH 9,6, prueba de PYR y otras. Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el mtodo de difusin en discos con la tcnica de Kirby y Bauer, segn las normas NCCLS (actualmente CLSI).

Enterobacterias.
Las enterobacterias son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, oxidasa negativos, no esporulados, que fermentan y oxidan la glucosa y reducen los nitratos a nitritos. Forman parte de la flora normal del intestino del hombre y de animales y se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Pueden ser mviles, aunque hay especies inmviles como Klebsiella y Shigella. Estas bacterias se relacionan con infecciones nosocomiales y de la comunidad, son causa de infecciones intestinales y extraintestinales como bacteriemias, infecciones de heridas quirrgicas y del tracto urinario, neumona. (Ver flujograma 4). Clasificacin: comprende ms de 25 gneros y cada uno est conformado por una o ms especies bacterianas, de ellas slo unas 25 especies han sido relacionadas con enfermedad infecciosa en el hombre. Las ms frecuentes en nuestro medio son: Salmonella entrica (aqui se encuentran todos los serotipos, ms de 2300). Shigella (S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii y S. flexneri) Escherichia coli Yersinia enterocltica Hafnia alvei Citrobacter (C. diversus, C. amalonaticus, C. freundii) Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans, E. cloacae) Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris) Edwarsiella tarda Klebsiella (K. pneumoniae, K. oxytoca) Morganella (M. morganii) Providencia (P. rettgeri, P. stuartii) Serratia (S. marcescens)

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 El resto de las enterobacterias son de poca importancia en enfermedad extraintestinal en el hombre. Caractersticas generales. Son bacilos gramnegativos. Oxidasa negativos. Fermentadores de la glucosa. Klebsiella posee cpsula. No forman esporas. Son aerobios o anaerobios facultativos. Cultivo: Crecen bien en la mayora de los medios que se utilizan como agar sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 C en 18 a 24 horas, forman colonias ms grandes, de color grisceo, y de bordes definidos. Otros medios de cultivos utilizados son agar Mac Conkey, Agar SS, agar XLD y para la diferenciacin bioqumica se emplean: LIA, MIO (motilidad, indol, ornitina), Citrato de Simmons, Urea de Christensen. Fenilalanina, malonato de sodio, Voges Proskauer. De acuerdo a las reacciones bioqumicas y siguiendo el flujograma de trabajo se puede llegar al diagnstico de la mayora de las especies. Muestras biolgicas: Heces fecales, sangre para hemocultivos, LCR, pus de heridas quirrgicas, esputo, medulocultivo, orina, exudados de oido. Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 C. Asas bacteriolgicas y agujas. Juego de coloracin de Gram. Placas para serologa. Lminas portaobjetos. Placas de agar sangre de carnero 5%, agar Mac Conkey, agar SS, agar XLD, agar nutritivo, agar Meller-Hinton para antibiograma, los que se usaran dependiendo del tipo de muestra, si se trata de infecciones intestinales o extraintestinales. Reactivo de oxidasa. Pruebas para la identificacin bioquimica: Kligler, LIA, MIO, Citrato de Simmons, Urea de Christensen. Fenilalanina, malonato de sodio, Voges Proskauer, Sorbitol. Antisueros polivalentes de Salmonella, Citrobacter. Antisueros de Salmonella de grupos A, B, C1, C2, D, E, F y flagelar y vi de Salmonella. Antisueros somticos de grupo de Shigella A, B, C y D. Recipiente con tapa con solucin de Hipoclorito de Sodio al 0.5%, para el depsito del material de descarte de la pruebas serolgicas. Examen directo: Se realizan extensiones de las muestras tiles, a investigar y se colorean con Gram, observndose los bacilos gramnegativos, caractersticos. Identificacin: se utilizan pruebas bioqumicas para identificacin de gnero y de especies, segn las tablas adjuntas y flujogramas. Pruebas serolgicas: las cepas aisladas de Salmonella y Shigella se confrman por serologa a partir del cultivo. Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el mtodo de difusin en discos con la tcnica de Kirby y Bauer, segn las normas NCCLS (actualmente CLSI).

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 Haemophilus
Este gnero esta conformado por varias especies, algunas forman parte de la flora normal de la nasofaringe y otras son patgenas para el hombre y se caracteriza por su morfologa, es un cocobacilo gramnegativo, pleomrfico, anaerobio facultativo que requiere para su crecimiento de los factores V (NAD) y X (hemina) de la sangre. La especie tipo es Haemophilus influenzae que puede estar en la flora normal del tracto respiratorio superior, pero es patgeno y responsable de infecciones como otitis media aguda supurada (OMA), sinusitis, conjuntivitis, meningitis purulenta, celulitis, artritis. Presenta una cpsula de polisacrido que permite la clasificacin en 6 serotipos: a, b, c, d, e y f. Es ms frecuente en nios pequeos. Caractersticas generales. Su identificacin depende de la necesidad de los factores de crecimiento X y V, Los que requieren solo de factor V no crecen en agar sangre, por lo que si se utiliza este medio hay que inocular un microorganismo como el estafilococo y segrega gran cantidad del factor V, entonces las colonias crecern alrededor de la estra de ste (fenmeno de satelitismo). Cultivo: Crecen en los medios agar sangre de carnero 5% (alrededor de la estra de estafilococo), agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate, Crecen en atmsfera de un 5 a 10% de CO2 y temperatura de 35 a 37 C en 18 a 24 horas. Forman colonias redondas, convexas, pequeas, iridiscentes y con aspecto de roco sin pigmento y sin hemolisis, con olor caracterstico. De acuerdo a las reacciones encontradas y siguiendo el flujograma de trabajo se puede llegar al diagnstico de las especies. Muestras biolgicas: Exudados nasofarngeos, sangre, LCR, lquido articular, tico, exudado conjuntival, La recoleccin de las muestras debe realizarse con cuidado y enviarse de inmediato al laboratorio.

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Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 C. Asas bacteriolgicas. Juego de coloracin de Gram. Placas para serologa. Lminas portaobjetos. Aplicadores de madera. Placas de agar sangre de carnero 5%, agar soyatripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate, agar y caldo MuellerHinton, medio de transporte de Stuart. Discos de papel con factores de crecimiento X, V, y X+V. Antisueros especficos y Ltex para deteccin de antgeno. Recipiente con tapa con solucin de Hipoclorito de Sodio al 0.5%, para el depsito del material de descarte de las pruebas serolgicas. Examen directo: la coloracin de Gram en muestras de LCR es muy til para observar los cocobacilos gramnegativos, caractersticos. Tambin se puede hacer deteccin de antgenos capsulares en el LCR, mediante aglutinacin con partculas de Ltex. Identificacin: Las muestras que se cultivan en agar sangre de carnero 5%, con estra de estafilococo deben observarse en el microscopio estereoscpico para buscar las colonias tpicas, con olor caracterstico, as como en agar chocolate. Se identifican por la coloracin de Gram. Finalmente se realiza la prueba de estudio de los factores de crecimiento, impregnados en discos de papel. Serotipificacin con antisueros especficos de grupo. (Ver flujograma 5 y tablas) Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el mtodo de difusin en discos con la tcnica de Kirby y Bauer, en medio Haemophilus test medium (HTM), segn las normas NCCLS (actualmente CLSI). Conservar las cepas aisladas para enviar al centro de referencia (CPHE).

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 Neisserias.
Las Neisserias son cocos gramnegativos que se agrupan en pares (diplococos), arrionados, aerobios, oxidasa y catalasa positiva, no esporulados. Forman parte de la flora normal de as vas respiratorias del hombre. Dentro del gnero Neisseria se encuentran dos especies patgenas: Clasificacin: Neisseria meningitidis (Meningococo). Agente causal de meningitis y septicemia. Neisseria gonorrhoeae (Gonococo). Agente causal de Blenorragia o gonorrea, enfermedad de transmisin sexual (ITS). Caractersticas generales. Son bacterias muy exigentes, slo se cultivan en medios enriquecidos, en humedad elevada, atmsfera de un 5 a 10% de CO2 y temperatura de 35 a 37 C en 24 a 72 horas. Cultivo: Crecen en los medios agar Mueller-Hinton, agar Thayer-Martin, agar sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate. Forman colonias mucoides, convexas, elevadas, de aspecto transparente u opaco, sin pigmento y no son hemolticas. Algunas especies producen pigmento amarillo verdoso. Los patrones para la diferenciacin en especies se realiza mediante la fermentacin de carbohidratos. De acuerdo a las reacciones encontradas y siguiendo el flujograma de trabajo (6) se puede llegar al diagnstico de las especies. Muestras biolgicas: La recoleccin de las muestras debe realizarse con cuidado y enviarse de inmediato al laboratorio. Para gonococo: exudados de uretra, endocrvix, faringe, conjuntiva, recto, lquido sinovial y sangre. Para meningococo: sangre, LCR, aspirado de petequias, nasofarngeo (en portadores) y esputo.

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Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 C. Asas bacteriolgicas. Juego de coloracin de Gram. Placas para serologa. Lminas portaobjetos. Aplicadores de madera. Placas de agar sangre de carnero 5%, agar ThayerMartin, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate, agar y caldo Mueller-Hinton, medio de transporte de Stuart. Reactivo de oxidasa. Medio CTA (agar cistina-tripticasa). Carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa. Antisueros especficos de grupo de Neisseria meningitidis y Ltex para deteccin de antgeno. Recipiente con tapa con solucin de Hipoclorito de Sodio al 0.5%, para el depsito del material de descarte de las pruebas serolgicas. Examen directo: Se realizan extensiones de las muestras tiles, a investigar y se colorean con Gram, observndose los diplococos gramnegativos, arrionados, dentro de los leucocitos polimorfonucleares (LPMNs), caractersticos. En caso de sospecha de gonorrea, el examen directo de las secreciones genitales es til para el diagnstico presuntivo, de mayor especificidad en el hombre, por lo que para obtener buenos resultados debe realizarse de inmediato y el apicador se recomienda que se frote suavemente sobre la superficie de la lmina, en una sola direccin para preservar los LPMNs. Identificacin: Neisseria gonorrhoeae: Los gonococos se identifican por su aspecto en la coloracin de Gram, colonias de aspecto mucoide, convexas, brillantes, cremosas de bordes enteros y color blanco grisceo, la reaccin positiva a la oxidasa y a la catalasa y los resultados de la produccin de cido de los carbohidratos en CTA (Produce cido de la glucosa). Neisseria meningitidis: Identificacin presuntiva: prueba de ltex positiva y observacin de diplococos arrionados gramnegativos dentro de los LPMNs. Si en el cultivo crecen colonias de aspecto transparente, mucoides, convexas, oxidasa y catalasa positivas, que a la coloracin de gram correspondan con diplococos gramnegativos, arrionados, pertenecen al gnero Neisseria. Posteriormente se realizan las pruebas de identificacin con la produccin de cido de los carbohidratos (glucosa y maltosa positivas). Finalmente se realiza la serotipificacin con antisueros especficos de grupo. Conservar las cepas aisladas para enviar al centro de referencia (CPHE).

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