Infeccin por Andes Hantavirus Disminuye Niveles de AGO2 en Complejo RISC de Clulas Endoteliales Humanas

Francisco Biron, Jos Ignacio Chacn, Rosario Fernndez, Trinidad Fernndez, Isidora Gonzlez, Nicols Valds.

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RESUMEN El Andes virus (ANDV) es el principal causante del sndrome cardiopulmonar por hantavirus (SCPH). Este sndrome es una patologa que afecta la va respiratoria y presenta una mortalidad de 37% en Chile. El ANDV tiene un efecto en la permeabilidad de las clulas endoteliales principalmente del pulmn, esto debido a una alteracin en la funcin regulatoria de los miRNA sobre la expresin de los RNA mensajero. Sin embargo, hasta el momento no se sabe de qu forma este virus afecta la actividad de los miRNA. En este estudio se propone que esta alteracin se debe a que el virus altera los niveles de Argonauta 2 (Ago2), protena esencial en la actividad de los miRNA. Para comprobar esta hiptesis se miden las concentraciones de Argonauta 2 en clulas sanas y en clulas infectadas por ANDV cultivadas in vitro, mediante un ELISA Sandwich. Se observ, por primera vez, que los niveles de Ago2 sufrieron una abrupta disminucin posterior a la infeccin por ANDV. Con este estudio aportamos al conocimiento de la patogenia del ANDV, lo cual puede dar una gua para posibles terapias y/o tratamientos.

Los hantavirus pertenecen a la familia bunyaviridae. Son virus esfricos con una cubierta de lpidos, que tienen de 80 a 110 nm de dimetro. Tiene un ARN monocatenario, el cual tiene un genoma trisegmentario: Segmento grande o L (6500 nt), el cual codifica la RNA polimerasa. Segmento medio o M (3600-3800 nt), el cual codifica

glucoprotenas G1 y G2 de recubierta. Segmento pequeo o S (1700-2100 nt), el cual codifica la protena N de la nucleocpside. El Andes virus (ANDV) es una especie de hantavirus, el cual tiene la mayor incidencia en Sudamrica, siendo en Chile y Argentina los pases con ms casos observados. En estos lugares, el ratn de cola larga o lauchita de los longicaudatus) y el otras especies del ANDV. Es del el

espinos (Oligoryzomys

gnero Oligoryzomys representan

reservorio

nico hantavirus donde se ha descrito la transmisin persona a persona (linaje ANDV-Sout). Una caracterstica nica del ANDV es la disponibilidad de un modelo animal, ya que causa una enfermedad letal en el hmster dorado o de Siria (Mesocricetus auratus) con curso similar al del humano. La disponibilidad de este modelo permite el estudio de drogas y tratamientos. El principal sntoma de la infeccin por Andes virus es el sndrome cardiopulmonar por hantavirus (HCPS o HPS). Este sndrome tiene porcentaje de casos fatales de cerca del 37% en Chile y acta afectando las uniones

intercelulares

de

clulas

endoteliales

por

ende

su

permeabilidad,

principalmente las del pulmn. Se presenta en cuatro fases: Prodrmica: fiebre, cefalea, mialgias y vmitos (3-4 das) Aguda del sndrome cardiopulmonar:Es de instalacin sbita y precedida por insuficiencia respiratoria, tos no productiva, edema pulmonar y en algunos casos shock cardiognico y arritmias pudiendo causar muerte (90% problemas en la coagulacin por trombocitopenia ) (2-4 das) Polirica: Resolucin falla cardiopulmonar Convalecencia : Recuperacin estado general del paciente

Segn un estudio realizado el 2010 por la American society for Microbiology, se sabe que infeccin por ANDES hantavirus altera los niveles de miARN, y su funcin regulatoria, produciendo un aumento en la permeabilidad vascular,

principalmente en clulas endoteliales de pulmn y corazn. Los miARN son ARN monocatenarios no codificantes, de una longitud de 21 a 25 nucletidos. Estos se unen al complejo RISC para llevar a cabo su funcin que consiste en regular la expresin gnica de ARN mensajero. El complejo RISC est compuesto por 3 protenas: Dicer(actividad helicasa), TRBP (protena de unin) y Argonauta 2 (actividad endonucleasa). Este complejo se une a un miARN que ser complementario a un ARN mensajero especfico. Si el emparejamiento es perfecto, el complejo RISC corta el ARNm, mediante la accin de Argonauta 2, impidiendo as la sntesis de la protena que este codificaba. Se demostr previamente (1) que en clulas afectadas por ANDES hantavirus hubo tanto un aumento y disminucin de distintos miRNA, sin embargo el mismo estudio tambin mostr que algunos miRNA no variaban en su concentracin pero s exista una alteracin en la funcionalidad de stos. Esto sugiere que puede haber una alteracin en la funcionalidad del complejo RISC la cual podra explicar esta falla de los miRNA. Este antecedente nos llev a plantear nuestra hiptesis. Hiptesis: la infeccin por ANDES hantavirus altera los niveles citoplasmticos de Argonauta 2 en clulas endoteliales humanas, afectando la regulacin de la expresin gnica mediante miRNA. Hiptesis Alternativa: La Infeccin por ANDES hantavirus altera los niveles citoplasmticos de DICER y/o TRBP en clulas endoteliales humanas, afectando la regulacin de la expresin gnica mediante miRNA.

Objetivo General: Estudiar si la infeccin por Andes hantavirus produce una alteracin de los niveles citoplasmticos de Argonauta 2, en clulas endoteliales humanas. Objetivo especfico: Comparar clulas endoteliales sanas con clulas endoteliales infectadas con ANDV, para determinar si existe variacin de los niveles citoplasmticos de la protena Ago 2, enzima DICER y protena TRBP. Establecer una relacin estadstica de las variaciones de estas protenas, entre clulas infectadas y no infectadas. Diseo Experimental: Se cultivaron clulas endoteliales, provenientes de una vena umbilical (HUEVECs), compradas en Clonetics, en un microambiente adecuado a un pH 7,4 , temperatura de 37C y con una osmolaridad de 300 mosmol, suplementado con: gentamicina 50g/ml, anfotericina B 50g/ml, 10% FCS (suero fetal bovino). En forma paralela se realiz un cultivo viral con la tcnica de cogulo de plasma. Luego se dividi el cultivo en dos subcultivos, uno de los cuales fue expuesto a la infeccin del ANDV, para luego de tres das marcarlo con un anticuerpo anti protena NY-1V (nucleocpside), separar las clulas infectadas de las no infectadas por medio de sorting por citometra de flujo y observar las clulas por un microscopio de epifluorecencia para ver si la protena se encuentra en el aparato de golgi, lo que indicara que el virus est en replicacin.

Despus de estos procedimientos, extrajimos treinta alcuotas de cada subcultivo, para cada protena y realizamos un conteo de clulas final. Nuestro control negativo fueron clulas endoteliales sanas y nuestra muestra fueron las clulas infectadas con ANDV. Para medir las concentraciones de las protenas, se realiz una lisis celular y luego por medio de la tcnica ELISA Sandwich DAS fue posible marcar las protenas, para luego someterlas a espectofotometra y as obtener los valores de absorbancia de nuestras muestras. Estos valores se extrapolaron en una curva de calibracin para obtener las concentraciones totales de las protenas de cada alcuota. Este valor debe ser corregido mediante una regla de 3 que permite establecer una relacin entre la cantidad de protena medida, y la cantidad de clulas presentes en la alcuota. Para el cuidado del cultivo, se realizar constantemente un conteo de clulas evaluando proliferacin y viabilidad mediante una cmara de Neubauer. Estos experimentos se desarrollan en un laboratorio de Bioseguridad 3. Para llevar a cabo nuestro experimento es necesario conocer los valores normales de las concentraciones citoplasmticas de cada protena, sin embargo despus de una intensa bsqueda no logramos encontrar estos valores descritos en la bibliografa. Con el fin de demostrar los procedimientos del anlisis estadstico, nosotros postulamos los siguientes valores poblacionales hipotticos: Ago2: 68M DICER: 71M TRBP: 28M

Para el anlisis estadstico realizaremos una prueba de hiptesis poblacional de dos medias mediante t de student, ya que este anlisis permite comparar dos medias poblacionales que se ditribuyan de manera normal sin importar si la desviacin estndar poblacional es conocida o no. Para realizar esta prueba se requiere que las poblaciones sean independientes. Resultados Esperados: Cuadro Resumen de datos obtenidos

Tabla 1. Resumen de concentraciones citoplasmticas de cada protena en clulas endoteliales sanas e infectadas obtenidas a partir de la extrapolacin en las curvas de calibracin respectivas.

Discusin:

P<

Con nuestros experimentos demostramos que luego de una infeccin por ANDV se observa una disminucin en los valores de Ago2. El que el Ago2 est disminuido podra implicar que el complejo RISC ste pierde su actividad de endonucleasa, siendo incapaz de romper los mRNA blancos del miRNA correspondiente. Se ha demostrado que en infeccin por ANDV, la expresin de mRNA sin regulacin de miRNA se traduce en un aumento de protenas que

Grfico 1. Comparacin de las concentraciones citoplasmticas de la protena Ago2, DICER y TRBP entre clulas endoteliales sanas y clulas infectadas por

fomentan la permeabilidad vascular (1). Estas alteraciones culminaran en el desarrollo de Sndrome Cardio-Pulmonar por Hantavirus. Por el contrario, nuestro trabajo demuestra que no existe una alteracin en los niveles tanto de TRBP como de DICER. Esto permite descartar la participacin de stas protenas en la patogenia del ANDV. Conclusiones: La infeccin por ANDV disminuye los niveles citoplasmticos de Argonauta 2 en clulas endoteliales. La infeccin por ANDV no altera los niveles citoplasmticos de DICER ni de TRBP en clulas endoteliales. Proyecciones: Se desconoce el mecanismo mediante el cual el virus disminuye los niveles de Ago2, lo cual podra ser objeto de un estudio futuro. En adicin, se podra realizar un estudio para evaluar si otras especies del hantavirus actuaran de forma similar al Andes virus, en relacin a la disminucin de Ago2. Limitaciones: Se requiere la realizacin de estudios previos a nuestra investigacin para determinar la cantidad exacta de hantavirus que debemos administrar. Tambin es trascendental conocer los niveles citoplasmticos de las protenas estudiadas en clulas endoteliales humanas en condiciones normales. Adems, nuestro estudio, al haber sido hecho in vitro, podra no reflejar la realidad de la patogenia del virus in vivo.

Bibliografa: 1. T. Pepini et al, Andes virus regulation of cellular microRNAs contributes to Hantavirus-induced endothelial cell permeability, American Society for Microbiology, noviembre 2010. 2. G.S. Tan et al, Clarifying mammalian RISC assembly in vitro, BMC Molecular Biology 2011, 12:19. 3. R.I. Gregory et al, Human RISC Couples MicroRNA Biogenesis and Posttranscriptional Gene Silencing, The Wistar Institute noviembre 18, 2005. 4. Ramesh S. Pillai, MicroRNA function: Multiple mechanisms for a tiny RNA?, Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, RNA Society 2005. 5. O. Peralta-Zaragoza et al, RNA de interferencia: Biognesis, mecanismos moleculares y sus aplicaciones en el cncer cervical, Revista

Investigacin clnica 2010. 6. Hantavirus en las Amricas: Gua para el diagnostico, el tratamiento, la prevencin y el control, Organizacin Panamericana de la Salud, 1999. 7. A. Lugo-Trampe , K. Trujillo-Murillo, miRNAs: reguladores claves de la expresin gnica, Hospital Universitario Dr. Jos Eleuterio Gonzlez, marzo 2009.

8. P.

Vial,

C.

Castillo,

et

al,

Diagnstico

manejo

del

sndrome

cardiopulmonar por hantavirus, Gobierno de Chile Ministerio de Salud, 2007. 9. Pablo Vial, Diagnstico y manejo del Sndrome Cardiopulmonar por Hantavirus, Ministerio de Salud Gobierno de Chile 2007. 10.Davis, Dulbecco, Microbiology p.789. 4 Edicin. J.B. Lippincott Company, Filadelfia, 1990. 11.Introduction to ELISA activity The University of Arizona, May 3, 2000. ANEXOS

Resultados obtenidos en clulas sanas:

Resultados obtenidos en clulas infectadas: