UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS CCB FMC3140000 - CROMATOGRAFIA LQUIDA APLICADA ANLISE DE DROGAS E OUTRAS

AS SUBSTNCIAS BIOATIVAS

Mestrandos: Maiko Luis Tonini e Ninna Granucci

Modificaes Incomuns em Histonas de Trypanosoma brucei

INTRODUO
HISTONAS
Tpicos Chave

Nucleosomo 146 pb Octmero H2A, H2B, H3 and H4; Protenas com carga positiva Resduos de Arg e Lys; Modificaes ps-traducionais em histonas Informaes epigenticas;

Fonte: http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid= 11240&pid=10026

Fonte: STRAHL, B.D.; Allis, C.D. Nature. v. 403, p. 4145.

INTRODUO
Trypanosoma Brucei
T. brucei

Protozorio; Causador da Doena do Sono; Ts-ts. VSGs

Fonte: http://www.microbiologyonline.org.uk/aboutmicrobiology/introducing-microbes/protozoa

INTRODUO
RP-HPLC
RP-HPLC

Componentes esto na fase aquosa; Fixam-se na fase estacionria da coluna; So eluidos da coluna pela passagem de uma fase movl organica; Componentes so separados baseados em seu carter hidrofbico;

INTRODUO
RP-HPLC
COLUNAS

Partculas: Slica ou beads; Tamanho da partcula: 3 a 50 microns (5m para pep deos par cula presso melhor separao; Poro: 100-1000 Angstrons (300 prot. e pept. ; Fase estacionria: Cadeias hidrofbicas que interagem com o analito; C4, C8, C18 C4 (Prot , C18 (pept. ;

1 25 cm de comprimento; Diametro interno: 1-5 mm; Taxa de fluxo: 0,02-2 mL/min

OBJETIVO DO TRABALHO

No existiam modificaes em histonas descritas para T. brucei

Isso dificulta estudos para saber se esta forma de regulao epigentica importante neste parasito

OBJETIVO: Identificar os tipos de modificaes de histonas presentes em T. brucei

MTODOS
EXTRAO DAS HISTONAS DE T. brucei

Formas procclicas (Cepa Lister 427) de T. brucei cultivadas em meio SDM-79

Isolamento dos ncleos (2 x 1010 cls.)

Solubilizao da cromatina por sonicao em meio salino

Extrao das histonas do sobrenadande com H2SO4 e precipitao com TCA e diluida em H20 Separao das histonas por RP-HPLC

MTODOS
SEPARAO DAS HISTONAS/SEQUENCIAMENTO LCQ classic instrument (Thermo Finnigan)
Injeo da amostra no EQP

60 % ACN 0 0

Min.

70

C8 FASE REVERSA

DETECTOR U.V. 214 nm A B

MALDI-TOF
ACN + TFA 0,1% (v/v) COLETOR DE FRAES (1 frao/minuto)

H2O

Clivagem enzimtica

FASE MVEL

SDS-PAGE / AU-PAGE

MTODOS
SEQUENCIAMENTO
AUTOMAO Procise 494-HT (Applied Biosystems)
HPLC

A cada ciclo

Fonte: http://www.biotech.illinois.edu/centers/Proteomics/Proteinscience/proteinsequence.htm

Degradao de Edman

PTH C18 FASE REVERSA

Identificao comparao com os T.R. de um padro de PTH-a.a.

DETECTOR 269 nm

RESULTADOS
Purificao das Histonas

214 nm

Cromatograma das Histonas de T. brucei

RESULTADOS
Confirmao da Pureza e Anlise Preliminar das Modificaes
H3 H2A
H2A + H3

H4

H2B

Eletroforese (SDS-PAGE) das fraes

Identificao das Histonas

Eletroforese das fraes bandas identificadas por MS/MALDI-TOF; H2B elui em 2 picos sem explicao aparente; AU-PAGE carga Fosforilaes e acetilaes;
Eletroforese (AU-PAGE) das fraes

RESULTADOS
Sequenciamento: Degradao de Edman

Os primeiros ciclos da degradao de Edman mostraram principalmente Alaninas metiladas (NMA/N-me lalanina rimeira e e esta modi cao descrita em istonas

RESULTADOS
Sequenciamento: Degradao de Edman

H3

H3 no pode ser sequenciada porque possui o a.a. N-terminal bloqueado (acetilao ou trimetilao);

RESULTADOS
Sequenciamento: Degradao de Edman e MS

Modificaes em H4 foram confirmadas por MS do peptdeo N-terminal

RESULTADOS
Sequenciamento: MS

Anlise de m peptdeo da poro C-terminal de H2A re elo mltiplas acetilaes

CONCLUSO

rimeiro passo para el cidar m mecanismo de reg lao epigen tica; 1

O genoma de T. brucei possui poucas enzimas modificadoras de histonas Poucas modicaes observadas;

A regulao, atravs das histonas, da expresso proteica, parece ser mais simples em T. brucei. (Modelo??)

FIM