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Il DNA contiene linformazione genetica

Griffith, 1928 esiste un principio trasformante, in grado di convertire ceppi innocui di Streptococcus pneumoniae in virulenti Avery, MacLeod & McCarty, 1944: il principio trasformante identificato nella molecola di DNA Hershey & Chase, 50 Il materiale ereditario, trasferito nei batteri infettati per produrre una nuova progenie virale fagica, lacido nucleico Watson & Crick, 1953 Proposta di un modello strutturale per il DNA coerente con la funzione di molecola depositaria dell informazione genetica.

Lesperimento di Griffith sulla trasformazione genetica in pneumococco.

Esiste un principio trasformante

In seguito, con esperimenti di frazionamento si dimostra che la sola frazione di acidi nucleici pu causare la trasformazione (Avery, MacLeod e McCarty, 1944)

La natura chimica del materiale genetico: lesperimento di Alfred Hershey e Martha Chase. Marcatura su proteine (S35) o su DNA (P32) nei fagi infettanti: la marcatura si ritrova nella progenie fagica solo in seguito a marcatura del DNA (e non delle proteine) Marcatura proteine supernatante Marcatura DNA- sedimento I virus riprogrammano le cellule ospiti per produrre nuovi virus, iniettando il proprio DNA dentro le cellule DNA = materiale genetico
Testa Coda Fibre della coda
DNA
300 000

DNA e RNA sono polinucleotidi: polimeri lineari di nucleotidi

Il DNA un acido nucleico costituito da lunghe catene di deossiribonucleotidi.


Scheletro zucchero-fosfato Gruppo fosfato Base azotata Zucchero A Base azotata (A, G, C, o T)
O H3C O C C N H

Nucleotide del DNA

Gruppo fosfato

P O O

CH2 H C N C O O CH HC O H C C H H

Timina (T)

Zucchero (deossiribosio) Nucleotide del DNA

Polinucleotide del DNA

Inizio anni 50 Regole di Chargaff: A=T, C=G; somma purine (A+T)=somma pirimidine (G+C) Rosalind Franklin: quadri di diffrazione ai raggi X rivelano una struttura periodica

1953: Watson e Crick propongono il modello della doppia elica

Il modello del DNA di James Watson e Francis Crick


G T A C A T O OH P O O O H2C

Legame idrogeno
OH T A O CH2 O O P O O CH2 O O O P O CH2 O O P O O CH2 O O P HO O

Coppie di basi appaiate


C A C G G T

O O P O O H2C O P O O H2C O P O O H2C O O

C O

T T

A A A A T T

G O

T O

OH G A T C

Modello a nastro

Struttura chimica

Modello computerizzato

2 catene polinucleotidiche antiparallele si avvolgono su unasse centrale con andamento destrorso Basi azotate di filamenti opposti appaiate specificamente mediante legami idrogeno e formano strutture planari giacenti su piani perpendicolari allasse Alternanza di solchi maggiori e minori Passo= 3.4 nm =10.4 coppie di basi Diametro= 2.0 nm

Struttura del DNA

sezione trasversa

il modello molecolare della doppia elica coerente con la funzione di deposito dellinformazione genetica

Estremit 5

Estremit 3

P
4 3

5 2 2 1

HO A T 1
3 4

Linformazione genetica rappresentata dalla sequenza di basi che tradotta in sequenza di amminoacidi nelle proteine (codice genetico) La complementarit specifica tra le basi alla base dei processi di trasmissione (DUPLICAZIONE), trasferimento (TRASCRIZIONE-TRADUZIONE) ed evoluzione (RICOMBINAZIONE) dellinformazione genetica e costituisce il principio di molti esperimenti/tecniche di ingegneria genetica

P C P G P T OH
Estremit 3

P G P C P A P
Estremit 5

Flusso dellinformazione genetica

Duplicazione del DNA


G C A G C T C G A T T C T G G G C T C A G T A T A T A A T

A C C C T T A A T T A A G T A C G G G

C C

A C G A T

T G C T A

A C G A T

T G C

A C A

T G C T A

A C G A T

T G C T A

A C G A T

T G C T A

Molecola originaria del DNA.

Entrambi i filamenti originari si comportano da stampo.

Due nuove molecole di DNA identiche.

Duplicazione semiconservativa del DNA


I generazione

II generazione

Nucleotidi dellRNA RNA-polimerasi

Trascrizione e traduzione
A
T

T C C A A T
T

si basano entrambe sul concetto di filamento stampo e sullappaiamento specifico tra basi

G
G

C A U C C A
G

T A G G T T A Direzione della trascrizione

Filamento stampo di DNA

RNA appena sintetizzato

Met

Met

Subunit ribosomiale pi grande

tRNA di partenza Sito P


UA C A U G UA C A U G

Sito A

Codone dinizio mRNA

Subunit ribosomiale pi piccola

Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di una specifica sequenza nucleotidica. Il sito riconosciuto generalmente formato da una sequenza di 4-8 bp. Enzimi diversi riconoscono sequenze nucleotidiche diverse: ogni enzima ha perci una sua caratteristica specificit Gli enzimi di restrizione sono isolati dai batteri, dove costituiscono un sistema di difesa naturale che distrugge eventuali molecole di DNA estraneo e quindi protegge da infezioni virali. 1978, premio Nobel a W. Arber, D. Nathan & H. OSmith, per la scoperta degli enzimi di restrizione

Esistono 3 classi di enzimi di restrizione; gli enzimi di tipo 2 sono i pi usati in ingegneria genetica: riconoscono brevi sequenze palindromiche (es GGTACC; GGTNACC) producendo estremit coesive (sticky) o piatte (blunt)

TAGLIO

SIMMETRICO

ASIMMETRICO

Isoschizomeri= riconoscono la stessa sequenza, ma di origine diversa e possibile diversit di taglio Es SmaI: CCCGGG; XmaI CCCGGG La sigla degli enzimi deriva dal nome di genere, specie e ceppo del microorganismo di origine FREQUENZA DI TAGLIO: La distanza media tra siti di taglio : 4n , dove n= n basi del sito riconosciuto Es: 4-base cutter: 44 = 256 bp 6-base cutter: 46 = 4096 bp

Applicazioni degli enzimi di restrizione 1) Mappe di restrizione 2) Creazione di molecole di DNA ricombinante e clonaggio 3) Analisi di RFLP

Molecole di DNA ricombinante

Le estremit coesive generate dagli enzimi di restrizione sono molto utili per le tecniche di manipolazione genetica. DNA di origine diversa sono legati grazie alla complementarit tra le estremit generate dallo stesso enzima di restrizione; le estremit sporgenti dei frammenti si associano mediante legami idrogeno; lenzima DNA ligasi salda le estremit, generando una molecola di DNA chimerica

RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphism


Il polimorfismo genetico consiste in differenze di sequenza a livello di cromosomi omologhi: differenze nucleotidiche, anche minime, possono generare o eliminare specifici siti di restrizione. La digestione di segmenti corrispondenti di cromosomi omologhi produce differenti quadri di restrizione chiamati RFLP.

Wild-type allele

AGATCT TCTAGA Restriction site

Mutant allele

AGAGCT TCTCGA Not a restriction site

Gli RFLP sono marcatori utili per - rilevare differenze tra genomi (studi filogenetici e di popolazione) - diagnosi di malattie ereditarie.
Un particolare RFLP pu essere associato alla forma difettosa di un gene, tanto da caratterizzare gli individui affetti dalla patologia. Attualmente, gli RFLP possono essere usati nella diagnosi di malattie con base genetica (fibrosi cistica, distrofia muscolare di Duchenne, fenilchetonuria, emofilia, etc.).
Allele I Allele II

Analisi su gel
w Taglio
C C G G G G C C A C G G T G C C

Frammenti pi lunghi

z x

Taglio y

C C G G

G G C C

Taglio C G y
C G G C G C

DNA prelevato dai cromosomi

w Frammenti pi corti y y

Esempio di esame diagnostico basato su un polimorfismo genetico.


0.2 kb 1.2 kb

introne Gene per la -globina Mst II (mancante in HbS) Tipo di emoglobina A Sequenza amminoacidica e nucleotidica nel gene per la -globina -Pro- Glu - Glu CCT-GAG-GAG Sito per MstII -Pro- Val - Glu CCT-GTG-GAG Sito non riconosciuto da MstII Elettroforesi dei prodotti di restrizione A S A/S

1.4 kb 1.2 kb

0.2 kb

Il cambiamento di una sola base (AT), nel gene per la -globina, determina una sostituzione amminoacidica nella proteina codificata (GluVal), che altera le propriet strutturali dellemoglobina, generando lanemia falciforme. Il cambiamento nucleotidico, rispetto alla sequenza wild type, comporta la perdita del sito riconosciuto dallenzima MstII. Questo polimorfismo ha unutilit diagnostica e pu essere rilevato analizzando il pattern di restrizione ottenuto trattando la regione genomica, precedentemente amplificata per PCR, con lenzima MstII: nel genotipo omozigote wild type, la digestione produrr due frammenti (A), nel mutato un unico frammento (S), nelleterozigote portatore tre frammenti (A/S).

Clonaggio molecolare
Il clonaggio molecolare consente lamplificazione e lo studio di uno specifico frammento di DNA.
Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA in grado di replicarsi autonomamente (: un cosiddetto veicolo o vettore). Il risultante vettore chimerico (DNA ricombinante) introdotto in un organismo ospite, in genere un batterio, che viene fatto riprodurre in modo da generare una popolazione numerosa: tutti i membri della popolazione conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo cos quantit elevate del DNA di interesse, inserito inizialmente.

Schema di clonaggio molecolare


1 Si isola il DNA da due fonti diverse E.coli Plasmide Gene V Estremit coesive 3 Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono mediante appaiamento di basi azotate 2 Si tagliano entrambi i DNA con un enzima di restrizione Cellula umana

DNA

1) isolamento e preparazione del DNA da clonare (es tagliando con opportuni enzimi di restrizione) 2) scelta e preparazione del vettore 3) ligazione: il frammento inserito nel vettore, ad es. un plasmide batterico 4) i vettori ricombinanti sono introdotti mediante trasformazione nel microorganismo ospite 5) riproduzione del clone trasformato e conseguente amplificazione del numero di copie del DNA di interesse 6) analisi del DNA clonato (es mediante sequenziamento)

4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con legami covalenti Plasmide con DNA ricombinante

Gene V

5 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite trasformazione Batterio ricombinante 6 Si clona il batterio

Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano

La base del clonaggio

Taglio e riunione del DNA con enzimi di restrizione e DNA ligasi: DNA lineare (inserto) e DNA plasmidico (vettore) contengono entrambi siti riconosciuti da EcoRI. Rimescolando i frammenti con estremit compatibili, in presenza di ligasi, si ottengono molecole ibride inserto-vettore.

Come si fa ad introdurre DNA estraneo in una cellula ospite?


Il DNA una molecola carica che attraversa difficilmente parete e membrane cellulari metodi di trasformazione Una volta entrato, affinch sia mantenuto nellospite e trasmesso alle successive generazioni, il DNA esogeno deve essere integrato in ununit di replicazione funzionante vettore di clonaggio La trasformazione ha unefficienza <100%: necessario poter distinguere le cellule trasformate da quelle non trasformate marcatori di selezione.

TRASFORMAZIONE
La trasformazione consiste nel trasferimento di DNA esogeno allinterno di una cellula ospite. Sono state sviluppate diverse tecniche che permettono di trasformare cellule sia batteriche che eucariotiche, incluse di mammifero.
-Trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico. La maggioranza dei metodi per la trasformazione batterica si basa sullosservazione che il trattamento con soluzioni fredde di cloruro di calcio, seguito da breve riscaldamento, favorisce lassunzione di DNA esogeno da parte delle cellule. Ancora non si conosce esattamente il meccanismo per cui lingresso del DNA viene favorito; forse i cationi, associandosi alle membrane batteriche, le rendono pi affini e permeabili a molecole negative come il DNA. -Elettroporazione: metodo originariamente sviluppato per cellule eucariotiche, ma usato anche per trasformare i batteri. Le cellule sono sottoposte a brevi impulsi elettrici che producono, nelle membrane, pori transitori attraverso cui passa il DNA (per eucarioti e batteri). -Infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno (metodo usato per eucarioti e batteri). -Gene gun: bombardamento delle cellule con microproiettili metallici su cui stato preassorbito il DNA (soprattutto per cellule vegetali). - Microiniezione (cellule di mammifero).

TRASFORMAZIONE
La trasformazione consiste nel trasferimento di DNA esogeno allinterno di una cellula ospite. Sono state sviluppate diverse tecniche che permettono di trasformare cellule sia batteriche che eucariotiche, incluse di mammifero.
-a)Trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico. -b) Elettroporazione -c) Gene gun

-Infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno (metodo usato per eucarioti e batteri). - Microiniezione (cellule di mammifero).

Lospite per il clonaggio varia secondo le esigenze

E. coli B. subtilis

S. cerevisiae

Efficienza di trasformazione: (quantit di trasformanti)/ (quantit di DNA) Lefficienza di trasf. di Escherichia coli, batterio Gram-negativo, ospite standard di numerosi esperimenti di clonaggio, aumenta se si usano ceppi : -deficienti per il sistema di restrizione -mutanti per alcune esonucleasi Si possono raggiungere efficienze di 107-109 trasformanti/g DNA

Facile ed economico da coltivare Crescita rapida (Tg=20-30 min) Genetica nota I ceppi da laboratorio hanno mutazioni che non consentono la diffusione allesterno

Colonia di Escherichi coli

Si prepara un terreno di coltura selettivo in cui solo i batteri/microorganismi trasformati sono in grado di crescere Condizioni di sterilit

Incubazione delle piastre alla T ottimale per la crescita del microorganismo

ELETTROFORESI SU GEL
Lelettroforesi su gel consente di separare ed analizzare molecole di DNA di dimensioni diverse.
Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante elettroforesi: migrazione in un campo elettrico. Essendo cariche negativamente, le molecole di DNA migrano verso il polo positivo. Se lelettroforesi avviene attraverso una matrice porosa, es. un gel di agarosio o di poliacrilammide, la velocit di migrazione dei frammenti di DNA inversamente proporzionale al LOG10 della loro lunghezza. Al termine dellelettroforesi, DNA di lunghezza diversa sono risolti in bande distinte.

Fasi di preparazione di un gel per elettroforesi 1 2 3

Dopo la corsa, il gel posto su una lampada di luce UV per visualizzare il pattern di migrazione del DNA

Southern, 1975
Il Southern Blotting permette di individuare frammenti di DNA con sequenza specifica allinterno di una popolazione eterogenea di frammenti
Il metodo si basa su:1) la produzione di una replica del gel su membrana; 2) la complementarit tra DNA sondae DNA fissato su membrana

Sonda radioattiva (DNA)

ATCCGA

La sonda un segmento di DNAss marcato Durante la fase di ibridazione riconosce e lega il DNA bersaglio presente sulla membrana

CG AT AT A C DNA a filamento singolo T G G A C CT T G C TA A T C T GC A G T G AT C C TA G G Mediante lappaiamento A AG delle basi azotate si individua il gene prescelto

La T e la concentrazione di sali del lavaggio determinano la stringenza: in condizioni di alta stringenza la sonda si lega solo a sequenze complementari; in condiz. di bassa stringenza si lega anche a sequenze parzialmente correlate.
Analoghi al southern blotting, in quanto basati sul trasferimento di molecole da gel di elettroforesi a membrana sono: -Northern blotting trasferim. di RNA; rilevamento per ibridazione con sonde di DNA -Western blotting trasferim. di proteine separate mediante PAGE; rilevamento con anticorpi marcati -South-Western blotting trasferim. di proteine; rilevamento con sonde di DNA ds; consente lidentificazione di proteine in grado di legare DNA

Il western blotting differisce dal southern per due aspetti principali: 1. Il trasferimento di proteine avviene per passaggio di corrente elettrica (e non per capillarit) 2. Il rilevamento si basa sul legame di anticorpi

Applicazioni del Southern blotting


Medicina legale: DNA fingerprint Gli RFLP di particolari marcatori sono evidenziati e confrontati mediante southern blotting

Sangue dellimputato

Sangue rinvenuto sui vestiti dellimputato

Sangue della vittima

Purificazione del DNA


Purificazione del DNA genomico 1. Lisi cellulare con metodi vari secondo il tipo cellulare 2. Rimozione dei frammenti cellulari mediante centrifugazione 3. La parte solubile trattata con solventi organici (fenolo e cloroformio) per denaturare e allontanare le proteine 4. Precipitazione e concentrazione degli acidi nucleici rimasti nella fase acquosa (etanolo o PEG) 5. Rimozione dellRNA: trattamento con enzima RNAsi 6. (Centrifugazione in gradiente di densit per separare diversi tipi di DNA) Resa di DNA genomico 0.5-3 g per mg di tessuto, 5-15 g da 300 l di sangue intero.

Purificazione di DNA plasmidico Da cellule di E. coli: metodo della lisi alcalina Il metodo si basa sul fatto che dopo trattamento alcalino il DNA circolare plasmidico ma non quello lineare, rinatura pi facilmente in seguito a neutralizzazione

Trattamento con detergente SDS e NaOH (pH 12) Neutralizzazione (pH 5.2) Eliminazione del precipitato (proteine e lipidi di membrana associati a DNA genomico) mediante centrifugazione Purificazione del DNA in soluzione grazie a cromatografie a scambio ionico o di gelfiltrazione Resa standard: 1-3 g per mL di coltura batterica iniziale

Vettori
I vettori assicurano la propagazione e replicazione del DNA esogeno nellospite. I vettori sono molecole di DNA costruite combinando e modificando sequenze naturali. 1)Vettori di clonaggio amplificazione del DNA inserito 2) Vettori di espressione traduzione in proteina del DNA inserito
Le caratteristiche di un vettore di clonaggio sono: -capacit autoreplicativa nellorganismo ospite -presenza di un gene marker per la selezione dei trasformanti (es gene di resistenza ad un antibiotico) -presenza di una regione polylinker contenente siti riconosciuti da diversi enzimi di restrizione, utilizzabili per linserimento del frammento di interesse - presenza di un gene marker per la selezione dei vettori ricombinanti (: la sequenza di tale gene sovrapposta al polylinker, peci linserimento del frammento clonato la interrompe con conseguente perdita della funzione corrispondente).

Esistono vari vettori di origine diversa; la scelta del vettore dipende dallapplicazione e dalla dimensione del frammento da clonare

VETTORE Plasmide Batteriofago e M13 Cosmidi BAC YAC

OSPITE batteri, lieviti batteri

TIPO DI CLONAGGIO, applicazioni genomico, cDNA Manipolazione generale genomico, cDNA Librerie, mutagenesi e sequenziamento Genomico librerie genomico librerie genomico librerie

Dimensione MAX dellinserto 10-20 kb 20 kb

batteri batteri Lieviti

45 kb 100-300 kb 100-2000kb

I plasmidi sono molecole di DNA circolari extra-cromosomali. Naturalmente diffusi in procarioti e alcuni eucarioti (lievito). Conferiscono un fenotipo caratteristico: es resistenza ad antibiotici o metali pesanti. Basso N copie 1-2/cellula (stringente) alto N copie 10-200/cellula (rilassato) Dimensione standard1-20kb
TEM 2000

Esempio di vettore plasmidico

regione di inserimento del DNA di interesse

Gene marker per selezionare trasformanti: resistenza ad antibiotico (ampicillina)

origine di replicazione

Vettore plasmidico con polylinker allinterno di un gene marker per la selezione dei ricombinanti. Il marker codifica per un fenotipo facilmente rilevabile: con linserimento del DNA esogeno si perde la funzione genica e il corrispondente fenotipo screening immediato dei cloni contenenti il vettore ricombinante.
In questo caso lac Z codifica per una -galattosidasi; lintegrit del gene si rileva mediante la capacit da parte della colonia di scindere un galattoside sintetico aggiunto al terreno di crescita. Se lac Z integro la -galattosidasi funziona e scinde lXgal liberando un composto blu; se un frammento di DNA inserito si interrompe il gene lac z perdita funzione enzimatica: le colonie trasformate sono incolori.

schema del meccanismo di screening bianco-blu basato sulla funzionalit del gene per la -galattosidasi.

Elementi trasponibili
Sequenze che hanno la capacit di muoversi da un sito allaltro del cromosoma

sito donatore

sito accettore

Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

GATCA CTAGT sito bersaglio

GATCA CTAGT

GATCA CTAGT

ripetizioni dirette del sito bersaglio