Quim. Nova, Vol. 25, No.

4, 609-615, 2002 DETECO DE ADULTERAES EM PRODUTOS ALIMENTARES CONTENDO LEITE E/OU PROTENAS LCTEAS Ana Cristina A. Veloso Instituto Politcnico de Bragana, Escola Superior Agrria, Quinta de Sta. Apolnia, Apartado 172, 5300 Bragana - Portugal Natrcia Teixeira IBMC/Servio de Bioqumica, Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto, R. Anbal Cunha, 164, 4050 Porto - Portugal Isabel M.P.L.V.O. Ferreira* e Margarida A. Ferreira CEQUP/ Servio de Bromatologia, Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto, R. Anbal Cunha, 164 - 4050 Porto Portugal Recebido em 16/7/01; aceito em 22/10/01

DETECTION OF ADULTERATIONS IN FOOD PRODUCTS CONTAINING MILK AND/OR MILK PROTEINS. A critical review of the most relevant analytical methodologies for quality and authenticity control of dairy products and foods containing milk proteins is presented. Chromatographic, electrophoretic and immunological methods are used for: detection of cows milk in ewe and goat milks, detection of whey added to milk, detection of caseins and/or whey proteins in non-lactic foods and study compounds resulting from milk proteins degradation. Techniques based on polimerase chain reaction are also suitable for detection of cows milk on cheeses of ewe and goat milks. Keywords: milk proteins; authenticity; analytical methods.

INTRODUO A autenticidade dos alimentos tornou-se um problema global. cada vez mais importante detectar a introduo no mercado de produtos fraudulentamente rotulados e de produtos de qualidade inferior, quer por razes econmicas, quer por razes de sade pblica. As adulteraes em produtos alimentares contendo leite e/ou protenas lcteas so relativamente frequentes e diversificadas, incluindo: (i) adio de leite de vaca ao leite de ovelha e/ou cabra para a preparao de queijo; (ii) a incorporao de protenas do soro na produo de queijos; (iii) a adio de casenas, ou protenas do soro a produtos alimentares, particularmente nos derivados de carne. As flutuaes sazonais na disponibilidade do leite de cabra e de ovelha e o preo mais elevado comparativamente ao leite de vaca so um incentivo para que os produtores de queijo adulterem os queijos tradicionais, de leite de cabra e de ovelha, com leite de vaca e protenas do soro1-4. Deste modo, a possibilidade de determinar a matria prima (tipo de leite) que foi utilizada na produo de queijos, tem grande importncia, no s para garantir a genuinidade dos queijos com denominao de origem, e dos queijos fabricados com leites puros, mas tambm na determinao das percentagens de leite em queijos de mistura. Por outro lado, a incorporao de protenas do soro em queijos aumenta o rendimento de produo, podendo assim ser utilizadas para substituir a gordura do leite dando origem a queijo de baixo teor de gordura5. A adio fraudulenta destas protenas normalmente detectada e quantificada pela determinao do glicomacropptdeo. Este polipeptdeo sendo um componente especfico do soro obtido da coagulao do leite pela renina, dever estar ausente no leite6,7. Um outro tipo de fraude que dever ser detectado a presena de produtos em desacordo com a rotulagem. Por exemplo, o consumo

de produtos que contenham leite e este no seja declarado na rotulagem, poder causar reaes alrgicas, em indivduos sensveis a esse produto. As protenas do soro e as casenas so frequentemente adicionadas a produtos alimentares devido s suas propriedades agregantes. Assim, por razes ticas e econmicas, torna-se imperativo o desenvolvimento de mtodos sensveis para a deteco dos vrios tipos de leites em produtos lcteos e no lcteos. A avaliao da qualidade dos produtos lcteos dever tambm incluir a deteco de compostos resultantes da degradao das protenas. Por exemplo, a deteco de peptdeos presentes em leite UHT (Ultra-High-Temperature) recentemente processado poder indicar que foi obtido a partir de leite de qualidade duvidosa. Por outro lado, a formao de peptdeos durante o armazenamento de produtos de longa durao, poder-se- dever presena de enzimas termicamente resistentes, que frequentemente provocam deteriorao da qualidade desses produtos. Poder-se, tambm, analisar o grau de desnaturao das protenas do soro, para avaliar a severidade do tratamento trmico utilizado, uma vez que este pode levar a uma importante perda da qualidade nutricional7,8. Neste trabalho de reviso sero abordadas diferentes metodologias analticas utilizadas na avaliao da qualidade e deteco de adulteraes em produtos alimentares contendo leite e/ou protenas lcteas. DETECO DE MISTURAS DE LEITE DE VACA, OVELHA E CABRA Com o objetivo de garantir a genuinidade dos queijos que tm leite de ovelha ou cabra como ingredientes, tm sido identificados alguns marcadores de autenticidade, qumicos e biolgicos, utilizando diferentes metodologias analticas bem estabelecidas e validadas. No entanto, devido grande variedade de queijos com diferentes caractersticas microbiolgicas e bioqumicas e devido aos diferentes fatores que podem afetar o processo de maturao, os resultados obtidos para um dado tipo de queijo, podem no ser aplicados a outra variedade.

*e-mail: bromato@ff.up.pt

Reviso

610

Veloso et al.

Quim. Nova

Num trabalho de reviso publicado pela FIL (Fdration Internationale de Laiterie), Ramos9 divide estas metodologias analticas em dois grupos, um baseado na determinao da composio em gordura, e outro na composio em protenas do leite. Os mtodos baseados na composio em gordura utilizam geralmente ou os ndices de cidos graxos volteis solveis e insolveis, em particular o ndice de Polenske10 ou mtodos cromatogrficos, utilizados para determinar a composio em cidos graxos. Para a anlise das fraes de protenas podem igualmente ser utilizados mtodos cromatogrficos. No entanto, neste campo os mtodos eletroforticos e imunolgicos tm-se mostrado mais vantajosos. Mais recentemente, a tcnica de PCR (Polimerase chain reaction), ao tornar possvel localizar um pequeno fragmento de DNA numa complexa mistura de molculas mais ou menos fragmentadas e replic-lo milhes de vezes, permitindo a sua posterior identificao, tem contribudo para a identificao de espcies componentes em diferentes produtos alimentares11 e inclusive no leite e no queijo4,12,13. Mtodos cromatogrficos A cromatografia gasosa uma das tcnicas utilizadas no estudo da composio em gordura em queijos maturados, uma vez que com exceo dos queijos maturados com fungos, poucas mudanas tm lugar na composio em gordura durante o processo de maturao14,15. Contudo, esta tcnica no eficiente quando se usa como adulterante leite desnatado. A gordura do leite das trs espcies (vaca, ovelha e cabra) contm elevada proporo de cidos volteis com nmero par de tomos de carbono. No entanto, o leite de ovelha e cabra contm teores mais elevados de cido caprico (C6), caprlico (C8), cprico (C10) e lurico (C12). As misturas podem ser detectadas com base nestas diferenas, desde que as propores no sejam inferiores a 15-20%, pois necessrio ter em conta o intervalo de variao da composio em cidos graxos, devido a fatores genticos e ambientais. A relao entre alguns cidos graxos, especificamente, C4/C6+C8 e C12/C10, entre outras, apresenta menores intervalos de variao que os cidos graxos individuais16. Tcnicas de cromatografia lquida (RP-HPLC - Reversed-phase High Pressure Liquid Chromatography), com deteco por ultravioleta e fluorescncia, foram igualmente utilizadas para a identificao de leite de vaca em leite e queijo de outras espcies, atravs da anlise da composio em b-lactoglobulina A bovina17. Os autores conseguiram detectar quantidades de 2% de leite de vaca em amostras de queijos com 2 anos de maturao. Kaminarides e Anifantakis18 conseguiram a separao das diferentes fraes de casenas que compem o leite de vaca, ovelha e cabra por HPLC com uma coluna de troca aninica (P.L.SAX 8 m 1000 A) e deteco no UV a 280 nm. Os leites de ovelha e cabra apresentam perfis cromatogrficos relativamente parecidos, mas que diferem consideravelmente do leite de vaca. A eluio da as1-casena bovina ocorre mais tarde que a das as1-casenas caprina e ovina, utilizando-se as mesmas condies cromatogrficas. Deste modo, possvel detectar e quantificar a presena de leite de vaca em leite de ovelha e cabra. A quantidade de leite de vaca adicionado em amostras adulteradas poder assim ser calculada por integrao da rea dos picos de as1-caseina bovina, usando uma curva padro preparada previamente com amostras adulteradas de composio conhecida. Mtodos eletroforticos Entre os mtodos fisico-qumicos utilizados para estudar misturas de leite de ovelha, cabra e vaca, as tcnicas eletroforticas apre-

sentam elevada sensibilidade (comparveis aos mtodos biolgicos) e no requerem reagentes especiais, nem equipamento muito dispendioso. Inicialmente, os mtodos eletroforticos detectavam as misturas de leite baseando-se na mobilidade superior da as1-caseina do leite de vaca. No entanto, tm surgido tcnicas mais sofisticadas, tais como a eletroforese em gis de poliacrilamida contendo ureia, que permitem a diferenciao das protenas do leite de vaca do leite de ovelha e cabra, a partir da g-caseinas bovinas. Apesar destas tcnicas eletroforticas serem muito teis na anlise de misturas de leite, a deteco mais difcil em queijos com protelise extensa. Diversos fatores, como o pH, tipo de coagulante, quantidade de soro que permanece na coalhada e o uso de culturas starter, pode afetar a protelise das casenas. Encontram-se resumidos na Tabela 1 alguns mtodos eletroforticos aplicados na deteco de adulteraes em leite. A adio de leite de vaca em queijos de ovelha foi quantificada por esta metodologia por Amigo et al.20. Estes autores utilizaram a anlise eletrofortica das protenas do soro para detectarem a adulterao, e verificaram que a razo entre a b-lactoglobulina A e B e a albumina srica bovina forneceu resultados muito precisos. Utilizando como corante nitrato de prata, foi possvel a deteco de quantidades de leite de vaca da ordem de 1% nos queijos. Este mtodo tem a vantagem de permitir analisar as protenas do soro que so menos susceptveis que as casenas protelise. Deve ser ressaltado, que embora as protenas do soro estejam presentes em concentraes muito reduzidas, estas permanecem inalteradas aps 5 meses de maturao dos queijos. No entanto, os autores verificaram que o aquecimento do leite de vaca a 90 C durante 30 minutos desnatura as protenas do soro, no permitindo detectar pequenas concentraes (1 a 10%) de leite de vaca adicionado. Estes autores verificaram ainda que os agentes coagulantes vegetais exerciam nas protenas do soro, uma ao proteoltica superior ao do coalho animal, embora no influenciassem o nvel de deteco. O tipo de presso exercida tambm no afeta o nvel de deteco. Este procedimento simples e de baixo custo. Mayer e Hrtner21 utilizaram uma eletroforese em gradiente em gel de poliacrilamida para separar a b-casena e assim determinar a presena das casenas bovinas em produtos lcteos. Utilizando a tcnica de SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate) possvel quantificar as casenas e as protenas do soro em leite processado lquido e em p24. Este mtodo poder permitir a deteco de adulteraes do leite por concentrados de protenas do soro ou leite desnatado em p. O mtodo de SDS-PAGE no s apropriado para a determinao das protenas do soro e casenas nos produtos lcteos, como tambm, tem sido utilizado para estudar e caracterizar a proteosepeptona25. Recentemente a tcnica de SDS-PAGE foi usada para determinar a composio das protenas do soro em leite de cabra e de ovelha. A quantificao das diferentes protenas foi feita por um sistema de anlise de imagem23. A focagem isoeltrica (pH 4 a 9) tem sido utilizada como primeira eletroforese, seguida por uma eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS ou ureia para separar as casenas do leite26. Estes autores relatam que com esta tcnica, possvel separar no s as casenas como tambm a para-k-casena, a b-lactoglobulina e alactoalbumina. A eletroforese capilar tem provado ser uma tcnica eficiente na anlise das protenas do leite e na avaliao da qualidade dos produtos lcteos. Existem diversos trabalhos que descrevem a sua utilizao na anlise de polimorfismos das protenas, na avaliao da extenso dos tratamentos trmicos, na deteco de adulteraes e de

Vol. 25, No. 4

Deteco de Adulteraes em Produtos Alimentares Contendo Leite e/ou Protenas Lcteas

611

Tabela 1. Mtodos eletroforticos em gel aplicados na deteco de adulteraes em leite e derivados Composto Casenas Mtodo Eletroforese em gel de poliacrilamida Eletroforese em gel de poliacrilamida Condies de anlise - gel de poliacrilamida 9% - colorao: azul de Coomassie G250, 15 h - Quantificao por densitometria a 550 nm - tampo de electroforese: tampo Tris-glicina a pH 8,3 - colorao: azul de Coomassie G250 e R250 e nitrato de prata - quantificao por densitometria a 600 nm - tampo superior: ACES 40mM, pH 6,8 - tampo inferior: piridina 200 mM, pH 5,2 - colorao: azul de Coomassie G250 - quantificao por densitometria a 629 nm - colorao: azul de Coomassie R - quantificao por densitometria a 600 nm Aplicao Deteco da adio de leite de vaca a leite de cabra pasteurizado Deteco de leite de vaca adicionado a queijos de leite de ovelha Referncia (19)

Protenas do soro

(20)

b-casena

Eletroforese em gel de poliacrilamida Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS

Deteco de casenas bovinas em leite e produtos derivados

(21)

Casenas, protenas do soro, protenas da membrana dos glbulos de gordura Protenas do soro

Deteco de adulteraes do soro de leite coalhado em p

(22)

- colorao: azul de Coomassie R250 - quantificao por tecnologia de anlise de imagem

Determinao da composio das protenas do soro em leite de cabra e ovelha

(23)

Tris - tris(hidroximetil)aminometano; ACES - cido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfnico; SDS - dodecilsulfato de sdio peptdeos derivados das protenas durante a protelise no leite e seus derivados7. Os tipos de eletroforese capilar mais utilizados nestas anlises so a eletroforese capilar de zona (capillary zone electrophoresis - CZE), a eletroforese capilar em gel (capillary gel electrophoresis - CGE) e a focagem isoelctrica capilar (capillary isoelectric focusing - CIEF). Na Tabela 2 so apresentados alguns trabalhos que aplicam esta tcnica na deteco de adulteraes em produtos alimentares contendo leite e/ou protenas lcteas. A eletroforese capilar de zona foi utilizada na deteco dos diferentes tipos de leite em misturas de leite de vaca, ovelha e cabra2. Cada tipo de leite originou um perfil eletrofortico tpico, permitindo a sua identificao. O mtodo desenvolvido por estes autores permitiu a deteco de 8% e 1% de leite de vaca adicionado a leite de ovelha ou cabra, respectivamente, de acordo com os diferentes tempos de migrao da as1-casena de cada espcie. Por outro lado, Cartoni et al.29 utilizaram a mesma tcnica para determinar a adulterao de produtos de leite de cabra com leite de vaca. A deteco e quantificao do leite de vaca foi obtida pela presena da alactoalbumina e b-lactoglobulina A e B. Estes autores conseguiram detectar 2% de leite de vaca em misturas dos dois tipos de leite e 4% em queijos. Com este mtodo estes autores apenas conseguiram uma anlise qualitativa de misturas de leite de vaca, cabra e ovelha e de misturas de leite de cabra e ovelha, devido sobreposio dos picos referentes a-lactoalbumina do leite de cabra e ovelha. Mtodos imunolgicos Os ensaios imunolgicos so frequentemente utilizados na indstria alimentcia para uma deteco qualitativa e quantitativa de componentes alimentares e contaminantes, tendo sido utilizados pela primeira vez no final dos anos 60. A sua aplicao inicial foi na deteco de protenas especficas em concentraes muito baixas. Estes primeiros ensaios baseavam-se em ensaios radioimunolgicos desenvolvidos no campo da medicina, no sendo extensivamente utilizados devido necessidade de utilizao de marcadores radioativos. O desenvolvimento, no incio dos anos 70, de ensaios imunoenzimticos, onde os marcadores radioativos so substitudos por enzimas, eliminando os perigos associados com a tcnica anterior, resulta numa maior aceitao destes ensaios aplicados a anlises de alimentos. Alm disso, a relativa simplicidade dos ensaios enzimticos e a elevada sensibilidade, devido especificidade das reaes antgenio-anticorpo, associada a baixos custos e utilizao de equipamento no sofisticado, do a estes mtodos um grande potencial na indstria alimentcia. As protenas do soro so extremamente antignicas e a sua determinao por tcnicas imunolgicas usuais como a imunodifuso radial, a Rocket eletroforese, mtodo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), e ensaios radioimunolgicos no complicada. A determinao das casenas, apesar de bastante fivel, mais difcil, uma vez que, estas protenas so pouco antignicas e encontram-se na forma de agregados26. A imunoprecipitao em meio lquido foi a primeira tcnica imunolgica utilizada na deteco de leites, de diversas origens animais, em misturas lcteas30. eficaz em leites crus e pasteurizados, mas no em leites esterilizados, em p ou condensados. Para estes leites no possvel observar a reao de precipitao, porque os precipitados so pouco visveis e desaparecem rapidamente aps a sua formao. Os mtodos imunolgicos em gel, em que se mistura o anticorpo em concentrao conhecida no gel, so sensveis e apresentam elevada reprodutibilidade. A tcnica de imunodifuso dupla em gis de agarose foi utilizada pela primeira vez em 1974, e permitiu detectar 2,5 % de leite de vaca em leite de cabra e ovelha31. Este mtodo embora semi- -quantitativo, no influenciado pela protelise do queijo. O teste COMIT para a identificao de leite de vaca (3-100%) em leite de ovelha, utiliza anticorpos policlonais para as protenas sricas do leite de vaca32. A diferena entre este e as tcnicas de imunodifuso convencionais est na utilizao de reagentes liofilizados em discos de papel de filtro, o que permite a sua difuso no gel. Alm disso, os gis possuem um corante e uma concentrao

612

Veloso et al.

Quim. Nova

Tabela 2. Mtodos de eletroforese capilar aplicada anlise das protenas do leite Composto a-la, b-lg A e B, as-casenas e b-casena Mtodo Eletroforese capilar de zona Condies de anlise - coluna no tratada de slica fundida - solvente de anlise: tampo fosfato 0,5 M, pH 6-9, com e sem ureia 4 M - solvente da amostra: PBS, pH 7 - injeco do leite sem tratamento da amostra - deteco UV a 200 nm - coluna capilar hidroflica revestida de slica fundida - solvente de anlise: tampo citrato com uria 6 M e MHEC 0,05%, pH 3 - deteco UV a 214 nm - coluna capilar revestida de slica fundida - solvente de anlise: tampo citrato de sdio 20 mM com MHPC 0,1% e ureia 6 M - deteco UV a 214 nm - coluna no tratada de slica fundida - solvente de anlise: tampo borato 100 mM com sulfato de sdio 30 mM, pH 8,2 - soro cido injectado directamente - deteco UV a 214 nm - coluna capilar de metil-silanizada - solvente de anlise: tampo borato 50 mM, pH 9,27 ou tampo borato 120 mM, pH 9,2 - deteco UV a 200 nm Aplicao Determinao da razo b-casena/a-la na deteco de adulteraes do leite com leite em p Referncia (27)

Glicomacro-pptdeo

Eletroforese capilar de zona

Deteco e quantificao do glicomacropeptdeo para detectar e estimar o soro em p, em leite e soro de leite coalhado em p Separao das protenas do leite de diferentes espcies. Deteco de leite de vaca em leite de cabra e ovelha

(28)

a e b-casenas, protenas do soro

Eletroforese capilar de zona

(2)

a-la, b-lg A e B e BSA

Eletroforese capilar de zona

Quantificao das protenas do soro do leite durante o armazenamento de leites UHT. Comparao com HPLC. Identificao da origem de produtos resultantes da protelise Anlise qualitativa das protenas do soro de leite de vaca e cabra. Determinao do leite de vaca em leite e queijo de cabra

(8)

a-la e b-lg A e B

Eletroforese capilar de zona

(29)

MHEC - metilhidroxietilcelulose; PBS cloreto de sdio 75 mM, fosfato de potssio 20 mM e azida de sdio 0,01%; MHPC metilhidroxipropilcelulose. adequada de polietilenoglicol, o que permite uma visualizao mais eficiente das linhas de precipitao antignio-anticorpo. As tcnicas descritas apresentam alguns inconvenientes, particularmente, requerem muito tempo ou necessitam de uma grande quantidade de anticorpos purificados e so qualitativas ou semi-quantitativas. O desenvolvimento das tcnicas imunoenzimticas (ELISA) constituiu uma alternativa interessante, pois estas possuem boa reprodutibilidade e uma sensibilidade mais elevada que a dos mtodos imunolgicos em gel. Diversos tipos de ELISA tm sido aplicados no doseamento das protenas do soro e das casenas, principalmente com o objetivo de detectar adulteraes nos produtos lcteos. Alguns exemplos so apresentados na Tabela 3. Dois mtodos ELISA (indireto e em sanduiche), foram desenvolvidos por Garca et al.33,34 para detectar pequenas adulteraes de leite de vaca no leite de ovelha. Em ambos foram utilizados anticorpos policlonais contra as protenas do soro do leite de vaca, conjugados com biotina. Uma vez que a biotina uma pequena molcula, a sua ligao aos anticorpos no prejudica a associao antgenio-anticorpo, mantendo a especificidade do anticorpo para o antgenio, o que poder no acontecer quando uma enzima se fixa diretamente ao anticorpo. Por outro lado, a conjugao da biotina com anticorpos um procedimento muito mais simples, originando produtos mais estveis do que os complexos enzima-anticorpo. No mtodo de ELISA indireto foi possvel detectar leite de vaca cru em leite de ovelha, embora a sensibilidade do mtodo fosse baixa, dado que no permitiu a quantificao de pequenas percentagens de leite de vaca (1-10%) adicionadas33. As protenas do soro desnaturam mais facilmente pelo calor que as casenas. Assim, a sua desnaturao trmica poder diminuir a sensibilidade deste mtodo para a deteco de leite de vaca em leite de ovelha. Os autores analisaram leite de vaca pasteurizado e UHT, retirados do mercado, e obtiveram resultados semelhantes aos obtidos com amostras de leite cru. O mesmo no aconteceu com leites esterilizados, onde obtiveram uma diminuio de 25% de antigenicidade das protenas do soro33. No mtodo de ELISA em sanduche, foi possvel detectar e quantificar quantidades bem definidas (1-30%) de leite de vaca adicionadas a leite de ovelha. Este mtodo mais sensvel do que o mtodo ELISA indireto na deteco e quantificao de pequenas quantidades (1-10%) de leite de vaca adicionado a leite de ovelha. Contudo, com o ELISA em sanduche no foi possvel detectar a adio de leite de vaca UHT e esterilizado. A resposta obtida com leite de vaca pasteurizado foi 50% mais baixa que a obtida com leite de vaca cru34. O mtodo de ELISA indireto desenvolvido por Haza et al.3 utiliza anticorpos monoclonais contra a as2-casena do leite de cabra. Este mtodo foi utilizado para detectar e quantificar quantidades de-

Vol. 25, No. 4

Deteco de Adulteraes em Produtos Alimentares Contendo Leite e/ou Protenas Lcteas

613

Tabela 3. Mtodos imunolgicos de ELISA aplicados s protenas do leite MTODO ELISA (indirecto) ELISA (sanduiche) ELISA (indirecto) ELISA (competitivo indirecto) ANTIGNIO Protenas do soro do leite de vaca Protenas do soro do leite de vaca as2-casena de leite de cabra b-lg bovina nativa e desnaturada APLICAO Deteco de leite de vaca adicionado a leite de ovelha Deteco e quantificao de leite de vaca adicionado a leite de ovelha Deteco de leite de cabra adicionado a leite de ovelha Deteco de protenas do leite de vaca nativas e desnaturadas em queijos de ovelha e cabra Deteco de leite de vaca e caseinatos adicionados a queijo de cabra e ovelha REFERNCIA (33) (34) (3) (1)

ELISA

g-casena bovina

(35)

finidas (0,5-15%) de leite de cabra adicionado a leite de ovelha. O limite de deteco situa-se entre 0,5 e 1% de leite de cabra adicionado. Estes autores analisaram tambm leite de cabra sujeito a diferentes tratamentos trmicos. Os resultados obtidos indicam que a antigenicidade da casena do leite de cabra no afetada por estes tratamentos, permitindo a sua deteco e quantificao. Beer et al.1 e Richter et al.35 descrevem dois mtodos ELISA competitivos indiretos para detectar leite de vaca adicionado a queijo de cabra e ovelha. Os primeiros autores utilizam anticorpos policlonais contra a b-lactoglobulina bovina nativa e desnaturada, enquanto os segundos utilizam anticorpos policlonais contra a gcasena bovina. No primeiro mtodo foi possvel detectar 100 ng/ml de b-lactoglobulina bovina nativa e desnaturada que equivale a 0,10,2% de leite de vaca adicionado nos queijos de cabra e ovelha, sendo assim possvel a deteco de adulteraes. No mtodo desenvolvido por Richter et al.35 o limite de deteco conseguido foi de 0,1% de leite de vaca e caseinatos adicionados. Os autores concluram ainda que este mtodo no poder ser aplicado deteco de leite de vaca em queijos de leite de bfalo, uma vez que, a g-casena deste leite est relacionada com a g-casena bovina, ligando-se de modo semelhante aos anticorpos utilizados. Os mtodos ELISA so cada vez mais utilizados na anlise de produtos alimentcios devido sua sensibilidade, baixo custo e reduzido tempo de anlise podendo vir a desempenhar um importante papel no controle da autenticidade dos produtos lcteos. Reao em cadeia da polimerase (PCR) O leite proveniente de glndulas mamrias saudveis contm um certo nmero de clulas somticas (100.000-500.000/ml para a vaca), predominantemente leuccitos, 2% dos quais se acredita serem provenientes das clulas epiteliais36. A tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR) baseia-se na anlise de DNA, permitindo detectar e amplificar pequenos fragmentos de DNA. Esta tcnica tem sido aplicada na indstria de lacticnios, principalmente para detectar contaminaes microbiolgicas, contudo, o leite tambm um substrato adequado para as anlises por PCR4,12,13. possvel extrair DNA do leite e de produtos lcteos processados como o queijo e utilizar este DNA genmico como substrato para amplificao por PCR do DNA especfico da casena. Nesta tcnica so utilizados primers codificando parte da sequncia do gene da b-casena, para detectar o correspondente DNA no leite e queijo. Os fragmentos de DNA amplificados so separados por eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etdio. O fragmento do

gene da b-casena (253, 247 pb) foi observado no leite de vaca, ovelha e cabra, assim como no leite em p, no leite condensado bovino e em queijos. A deteco de leite de vaca nos leites e queijos de ovelha e cabra foi possvel com base na diferenciao de tamanho dos fragmentos de PCR, os de bovino apresentaram 253 pb enquanto que os de ovino/caprino apresentaram 247 pb4,12,13. O DNA extrado pode ser usado tambm em anlises mais complexas, como anlises de restrio enzimtica especfica. A identificao de locais especficos de restrio enzimtica, localizados exclusivamente no produto de PCR de ovino/caprino, permitiu uma deteco mais exata aps digesto. Obtiveram-se dois fragmentos de 66 e 181 pb aps o uso de enzimas de restrio Alu I ou 87 e 160 pb para a enzima Ava II. Aps a adio de leite de vaca ao leite de cabra, Plath et al.4 obtiveram uma banda adicional correspondendo ao produto por hidrolisar do PCR de bovino (253pb). Deste modo, foi possvel estabelecer um ensaio semi-quantitativo, com um limite de deteco de 0,5% de leite de vaca em queijos preparados com leite de ovelha e de cabra. Espectrometria de massa A espectrometria de massa tem sido utilizada para determinar a massa molecular das protenas do leite de vaca48, ovelha49 e cabra50, assim como na identificao de variantes genticas51, 52, alteraes na composio dos aminocidos e modificaes como fosforilao53 e glicosilao53. O estudo das protenas do leite de vaca utilizando a tcnica de HPLC com deteco por espectrometria de massa (MS) forneceu informaes importantes para a caracterizao das casenas52 e outras protenas do leite48. Trujillo e colaboradores aplicaram igualmente a espectrometria de massa em combinao com HPLC, para a separao em linha, deteco e estudo da composio das protenas de leite de cabra49 e de ovelha50. As protenas do soro que no foi possvel resolver por HPLC-MS, foram purificadas por FPLC (fast preparative liquid chromatography) e analisadas por espectrometria de massa via anlise por injeco em fluxo (FIA) 49,50. As metodologias descritas permitem caracterizar cada um dos tipos de leite, assim como o estudo de processos proteolticos no leite. DETECO DA INCORPORAO DE SORO EM LEITE A adio fraudulenta de soro ao leite normalmente detectada e quantificada pela determinao do glicomacropeptdeo, que resulta

614

Veloso et al.

Quim. Nova

da quebra da ligao peptdica da k-casena entre os aminocidos 105-106 Phe-Met. Desta ciso forma-se a para-k-casena (1-105) que permanece nas micelas de casena e o glicomacropeptdeo (106169) que fica no soro. O glicomacropptdeo geralmente quantificado por mtodos cromatogrficos, particularmente a cromatografia de excluso molecular37, HPLC em fase reversa38 e cromatografia de troca inica, quer catinica39, quer aninica40. A eletroforese capilar de zona com uma coluna hidroflica de slica fundida28 foi tambm utilizada com sucesso na deteco e quantificao do glicomacropetdeo para detectar e quantificar o soro em leite. DETECO DE CASENAS E/OU PROTENAS DO SORO EM PRODUTOS ALIMENTARES NO LCTEOS As casenas podem ser facilmente purificadas atravs da precipitao no ponto isoeltrico ou por coagulao pela renina. Desde os anos 60 que as casenas vm sendo utilizadas na indstria alimentcia por proporcionarem textura e corpo aos alimentos, funcionarem como emulsificantes e reterem gua. So frequentemente utilizadas em alimentos como produtos de confeitaria (bolos, po, biscoitos), bebidas (lcteas e no lcteas), sopas, vegetais, carnes, sobremesas (mousses e gelados), cremes de caf, etc. O interesse pelas protenas do soro mais recente. O desenvolvimento, nos anos 70, de processos de ultrafiltrao facilitou a sua purificao, observando-se uma crescente aplicao destas protenas na indstria alimentcia. Devido s suas propriedades emulsificantes e gelificantes e viscosidade e solubilidade, a sua utilizao relevante em bebidas, produtos lcteos, crneos, confeitaria, sopas, molhos, condimentos e produtos dietticos41. No entanto, a incorporao de casenas e protenas do soro nos alimentos deve ser declarada na rotulagem. O consumo de produtos que contenham leite e que no seja mencionado na rotulagem, pode causar reaes alrgicas em indivduos sensveis. Para detectar a presena de protenas do leite em alimentos no lcteos, particularmente em produtos crneos, utilizam-se igualmente mtodos eletroforticos, imunolgicos e cromatogrficos42. Estes mtodos apresentam alguns problemas de sensibilidade e reprodutibilidade em alimentos esterilizados. DETECO DE COMPOSTOS RESULTANTES DA DEGRADAO DAS PROTENAS DO LEITE Modificaes tais como desnaturao e protelise, comuns na manufactura de muitos lacticnios levam formao de novos compostos, incluindo peptdeos e aminocidos. As protelises incontroladas ou prolongadas (qumicas ou enzimticas) podem resultar na formao de peptdeos amargos. Geralmente, este sabor amargo est relacionado com o contedo em aminocidos hidrofbicos. Informaes sobre a ocorrncia destes compostos derivados so teis para avaliar a qualidade do processamento e possveis adulteraes. O estudo, por eletroforese capilar e por HPLC, das modificaes que ocorrem na frao proteica de leites submetidos a tratamento UHT contribuiu decisivamente para controlar a qualidade deste produto. Por um lado, possvel avaliar a severidade do tratamento trmico atravs do estudo da desnaturao das protenas do soro8,43,44. Por outro lado, a presena de peptdeos no leite recentemente produzido indica que este foi obtido a partir de leite cru de baixa qualidade, e a formao de peptdeos durante o armazenamento do leite UHT, pode ser uma indicao da presena de enzimas resistentes ao calor45. A tcnica de eletroforese capilar permite a diferenciao entre peptdeos produzidos pela ao da plasmina e os que resultam das

enzimas proteolticas das bactrias psicotrficas8. Deste modo, fornece informao sobre a qualidade do leite cru e da tecnologia utilizada. Tambm permite avaliar a severidade do tratamento trmico a que o leite foi submetido. Uma outra reaco de interesse em leites aquecidos a reaco da lactose com os resduos de lisina das protenas. As reaces de Maillard observadas provocam a formao de lactulosil-lisina. A hidrlise deste produto origina a furosina, cuja quantificao uma boa indicao da intensidade do tratamento trmico, assim como, uma medida da desnaturao proteica e perda de lisina. A sua presena no leite pode ainda fornecer uma informao complementar sobre a qualidade do leite, pois permite saber se foi adicionado leite em p reconstitudo ao leite lquido7,46,47. CONCLUSES O controlo de qualidade do leite e derivados deve tornar-se cada vez mais rigoroso e frequente. A indstria de lacticnios e as entidades responsveis por assegurar a autenticidade destes produtos, necessitam ter sua disposio meios que possam dar respostas precisas em tempo real, ao longo das vrias etapas de fabricao e comercializao, minimizando os custos decorrentes de qualquer anomalia que possa surgir. A cromatografia, a eletroforese e os ensaios imunolgicos tm sido as tcnicas mais adequadas para avaliar a qualidade e autenticidade dos produtos alimentares contendo leite e/ou protenas lcteas. O desenvolvimento de cromatografias rpidas, FPLC e HPLC, e de eletroforese capilar, abriu novas perspectivas para a diminuio dos tempos de anlise. Mais recentemente, com a tcnica de PCR tambm se tm obtido resultados promissores. O mesmo acontecendo com a espectrometria de massa. Os ensaios imunolgicos sero, certamente mais utilizados na tecnologia dos lacticnios, quando estiverem disponveis comercialmente anticorpos mais baratos e especficos. REFERNCIAS
1. Beer, M.; Krause, I.; Stapf, M.; Schwarzer, C.; Klostermeyer, H.; Z. Lebensm. Unters Forsch. 1996, 203, 21. 2. Cattaneo, T.M.P.; Nigro, F.; Greppi, G.F.; Milchwissenschaft 1996, 51, 616. 3. Haza, A.I.; Morales, P.; Martn, R.; Garca, T.; Anguita, G.; Gonzlez, I.; Rodrguez, E.; Sanz, B.; Hernndez, P.E.; J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 1756. 4. Plath, A.; Krause, I.; Einspanier, R.; Z. Lebensm. Unters Forsch. A. 1997, 205, 437. 5. Lo, C.G.; Bastian, E.D.; J. Dairy Sci. 1998, 81, 16. 6. Greenberg, R.; Dower, H.J.; J. Agric. Food Chem. 1986, 34, 30. 7. Recio, I.; Amigo, L.; Lpez-Fandio, R.; J. Chromatogr. Biomed. Sci. Appl. 1997, 697, 231. 8. Recio, I.; Frutos, M. de; Olano, A.; Ramos, M.; J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 3955. 9. Ramos, M.; Bulletin 181 FIL_IDF. 1984. 10. Colmenar, M.L.; Carballido, A.; Garcia-Olmedo, R.; Anal. Bromatol. 1965, 17, 389. 11. Faria, M.A.; Ferreira, M.A.; Rev. Port. Farm. 1999, XLIV, 31. 12. Mendes, E.; Faria, M.A.P.; Ferreira, I.M.P.L.V.O.; Pinho, O.; Ferreira, M.A.; 9as Jornadas de Analisis Instrumental, Barcelona, Espanha, 1999. 13. Mendes, E.; Faria, M.A.P.; Ferreira, I.M.P.L.V.O; Ferreira, M.A.; 4 Encontro de Qumica dos Alimentos, Coimbra, Portugal, 1999. 14. Ramos, M.; Martinez-Castro, I.; Le lait 1976, 56, 164. 15. Vanbelle, M.; Vervack, W.; Foulon, M.; Lait 1978, 58, 245. 16. Sadini, V.; Il Latte 1963, 37, 933. 17. Urbanke, W.; Luf, W.; Brandl, E.; Z. Lebensm. Unters Forsch. 1992, 195, 137. 18. Kaminarides, S.E.; Anifantakis, E.M.; J. Dairy Res. 1993, 60, 495. 19. Furtado, M.M.; J. Dairy Sci. 1983, 66, 1822. 20. Amigo, L.; Ramos, M.; Martin-Alvarez, P.J.; J. Dairy Sci. 1991, 74, 1482. 21. Mayer, W.; Hrtner, H.; Electrophoresis 1992, 13, 803. 22. Malin, E.L.; Basch, J.J.; Shieh, J.J.; Sullivan, B.C.; Holsinger, V.H.; J. Dairy Sci. 1994, 77, 2199.

Vol. 25, No. 4

Deteco de Adulteraes em Produtos Alimentares Contendo Leite e/ou Protenas Lcteas

615

23. Casper, J.L.; Wendorff, W.L.; Thomas, D.L.; J. Dairy Sci. 1998, 81, 3117. 24. Basch, J.J.; Douglas Jr., F.W.; Procino, L.G.; Holsinger, V.H.; Farrell Jr., H.M.; J. Dairy Sci. 1985, 68, 23. 25. Strange, E.D.; Malin, E.L.; van Hekken, D.L.; Basch, J.J.; J. Chromatogr. 1992, 624, 81. 26. Grappin, R.; Ribadeau-Dumas, B. Em Advanced Dairy Chemistry - 1: Proteins; Fox, P.F., ed.; Blackie Academic & Professional: London, 1992, p. 1-62. 27. Chen, F.-T.A.; Zang, J.-H.; J. AOAC Int. 1992, 75, 905. 28. Riel, J.v.; Olieman, C.; Electrophoresis 1995, 16, 529. 29. Cartoni, G.; Coccioli, F.; Jasionowska, R.; Masci, M.; J. Chromatogr., A 1999, 846, 135. 30. Pinto, F.C.; J. Dairy Res. 1966, 33, 129. 31. Durand, M.; Meusnier, M.; Delahaye, J.; Prunet, P.; Boll. Ac. Vet. 1974, 47, 247. 32. Garca, T.; Martin, R.; Rodrguez, E.; Hernandez, P.E.; Sanz, B.; J. Dairy Res. 1989, 56, 691. 33. Garca, T.; Martn, R.; Rodrguez, E.; Morales, P.; Hernndez, P.E.; Sanz, B.; J. Dairy Sci. 1990, 73, 1489. 34. Garca, T.; Martn, R.; Rodrguez, E.; Azcona, J.I.; Sanz, B.; Hernndez, P.E.; J. Food Prot. 1991, 54, 366. 35. Richter, W.; Krause, I.; Graf, C.; Sperrer, I.; Schwarzer, C.; Klostermeyer, H.; Z. Lebensm. Unters Forsch. A 1997, 204, 21. 36. Targowski, S.P.; J. Dairy Sci. 1983, 66, 1781. 37. Van Hooydonk, A.C.M.; Olieman, C.; Netherlands Milk and Dairy Journal 1982, 36, 153. 38. Olieman, C.; van Riel, J.A.M.; Netherlands Milk and Dairy Journal 1989, 43, 171.

39. Lonil, J.; Moll, D.; J. Dairy Res. 1991, 58, 321. 40. Outinen, M.; Tossavainen, O.; Syvoja, E.-L.; Korhonen, H.; Milchwissenschaft 1995, 50, 570. 41. Mulvihll, D.M. Em Advanced Dairy Chemistry - 1: Proteins; Fox, P.F., ed.; Blackie Academic & Professional: London, 1992; p. 369-404. 42. Ashoor, S.H.; Stiles, P.G.; J. Chromatogr. A 1987, 393, 321. 43. Recio, I.; Olieman, C.; Electrophoresis 1996, 17, 1228. 44. Ferreira, I.M.P.L.V.O.; Mendes, E.; Ferreira, M.A.; Anal. Sci. 2001, 17, 499. 45. Lpez-Fandio, R.; Olano, A.; Corzo, N.; Ramos, M.; J. Dairy Res. 1993, 60, 339. 46. Erbersdobler, H.F.; Dehn, B.; Nangpal, A.; Reuter, H.; J. Dairy Res. 1987, 54, 147. 47. Lonil, J.; Moll, D.; Fauquant, J.; Maubois, J.L.; Pearce, R.J.; Bouhallab, S.; J. Dairy Sci. 1997, 80, 2270. 48. Lonil, J.; Moll, D.; Gaucheron, F.; Arpino, P. Gunot, P.; Maubois, J.L; Lait 1995, 75, 193. 49. Trujillo, A.J.; Casals, I.; Guamis, B.; J Chromatogr. A 2000, 870, 371. 50. Trujillo, A.J.; Casals, I.; Guamis, B.; J Dairy Sci. 2000, 83- 11. 51. Ferranti, P.; Malorni A.; Nitti, G.; Laezza, P.; Pizzano, R.; Chianese, L.; Addeo, F.; J. Dairy Res. 1995, 62, 281. 52. Visser, S.; Slangen, C.J.; Lagerwerf, F.M.; Van Dongen, W.D.; Haverkamp J.; J Chromatrogr., A 1995, 711, 141. 53. Chianese, L.; Garro, G.; Nicolai, M.A.; Mauriello, R.; Ferranti, P.; Pizzano, R.; Cappuccio, U.; Laezza, P.; Addeo, F.; Ramuno, L.; Rando, A.; Rubino, R.; Lait 1993, 73, 533. 54. Burr, R.; Moore, C.H.; Hill, J.P.; Milchwissenschaft 1996, 51, 488.