CQA

Controle da Qualidade Analtica

Fernando Mota de Oliveira
LABWIN Servios Especializados Ltda

Demonstrao Inicial de Competncia (DIC) e Validao do Mtodo ................................................ 2 1.1 Demonstrao da Capacitao do Analista ................................................................................... 2 1.2 Composio de uma validao........................................................................................................ 2 1.3 Descrio dos possveis itens de validao .................................................................................. 3 1.4 Preparo de Spikes (Adio de Padro) ........................................................................................... 4 1.5 Repetitividade r (repeatability), % Recuperao e bias (Diferena) ........................................... 4 1.6 Repetitividade em Microbiologia (Contagens).............................................................................. 5 1.7 Limite de Deteco do Mtodo e Limite de Quantificao ........................................................... 6 1.8 Linearidade (Linearity), Faixa de Trabalho (Work Range) e Sensibilidade (Sensibility) ........... 9 1.9 Reprodutibilidade R (Reprodutibility, preciso interlaboratorial ou intralaboratorial)........... 11 1.10 Exatido (Accuracy) .................................................................................................................... 12 1.11 Comparativo de Mtodos diferentes com amostras diferentes ............................................. 14 1.12 Especificidade/Seletividade ou Identificao........................................................................... 14 1.13 Robustez....................................................................................................................................... 15 1.14 Linearizaes de Curvas Analticas e suas respectivas incertezas ...................................... 16 1.15 Equaes de Linearizao sem forar o zero .......................................................................... 16 1.16 Equaes de linearizao forando o zero............................................................................... 17 1.17 Tabela de t de Students Unilateral a 99% (uso em LD e LQ)............................................... 18 1.18 Tabela de t de Students bilateral a 95% (uso para eliminao de Outliers, clculos de limites de confiana, etc.) ......................................................................................................................... 18 1.19 Eliminao de Outliers (valores extremos) pelo teste de Grubbs.......................................... 19 1.20 Exerccio Clculo de LDM........................................................................................................ 20 1.21 Exerccio Clculo de Repetitividade e %Recuperao......................................................... 20 2 Demonstrao contnua de Competncia (DCC) ................................................................................ 21 2.1 Controles da Qualidade Analtica Rotineiros............................................................................... 21 2.2 Calibrao ........................................................................................................................................ 22 2.3 Clculos de CQA ............................................................................................................................. 22 2.4 Cartas de Controle .......................................................................................................................... 23 2.5 Avaliao de QC para amostras pequenas .................................................................................. 24 2.6 Aes Corretivas............................................................................................................................. 24 3 Referncias Bibliogrficas .................................................................................................................... 24

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

1/24

CQA Controle da Qualidade Analtica

1 Demonstrao Inicial de Competncia (DIC) e Validao do Mtodo

recomendado ter a validao do Mtodo e testes de capacitao dos Analistas para cada Analito. Novos testes so necessrios ao modificar mtodos, comparando os resultados com o mtodo de referncia. A validao do mtodo permite conhecer as capacidades e limitaes de um mtodo analtico. 1.1 Demonstrao da Capacitao do Analista

Segundo o Manual de Standard Methods (para guas) da APHA, na avaliao inicial do Analista para anlises de guas requer-se ao menos uma prova em branco e 04 Spikes de Branco (Concentrao entre 10 LDs e o meio da curva de calibrao) ou outro nvel especificado no mtodo. Deve-se fazer os testes aps anlise dos padres de calibrao requeridos. Cuidado para que a prova em branco no tenha o analito em mais que a metade do LQ ou outro nvel especificado no mtodo. Garantir que a repetitividade e a exatido (porcentagem de recuperao) calculados para o spike de branco so aceitveis com base nos critrios listados no mtodo escolhido. Se no h critrios estabelecidos no mtodo use Recuperao de 80% a 120% e %CV <=20% (Desvio padro Relativo) como ponto de partida. Se detalhes de demonstrao inicial de competncia no so fornecidos no mtodo de escolha especifique e referencie o mtodo ou procedimento usado para demonstrao de competncia. Evidentemente que em um ambiente muito produtivo, ter que fazer os testes de cada novo analista em todos os ensaios torna-se uma tarefa difcil ou at impossvel. Nestes casos pode-se escolher um nmero limitado de mtodos que envolvam as habilidades requeridas (preparos, extraes, leitura em espectrofotmetros, entendimento de cromatogramas, medies volumtricas, pesagens, etc.) para os testes de capacitao do Analista e aliar a isto uma superviso por analistas experientes aos novos analistas. 1.2 Composio de uma validao

A validao do mtodo pode ser composta por diversos ou todos os itens que seguem. Uma anlise crtica deve ser feita para definir o que aplicvel e o que tcnica e economicamente vivel de se fazer de acordo com o mtodo analtico. Existe um nmero muito grande de situaes em um laboratrio com relao a validaes ou re-validaes, de modo que muito difcil se predefinir o que requerido ou obrigatrio. Deve-se levar em conta que as validaes consumem muito tempo e portanto devem ser feitas visando ter-se registros de dados acima de tudo teis. A srie que segue utilizada no software Labwin CQA. Outras formas de realizao dos testes podem ser recomendadas. a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) Repetitividade (r), Exatido, %Recuperao e bias (diferena sistemtica). Repetitividade em microbiologia. Limites de deteco (LD ou LDM) e quantificao (LQ ou LQM). Exatido por anlise de material de referncia Reprodutibilidade (R), Repetitividade (r) e Exatido em Intralaboratorial (vrios analistas em um mesmo Laboratrios) Reprodutibilidade (R), Repetitividade (r) e Exatido em Interlaboratorial (vrios laboratrios utilizando o mesmo mtodo). Seletividade. Robustez. Comparativo de Mtodos - Amostras diferentes em mtodos diferente. Repetitividade, Exatido e %Recuperao - Multi-Anlise. Para uso em cromatografia e analisadores em linha). LD e LQ - Multi-Anlise. Para uso em cromatografia e analisadores em linha.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

2/24

1.3 a)

Descrio dos possveis itens de validao Descrio do conhecimento de Limitaes e Interferncias (Limitations and Interferences): Estas descries geralmente devem constar no mtodo analtico e podem opcionalmente utilizar os testes de especificidade/seletividade ou a identificao (por cromatografia, Espectrometria de massas, infra-vermelho, etc.) como complemento. Em mtodos oficiais muitas vezes todos estes estudos j foram feitos e constam nos mesmos. Freqncia: Geralmente feito apenas ao se pr o mtodo em uso. Repetitividade (Repeatability): Tambm chamado de Preciso de Analista indica a preciso do mtodo. feito com a anlise de uma mesma amostra (geralmente 5 a 10 vezes) por um mesmo analista, em um mesmo instrumento, em um perodo de tempo relativamente curto. Para componentes menores pode ser requerido o teste em 03 faixas de concentraes (quando h curva analtica, geralmente em 20%, 50% e 100% da curva) quando pode-se obter a equao linearizada de desvio padro em funo de concentrao. Na inviabilidade de se obter a equao o valor de CV (Coeficiente de Varincia ou Desvio padro relativo) pode ser utilizado para valores em concentraes diferentes da estudada. Os valores de repetitividade so utilizados para gerar as cartas de controle de mdia para exatido e de amplitude para duplicatas, clculos de incertezas de ensaios, etc. Se os testes so feitos com amostra de teor conhecidos os resultados podem ser utilizados tambm para obteno de %Recuperao (%Recovery) indicativo da eficincia de extraes, digestes, etc, quando o mtodo as usa. Pode-se tambm calcular bias ou Diferena entre o resultado obtido e o real: com base no teste t se pode definir se o mtodo tem resultados sistematicamente diferentes (biased) ou no (un biased). Freqncia: Os testes so feitos somente ao pr-se o mtodo em uso ou quando o mtodo sofre modificaes. Rotineiramente a Repetitividade acompanhada atravs de duplicatas geralmente com freqncia de a cada 10 ou 20 amostras a at 1 por ms que so lanadas em cartas de controle de amplitude. Exatido (Accuracy): Indica o quanto os resultados obtidos so prximos dos reais. Geralmente as amostras so analisadas 1 a 3 vezes e o teor obtido comparado com o real. Os testes de exatido internos na maioria das vezes so com Spikes, Materiais de Referncia ou Formulaes de Laboratrio e e os externos com amostras de interlaboratorais (onde o analista no conhece o teor da amostra). Freqncia: Os testes internos normalmente so feitos com freqncia de no mnimo a cada 10 ou 20 amostras analisadas a no mximo um por ms e os resultados lanados em cartas de controle de mdia. A freqncia dos testes internos deve ser definida pela gerncia do laboratrio dentro de algo vivel tcnica e economicamente. Os testes interlaboratoriais normalmente so feitos 1 a 2 vezes por ano e trazem a vantagem de haver comparao com outros laboratrios e com padres de origens diferentes, o que permite que se detecte problemas no perceptveis dentro do laboratrio. Limites de Deteco e Quantificao (Detection and Quantification Limits): O Limite de Deteco indica o teor a partir do qual o analito pode ser detectado com 99% de confiana e o de quantificao o teor a partir do qual os teores obtidos tm preciso aceitvel. Aplica-se somente em mtodos para impurezas ou componentes menores. requerido somente para componentes menores ou impurezas. Freqncia: Os testes geralmente so feitos somente ao pr-se o mtodo em uso ou quando ocorre alguma mudana que possa interferir na deteco, como instrumental diferente ou mudanas no rudo instrumental. Reprodutibilidade (Reproducibility): A reprodutibilidade a maior diferena, no nvel de confiana de 95%, que pode ocorrer em resultados obtidos em condies de reprodutibilidade, ou seja, analistas diferentes, instrumentos diferentes ou at laboratrios diferentes. A reprodutibilidade uma combinao do desvio padro dos participantes com o desvio padro entre os participantes. O ideal que vrios laboratrios, com supervises diferentes, analisem a mesma amostra 5 a 10 vezes em Interlaboratoriais. Desta forma pode-se obter a Reprodutibilidade e alm disto avaliar cada participante quando a preciso e quanto a exatido. A Reprodutibilidade pode ser feita tambm internamente, em Intralaboratoriais (cada analista analisando a mesma amostra 5 a 10 vezes) onde alm de um valor de Reprodutibilidade (chamada intermediria), avaliar cada analista quanto a preciso e exatido. Estes dados podem ter valor como Qualificao dos Analistas (requerido pela ISO 17.025) e cada novo analista pode fazer a anlise da mesma amostra sendo assim qualificado para anlises rotineiras. Observar que esta Qualificao pode ser invivel de ser feitas para todos os mtodos do laboratrio e qualificaes apenas em poucos mtodos que representem a rotina feita (exemplo, um espectrofotomtrico, um cromatogrfico, etc.). Freqncia: Os testes geralmente so feitos no incio de uso do mtodo (no antes de implant-lo, quando os analistas ainda no tm experincia). A Qualificao deve ser feito com cada novo analista, que analisa a mesma amostra (ou uma amostra preparada com a mesma concentrao). Linearidade (Linearity), Faixa de Trabalho (Work Range) e Sensibilidade (Sensibility): A linearidade e a sensibilidade aplicam-se somente a mtodos instrumentais com curvas analticas. A linearidade indica o valor mximo que o instrumento pode apresentar uma resposta proporcional ao teor do analito e a sensibilidade a relao entre resposta (absorbncia, rea, etc.) e concentrao (inclinao da curva analtica). A faixa de trabalho geralmente limitada pelo limite de deteco e a linearidade em mtodos instrumentais. Freqncia: Os testes so feitos somente ao pr-se o mtodo em uso ou quando o mtodo sofre modificaes, exceto para sensibilidade, que, para mtodos onde a sensibilidade do aparelho pode modificar muito (exemplo: GC/MS) o valor deve ser calculado semanalmente ou mensalmente e comparado com o valor inicial (geralmente se considera uma perda de cerca de 20% de sensibilidade pode indicar ocorrncia de problemas).

b)

c)

d)

e)

f)

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

3/24

g)

Especificidade/Seletividade: Indica se o teor obtido de um analito pode ser afetado por interferentes ou pela matriz. verificado pela comparao de ensaios feitos pelo menos 5 vezes na condio padro e na condio problema (com o interferente ou na matriz interferente). Geralmente dispensado para mtodos oficiais, onde estes estudos j foram feitos. Freqncia: Os testes so feitos somente ao pr-se o mtodo em uso. Robustez: Indica se o teor obtido de um analito pode ser afetado quando o mtodo no foi implementado perfeitamente ou quando o ensaio feito em condies precrias, ou seja, mtodo executado por um analista destreinado, uso de equipamentos inadequados (pipetas, etc.), equipamentos mal regulados (placa de aquecimento, termmetro, etc.), etc. Um mtodo robusto um mtodo que mesmo feito em condies precrias gera bons resultados. verificado pela comparao de ensaios feitos pelo menos 5 vezes na condio padro e na condio problema da mesma amostra. Geralmente dispensado para mtodos oficiais, embora um mtodo oficial possa no ser necessariamente robusto. Freqncia: Os testes so feitos somente ao pr-se o mtodo em uso. Preparo de Spikes (Adio de Padro)

h)

1.4

Para testes de Repetitividade, Limites de Deteco, Exatido, Reprodutibilidade, etc. as adies de padro e o preparo de formulaes com freqncia so necessrios. Para componentes menores (exemplo, impurezas em produtos ou impurezas em guas e solos) o spike deve ser feito de maneira que o volume adicionado seja desprezvel (geralmente menor que 1% do volume de amostra) de modo a simplificar os clculos em uma rotina diria. Os padres utilizados devem ser preferencialmente com teores certificados e com suas respectivas incertezas, embora isto nem sempre seja possvel em todas as ocasies (exemplo, para impurezas em produtos industriais). Seguem exemplos bsicos destes procedimentos. Exemplo de Spike de 100mg/L de Cloretos em gua: Partindo-se de uma soluo a 10g/100mL (100000mg/L) de Cloretos (Preparada a partir de Cloreto de Sdio), a 100mL de gua se adicionam 100L desta soluo. Exemplo de Spike de 10 g/L de Benzeno em gua: Partindo-se de uma soluo a 1000g/mL de Benzeno, 1mL desta soluo so diludos para 100mL em balo volumtrico gerando uma soluo a 10g/mL (10000g/L); a 100mL de gua ultra-pura se adicionam 100L desta soluo. Exemplo de Adio de Padro em produto formulado em massa por massa: a 50g de produto a 5,10% (mdia de anlise em duplicata) se adiciona 2,5g de produto a 99% (Adio de 4,95%). Teor Total = ((50g X 5,10%) + (2,5g X 99%)) / 52,5g = 9,571%. Teor adicionado = 4,95%. Resultado do ensaio corrigido (Recuperado) = (Teor obtido X 52,5 / 50 - 5,10). Exemplo de Adio de Padro em produto formulado em massa por volume: Em uma proveta de 1,0L com 0,500L de produto a 52,2g/L (mdia de anlise em duplicata) se adiciona 25g de produto a 99% (Adio de 49,5g/L) e mede-se o volume final igual a 0,520L. Teor Total = ((0,5LX52,2g/L) + (25gX99/100))/0,520L = 97,79g/L. Teor adicionado = 49,5g/L. Resultado do ensaio corrigido (Recuperado) = (Teor obtido X 0,520L/0,500L - 52,2). Exemplo de preparo de formulao em massa a 5% tendo-se formulao placebo (sem o princpio ativo): A 95,00g de formulao placebo se adiciona 5,00g de produto a 99%. Teor final: 5g X 0,99 X 100% / 100g = 4,95%. Exemplo de preparo de formulao em massa por volume a 15g/L tendo-se formulao placebo (sem o princpio ativo): Em um balo volumtrico de 500mL adiciona-se 7,500g de Produto a 99% e completa-se a volume com formulao placebo. Teor final: 7,500g X 0,99 / 0,500L = 14,85g/L. Exemplo de amostra de gua Sinttica (de Standard Methods): 241mg/L de Cloretos, 108mg/L de Ca, 82mg/L de Mg, 3,1mg/L de K, 19,9mg/L de Na, 1,1mg/L de Nitratos (como N), 0,25mg/L de Nitritos (como N), 259mg/L de Sulfatos e 42,5mg/L de Alcalinidade (atravs de NaHCO3), todos em gua destilada. 1.5 Repetitividade r (repeatability), % Recuperao e bias (Diferena)

Aplica-se a todos os tipos de amostras. A condio de Repetitividade que utilize um mesmo analista e o mesmo instrumental em um perodo relativamente curto (geralmente amostras feitas em srie). Para que serve: a) Como saber se uma duplicata gerou valores aceitveis? b) Utilizado para gerar os limites iniciais para cartas de mdias (spikes, etc.) e de amplitudes (para duplicatas). c) Clculo de incerteza do ensaio. d) A %Recuperao e bias (diferena) so teis em mtodos com extraes, digestes, etc. que tendem a gerar baixos resultados. Se com base no teste t o valor de bias (diferena mdia) negligencivel o mtodo considerado No Diferenciado (unbiased) e do contrrio um mtodo Diferenciado (biased).

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

4/24

Recomendao de execuo para anlises de impurezas ou componentes menores Ao menos 5 replicatas (recomendado 10) em 03 faixas de concentrao (para mtodos instrumentais recomendamos 20%(baixa), 50%(mdia) e 100%(alta) da curva analtica). As amostras geralmente so preparadas atravs de Spikes. Recomendao de execuo para produtos puros ou componentes maiores Ao menos 5 replicatas (recomendado 7) em 01 faixa de concentrao tpica. A amostra de testes pode ser uma amostra tpica, uma amostra que passou por interlaboratorial ou de preferncia um material de referncia. Clculos Para cada srie de replicatas deve-se eliminar valores extremos (muito altos ou muito baixos) pelo teste t ou pelo teste de Grubbs, para a seguir partir para os demais clculos. Para mais detalhes veja o anexo. Mdia (M) Mdia aritmtica em cada faixa de concentrao Desvio padro (DP) Desvio padro em cada faixa de concentrao Limite de Repetitividade (r) = k X DP O DP pode ser multiplicado por um fator de abrangncia (k) de modo a representar um limite de confiana de 95%. O valor de k pode ser: a) 2,772 (1,96 X raiz(2) que representa a distribuio normal a 95% para duplicatas) b) (t a 95%, n-1) X Raiz (n + n/1), que representa 95% de confiana pela distribuio t (poucos amostras) c) 3,267 (Limite para cartas de controle de duplicatas) %Recuperao %Recuperao = Mdia X 100 / Valor Real. Somente pode ser calculado em Spikes ou quando se tem o teor real da amostra (material de referncia). Curva linearizada A repetitividade pode ser apresentada na forma de equao: Desvio Padro = Concentrao X b + a quando se trabalha em 3 faixas de concentrao. Para mais detalhes ver o captulo sobre linearizao.

1.6

Repetitividade em Microbiologia (Contagens)

Em contagens de bactrias, via membrana filtrante ou via Pour Plate, para se obter uma distribuio prxima da normal necessrio que se trabalhe com os Logartimos em base 10 das contagens.
Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados 03/09/06 5/24

O trabalho normalmente feito somente com duplicatas, onde a repetitividade do ensaio acompanhada. Testes Iniciais: ao menos 7 a 15 duplicatas de amostra rotineiras so feitas, e com base nestes dados se obtm a mdia das diferenas absolutas dos logartimos das contagens. Os Outliers so eliminados pelo teste de Dixon.Este desvio mdio tomado como base para a carta de controle de amplitude, onde o limite de controle o desvio mdio vezes 3,267. Teste rotineiros: A cada 10 ou 20 amostras faz-se uma duplicata e a diferena absoluta dos Logs lanada em carta de controle de amplitude.

1.7

Limite de Deteco do Mtodo e Limite de Quantificao

Aplica-se somente a mtodos onde o analito impureza ou traos e que eventualmente no detectado. O Limite de Deteco do Mtodo ou Limite de Deteco, a concentrao do analito que pode ser detectada com cerca de 99% de confiana. Estatisticamente o LDM definido como o desvio padro prximo ao LDM vezes o valor de t de students unilateral a 99% de confiana. O valor de t depende no nmero de replicatas. Para 7 este valor corresponde a aproximadamente 3 (o valor de t varia de 3,4 a 2,8 entre 6 e 10 replicatas). O valor 3 arredondado considerado em grande parte das literaturas e ser considerado com este valor arredondado por uma questo de sistemtica, considerando-se que o LDM no passa de uma estimativa estatisticamente baseada. Independente da forma de execuo as frmulas bsicas so: LDM = Mdia do Branco + 3 Desvios Padro LQ = Mdia do Branco + 10 Desvios Padro O LQ tambm pode ser abordado como LQ prtico onde se mede o desvio padro de amostras em vrias faixas de concentrao bastante baixas e se define a partir de qual o desvio padro aceitvel, que chamado de LQ. No entraremos em detalhes destes procedimentos. Para que serve o LDM e o LQ? a) A partir de que concentrao podemos ter certeza que um analito est presente com confiana?. A partir do LDM. b) A partir de que valor os resultados podem ser considerados relativamente precisos?. A partir do LQ. Na faixa entre o LDM e o LQ os nmeros so considerados estimativas ou semi-quantitativos. Alguns laboratrios optam por expressar como segue: a) Valores abaixo do LDM como <Valor do LDM. b) Valores abaixo do LDM como ND, expressando o valor do LDM no mesmo relatrio. c) Valores acima do LDM como resultados normais, independente do LQ; d) Valores entre o LDM e o LQ como Resultado J, onde o J indica a justificao de ser estimativa; e) Valores entre o LDM e o LQ como Traos e somente os valores a partir do LQ como nmeros;

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

6/24

O LQ indica um valor a partir do qual podem-se fazer comparaes com outros resultados. Exemplo: Um resultado obtido por um laboratrio entre o LDM e o LQ pode apresentar erros entre 50% e 100%. Se o mesmo no est devidamente assinalado poder ser comparado com resultados obtidos por outro laboratrio para a mesma amostra e a comparao levar a concluses nada agradveis. Outros nomes e siglas (siglas em ingls entre parntesis): a) LDM (MDL): Limite de Deteco do Mtodo, tambm chamado de LD (LoD). b) LDI (IDL): Limite de Deteco Instrumental. Equivale ao LDM na maioria dos casos, exceto quando o procedimento analtico complexo e leva a perdas. c) LQ (QL): Limite de Quantificao. d) LR (RL): Limite de resultados, o mesmo que LQ. Existem 04 tcnicas bsicas para se obter LDM e LQ: a) Replicatas de prova em branco. b) Replicatas de Spikes (requer que se estime o LDM previamente). c) Regresso Linear (requer que se estime o LDM previamente). d) Relao Sinal/Rudo (em cromatografia). Quando se trabalha com Replicatas de Branco e com Spikes os mtodos da EPA podem requerer confirmao atravs de Spikes em uma faixa pouco acima do LDM. Para se trabalhar com Spikes e com Regresso Linear A primeira etapa se obter uma estimativa, mesmo que grosseira, do Limite de Deteco. LDM algo sempre com certa complexidade para se obter valores dentro da realidade. Por mais complexos os clculos e perfeita a estatstica pode-se chegar a valores absurdos se no se tem uma estimativa inicial correta. Por fim, os LDMs no passam de estimativas com fundamento estatstico. Assim devem ser expressos apenas com um ou dois algarismo significativos, pois esto em uma faixa de concentrao onde a incerteza pode chegar a 100%. Ter uma estimativa com base prtica essencial, ou pode-se chegar a valores absurdos e no se ter como avaliar a validade. Exemplos: a) b) c) A experincia do Analista pode fornecer valores razoveis do LDM. Mtodos espectrofotomtricos: Calcular o resultado com absorbncia de 0,001 (Mtodos muito simples) a 0,005 (mtodos mais complexos, com preparos, etc.) . Exemplo: um mtodo resultado (em mg/L) calculado como Absorbncia X 23,5 tem um LDM estimado em 0,002 X 23,5 = 0,05mg/L. Mtodos cromatogrficos: Prximo ao pico de interesse procurar por rudos ou picos bem pequenos, calcular a rea mdia deles e calcular como se fosse o composto de interesse. Se j h um histrico de resultados baixos, prximos ao no detectvel considere esta estimativa. Outra possibilidade: reduzir o Slope (thereshold) e a rea mnima obtendo assim o rudo da linha base em uma injeo de amostra, podendo assim calcular o rudo mdio (mdia das reas dos picos detectados) prximo ao pico de interesse. Este rudo vezes 3 uma tima estimativa do LDM. A rea mnima dever ser estimada para ser um valor um pouco abaixo disto. Mtodos titulomtricos: Normalmente o volume de uma gota (0,05mL) prximo do limite de deteco quando a viragem bem perceptvel ou quando a curva de titulao bastante vertical durante a viragem. Para viragens ruins um volume de cerca de 0,2 mL pode ser mais adequado. Calcular uma amostra com este volume estimado. Exemplo: Em cloreto titulomtrico (Mohr) usando AgNO3 0,014M e 50mL de amostra, o clculo (em mg/L) feito como Volume X 0,014 X 35450 / 50, e o LDM pode ser estimado em 0,20 X 0,014 X 35450 / 50 = 2 mg/L. Mtodos gravimtricos: Considere o clculo com base na incerteza da balana. Para balanas de 4 decimais a incerteza geralmente na ordem de 0,0004g. Para balanas de 5 decimais a incerteza geralmente na ordem de 0,00005g. Para balanas de 2 decimais a incerteza geralmente na ordem de 0,01g. Exemplo: Em Slidos Suspensos, em mg/L, 50mL de amostra so filtrados e os slidos pesados em balana de 4 decimais; o resultado calculado como g Slidos X 1000000 / 50 e o LDM pode ser estimado em 0,0004 X 1000000 / 50 = 8 mg/L.

d)

e)

LDM e LQ a partir de Replicatas de Prova em Branco Esta forma de execuo se aplica somente a mtodos onde a prova em branco sempre apresenta valores, como espectrofotometria, titulaes, gravimetria, etc. Normalmente no se aplica a mtodos cromatogrficos e outros, onde a prova em branco raramente apresenta resposta. A execuo simples e praticamente prova de falhas: cerca de 7 replicatas de prova em branco (preparadas como se fossem amostras). LDM = Mdia do Branco + 3 Desvios Padro LQ = Mdia do Branco + 10 Desvios Padro

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

7/24

A confirmao do LDM (EPA) pode ser requerida. LDM e LQ a partir de Replicatas de Spikes em baixa concentrao Quando o mtodo no apresenta resposta nas provas em branco (muito comum em cromatografia), para avaliar o desvio padro em valores baixos necessrio fazer adio de padro em uma prova em branco (tambm chamado de Spike de Branco). cerca de 7 Spikes entre 2 e 5 LDM estimado devem ser analisados. Geralmente adotamos 2LDMs como um valor adequado. Considerando-se que a prova em branco apresenta resultado zero: LDM = 3 Desvios Padro LQ = 10 Desvios Padro A confirmao do LDM (EPA) pode ser requerida. LDM e LQ a partir de regresso linear Para maior conhecimento consulte o item sobre clculos de regresso linear. A regresso linear uma ferramenta tima para determinar o Limite de Deteco. A curva linearizada com valores prximos do LDM fornece o valor de Intercepto, que equivale uma mdia de prova em branco e tambm um valor de RSD (Residues Standard Deviation) calculado com base nas diferenas entre valores reais e valores calculados de concentraes. O RSD equivale a um desvio padro das concentraes. Para a execuo padronizamos gerar uma curva analtica com trs concentraes (2LDM, 4LDM e 6LDM) em triplicatas ou em duplicatas. O eixo Y deve mostrar concentraes e o eixo X o sinal instrumental. LDM = Intercepto + 3 RSD LQ = Intercepto + 10 RSD Na figura que segue a linha violeta a curva linearizada e a linha azul a curva linearizada mais 3 RSD. Apresenta 3 replicatas em 0,1mg/L; 0,2mg/L e 0,3mg/L.

LDM via relao Sinal/Rudo para cromatografia (Limite de Deteco Instrumental) Para cromatografia, a mdia dos picos de rudo, na janela, ou prximo do pico de interesse, representam o desvio padro da linha base (que define o Limite de Deteco Instrumental). Forma de Execuo: a) Injetando uma prova em branco obter as reas de 7 a 10 picos de rudo na regio do pico de interesse. Se for necessrio, reduzir a rea rejeitada previamente. b) Calcular as respectivas concentraes eqivalentes aos rudos com base na ltima calibrao feita. c) LDM ser calculado, com base no LDI, como 3 * Mdia e o LQ ser calculado como 10 * Mdia. Confirmao do LDM (geralmente requerido pela EPA) Se o LDM foi definido por provas em branco ou por Spikes a confirmao pode ser requerida.
Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados 03/09/06 8/24

Deve-se fazer Spikes em uma concentrao prxima do LDM e um pouco diferentes da do Spike inicial (quando feito por Spikes). Geralmente se adota 4 LDMs. Aps isto o clculo como segue: Comparar as varincias da determinao inicial e esta: 2 2 a) Obter F calculado = (Desvio padro maior) / (Desvio padro menor) . c) Obter F Tabelado a 95% com graus de liberdade do maior e graus de liberdade do menor. Considerando-se 7 replicatas os graus de liberdade so 6 e o valor de F = 4,28. d) Se o valor de F calculado for maior que o de F tabelado os testes devem ser refeitos, pois tm varincias diferentes. e) Se o valor de F calculado for menor que o de F tabelado deve-se calcular o desvio padro combinado (pooled) 2 2 como segue, onde os graus de liberdade so 6: DP Comb. = (6(DP1) +6(DP2) )/(6+6). f) Recalcular o LDM e o LQ com base no DP Combinado (pooled)

1.8

Linearidade (Linearity), Faixa de Trabalho (Work Range) e Sensibilidade (Sensibility)

Estas trs propriedades podem ser obtidas atravs de uma curva analtica (concentrao e sinal). Para se obter um valor mximo de linearidade deve-se estender a curva para faixas de concentrao mais altas. Caso a concentrao no seja estendida o valor do maior ponto de calibrao deve ser considerado como a linearidade. Para mtodos no instrumentais o valor mximo da faixa de trabalho pode ser obtido atravs de outras consideraes que independem da curva analtica. Linearidade (Linearity) Se aplica somente a mtodos instrumentais. A forma mais simples de se definir a linearidade de um mtodo fazer uma curva analtica extentendo-a o tanto quanto possvel e plotar em um grfico. A regio onde iniciar-se a perda de linearidade por observao visual deve ser considerado como o limite superior. A Linearidade tambm pode ser definida com base em clculos de regresso linear, fazendo testes nos ltimos pontos da curva: a) O teste pode ser feito somente para mais de 3 pontos de uma curva analtica. b) Obtm-se a curva linearizada e a incerteza das concentraes (RSD), sem considerar o ponto seguinte (em teste). Por exemplo: lineariza de 1 a 3 pontos e compara com o ponto 4 ou lineariza de 1 a 4 e compara com o ponto 5. c) O valor de RSD comparado com o resduo do ponto seguinte, em teste, (Concentrao Concentrao calculada) atravs do teste t: o d) t = [Concentrao Concentrao calculada] do ltimo ponto / (RSD X Raiz((n+1)/n)... para testar o 5 . ponto n=4.
Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados 03/09/06 9/24

e) f)

O valor de t obtido comparado com o valor de t tabelado a 95% e 2 graus de liberdade ao se testar o 5 . ponto (2,92). Sendo o valor de t obtido maior que o valor de t tabelado considera-se que o ponto seguinte j foge da linearidade e uma linha vermelha traada no grfico antes do ponto em teste. Caso o grfico no apresente o trao vermelho a curva linear em toda sua extenso. O teste no utilizado para curvas com menos de 4 pontos.

Faixa de Trabalho (Work Range) A faixa inicial do mtodo normalmente limitada pelos limites de deteco e quantificao, enquanto que a faixa final normalmente limitada pela linearidade dos intrumentos. Quase sempre a faixa de trabalho pode ser extendida com diluies das amostras, quando aplicvel. Em mtodos no instrumentais a faixa de trabalho pode ser limitada pela capacidade dos instrumentos envolvidos, como buretas, balanas, etc. A faixa de trabalho normalmente citada na introduo dos mtodos analticos (Exemplo, Este mtodo abrange teores de Ferro entre 0,1mg/L e 3,0 mg/L). Sensibilidade (Sensibility) Somente para mtodos instrumentais. Refere-se relao de resposta de um instrumento dividida pela concentrao do analito. Quanto maior este valor mais sensvel o mtodo. Deve-se evitar confundir os termos limite de deteco e sensibilidade, pois um mtodo muito sensvel pode no ter um limite de deteco muito bom. Na prtica os termos no so relacionados diretamente. A sensibilidade, quando calculada periodicamente permite verificar se um equipamento est tento perda de resposta, normalmente indicativo de desgaste. Sensibilidade = Coeficiente angular da curva analtica (Sinal / Concentrao) Testes Rotineiros: Deve-se escolher uma freqncia diria/semanal/mensal e um valor percentual (exemplo: 10%) de tolerncia de perda de sensibilidade para indicar problemas no instrumento.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

10/24

1.9

Reprodutibilidade R (Reprodutibility, preciso interlaboratorial ou intralaboratorial)

Diferente da Repetitividade a Reprodutibilidade a preciso do ensaio em condies mais variadas. Idealmente obtida em um programa interlaboratorial (executado pelo mesmo mtodo em todos os laboratrios). Havendo impossibilidade disto pode ser obtida atravs de um intralaboratorial, onde analistas diversos faro os testes em dias diferentes e talvez at com instrumentos diferentes. A reprodutibilidade a maior diferena, no nvel de confiana de 95%, que pode ocorrer em resultados obtidos em condies de reprodutibilidade. A reprodutibilidade calculada pela combinao do desvio padro entre participantes com o desvio padro dos participantes. Estes dados so obtidos por anlise de varincias (ANOVA, fator nico). Para mais detalhes ver o item sobre ANOVA. Desvio Padro de R = Raiz (DP entre participantes + DP dos participantes ) R = Desvio Padro de R X k (k geralmente 2,772 para 95% de confiana)
2 2

Geralmente feito em uma nica faixa de concentrao, mas pode ser feito em vrias. Para interlaboratorial ao invs de analistas se usaro laboratrios com supervises independentes. Utilidade O objetivo da reprodutibilidade definir limites de aceitao de duplicatas feitas nas mesmas condies do teste de reprodutibilidade. Exemplo, quanto se aceita de diferena entre anlises feitas por analistas diferentes ou por laboratrios diferentes? Que influncia isto pode ter quando um cliente compara nossos resultados com limites ou especificaes?. Execuo Geralmente cada analista ou laboratrio faz entre 4 e 7 replicatas e se avalia a preciso e a exatido de cada participante aps eliminar-se resultados muito imprecisos ou muito inexatos e se faz o clculo de reprodutibilidade. Os testes podem ser feitos em uma ou mais faixas de concentrao. Clculos a) b) c) d) e) f) Obtm-se a mdia de cada participante, a mdia das mdias e o desvio padro destas mdias. Com base no teste de Grubbs eliminar dos clculos seguintes os participantes com valores de Grubbs para suas mdias (Mdia do participante Mdia dos participantes)/Desvio padro das mdias, maiores que o valor tabelado. Realizam-se os clculos descritos no item ANOVA e obter DP Entre participantes e DP dos participantes. 2 Calcula-se o desvio padro de Reprodutibilidade DP R = Raiz (DP Entre participantes + DP dos 2 participantes ). Calcula-se o valor de Reprodutibilidade R = DP R x 2,772 2 Calcula-se o valor de F de cada participante e compara-se com o valor de F tabelado. F = DP do participante / 2 DP Entre participantes . O valor de F tabelado deve ser procurado na tabela de 95% (alfa=0,05) onde graus de liberdade do numerador = N replicatas 1 e graus de liberdade do denominador = N participantes 1. Se o valor de F for maior que o tabelado a preciso do participante considerada ruim. Calcula-se o valor de t de cada participante e compara-se com o valor de t tabelado (a 95% com graus de liberdade = N de participantes 1). t = (Mdia do participante Mdia das mdias) / (DP dos Participantes X Raiz (N Participantes)). Se o valor de t for maior que o tabelado o participante tem exatido considerada ruim. Calcula-se o valor de Z-Score de cada participante: Z = (Mdia do Participante Mdia das mdias) / DP dos Participantes. Os valores absolutos de Z maiores que 2 indicam advertncia, enquanto valores absolutos de Z maiores que 3 indicam exatido ruim do participante.

g) h)

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

11/24

Anlise ANOVA com fator nico e dados agrupados em linhas Em linhas: Replicatas Em colunas: Participantes. Para intralaboratoriais, Analistas. Para interlaboratoriais Laboratrios. Para Teste de Homogeneidade Data. MQ dentro: a mdia das varincias (soma das varincias dos participantes / nmero de participantes) DP dentro: o desvio padro mdio dos participantes (raiz de MQ dentro) MQ entre: a varincias das mdias dos participantes. DP entre: o desvio padro entre participantes = Raiz((MQ entre MQ dentro)/nmero de replicatas) Para saber se os participantes tm varincia semelhante (ou se as execues so homogneas) calcula-se F = MQ entre / MQ dentre que deve ser menor ou igual ao valor de F tabelado (F 95%, GL entre, GL dentre), onde GL entre = N participantes 1 e GL entre = N participantes X (N replicatas 1). Com fazer ANOVA em Excel As ferramentas de anlises de dados devero estar instaladas. No menu Ferramentas escolha Anlise de Dados e ANOVA: Fator nico. Selecione os dados (somente os nmeros) com replicatas em colunas e um participante por linha. Escolha Dados agrupados por Linhas Alfa: 0,05 OK. Sero dados os valores de MQ entre e MQ dentre. Com base nestes valores calcule DP entre e DP dentre, conforme mostrado acima. 1.10 Exatido (Accuracy) A exatido visa verificar o quanto os resultados obtidos so prximos dos reais ao se analisar amostras com valores conhecidos. Cada amostra geralmente analisada 1 a 3 vezes e a mdia obtida avaliada. Geralmente no h um teste inicial de exatido, mas sim um acompanhamento rotineiro de 2 formas principais:

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

12/24

a)

b)

Controle da Qualidade Interno atravs da anlise rotineira de Spikes, Amostras/Formulaes feitas em laboratrios ou de Materiais de Referncia, geralmente a cada 20 amostras rotineiramente analisadas. Para indstrias, em freqncia diria/semanal/mensal de modo equivalente a aproximadamente a cada 20 amostras. Participao em Interlaboratoriais, geralmente 1 a 2 vezes por ano para cada ensaio;

A exatido avaliada com base no Z-Score (ndice-Z): Onde x z = (x xD)/ Resultado mdio (ou nico) obtido no teste Valor designado Desvio padro alvo

xD

A interpretao do ndice z baseada na propriedade do desvio padro normal. Cerca de 5% dos resultados devero situar-se fora do limite de 2, e apenas cerca de 0,3% dos resultados devero situar-se fora do limite de 3. A classificao que segue aplicada: |z| 2 2< |z| <3 |z| 3 Resultado satisfatrio Resultado questionvel (Advertncia) Resultado no satisfatrio

Interlaboratoriais: Os resultados de interlaboratoriais normalmente so avaliados com base nos valores de Z-Score, embora outras avaliaes como Elipse e Erros normalizados possam complementar. O valor designado pode ser a mdia de todos os participantes (sem outliers), a mediana, o valor de formulao ou outro valor confivel. O desvio padro alvo pode ser o desvio padro dos participantes (sem outliers), a Amplitude Interquartil Normalizada, o valor de Holwitz ou outro valor confivel. Estes resultados podem ser lanados neste software na parte de exatido, como forma de ter-se um acompanhamento sistemtico.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

13/24

1.11 Comparativo de Mtodos diferentes com amostras diferentes Estes testes geralmente quando se quer comparar um mtodo em uso com um novo mtodo ou um aparelho antigo com um novo aparelho. Estes testes podem ser executados na rotina diria. Basta que cada amostra recebida para anlise seja feita simultaneamente pelos 02 mtodos que se quer comparar no decorrer de alguns dias ou mais. Recomendado pelo menos 07 vezes. O exemplo que segue foi feito com amostras com teores semelhantes. Uma vez que o teste baseado em diferenas, amostras com teores variados tambm servem para este teste. Amostra AA BB CC DD EE Teor de Fosfato em gua pelo Teor de Fosfato em gua pelo Diferena mtodo A Mtodo B 0,97 0,92 0,05 0,98 0,94 0,04 0,96 0,90 0,06 1,02 0,96 0,06 0,97 0,90 0,07

Mdia das diferenas: 0,056 Desvio padro (n-1) das diferenas: 0,011 t(5 replicatas): 2,776 Variao da diferena a 95%: 2,776 X 0,011 / 5 = mais ou menos 0,014 ppm A diferena entre os resultados de 0,056 mais ou menos 0,014ppm, ou seja, a diferena pode variar de 0,042 a 0,07, que no inclui o zero, logo os mtodos so diferentes (levam a resultados sistematicamente diferentes). Se a diferena inclusse o valor zero (ou seja variasse de um valor negativo a um valor positivo) os mtodos poderiam ser considerados equivalentes. 1.12 Especificidade/Seletividade ou Identificao Identificao Identificao aplica-se somente a mtodos onde haja alguma dvida se o composto analisado realmente o que o mtodo promete analisar. Em cromatografia podem ocorrer coeluies, em mtodos espectrofotomtricos outros compostos podem absorver radiao no comprimento de onda utilizado, etc. A necessidade do teste mais comum em frmacos, onde a certeza de que o composto presente realmente o que o mtodo detecta tem importncia crtica. A identificao pode ser feita por mtodos como infra-vermelho, espectrometria de massas, etc. O registro consiste nos dados deste trabalho de pesquisa. Especificidade/Seletividade Os testes de Seletividade/Especificidade Permitem testar interferncias, ou seja, avaliar se um mtodo detecta somente o analito desejado ou se pode sofrer interferncias da matriz ou de outras impurezas. Basicamente as anlises so feitas em duas sries: a) Na condio padro (matriz limpa e sem interferentes). b) Na condio problema (matriz problema ou presena do interferente). As duas sries so comparadas quanto a preciso e exatido definindo-se se h real interferncia. Diversos mtodos oficiais (Exemplo Standard Methods da APHA e ASTM) j sofreram este tipo de teste e vm com indicao de interferentes e a partir de que concentrao interferem, dispensando testes de Especificidade/Seletividade. O tratamento estatstico utilizado a Comparao de duas mdias. O teste F verifica se as varincias dos 2 testes so compatveis. Um comparativo pelo Teste t (considerando a mdia na condio padro como referncia) indica se os resultados so compatveis nas duas condies. A forma de fazer o teste t depende das varincias serem compatveis ou no. O ideal que se faa em um nvel de concentrao relativamente baixa da analito de modo que as interferncias e outros problemas sejam mais facilmente detectveis. Execuo 5 a 10 Replicatas de Spikes em condio Padro (exemplo, gua destilada) 5 a 10 Replicatas de Spikes em condio Problema (exemplos, gua bruta ou gua contendo um possvel interferente).
Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados 03/09/06 14/24

Clculos Considerando Pad. = Condio Padro e Prob. = Condio Problema e que foram feitas 7 replicatas de cada teste. Anlise de varincias F = Varincia Prob./Varincia Pad. Comparar com F Tabelado a 95% (0,05) com 6 graus de liberdade do numerador e 6 graus de liberdade do denominador. Se o valor de F calculado for maior que o de F Tabelado as varincias so compatveis. Se as varincias so compatveis (caso mais comum) Calcula-se a mdia e o desvio padro de cada teste (Padro e Problema). 2 2 Calcula-se o Desvio Padro combinado (Pooled): (6 X DP Prob + 6 X DP Pad ) / (6 + 6). Calcula-se o valor de t entre os testes: t = (Mdia Pad. Mdia Prob.) / (DP Comb. X Raiz(1/7+1/7)). Se o valor de t for negativo inverter o sinal. Obtm-se o valor de t tabelado (t a 95%, com 6 graus de liberdade). Se o valor de t calculado for maior que o de t tabelado o mtodo no especfico/seletivo na condio problema (interferncias). Se as varincias so incompatveis Quando as varincias diferem o clculo de t deve levar em conta os graus de liberdade efetivos. Calcula-se a mdia e o desvio padro de cada teste (Padro e Problema). Acompanhamento Rotineiro de Especificidade/Seletividade: Se h suspeita de que as amostras possam ter interferentes deve-se ter uma freqncia de anlise de amostras com Spikes (Spikes de Amostras) geralmente a cada 20 amostras e estas podem ser acompanhadas em cartas de controle de mdia da mesma forma que em exatido.

1.13 Robustez A robustez procura avaliar se um mtodo pode fornecer bons resultados mesmo quando no implementado por completo. Implementar por completo significa analistas treinados aparelhos adequados e funcionando perfeitamente, etc. Pode-se imaginar diversas situaes possveis e testar contra uma situao padro (analista treinado e experiente, aparelhos funcionando perfeitamente, etc.). Exemplos de situao problema: Analista realizando o ensaio pela primeira vez, Placa de aquecimento com 50C abaixo do esperado, placa de aquecimento inadequada, deixar de adicionar um reagente que elimina um interferente, amostra medida com pipeta graduada ao invs de volumtrica, etc. O tratamento estatstico o mesmo utilizado em seletividade/especificidade.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

15/24

Um mtodo de desenvolvimento interno ou de literatura mais sujeito a falta de robustez (no necessariamente) que um mtodo oficial largamente utilizado e testado. No h um acompanhamento rotineiro de robustez, mas apenas testes feitos ao iniciar-se o uso do mtodo ou quando se suspeita de problemas. 1.14 Linearizaes de Curvas Analticas e suas respectivas incertezas Informaes bsicas No software LABWIN, nas telas onde isto se aplica, so feitas automaticamente medida que os valores so digitados. O uso de zero forado opcional. Quando no se usa zero forado a linearizao apresentar 02 incertezas (do coeficiente a e do coeficiente b), enquanto que forando-se o zero se ter apenas a incerteza do coeficiente b (inclinao). Desta forma recomendado o uso de zero forado sempre que for vivel para ter-se uma menor incerteza no mtodo analtico ao final. A linearizao, atravs das tcnicas de mnimos quadrados, visa obter uma equao de primeiro grau (y = bx + a ou Concentrao = Medida * b + a) que melhor defina as sries de pontos de medida e de concentrao. O coeficiente b chamado de inclinao e o coeficiente a chamado de intercepto (do eixo das concentraes). Na qumica analtica o mais comum que as curvas interceptem o zero, ou seja o coeficiente a seja zero. Mesmo que em grande parte das vezes o valor de a calculado no seja zero, o intervalo de confiana de a inclui o zero, sugerindo que trabalhar com equaes de linearizao com zero forado seja mais vantajoso. A vantagem do uso de uma equao do tipo y = bx que tem-se apenas a incerteza do coeficiente b, o que geralmente resulta em menor incerteza total para o ensaio. O clculo do coeficiente a e de seu intervalo de confiana, e a demonstrao das incertezas dos clculos com e sem o forar de zero certamente mostra que a maior parte das equaes em qumica analtica devem ser usadas com zero forado. No software LABWIN Incertezas fazer esta comparao muito fcil, bastando clicar na opo Forar Zero. As situaes em que necessrio o uso do coeficiente a (intercepto do eixo das concentraes) normalmente indicam anormalidades nos mtodos. Valores de a positivos normalmente indicam contaminaes do processo (contaminaes de reagentes, rudo de fundo anormal, etc.) e valores de a negativos normalmente indicam interferentes por reaes com o analito (consumo do analito por reaes paralelas, adsoro de compostos em colunas cromatogrficas, etc). Os ensaios com curvas que usam o intercepto (coeficiente a) apresentam um componente a mais de incerteza que a incerteza do coeficiente a. O Coeficiente de correlao (r) indica o quanto as sries de x e y esto relacionadas. Valores de r prximos de 1 indicam boa curva de calibrao analtica. Normalmente para mtodos em nveis de ppm ou porcentagem os valores de r so superiores a 0,99. Em mtodos para nveis de ppb ou ppt os valores de r costumam ser acima de 0,98. A observao das curvas analticas e experincia prtica podem definir valores mnimos de r adequados a cada mtodo analtico. Ter um valor mnimo de r como referncia pode servir como base para se considerar uma calibrao como invlida ou para eliminar-se algum ponto que fuja muito da reta linearizada. Incertezas da Linearizao Incerteza da concentrao (y): Uma estimativa da incerteza associada aos valores de concentrao (y) calculados com base na equao definida feita com base na soma dos quadrados das diferenas entre cada valor de y calculado 2 e y real ((ycalc.-yreal) ). O valor de incerteza de y equivalente a um desvio padro (n-1) nos resultados. O intervalo de confiana de y (concentrao) pode ser calculado com o valor de t(n-2). Intervalo de confiana da concentrao = Concentrao + t(n-2) * (incerteza de y), onde t o valor de t(n-2) na tabela bilateral. Obs.: Para curvas com zero forado usa-se t(n-1). Incerteza da inclinao (b): Uma estimativa da incerteza associada ao valor do coeficiente b (inclinao) calculado 2 feita com base na soma dos quadrados das diferenas entre cada valor de y calculado e y real ((ycalc.-yreal) ) e na soma dos valores de x. O valor de incerteza de b equivalente a um desvio padro (n-1) no valor de b. O intervalo de confiana de y (concentrao) pode ser calculado com o valor de t(n-2). Intervalo de confiana da inclinao = Concentrao + t(n-2) * (incerteza de b), onde t o valor de t(n-2) na tabela bilateral. Incerteza do intercepto (a) : A incerteza do valor de a (intercepto) tambm til para se definir se vale a pena manter seu valor ou fazer a linearizao com zero forado. A incerteza de a tambm eqivale a um desvio padro no valor de a. Para saber se o intervalo de confiana de a inclui o zero utiliza-se o valor de t para o nmero de pontos de calibrao, ou seja, o intervalo de confiana de a = a + t (n-2)*(Incerteza de a), onde t o valor de t(n-2) na tabela bilateral. Se o intervalo de confiana de a inclui o zero, na maioria das vezes a equao deveria ser recalculada com zero forado. 1.15 Equaes de Linearizao sem forar o zero

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

16/24

RSD (Residue Standard Deviation) ou Incerteza das concentraes calculadas = raiz ((ycalc.-yreal) / (n-2)) Incerteza de b (Coef. angular) = RSD/raiz((x x mdio)) Incerteza de a (intercepto) = RSD * raiz ((1/(n-2))+((x mdio) /(x x mdio))) 1.16 Equaes de linearizao forando o zero b = xy /x
2 2 2

RSD (Residue Standard Deviation) ou Incerteza das concentraes calculadas = raiz ((ycalc.-yreal) / (n-1)) Incerteza de b (coeficiente angular) = RSD/raiz(x ) Coeficiente de Correlao r = n (xy) (xy) / raiz((ny - yy) * (nx - xx))
2 2 2

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

17/24

1.17 Tabela de t de Students Unilateral a 99% (uso em LD e LQ) Nmero de replicatas 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 61 t de Students Unilateral (para 99%) 31,821 6,965 4,541 3,747 3,365 3.143 2.998 2.896 2.821 2.764 2.718 2.602 2.390

1.18 Tabela de t de Students bilateral a 95% (uso para eliminao de Outliers, clculos de limites de confiana, etc.) t de Students Bilateral (para 95%) 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,201 2,093 2,021

Nmero de replicatas 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 20 41

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

18/24

1.19 Eliminao de Outliers (valores extremos) pelo teste de Grubbs O objetivo do teste eliminar outliers (valores extremos), ou seja, nmeros que no fazem parte de uma srie de resultados. n Valor Crtico a 95% de confiana 3 1,155 4 1,481 5 1,715 6 1,887 7 2,020 8 2,126 9 2,215 10 2,290 15 2,549 20 2,709 30 2,908 40 3,036 Se um resultado suspeito calcule o valor de Gc n M DP R Gc Gt Teste nmero de resultados Mdia dos resultados Desvio padro dos resultados Resultado suspeito G calculado = Absoluto((R M) / DP) G tabelado Se Gc>Gt ento o valor um outlier

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

19/24

1.20 Exerccio Clculo de LDM A seguir uma srie de resultados obtidos pelo Spike de 0,10ppm de Nitrobenzeno em Benzeno para a anlise cromatogrfica de Nitrobenzeno em Benzeno. Elimine os outliers pelo teste de Grubbs e calcule o LDM. Com base nas % recuperaes e no valor de Conc./LDM conclua se o teste foi vlido. Resultados obtidos: 0,095; 0,102; 0,098; 0,140; 0,097; 0,096; 0,110; 0,103.

1.21 Exerccio Clculo de Repetitividade e %Recuperao Em uma anlise de uma mistura de 2,6-DNCB e 2,4-DNCB um analista analisou uma amostra 08 vezes por cromatografia obtendo os teores que seguem. Caso haja algum valor suspeito elimine-o pelo teste de Grubbs. Calcule o desvio padro da repetitividade, a repetitividade e a %Recuperao da amostra para o 2,6-DNCB e para o 2,4-DNCB. 2,6-DNCB: 19,2; 18,9; 19,7; 19,3; 20,9; 19,3; 19,4; 19,3 2,4-DNCB: 79,3; 79,5; 79,4; 78,9; 76,5; 79,5; 79,4; 79,1

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

20/24

Demonstrao contnua de Competncia (DCC)

Tambm conhecido como: a) Amostras de Controle do Laboratrio; b) Padres de Controle do Laboratrio; c) Spikes de Branco do Laboratrio. usado para garantir que o Laboratrio continua sob controle durante o perodo em que as amostras so analisadas. Define a performance do laboratrio, diferenciando da performance do Laboratrio para amostras/matrizes. De preferncia obtenha estas amostras de fontes externas diferentes das que fornecem os padres. Analise estas amostras ao menos trimestralmente. 2.1 Controles da Qualidade Analtica Rotineiros

PROVA EM BRANCO (B) No mnimo inclua a cada batelada ou a cada 20 amostras, o que for mais freqente. Analise o branco aps a calibrao diria e aps amostras muito contaminadas se houver suspeita de contaminao de amostras por arraste (carryover). Geralmente os resultados so suspeitos se o resultado do branco est acima do LQM e as amostras devem ser repreparadas. Se o branco foi maior que o LQM so necessrias aes corretivas. SPIKE DE BRANCO (SB) Usado para avaliar o desempenho do laboratrio e recuperao do analito em matrizes limpas. No mnimo a cada 20 amostras ou por batelada, o que for mais freqente. Deve ser em uma concentrao entre 10 LDMs e o meio da curva de calibrao ou outro valor especificado no mtodo. O preparo deve ser com padro de origem diferente do padro usado na calibrao. O SB deve ser avaliado pela %Recuperao. Se fora de controle tome aes corretivas, como repreparo e re-anlise de amostras. Use cartas de controle. SPIKE DE AMOSTRAS (SA) Adies de padro feitas antes do preparo das amostras. No mnimo a cada 20 amostras ou por batelada, o que for mais freqente. Deve ser em uma concentrao entre 10 LDMs e o meio da curva de calibrao ou outro valor especificado no mtodo. De preferncia use o mesmo valor do SB a fim de poder diferenciar o desempenho do laboratrio dos efeitos de matriz. O preparo deve ser com padro de origem diferente do padro usado na calibrao. Faa as adies de modo que os teores existentes nas amostras no interfiram de forma adversa nos resultados. Por exemplo, se as amostras contm o analito de interesse, ajuste a adio para a mesma concentrao. Avalie os resultados pela exatido ou %Recuperao. Se fora de controle tome aes corretivas como retificar o efeito da matriz, ou usar outro mtodo, ou usar o mtodo de adio de padro. Veja os critrios de aceitao no mtodo, se houver, at que o laboratrio desenvolva seus prprios critrios. Tome como base para aceitao de batelada o SB e no o SA, uma vez que a matriz pode afetar de forma adversa os resultados. DUPLICATA DE SPIKE OU DUPLICATA DE AMOSTRA (DS ou DA) Se a amostra no contm o analito o mais comum Duplicata de Spike. No mnimo a cada 20 amostras ou por batelada. Devem ser avaliadas para repetitividade e exatido (apenas para repetitividade em duplicatas de amostras). O preparo deve ser com padro de origem diferente do padro usado na calibrao. Faa as adies de modo que os teores existentes nas amostras no interfiram de forma adversa nos resultados. Por exemplo, se as amostras contm o analito de interesse, ajuste a adio para a mesma concentrao. Se fora de controle tome aes corretivas como retificar o efeito da matriz, ou usar outro mtodo, ou usar o mtodo de adio de padro. Veja os critrios de aceitao no mtodo, se houver, at que o laboratrio desenvolva seus prprios critrios. Tome como base para aceitao de batelada o SB e no o DS ou DA, uma vez que a matriz pode afetar de forma adversa os resultados. PADRO INTERNO Usado em anlise orgnica. So compostos adicionados nas amostras e que se assemelham aos compostos analisados e no causem interferncias. Os resultados so calculados com base em suas quantidades adicionadas. Devem ter tempo de reteno e espectros diferentes dos analitos e eluir em uma rea representativa do cromatograma. Se no se usa Surrogate o padro interno adicionado na amostra preparada para anlise (para poder avaliar com preciso o Surrogate), do contrrio adicionado na amostra antes do preparo. (SURROGATE) PADRO DE CONTROLE Usado em anlise orgnica. So compostos adicionados nas amostras e que se assemelham aos compostos analisados e no causem interferncias. Devem ser compostos incomuns na natureza (geralmente fluorados e deuterados) e so sempre adicionados na amostra antes do preparo para poder monitorar todas as perdas dos processos (extraes, etc.). Se os valores obtidos para o Surrogate esto fora de controle, tome aes corretivas, como re-preparo e re-anlise das amostras quando requerido.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

21/24

2.2 a) b)

Calibrao Calibrao de Instrumento e Manuteno: Conforme Manual; Calibrao Incial: Mnimo de 3 pontos para curvas lineares e mnimo de 5 pontos para curvas no lineares. O menor valor deve ser prximo do LQM e o maior valor no final da faixa de calibrao. Evite diferenas de mais de duas vezes entre as concentraes. As curvas podem ser Linear pela origem, Linear fora da origem, ou No Linear (passando ou no pela origem). Se fatores de Resposta so usados os valores de %CV calculados devem ser menores que os especificados nos mtodos e a sensibilidade deve ser verificada tambm (em GC/MS por exemplo). Se o coeficiente de correlao no for especificado um valor de no mnimo 0,995 recomendado. Verificao de Calibrao: Analisando um padro prximo do meio da curva de calibrao. A frequncia deve ser baseada em tempo (por exemplo, a cada 12 horas) ou pelo nmero de amostras analisadas (por exemplo, a cada 10 amostras). Clculos de CQA Calibrao Inicial

c)

2.3 a)

A = rea, C= Concentrao. FRR (Fator de resposta relativa para padro interno para o composto x) = (Ax / Api) X (Cpi / Cx) FR (Fator de resposta para padro externo) = Ax / Cx FC (Fator de calibrao) = rea do padro / Massa injetada %CV = Desvio padro X 100 / Mdia. b) Verificao de calibrao

%D (% Diferena do FR) = (FR mdio inicial FR mdio da verificao) X 100 / FR mdio Inicial %D (% Diferena para valores) = (Valor verdadeiro Valor achado) X 100 / Valor verdadeiro. %Recuperao = Valor achado X 100 / Valor verdadeiro c) Spike de branco (Amostra de Controle do Laboratrio) (SB)

%Recuperao = Valor achado X 100 / Valor verdadeiro d) Surrogate

%Recuperao = Valor achado X 100 / Valor verdadeiro e) Spike de Amostra (SA)

% Recuperao = (Resultado do Spike Resultado da Amostra) X 100 / Concentrao adicionada f) Duplicata de Amostra

DRP (Diferena Relativa Percentual) = (Result. da amostra Result. da Duplicata) X 100 / mdia g) Mtodo de Adio de Padro (para corrigir interferncia de matriz)

Concentrao = (Sinal da amostra X Volume de padro adicionado X Conc. do Padro) / ((Sinal da amostra com padro Sinal da amostra) X Volume de amostra inicial.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

22/24

2.4

Cartas de Controle

So essenciais para um controle de qualidade e os sistemas computadorizados podem ser uma alternativa para o controle. Cartas de Exatido ou de mdia: Usada para Provas em Branco, Padres de Controle Laboratrio, Padres de Verificao de Calibrao, Spikes de Branco, Spikes de Amostra e Surrogates. Linha Central: Mdia Limites de Advertncia: +2 desvios padro (incluem 95% dos resultados) Limites de Controle: +3 desvios padro (incluem 99% dos resultados) Pode-se usar valores absolutos para valor fixo de Concentrao ou relativos se a concentrao varia. Cartas de Amplitude: Usam %CV para replicatas ou Diferena Relativa Percentual (DRP) para duplicatas. Linha Central para duplicatas: 1,128CV Linha de Advertncia para Duplicatas: 1,128CV + (2/3) (3,267CV - 1,128CV) = 2,554CV (inclui 95% dos resultados) Linha de Controle para duplicatas: 3,267CV (inclui 99% dos resultados). Para anlises de controles em concentrao fixa as cartas de amplitude podem ser bem simples e feitas como descrito acima. Para concentraes variveis, mais comumente se traam curvas de Limites de Controle em funo da concentrao e lanam-se os resultados em tabelas como abaixo: >LC <LC <LA Data 18 04/04 25 05/04 6 06/04 7 10/04 3 12/04

3 01/04

5 02/04

Anlise de Cartas de Mdia Segundo Standard Methods (APHA): a) b) c) d) Limite de Controle: Se excede o LC re-analise imediatamente. Se se mantm dentro do LC continue as anlises. Se no descontinue e corrija o problema. Limites de Advertncia: Se dois de trs pontos sucessivos excedem o LA, analise outro CQ. Se estiver abaixo de LA continue as anlises. Se no, avalie a tendncia potencial e corrija o problema. 1 desvio padro: Se 4 de 5 pontos sucessivos excedem 1 desvio padro ou esto em ordem sempre crescente ou decrescente analise outro CQ. Se este ponto muda a ordem ou est abaixo de 1 desvio padro continue as anlises. Se no pare as anlises e corrija o problema. Tendncias: Se 7 CQs sucessivos esto sempre acima ou abaixo da linha central interrompa as anlises e corrija o problema.

Segundo regras gerais de cartas de controle (mais usadas industrialmente) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) Qualquer ponto acima dos limites de controle. Sete pontos seguidos acima ou abaixo da mdia. Sete oscilaes para cima e abaixo da mdia. Sete pontos seguidos crescendo ou decrescendo. 14 pontos alternando subidas e descidas. 15 pontos na regio de mdia e 1 desvio padro 2 pontos seguidos nos limites de advertncia.

Uma outra utilidade das cartas de controle mostra melhorias na preciso do mtodo. Se raros pontos excedem os LAs, recalcule os Limites com base nos ltimos 10 ou 20 pontos. Tendncias indicam erros sistemticos.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

23/24

2.5 Avaliao de QC para amostras pequenas Amostras de pequenos tamanhos como Brancos de Campo e Amostras em duplicatas podem no ser adequados para QC com cartas de controle. 2.6 Aes Corretivas

Quando necessrio tome imediatamente aes corretivas para corrigir e eliminar fontes de erros. No relate os resultados at que as causas de erros tenham sido identificadas e corrigidas ou Identificadas ou Qualificadas. Qualificar significa relatar os resultados junto com observaes sobre alguma irregularidade. Qualificar os resultados no elimina a necessidade aes corretivas, mas permite relatar os resultados quando no possvel ou prtico reanalisar as amostras. Mantenha registros de aes corretivas e eventos fora de controle. O objetivo de aes corretivas no apenas eliminar causas, mas tambm evitar repeties futuras. As aes corretivas comeam com os Analistas que comunicam os eventos fora de controle aos Supervisores. Tais eventos incluem: Pontos fora de Controle em Cartas, Perdas de tempo excessivas, perdas de amostras, malfuncionamento de equipamentos e evidncias de contaminaes de amostras. Aes corretivas recomendadas quando os QC so inaceitveis: a) Verificar dados para erros de clculos e transcrio; b) Verificar cumprimento dos procedimentos de preparo e anlise; c) Verificar padres de calibrao contra padres independentes; d) Se o SB falha re-analise outro SB; e) Se o segundo SB falha analise um material independente e se for aceitvel re-prepare e re-analise as amostras afetadas. f) Se um SA falha cheque o SB. Se o SB aceitvel, qualifique o resultado da Amostra usada ou analise por outro mtodo ou por adio de padro. g) Se o SA e o respectivo SB falham re-prepare e re-analise as amostras. h) Se o Branco falha, re-analise o branco. i) Se o segundo Branco falha re-prepare e re-analise as amostras. j) Se o Surrogate ou Padro Interno falham e no h registros de erros de clculos, re-prepare e re-analise as amostras

Referncias Bibliogrficas
1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) Oliveira, Fernando Mota: Guia do Usurio do Software LABWIN-CQA. Labwin Ltda, Junho de 2004 EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods; A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM, First Internet version, December 1998, First English Edition 1.0 1998; www.eurachem.ul.pt/guides Miller, J. C. and Miller, J. N.: Statistics for Analytical Chemistry, second edition, Ellis Horwood Ltd, London, 1992, pp-60-62. EPA: Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit - Revision 1.11, 40 CFR Part 136, Appendix B IUPAC: Nomenclature, symbols, units and their usage in Spectrochemical analysis II, Spectrochim Acta B 1978, 33B, 242 and Limit of Detection, A Closer Look at the IUPAC Definition, Analytical Chemistry 1983, V. 55, No. 7 page 712A; a APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20 . Ed., USA, APHA, 1998. Hubaux, A. and Vox, G.: Decision and detection limits for linear calibration curves, Analytical Chemistry 42, 849 - 855 (1970). ASTM Standard D4885-91: Standard Practice for Comparing Test Methods, ASTM Standards on th Precision and Bias for Various Applications, 4 Edition, 1992. Knoll, J. E., J. Chromat. Sci., 23(9), 1985, 422-425. Eurachem Group: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, Eurachem/CITAC, second Edition, UK, 2000. Hoel, Paul G.: Estatstica Elementar, Atlas, So Paulo, 1981. Microsoft Corporation: Documentao (arquivos de ajuda) do Microsoft Excel 97, Microsoft, 1997. Lapponi, Juan Carlos: Estatstica usando Excel, Lapponi Treinamento e Editora, So Paulo, 1995.

Copyright Fernando Mota de Oliveira, todos os direitos reservados

03/09/06

24/24